CN106591222A - 一种皮肤干细胞活性成分的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种皮肤干细胞活性成分的提取方法，是将人源性皮肤组织加入添加有PMSF蛋白酶抑制剂的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水混合消化液中恒温摇床培养，以含体积分数10%胎牛血清的M199培养基终止消化，离心收集沉淀，生理盐水重悬细胞得到复合皮肤干细胞，应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体筛选出Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞。以本发明方法提取的Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞纯度可以达到95.8%，皮肤干细胞数量多、细胞存活率高、活性好，应用于治疗脱发的药物中，生发效果显著。

Description

一种皮肤干细胞活性成分的提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种皮肤干细胞活性成分的提取方法。以本发明方法提取的皮肤干细胞活性成分可应用于治疗脱发。

背景技术

脱发是皮肤科的常见多发病，多发于男性，严重影响人的外观和心理状态。脱发分为多种类型，雄激素源是最常见的一种。中国脱发患病率约30.29%，其中25岁至55岁男性中25%有雄激素源性脱发。而西方男性脱发现象更明显，30岁到70岁男性脱发率与年龄成正相关。随着社会压力的增加，男性心理负担增大，脱发向低龄化发展，患病率也成逐年上升趋势。

众多学者致力于脱发治疗研究，但不论是中医的药物、针灸或穴位按摩治疗，或西医的药物或手术移植治疗，还是中西医结合治疗，虽然能在短期使毛发再生，但复发率高，副作用大。目前美国食品药品管理局(FDA)批准米诺地尔和非那雄胺两种治疗脱发的药物用于治疗斑秃和雄激素性脱发，对大多数患者有较好的生发效果。随后法国和英国等欧洲国家也开始上市销售，我国也有米诺地尔制剂用于临床。但米诺地尔液会引起刺激性或变应性接触性过敏反应，部分患者可出现瘙痒和头皮脱屑症状；使用过程中还可能引起面部和四肢多毛症；严重的会造成心跳加快、血压升高等副作用；停用后治疗效果逐渐消失。非那雄胺仅适用于男性脱发治疗，但长期临床实践表明，其存在引起性功能异常、精子一过性减少和男性乳房发育异常等不良反应，尚有其它包括骚痒感、风疹及面唇部肿胀等过敏反应和睾丸疼痛等不良反应。

干细胞(Stem Cell)是一类具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能的细胞群体，是形成人体各种组织、器官的“万能细胞”、“祖宗细胞”。干细胞可以产生和分泌大量的生物活性因子如干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等，这些干细胞生物活性因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能，可有效活化人体干细胞、调控机体细胞信号传导，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老细胞。干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。

利用干细胞分泌产生的生物活性因子激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老细胞，从而治疗脱发的问题，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。

可以通过很多种方式获取干细胞分泌的活性成分。CN 104622904A公开了一种皮肤干细胞活性成分及其应用，是先以胶原酶III与含双抗的DMEM的混合酶液对皮肤组织进行首次消化，再用0.25wt%胰酶/EDTA在37℃二次消化，收集两次消化后通过200目滤网的滤液，以磁珠筛选法筛选出Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞。以该方法提取的皮肤干细胞数量少，且胶原酶III与胰酶的消化时间长，对细胞损伤较大，导致提取的皮肤干细胞成活率低、活性较差，最终影响其治疗脱发的药效。

发明内容

本发明的目的是提供一种皮肤干细胞活性成分的提取方法，以本发明方法提取皮肤干细胞活性成分，能够提高皮肤干细胞的数量、成活率及活性，促进毛发再生。

本发明所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法是用生理盐水将人源性皮肤组织清洗干净，机械破碎，加入添加有PMSF蛋白酶抑制剂的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水混合消化液中，37℃恒温摇床培养，以含体积分数10%胎牛血清的M199 培养基终止消化，收集消化液，离心收集沉淀，以生理盐水重悬细胞，重复2～3次，得到复合皮肤干细胞；应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体，以磁珠筛选法从复合皮肤干细胞中筛选出Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞。

其中，所述的混合消化液是配制总质量浓度为0.25%的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水溶液，加入溶液质量1%的PMSF蛋白酶抑制剂，调节溶液的pH值为7.2～7.4得到的混合消化液。

