CN103501796A - 护肤霜 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到皮肤护理组合物,其包括用于外部应用的药妆品,并且更具体,一种护肤霜,其包含被生长在二维培养条件的细胞所调理适应的细胞培养基。也包括使用这种组合物的方法以及包含其护肤霜的试剂盒。
Description
发明背景
发明领域
本发明一般涉及到皮肤护理组合物,更具体地涉及药妆品及药剂,用于外部应用,包括护肤霜,其包含被二维培养条件生长的包皮衍生的成纤维细胞所调理适应的细胞培养基。
背景信息
目前还没有对老化皮肤的治愈,并且对老化和/或有皱纹的皮肤的治疗都是暂时的而且受弊端和副作用的困扰。在真皮层存在的胶原蛋白和弹性蛋白质的损失随着时间推移导致弹性及皮肤厚度的衰退,其可能导致细纹和皱纹。可用于治疗面部皱纹最常见的手术干预,包括拉皮,激光手术,磨皮焕肤,注射疗法如(肉毒素)。然而,外科手术方法可能会导致有害的并发症,往往是痛苦的,并且必须随着时间重复进行。非侵入性疗法包括由α/β羟基、视黄酸、阿基瑞林(argirelines)、和维生素的构成的外用配方制剂。然而,这些方法没有完全消除皱纹,并要求多次而且往往是昂贵的治疗。有些外用配方制剂可作为对皮肤的刺激物,引起伤口愈合反应,但没有成功地用足够的蛋白质补充变薄的皮肤用于治疗和/或预防年龄相关的缺陷。
皮肤老化的发病机制被很好地定义;其特点为金属蛋白酶介导的胶原蛋白合成的减少和胶原蛋白分解的增加(Arch.Dermatol.138[11]:1462-70,2002)。真皮的胶原蛋白的净损失被认为是有助于和/或容许了起皱纹。刺激在伤口愈合中胶原蛋白生成的生物学因素可能为衰老的皮肤提供益处。因此,生长因子、肽片段、和其它生物活性分子被纳入抗衰老的药妆品。
生长因子是典型地具有多样化生物效应的肽。已被确定为在伤口愈合和/或表皮重构中有用的一些生长因子家族包括,例如,转化生长因子-β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)。
在体外培养的活细胞将细胞外蛋白质和肽(包括生长因子)分泌到其培养所在的营养培养基中。暴露于培养中的细胞的培养基中被称为“条件培养基”。在美国专利号6,372,494中,Naughton等人教导了,包括三维的细胞外基质以及多层的间质和组织特异性的细胞(即,三维培养系统)的来自细胞培养的条件培养基可有利地用于准备生长因子富集的药妆品组合物;美国专利号6,372,494其完整内容通过引用合并入本文。事实上,Naughton等人断言复合的三维培养系统具有超越简单二维培养系统的许多优点,例如,更大的表面积;更类似于体内组织;不存在“接触抑制”(在两维培养中对细胞生长的限制);局部微环境的创建;增加细胞间的相互作用和潜在的细胞迁移;分化表型的维护以及分化因子的合成,等等。可惜,三维培养系统实质上更昂贵,而且其建立和维护相比常规二维培养系统在技术上具有挑战性。而且,三维培养中形成的复合生物系统产生太多的变量(例如,细胞-细胞和细胞-基质的相互作用、组织分化,等等),以至于对于收获的条件培养基进行质量控制变得几乎不可能,并且生长因子组合物中批次与批次之间的变化性可能是商业上不能接受的。
因此,虽然使用生长因子治疗老化皮肤受到皮肤护理专业人员的青睐,对于更有效的外用配方制剂仍然存在重要的和未满足的需求,所述配方制剂其用于治疗和/或预防皮肤损伤,由于老化和环境因素的皱纹和/或其他瑕疵,其中所述配方制剂包括富含生长因子的条件培养基和/或由经济的、良好控制下的和均一的二维细胞培养方法的产生的细胞外基质的组合物。
发明概述
本发明涉及皮肤护理组合物,包括药妆品和护肤霜,用于外部应用,其包含被二维培养下生长的细胞调理适应的细胞培养基。本发明还公开了使用这样的组合物用于治疗皮肤疾病的方法。
在一个实施方案中,公开了用于治疗和/或预防皮肤缺陷的护肤霜,其包含条件培养基或者其提取物或浓缩物,其来自培养的基本上同质化的包皮衍生的成纤维细胞,其中产生条件培养基是通过在二维培养中,在适于促进至少一种生长因子分泌到营养培养基中的条件下将营养培养基与细胞温育,并且其中条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述至少一种生长因子以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。在一个方面,第一种条件培养基是从转化的细胞获得并且第二种是从相同细胞株的非转化细胞获得。在相关方面,细胞来自不同细胞株。
在一个方面,所述条件包括在二维聚苯乙烯微载体的细胞培养。在相关方面,细胞从非转化的细胞中获得的。在进一步的相关方面,细胞来自指定为ATCC保藏号PTA-11681的细胞系。在另一个相关的方面,细胞可以用用SV40大T抗原来转化。在进一步的相关方面,细胞来自指定为ATCC保藏号PTA-11680的细胞系。