进一步地，所述混合消化液中，Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的质量比为1∶1。

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。本发明选用Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶混合，能够温和地消化细胞间质，但对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。同时，该混合胶原酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在，仍然具有活性，可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率。本发明添加的PMSF蛋白酶抑制剂能够缓解消化液对组织的消化作用，使消化更加缓和，减小对干细胞的损伤，在生理pH和温度条件下，特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质，对温度、pH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件影响而改变本身的构象和性质。本发明调整消化液的pH值在7.2～7.4并在37℃消化，接近人的生理pH值和温度，能够更好的发挥胶原酶的消化作用，减少消化时间，减轻组织因消化时间过久引发的对干细胞的损伤。

本发明上述提取方法中，具体是将所述混合消化液置于摇床上，以100～200r/min的转速培养30～50min。

经流式细胞仪检测，采用本发明上述方法提取的Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞的纯度可以达到95.8%。台盼蓝染色比较发现，Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞的细胞存活率也明显高于以CN104622904A方法提取获取的细胞。

本发明同时也提供了上述获得的皮肤干细胞活性成分的培养方法，是将分选获取的Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞接种于培养瓶中，加入表皮干细胞专用培养基，在饱和湿度、体积分数5% CO₂、37℃环境下恒温培养，待细胞长到80%～90%融合后，用不含EDTA的0.25wt%胰酶消化传代；将传代细胞移入新的培养瓶中，重复以上培养、增殖过程。在细胞生长最佳期收集细胞上清液，1000r/min离心5min，将弃去细胞沉淀后的上清继续以9000r/min离心15min，弃去液体，用生理盐水重悬沉淀物，最终得到皮肤干细胞活性成分。收集到的含有皮肤干细胞活性成分的生理盐水可以置于-20℃保存。

所述的表皮干细胞专用培养基是在含体积分数5～10%胎牛血清的M199培养基中加入生长因子与抗生素组合物配制而成的，其中，所述生长因子包括谷氨酰胺、谷丙酸钠和Endogro细胞因子，抗生素为青链霉素，所述谷氨酰胺在培养基中的浓度为100～200mmol/L，谷丙酸钠在培养基中的浓度为5～10mmol/L，Endogro细胞因子在培养基中的浓度为5～10µmol/L，所述青链霉素在培养基中的浓度各自为100IU/mL。所述专用培养基中含有皮肤干细胞生长特需的营养成分谷氨酰胺和Endogro 细胞因子以及双抗，能够有效促进细胞增殖，增强细胞免疫力，维持细胞良好的生长态势。青链霉素的加入能够防止细胞生菌，保证表皮干细胞分泌液的健康无污染。

本发明选用复温的质量终浓度为0.25%的不含EDTA的胰酶消化细胞进行传代，该胰酶较含EDTA的0.25%的胰酶更温和，对细胞损伤更小，细胞结构更完整。

本发明调整了复合胶原酶的组成配比，并生理盐水作为提取过程的平衡试剂，从皮肤组织的清洗到皮肤干细胞的获取进行整体优化，使得提取的皮肤干细胞数量高、成活率高、活性好；在皮肤干细胞的培养过程中使用了表皮干细胞专用培养基，并使用不含EDTA的胰酶进行消化传代，消化程度温和，减小了对皮肤干细胞结构的损伤，最终制备的皮肤干细胞分泌的活性成分浓度高，生发作用效果好。

经检测，以本发明所述提取方法提取的皮肤干细胞活性成分在干细胞的数量、成活率和活性方面均较CN 104622904A中皮肤干细胞活性成分有显著提高。

将本发明提取的皮肤干细胞活性成分、CN 104622904A中皮肤干细胞活性成分、市售药品米诺地尔或非那雄胺分别作用于正常和病理小鼠模型，以及应用于治疗脱发的药物中，各试验结果均显示出本发明不仅好于市售药品米诺地尔或非那雄胺，也明显强于CN104622904A皮肤干细胞活性成分的显著生发效果。

附图说明

图1是实施例1提取的皮肤干细胞活性成分培养4天时的镜下图。

图2是比较例1提取的皮肤干细胞活性成分培养4天时的镜下图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步的举例描述，但下述实施例并不构成对本发明的任何限制。在不背离本发明技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变，都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：皮肤干细胞的分离和培养。

取人源性皮肤组织，以生理盐水进行清洗，待其中的肿胀液与皮肤组织自然分层后，吸弃下方溶液；加入等体积的生理盐水至皮肤组织中，放置摇床上摇振5min，静置1～5min，吸弃下方溶液；再加入等体积的生理盐水，1000rpm离心5min，弃上清；以生理盐水重复清洗组织并离心弃上清，直至上清液清亮、组织中无任何血迹，得到表皮组织。

取0.25gⅠ型胶原酶、0.25gⅡ型胶原酶，加入200mL生理盐水中溶解均匀，再加入2gPMSF蛋白酶抑制剂溶解均匀，调节溶液的pH值在7.2～7.4，得到混合消化液。

将清洗干净的表皮组织机械破碎，加入到上述混合消化液中，置于摇床上，于37℃条件下，以200r/min的转速恒温培养50min后，加入含10%胎牛血清的M199培养基终止消化。收集消化液，1000r/min离心5min，去除上清后的沉淀中再加入生理盐水重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清，再以生理盐水重悬细胞，过滤细胞悬液至新的离心管中，补加生理盐水，1000rpm离心5min，弃去上清液，获得复合皮肤干细胞。

应用SIGMA公司磁珠标记的Dlk抗体，以磁珠筛选法从复合皮肤干细胞中筛选出Dlk1⁺皮肤干细胞；再应用SIGMA公司磁珠标记的Sca1抗体，以磁珠筛选法从分选出的Dlk1⁺皮肤干细胞中筛选出Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞。

向含10%胎牛血清的M199培养基中加入生长因子谷氨酰胺、谷丙酸钠和Endogro细胞因子，抗生素青链霉素配制表皮干细胞专用培养基，配制成的专用培养基中含谷氨酰胺200mmol/L、谷丙酸钠10mmol/L、Endogro细胞因子10µmol/L，青链霉素的浓度各自为100IU/mL。

将分选出的Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞接种于25cm²培养瓶内，加入表皮干细胞专用培养基，在饱和湿度、体积分数5% CO₂、37℃环境下恒温培养，待细胞80%～90%融合后，以质量终浓度0.25%的不含EDTA胰酶消化传代。如此重复培养、扩增，获得大量的Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞。

待细胞长到最佳状态时，收集皮肤干细胞上清，使用低速离心机以1000r/min离心5min，弃去悬液中的细胞沉淀。将收集的上清移入离心管中，使用低温高速离心机，控制温度在4℃，9000r/min离心10min，弃掉液体，收集表皮干细胞上清中的皮肤干细胞活性成分，以生理盐水重悬，将含有皮肤干细胞活性成分的混悬液移入EP管中，-20℃保存。

比较例：按照CN 104622904A方法提取皮肤干细胞活性成分。

按照酶液与皮肤组织的体积比为3∶1，将剪碎的皮肤组织加入溶解在含有双抗的DMEM中的胶原酶 III(1.0mg/ml)酶液中放置2h，以200目滤网过滤并收集滤液，用等量的含10% FBS的DMEM终止胰酶的消化。剩余组织块以0.25%胰酶/EDTA在37℃消化，200目滤网过滤，收集滤液。合并两次滤液，分别应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体，以磁珠筛选法筛选出Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞。

将分选出的皮肤干细胞接种于培养瓶中，加入5mL皮肤干细胞无血清专用培养基(含50ug/mL牛垂体提取物和5ng/mL DMEM，pH＝7.0～7.4)，在湿度≥95%，温度37℃，体积分数5% CO₂ 孵箱中培养，隔2天换液。待细胞70%～80%融合后，以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化传代，将传代产生的细胞移入新的培养皿中。重复以上培养、传代过程，培养过程中根据需要调整最佳的细胞数量。

待细胞长到最佳状态时，收集皮肤干细胞上清，以1000r/min离心 5min，弃去悬液中的细胞沉淀。将收集到的上清移入离心管中，使用低温高速离心机，控制温度离心收集皮肤干细胞上清中的皮肤干细胞活性物质，离心速度9000r/min，时间15min，弃掉离心管中的液体。用PBS液重悬离心管底部的沉淀物，得到含有皮肤干细胞活性成分的混悬液，移入EP管中，-20℃保存。

应用例 1。

以流式细胞仪检测皮肤干细胞活性成分的纯度，结果显示，实施例1提取的Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞的纯度可以达到95.8%，明显高于CN 104622904A中获得皮肤干细胞的纯度92.0%(p<0.05)。

应用例 2。

以台盼蓝染色检测法检测，实施例1获得干细胞活性成分的成活率为84.77%，而比较例干细胞活性成分的成活率只有69.85%。本发明获得干细胞活性成分的成活率明显高于CN 104622904A(p<0.05)。