在另一个方面,护肤霜进一步包括一种或多种溶剂,一种基质溶剂,一种或多种植物性药物,以及一种或多种润肤剂。在相关方面,所述基质是纯净水。
在另一个相关的方面,所述至少一种生长因子包括:EGF、PDGF、FGF、TGF-β、TGF-α、NGF、Epo、IGF-I、IGF-II、IL1-α、IL-1-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、INF-α、INF-β、INF-γ、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、和M-CSF,或其组合。在相关方面,该组合包括TGF Beta-1、TGFBeta-2、TGF Beta-3、IL-3、IL-6、IL-7和IL-8,并且其中条件培养基以至少20%(wt%)浓度存在。在进一步的相关方面,该组合包括约1-3ng/mL TGF Beta-1、约100-160pg/mL TGF Beta-2、约50-100pg/mL TGF Beta-3、约60pg/mL IL-3、约11pg/mL IL-6、约50pg/mLIL-7和约4-10pg/mL IL-8,其中所述条件培养基是以约30-42%(wt%)存在。
在一个方面,护肤霜进一步包括增稠剂。在一个相关方面,增稠剂包括聚乙二醇(PEG)、基于植物的脂肪醇和共聚物的组合。在一个进一步有关的方面,基于植物的脂肪醇包括癸醇,辛基癸醇,月桂醇,月桂基-肉豆蔻醇,肉豆蔻醇,十六烷基硬脂醇(ceto-stearylalcohol)及其各种共混物、鲸蜡醇、和硬脂醇。在另一个方面,所述增稠剂包括PEG-150、癸醇和SMDI共聚物。
在一个方面,护肤霜进一步包括湿润剂。在一个相关方面中,湿润剂包括PCA钠、甘油、丙二醇、山梨糖醇、透明质酸、尿素、和乳酸。在另一个方面,护肤霜进一步包括尿囊素。
在一个方面,护肤霜进一步包括至少一种防腐剂。在一个相关的方面,所述至少一种防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯,双咪唑烷基脲、苯氧基乙醇、DMDM乙内酰脲、山梨酸、苯甲醇、甲醛、和三氯生。在另一个相关的方面,所述至少一种防腐剂包括甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮、和咖啡因。
在另一个方面,护肤霜进一步包括PEG-150、癸醇、SMDI共聚物、PCA钠、尿囊素、纯净水、甲基异噻唑啉酮和对羟基苯甲酸甲酯。
在一个方面,护肤霜还包括额外的试剂。在一个相关的方面,所述额外试剂包括Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)或阿基瑞林。
在另一个方面,护肤霜进一步包括第二种条件培养基或者其提取物或浓缩物,其中第二种条件培养基是通过在二维培养中,在适于促进至少一种第二类生长因子或者一种以上细胞外基质蛋白分泌的条件下将营养培养基与第二种基本上同质化的真核细胞温育,并且其中在条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述生长因子或细胞外基质蛋白以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。
在另一个实施方案中,公开了治疗和/或预防皮肤缺陷的方法,其包括施用护肤霜到有需要的受试者的皮肤,所述护肤霜包含条件培养基或者其提取物或浓缩物,其来自培养的基本上同质化的包皮衍生的成纤维细胞,其中产生条件培养基是通过在二维培养中,在适于促进至少一种生长因子分泌到营养培养基中的条件下将营养培养基与细胞温育,并且其中条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述至少一种生长因子以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。在一个方面,第一种条件培养基从转化的细胞获得而第二种是从相同细胞系的非转化细胞获得。在一个相关方面,细胞来自不同细胞株。
在一个方面中,通过外部施用应用护肤霜。在一个相关方面,外部施用是通过透皮的皮肤印片(stamp)或射频微针设备或点阵激光。
在另一个方面,皮肤缺陷包括皮肤老化、皮肤皱纹、雄激素性脱发(AGA)、睫毛损失、阳光晒伤、烧伤、手术疤痕、撕裂伤、妊娠纹、痤疮疤痕、伤口、阴道干涩。
在一个实施方案中,公开了指定为ATCC保藏号PTA-11680的成纤维细胞系。在另一个实施方案中,公开了指定为ATCC保藏号PTA-11681的成纤维细胞系。