图1和图2分别给出了显微镜下观察实施例1与比较例获取皮肤干细胞活性成分的数量和生长状态。在相同的条件下培养4天后，可见图1中皮肤干细胞生长数量明显多于图2，且图1中皮肤干细胞的生长状态也好于图2。

应用例3：本发明与CN 104622904A皮肤干细胞活性成分的药效性实验对比。

下述试验中，治疗组均使用实施例1制备的皮肤干细胞活性成分，对照组均使用比较例制备的皮肤干细胞活性成分。

1.1 本发明皮肤干细胞活性成分对脱毛C57BL/6小鼠的作用。

6周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分为治疗组、对照组和对比组3组，每组10只。以松香和石蜡按照1∶1的比例配成药物在小鼠背部脱毛，使用移液器将药物涂抹于各组小鼠脱毛区，每日上、下午各涂抹2次。用温水洗净，以小鼠背部光滑，无伤无残毛为净。

实验小鼠给药面积3cm×3cm，确保小鼠皮肤无损伤。治疗组每次给药量0.05mg/只、对照组每次给药量0.5mg/只、米诺地尔酊剂组使用市售米诺地尔酊剂，每次给药量0.lml/只。连续用药至皮肤进入休止期。每天记录每只小鼠由静止期进入生长期的转变时间，观察终点时间和毛重差。并在观察终点时间将小鼠断颈处死，取背部相同部位面积2.5cm×2.5cm的新生毛发称重。统计分析各受试物小鼠转变时间、观察终点时间和毛重差异，结果见表 1。

转变时间是指由静止期转变为生长期的时间，时间越短，表明诱导作用越强，促进毛发向生长期转变的能力越强。由表1可知，治疗组和对照组与米诺地尔酊剂组比较，转变时间均显著缩短(P<0.05)，且治疗组比对照组的转变时间更短(P<0.05)。

观察终点时间与毛发生长期的时间密切相关，时间愈长，毛发生长时间越长，促进生长作用越强。表1表明，治疗组观察终点时间长于对照组和米诺地尔酊剂组(P<0.05)。

毛重指标衡量毛发生长质量情况，表1表明，治疗组毛发重量高于对照组和米诺地尔酊剂组(P>0.05)。

毛发长度指标衡量毛发生长的速度情况，表2表明，相同时间内，治疗组和对照组毛发生长速度快于米诺地尔酊剂组，且治疗组的毛发生长速度明显快于对照组(p<0.05)。

1.2 本发明皮肤干细胞活性成分对雄激素脱发模型小鼠的作用。

6周龄雄性C57BL/6小鼠，18～20g，随机分为3组，每组10只。治疗组和对照组每次给药量0.05mg/只；非那雄胺组按照0.17mg/kg剂量给予非那雄胺片水混悬液。

各组小鼠每次肌注0.lml丙酸翠酮注射液，每日1次，造雄激素性脱发模型。非那雄胺片组灌胃给予非那雄胺混悬液，每日1次；治疗组和对照组则取各药物均匀涂抹于小鼠背部，每日早晚各给药一次，连续给药12周。在观察终点时间将小鼠断颈处死，剪取用药部位面积约为2.5cm×2.5cm的皮肤毛发，称重毛发重量。将小鼠去毛皮肤剪碎，加入生理盐水用组织匀浆机高速匀浆，匀浆液于3000rpm离心20min，收集上清液，按试剂盒说明书测定二氢翠酮(DHT)含量。各组小鼠在观察终点时间的毛重测定结果见表3。

皮肤中DHT浓度越低，毛发重量越高。由表3可知，治疗组降低皮肤DHT及增加毛重效果均优于对照组和非那雄胺组(P<0.05)。

1.3 本发明皮肤干细胞活性成分对脂溢性脱发患者的作用。

选择皮肤科门诊脂溢性脱发患者78例，年龄16～60岁，放疗、化疗引起的脱发或有药物接触过敏史者除外。分为治疗组和对照组，保证两组患者性别、年龄、病程间均具有均衡性。用软毛刷或药棉蘸药擦患处，以药液涂遍患处为度，3次/天。用药期间两组患者用温水洗头1次/3天，患处避免风、冷刺激，期间不用其他生发疗法。60天为一疗程，连续进行3个疗程。