在一个实施方案中,公开了包括护肤霜、容器、标签和提供应用所述护肤霜的方法的说明书的试剂盒,所述护肤霜包含条件培养基或者其提取物或浓缩物,其来自培养的基本上同质化的包皮衍生的成纤维细胞,其中产生条件培养基是通过在二维培养中,在适于促进至少一种生长因子分泌到营养培养基中的条件下将营养培养基与细胞温育,并且其中条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述至少一种生长因子以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。
附图说明
图1显示含有SV40大T抗原的质粒:pBsSVD2005的示意图。
图2显示了采用年龄在25-72岁的20个受试者进行的比较研究的结果。给予受试者未贴标签的4个产品的容器(AQ产品;TNS、BIO-GEL和Revive),包括安慰剂。研究时间—75天。
图3显示了在42%(wt%),对皮肤的纹理、皱纹、细纹、紧致度、和整体改善的平均百分比改善分数。
图4显示了在30%(wt%),对皮肤的纹理、皱纹、细纹、紧致度、和整体改善的平均百分比改善分数。
图5显示了在20%(wt%),对皮肤的纹理、皱纹、细纹、紧致度、和整体改善的平均百分比改善分数。
图6显示了比较研究中在不同时间点的功效。时间点7、15和30天(42%,wt%)。
图7显示了比较研究中在不同时间点的功效。时间点7、15和30天(30%,wt%)。
图8显示了比较研究中在不同时间点的功效。时间点7、15和30天(20%,wt%)。
图9显示了使用AQ皮肤治疗组合物连同皮肤病的透皮给药印片的治疗前后。受试者的额头上有痤疮疤痕。
图10显示了使用AQ皮肤治疗组合物连同皮肤病的透皮给药印片的治疗前后。受试者的脸颊上有痤疮疤痕。
图11显示了一个图形,其展示了相对于安慰剂(生理盐水)使用AQ护发精华素的72个受试者的头发生长参数的改善。
图12显示了一位受试者用AQ组成物治疗15周期间头皮上渐进的头发生长。图片显示在0、8、15周的结果。
图13显示了另一位受试者用AQ产品治疗15周期间头皮上渐进的头发生长。图片显示在0和15周的结果。
图14显示了临床评估(纹理、皱纹、细纹、紧致度)作为改善百分比的函数。
图15显示了受试者评估(纹理、皱纹、细纹、紧致度)作为改善百分比的函数。
图16显示了对AQ活性精华素的客户评估的平均分数(%)(数量、香味、质量、满意度、再次购买、整体)。
图17显示了对AQ活性精华素的受试者评估(%)(纹理、皱纹、细纹、紧致度、数量、香味、质量、满意度、再次购买、整体)。
发明详述
在描述本发明组合物、方法和方法学之前,应当理解,本发明并不限定于所述的特定的组合物、方法和实验条件,因为这样的组合物、方法和条件可能会发生变化。也可以理解,本文所用的术语仅为了描述特定实施方案的目的,并不打算进行限制,因为本发明的范围只在所附的权利要求中将被限制。
在本说明书和所附的权利要求中所用的,单数形式“一”,“一个”,“该”包括复数的引用,除非上下文清楚地另有所指。因此,例如,“一个细胞”的引用包括一个或多个细胞,和/或本文所述类型的组合物,其对于本领域技术人员在阅读本公开等诸如此类会变得显而易见。
除非另有定义,本文所用的所有技术的和科学的术语具有与在本发明所属领域的普通技术人员之一所通常理解的相同的含义。与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试,因为会被理解的是,修改和变化都包括本公开的精神和范围之内。
在一些实施方案中,本发明涉及对皮肤的治疗和/或防治的外用配方制剂,其包括来自二维细胞培养的条件培养基。细胞可以以单层培养在常规基底,滚瓶,珠子,或任何其他的二维培养系统,从而提供这类可扩展的培养系统已知的许多优点中的至少一些,包括细胞微环境的精确控制。细胞优选地是人的从而降低免疫应答的风险,并且其包括尤其是间质细胞、角质细胞、黑素细胞、实质细胞、间充质干细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞。在本发明的一些实施方案中,原代人包皮成纤维细胞的单层培养物用于调理适应其所沐浴的营养培养基。由这样的细胞培养所调理适应的培养基含有多种自然分泌的蛋白,包括细胞外基质蛋白和生物活性的生长因子。
生长因子和皮肤老化的发病机制
皮肤的真皮层中包含对为保持皮肤的厚度、弹性和活力所必要的结构元素。随着年老,这些蛋白质的生产速率降低,而且导致下垂的皮肤和皱纹。细胞外蛋白质分泌到条件培养基,其包括生长因子、细胞因子、肽、结构的和细胞外基质蛋白及前体等等,显示出用于众多类型的领域的产品制备的新的可能性,包括治疗和/或预防年龄有关的皮肤活力损失。在促进生长、增强自分泌来维护组织结构和功能以及在促进伤口愈合中,生长因子众所周知发挥重要的作用。细胞的细胞因子和生长因子参与了多个关键的细胞过程,包括细胞增殖、粘附、形态外观、分化、迁移、炎症反应、血管生成和细胞死亡。有研究已表明,对细胞的低氧应激和损伤诱导包括相对应于生长因子的mRNA和蛋白质的水平增加在内的应答,所述生长因子包括尤其是血小板衍生的生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子1和2(FGFs)、胰岛素样生长因子1和2(IGFs)、转化生长因子-β(TGF-β)。
如前所述,一些生长因子,如TGF-β,在伤口愈合被应激蛋白所诱导。两个已知的应激蛋白为GRP78和HSP90。这些蛋白质稳定细胞结构并且致使细胞抵抗不利条件。TGF-β家族二聚体蛋白包括TGF-β1、TGF-B2和TGF-B3并且调节许多细胞类型的生长和分化。此外,这个家族的蛋白质表现出广泛的生物效应,刺激一些类型的细胞的生长(Noda等人,1989,Endocrinology124:2991-2995)并抑制其他类型细胞生长(Goey等人,1989,J.Immunol.143:877-880;Pietenpol等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3758-3762)。已显示TGF-β能增加包括胶原蛋白、纤连蛋白的细胞外基质蛋白的表达(Ignotz等人,1986,J.Biol.Chem.261:4337-4345),并加快伤口的愈合(Mustoe等人,1987,Science237:1333-1335)。
另一个这样的生长因子为PDGF。PDGF最初发现为间充质衍生细胞的一种强有力的促细胞分裂剂(Ross R.等人,1974,Proc.Natl.Acad.Sci.USA71(4);1207-1210;Kohler N.等人,1974,Exp.CellRes.87:297-301)。PDGF已知为间充质干细胞的一种强有力的促细胞分裂剂,并通过增强成纤维细胞功能而增加组织形成中细胞化和颗粒化的速度。用PDGF处理的伤口显现早期炎症反应,包括在伤口部位的中性粒细胞和巨噬细胞类型的增加。这些伤口也显示出成增强的纤维细胞功能(Pierce,G.F.等人,1988,J.Exp.Med.167:974-987)。PDGF和TGF-β在动物研究中都已显示能增加胶原蛋白的生成、DNA含量和蛋白质水平(Grotendorst,G.R.et al,1985,J.Clin.Invest.76:2323-2329;Sporn,M.B.et al,1983,Science(Wash DC)219:1329)。PDGF已显示出在治疗人的伤口中是有效的。在人的伤口,PDGF-AA的表达在溃疡愈合压力下增加。PDGF-AA的增加对应于伤口的激活的成纤维细胞、细胞外基质沉积和激活的血管化的增加。此外,这样的PDGF-AA的增加在慢性不愈合的伤口中没有发现(Principles of Tissue Engineering,R.Lanza等人(eds.),pp.133-141(R.G.Landes Co.Texas1997)。具有诱导血管生成和伤口愈合能力的其他生长因子包括VEGF、KGF和基本的FGF。
在一般情况下,认为通过直接添加生长因子来提高其供应在治疗伤口和皮肤老化中是亟须。类似地延缓老化过程的合成肽,也可加入药妆制品。事实上,在一些情况下,合成的肽和生长因子可被加入到培养基中,以刺激细胞来加工生成特定的分泌蛋白。因此,条件培养基中除了由细胞合成和分泌到条件培养基的生长因子外可包括一些尚未被细胞代谢的合成的生长因子。
细胞培养
预调理适应的细胞培养基中可以是充分满足培养细胞的营养所需的任何细胞培养基。细胞培养基的例子包括,但不限Dulbecco’s改性Eagle’s培养基(DMEM)、Ham’s F12、RPMI1640,Iscove’s、McCoy’s和对于领域中的技术人员显而易见的其他培养基的配方制剂,其包括在Methods For Preparation of Media,Supplements and SubstrateFor Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss,New York(1984)和Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley&Sons Ltd.,Chichester,England1996中发现的那些,上述两者都通过引用整体合并入本文。在一个实施方案中,不含酚红的DMEM被用作细胞培养基。所述培养基可补充支持所需的细胞或组织培养的必要的任何组分。在相关方面中,培养基中补充有抗生素-抗真菌剂和L-谷氨酰胺。在一个实施方案中,抗生素-抗真菌剂和L-谷氨酰胺各占培养基的1%,抗生素-抗真菌剂包括青霉素、硫酸链霉素、两性霉素B。此外,血清,如牛血清,是白蛋白和球蛋白的一种复杂溶液,如果需要可添加生长促进剂和生长抑制剂。血清应为无病原体的,并且认真的排查支原体、细菌、真菌和病毒污染。并且,血清一般从美国获得,而不是从本土牲畜携带传染试剂的国家获得。激素添加到培养基中可能会是或不是所期望的。在一个实施方案中,胎牛血清添加到细胞培养基中。在相关方面,胎牛血清占培养基的约5-20%。