疗效判断标准：显效，脱发明显减少或恢复正常，头屑、瘙痒消失，患处有明显新发生长或原毳毛样发变粗、黑、硬、长，外观明显改善；有效：脱发、头屑减少，瘙痒减轻，患处有新发生长，外观有所改善；无效：脱发、头屑略减少或无变化，瘙痒略轻或同前，无新发生长，外观改善不明显。

脂溢性脱发患者的疗效越高，起效天数越早，说明治疗越有效。从表4可以看出，治疗组对脂溢性脱发患者的疗效明显高于对照组(P<0.05)。同时，表5也说明应用治疗组的脂溢性脱发患者的起效天数明显早于对照组(P<0.05)。

1.4 本发明皮肤干细胞活性成分对斑秃患者的作用。

选择皮肤科门诊斑秃患者72例，年龄16～60岁，放疗、化疗引起的脱发或有药物接触过敏史者除外。分为治疗组和对照组，保证两组斑秃患者性别、年龄、病程间均具有均衡性。用软毛刷或药棉蘸药擦患处，以药液涂遍患处为度，3次/天。用药期间两组患者用温水洗头1次/3天，患处避免风、冷刺激，期间不用其他生发疗法。60天为一疗程，连续进行3个疗程。

疗效判断标准：治愈：脱发区有终毛生长，外观恢复正常，脱发区周围毛发不松动，新发不再脱落；显效：脱发区普遍有毳毛生长，终毛覆盖区超过脱发区1/2，脱发区周围毛发不松动，新发不脱落；有效：脱发区普遍有毳毛生长，尚无终毛或终毛未达到脱发区1/2，脱发明显减少；无效：脱发区没有或仅有少量毳毛生长，毛发继续脱落。

斑秃患者的疗效越高，起效天数越早，说明治疗越有效。从表6可以看出，治疗组对斑秃患者的疗效明显高于对照组(P<0.05)。同时，表7也说明应用治疗组的斑秃患者的起效天数明显早于对照组(P<0.05)。

上述应用试验证明，以本发明方法获取的皮肤干细胞活性成分应用于脱发治疗，较CN 104622904A提取的皮肤干细胞活性成分的药效更为显著。

Claims (8)

1.一种皮肤干细胞活性成分的提取方法，是用生理盐水将人源性皮肤组织清洗干净，机械破碎，加入添加有PMSF蛋白酶抑制剂的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水混合消化液中，37℃恒温摇床培养，以含体积分数10%胎牛血清的M199 培养基终止消化，收集消化液，离心收集沉淀，以生理盐水重悬细胞，得到复合皮肤干细胞；应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体，以磁珠筛选法从复合皮肤干细胞中筛选出Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞。

2.根据权利要求1所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其中所述的混合消化液是配制总质量浓度为0.25%的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水溶液，加入溶液质量1%的PMSF蛋白酶抑制剂，调节溶液的pH值为7.2～7.4得到。

3.根据权利要求2所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是所述混合消化液中Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的质量比为1∶1。

4.根据权利要求1所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是将所述混合消化液在摇床上以100～200r/min的转速培养30～50min。

5.根据权利要求1所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是以下述方法培养所述皮肤干细胞活性成分：将分选获取的Dlk1⁺/Sca1⁻皮肤干细胞接种于培养瓶中，加入表皮干细胞专用培养基，在饱和湿度、体积分数5% CO₂、37℃环境下恒温培养，待细胞长到80%～90%融合后，用不含EDTA的0.25wt%胰酶消化传代；将传代细胞移入新的培养瓶中重复培养；收集细胞上清液，1000r/min离心，收集上清，继续以9000r/min离心，收集沉淀，以生理盐水重悬，得到皮肤干细胞活性成分。

6.根据权利要求5所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是所述的表皮干细胞专用培养基是在含体积分数5～10%胎牛血清的M199培养基中加入生长因子与抗生素组合物配制而成。

7.根据权利要求6所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是所述的生长因子包括谷氨酰胺、谷丙酸钠和Endogro细胞因子，抗生素为青链霉素。

8.根据权利要求7所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是所述谷氨酰胺在培养基中的浓度为100～200mmol/L，谷丙酸钠在培养基中的浓度为5～10mmol/L，Endogro细胞因子在培养基中的浓度为5～10µmol/L，所述青链霉素在培养基中的浓度各自为100IU/mL。