预调理适应的培养基的成分可包括氨基酸(D和/或L-氨基酸)如谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,和缬氨酸及其衍生物;酸溶亚群如硫胺素、抗坏血酸、三价铁化合物、铁化合物、嘌呤、谷胱甘肽和磷酸二氢钠。
附加成分包括糖、脱氧核糖、核糖、核苷、水溶性维生素、核黄素、盐、痕量金属、脂类、乙酸盐、磷酸盐、HEPES、酚红、丙酮酸盐和缓冲液(参见,例如,Nouricel MD可来自Melbourne Dematology,澳大利亚)。
用在培养基配方制剂中的其他成分包括脂溶性维生素(包括A、D、E和K)类固醇以及其衍生物、胆固醇、脂肪酸和脂类、吐温80、2-巯基乙醇嘧啶,以及各种补充剂包括血清(胎儿、马、小牛等)、蛋白质(胰岛素、转铁蛋白、生长因子、激素等)、抗生素(庆大霉素、青霉素、链霉素、两性霉素B等)、全蛋超滤液、和粘附因子(纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白,韧黏素(tenascins)等)。在一个实施方案中,所用的两性霉素B是Fungizone。
当然,培养基可能会或不会需要补充生长因子、肽、和其他蛋白质(如粘附因子),因为许多细胞构建自己、加工生产出生长和粘附因子及其他产物进入培养基。
预调理适应的培养基中其它成分,如维生素、生长和粘附因子、肽、蛋白质等等,可以由本领域的技术人员根据特定的需要选择。本发明的实施方案可以使用任何适当的细胞类型以实现所需的条件培养基。
基因工程细胞可用于调理适应培养基。这样的细胞可以被修饰,例如,表达所需的一种或多种蛋白质,从而培养基中所表达的一种或多种蛋白质的浓度根据特定的所需应用进行优化。依照本发明的方面,用于调理适应培养基的细胞和组织培养可以工程化来表达可赋予广泛多样功能的目标基因产物,其包括但不限于,在表达蛋白中改进性能类似生理反应、增加对具体应用(如伤口愈合或抑制某些蛋白质如蛋白酶、乳酸等)有用的特定蛋白质的表达。
调理适应所述培养基可以通过间质细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、实质细胞、间充质干细胞(谱系约束的或不约束的前体细胞)、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞,和/或胚胎干细胞。这些细胞可以包括但不限于,骨髓、皮肤、肝、胰腺、肾脏、神经系统组织、肾上腺、粘膜上皮和平滑肌,略举数例。成纤维细胞和成纤维细胞样的细胞以及构成间质的其他细胞和/或元素的来源可能是胎儿或成年,也可能衍生自方便的来源,如皮肤、肝、胰、粘膜、动脉、静脉、脐带和胎盘组织等。这样的组织和/或器官,可以通过适当的活检或尸检获得。事实上,尸体器官可用于大量供应间质细胞和元素。
可以通过分解作为成纤维细胞来源的适当器官或组织很容易地分离成纤维细胞。这可通过使用本领域技术人员已知的技术完成。例如,组织或器官可被机械地分解,和/或用消化酶和/或螯合剂处理,其削弱邻近细胞之间的连接使得组织能够分散成单个细胞的悬浮液中而不伴随明显的细胞破碎。可以通过切碎组织并单独或组合地使用任何多个消化酶来消化切碎的组织来完成酶促解离。这些包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、和/或透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶等。机械破碎也可以通过多种方法完成,其包括但不限于,使用研磨机、搅拌机、筛、均化器、压力小室或超声细胞破碎器(insonators),略举数例。组织分解技术的综述参见Freshney,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,2dEd.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.9,pp.107-126。
一旦组织已经降为单个细胞的悬浮液,该悬浮液可以分馏成亚群,从中可以得到的成纤维细胞和/或其它间质的细胞和/或元素。这个也可以通过使用细胞分离的标准技术完成,包括但不限于,克隆和选择特定的细胞类型、选择性地破坏不需要的细胞(阴性选择)、根据不同细胞凝集性在混合细胞群中分离、冻融过程、混合细胞群中细胞的不同黏合属性、过滤、常规区带离心、离心淘洗(反流离心)、单位重力分离、逆流分布、电泳和荧光激活细胞分选。对于克隆选择和细胞分离技术的综述,参见Freshney,Culture of Animal Cells:AManual of Basic Techniques,2d Ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.11and12,pp.137-168。
成纤维细胞的分离,例如,可如下进行:新鲜的组织样本(例如,人包皮)在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中彻底洗涤并切碎,以去除血清。切碎的组织在如胰蛋白酶的解离酶的新鲜制备溶液中温育1-12小时。这样温育后,悬浮分离的细胞,离心成团,并铺板到培养皿。所有的成纤维细胞会在其他细胞之前附着,因此,适当的间质细胞可以有选择性地分离和生长。然后,分离的成纤维细胞可生长至汇合铺满。在一个方面,活的人类成纤维细胞指定为AQHFF-0在2011年2月14日保藏于美国模式培养物保藏中心(ATCC),10801UniversityBlvd.,Manassas,Va.,具有ATCC保藏号PTA-11681。
在另一个方面,成纤维细胞被SV40大T抗原转化来建立长期永生化的培养。在相关方面,活的转化的人类成纤维细胞指定为AQHFF-SV40在2011年2月14日保藏于美国模式培养物保藏中心(ATCC),10801University Blvd.,Manassas,Va.,具有ATCC保藏号PTA-11680。
按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款和规定进行保藏。本专利一经授权,所述保藏材料的公众可用性的所有限制将被不可撤回地取消。所述细胞将被维持,其期限为,至少三十(30)年,和保管人收到要求提供所述保藏的样品的最近一次请求之后至少五(5)年,和至少超出所述进行保藏的专利的强制执行期,之中的较长者为准。
使用本领域已知的方法可以分离胚胎干细胞和/或构成间质的其他元素。比如,据报道,在人的胚胎干细胞群和分离及使用这些细胞的方法已经报道于Keller等人,Nature Med.,5:151-152(1999),SmithCurr.Biol.8:R802-804(1998);从原始生殖细胞中分离,Shamblatt等人,PNAS95:13726-1373(1998);从胚母细胞中分离,Thomason等人,Science282:1145-1147(1988)。间充质干细胞的分离和培养是本领域已知的。参见Mackay等人,Tissue Eng.4:415-428(1988);Williamet al,Am Surg.65:22-26(1999)。同样,Flax等人,Nature Biotechnol,16:1033-1039(1998);和Frisen等人,Cell.Mol.Life Sci.,54:935-945(1998)中所描述的方法可以分离神经干细胞。
按照本领域任何方式已知的公开实施方案培养细胞,包括在单层和珠子中以及通过任何方式(即,培养皿、滚瓶、连续流动系统等)。在一个方面,在能无菌操作和处理的环境中培养细胞。细胞和组织培养的常规方法受制于需要对培养基的人为监督和控制。这限制了在单一时间内可被培养的细胞和组织的量,因此限制了在单一时间内可获得的调理适应的细胞培养基的体积。出于这个原因,可以允许大规模生长的方式调理适应培养基(产生大规模的条件培养基)。在另一个方面,可通过照射或丝裂霉素-C处理会使细胞停滞在生长阶段,以减少对人为监督的需要。
在一些实施方案中,所培养的细胞可以首先铺板到平皿,然后在细颈瓶中,然后在两升的滚瓶系统。一旦有足够数量的细胞已经长成,细胞传代到二维平面六边形聚苯乙烯的微载体。在一个实施方案中,聚苯乙烯微载体Nunc2D MicroHex载体。在一个方面,带有贴壁细胞的微载体,可能会悬浮在容量10升的生物反应器,其由放置摇臂系统顶部的一次性无菌塑料袋构成。在细胞耗尽前,每个袋子预计将产生培养基长达约3个月。当培养基随后被收集时,可以将其过滤以除去任何可能存在的细胞。所述培养基还可被浓缩或用PBS或dH2O稀释来修改生长因子的浓度。可使用Corning75平方厘米的组织培养瓶。可通过Upstate Labs的使用Luminex技术的Beadlyte的人类细胞因子分析器的检测服务检测批次的生长因子/细胞因子的含量。
还参见"What is preferred method for cell culture?":The WaveBioreactor(System20/50,Wave Biotech,New Jersey),其中可在预先无菌化的单次使用塑料袋中进行细胞培养(0.1-25L容积)。所述袋子可装入培养基、细胞和Nunc微载体,并膨胀形成一个刚性的不透气腔室。然后,可将其放置在一个摇动平台上,并摇动引起波浪。柔和的波浪运动提供培养基的氧化作用和混合伴随最小化的剪切力。
细胞的培养可以在实验室规模上或工业尝试或生产规模进行。可使用市售的产品和技术完成规模放大,例如,Nunc品牌产品,包括NunclonTM A表面跨越整个范围(从小的单孔到细胞工厂40(CF40))。分泌产物的采收和清理可使用常规技术进行。
除了广泛的可获得的表面和表面区域配置,颗粒也可用于在搅拌的悬浮液中支持细胞生长的发酵罐中。二维微载体(例如,来自Nunc的MICROHEXTM)是六边形二维低密度颗粒需要最少的搅拌并且因此细胞受到最小的应力。
大型哺乳动物细胞培养的传统障碍已经得到解决,搅拌式反应器逐渐成为产业技术的选择。使细胞适应悬浮培养、剪切敏感性和供氧的问题已基本解决。但对于许多低容量和特定应用,反应器技术保持多元化,反应器范围从滚瓶到堆积培养板和中空纤维。
一般来说,与原代培养相反,利用细胞系时优选地先对其筛选人和动物的病原体。根据应用,这种筛选可能或多或少是重要的,例如,在伤口愈合或食品添加剂的应用,其中无病原体的细胞是所需的。筛选病原体的方法在本领域中是众所周知的。细胞类型会影响条件培养基的属性。
一些研究人员已探讨了与基底膜成分相关的天然底物的使用。基底膜包括在体内围绕着大多数细胞的糖蛋白和蛋白聚糖的混合物。例如,Reid和Rojkund,1979,In,Methods in Enzymology,Vol.57,CellCulture,Jakoby&Pasten,eds.,New York,Acad.Press,pp.263-278;Vlodaysky等人,1980,Cell19:607-617;Yang等人,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:3401已经将胶原蛋白用于培养肝细胞、上皮细胞和内皮组织中。在漂浮胶原蛋白上(Michalopoulos和Pitot,1975,Fed.Proc.34:826)以及硝酸纤维素膜上(Savage and Bonney,1978,Exp.Cell Res.114:307-315)的细胞生长已经用于试图促进末端分化。
小鼠胚胎成纤维细胞的培养已被用于提高细胞生长,特别是在低密度下。这种效应被认为是部分由于培养基的补充物,但也可能是由于细胞产物对底物的调理。在这些系统中,成纤维细胞饲养层的生长成汇合单层,其使表面适合于其它细胞的附着。例如,已报道在正常胎儿小肠的汇合饲养层上神经胶质瘤的生长(Lindsay,1979,Nature228:80)。
间质细胞可被基因工程改造来调节分泌到培养基中的蛋白质产物,以提高条件培养基中得到的回收产物的浓度。例如,抗炎因子,例如,抗-GM-CSF、抗-TNF、抗-IL-1、抗-IL-2等等。可选地,间质细胞可被基因工程改造来“敲除”促进炎症的天然基因产物的表达,例如,GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2,或“敲除”的MHC的表达以降低排斥反应的风险。用于调理适应培养基的细胞可以被基因改造来改变培养基中的蛋白质的浓度。条件培养基被处理用在如下用途,其包括化妆品添加剂和与用于治疗和/或预防老化、皱纹和伤口愈合的外用配方制剂相关的任何药物应用。在一个实施方案中,公开了用于刺激毛发生长的组合物和方法,其包括刺激头部和睫毛的毛发生长。在一些实施方案中,本发明还涉及组合物,其含有胞外基质蛋白和/或其是衍生自条件培养的基他纯化的蛋白质。
细胞可能被工程改造来表达靶基因产物,其有生物活性的并提供了一种所选的生物学功能,其作为所选生理条件的受体,其增强基因产物的不足的或缺陷的表达,或其提供抗病毒、抗细菌、抗微生物或抗癌活性。按照本发明,靶基因产物可以是肽或蛋白质,如酶、激素、细胞因子、抗原或抗体,调节蛋白(如转录因子或DNA结合蛋白),结构蛋白(细胞表面蛋白),或者目标基因产物可以是核酸(如核糖体或反义分子)。靶基因产物包括但不限于,增强细胞生长的基因产物。例如,遗传改造可以上调内源性蛋白质,引入新的蛋白质或通过表达异源的离子通道或改变内源性离子通道功能来调节离子浓度。例子包括但不局限于表达全身性递送的基因产物的工程改造的组织(例如,分泌的基因产物如包括生长因子、激素、因子VIII、因子Ⅸ、神经递质和脑啡肽的蛋白)。
含有感兴趣的基因的DNA构建体的制备、转化或转染细胞以及选择携带和表达感兴趣的基因的细胞的方法是本领域众所周知的。参见,例如,Maniatis等人,1989,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Ausubel等人,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates&Wiley Interscience,N.Y.;和Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.中所描述的技术。
工程改造细胞通过使用多种载体中的任何,其包括但不限于,整合型病毒载体,例如逆转录病毒载体或腺相关病毒载体;或非整合复制载体,例如乳头瘤病毒载体、HSV载体、SV40载体、腺病毒载体;或复制缺陷型病毒载体。需要瞬时表达时,非整合载体和复制缺陷型载体可能是优选的,因为诱导型或组成型启动子可用于这些系统来控制感兴趣的基因的表达。可选地,整合载体可以用于获得瞬时表达,提供被诱导型启动子控制的感兴趣的基因。将DNA导入细胞的其它方法包括使用的脂质体、脂质体转染、电穿孔、粒子枪、或通过直接的DNA注射。在本发明的一个方面,细胞被含有SV40大T抗原的载体转化来建立永生化细胞。在相关方面,载体为SV40大T(SVLT)抗原的哺乳动物表达载体,其中这样的载体包含位于SV大T抗原的编码序列侧翼的近端SVLT启动子和远端SVLT元件,一个以上噬菌体启动子,一个以上多个克隆位点,一个以上细菌细胞的选择基因,一个以上哺乳动物细胞的选择基因,一个以上用于整合到哺乳动物宿主的位点,或一个以上用于在细菌宿主中质粒传播/复制的位点,或上述的组合。例如,载体可以是pBsSVD2005(AddGene,CambridgeMA)。参见,例如,图1。
细胞优选地用核酸(如DNA)转化或转染,其由一个以上适当的表达控制元件所控制即与其有效关联在一起,如启动子或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸位点、其他以及可选择标记。引入外源DNA后,工程改造的细胞可能被允许生长在富集的培养基中,然后切换到选择性培养基。外源DNA中的选择标记赋予对筛选的抗性并使细胞稳定地将例如在质粒上的外源DNA,整合到他们的染色体上,并生长形成细胞聚集灶,然后可能被克隆并扩大成细胞系。该方法可以有利地用于工程改造细胞系其表达的基因产物到培养基中。
也可以使用任何启动子来驱动插入基因的表达。例如,病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40、乳头瘤病毒,Epstein-Barr病毒、弹性蛋白基因启动子和B-球蛋白。优选地,用于控制感兴趣的基因表达的控制元件应允许基因的可调节的表达,其产物仅在体内需要时合成的。如果需要瞬时表达,组成型启动子优选用在非整合型和/或复制缺陷型载体。可选地,也可以使用诱导型启动子来驱动在必要时插入基因的表达。诱导型启动子可以内置于整合型和/或复制型载体。例如,诱导型启动子包括但不限于,金属硫蛋白和热休克蛋白。
根据一个实施方案的,用于表达感兴趣的外源基因的诱导型启动子是本文所公开的那些调节蛋白的那些天然启动子,其以冷冻保存及后续解冻的结果而被诱导。例如,TGF-β、VGEF或各种已知的热休克蛋白的启动子可用作表达控制元件,即,可有效连接到感兴趣的外源基因上以表达在调理适应细胞培养基的组织构建体中的所需基因产物。
也可以使用多种方法来获得工程改造到细胞中的基因产物的组成型或瞬时表达。例如,可使用Seldon等人,1987,Science236:714-718所描述的反式核(transkaryotic)移植技术。如本文所用“反式核(Transkaryotic)”,表示所植入细胞的细胞核已经通过稳定或瞬时转染添加DNA序列而被改变。在一个方面,细胞可能被基因改造来瞬时地和/或在诱导型的控制下在恢复之后期间表达的这些基因产物,或者为锚定到间质细胞上的嵌合的融合蛋白,例如,为由受体或受体样分子的细胞内和/或跨膜区构成的嵌合分子,作为胞外区的基因产物。
在本发明的其它方面,调理适应细胞培养基的二维组织培养可能包含成纤维细胞、角质细胞、黑色素细胞、间充质干细胞、肝储备细胞,神经干细胞、胰腺干细胞、和/或胚胎干细胞和/或实质细胞和/或在许多类型的组织中发现的实质干细胞,所述组织包括但不限于骨髓、皮肤、肝脏、胰腺、肾、肾上腺和神经系统的组织、以及胃肠道和泌尿生殖道的组织中、和循环系统。参见,美国专利号4,721,096;4,963,489;5,032,508;5,266,480;5,160,490;和5,559,022,其中每个通过引用整体合并到本文。
在其它实施方案中,可将不同类型的细胞分别培养,其中富集了不同细胞类型特异性因子的条件培养基可以通过混合所需比例的被这些不同细胞类型调理的培养基来配制。这些独自的二维培养可以采用任何上述的细胞类型,其包括基因工程改造的细胞和细胞系。
条件培养基
Naughton等人,在美国专利号6,372,494(通过引用整体并入本文)提出了逆转皮肤老化的影响并消除面部皱纹的新方法。申请人现在Naughton方法上改善通过将关键的结构蛋白和相关生长因子直接递送到皮肤来重新建立新生皮肤的天然环境。这可以通过将一种以上细胞类型而来的生长因子富集的条件培养基与配制的药妆品制备物(例如,霜、药膏、凝胶、乳液、喷雾、血清等等)相组合来实现,所述细胞在高度控制的单层(二维)培养条件下独立生长。除了所述条件培养基,药妆制品优选地包括一种以上的各种其它有益的活性和惰性成分,其具有功效而在所述领域被使用。
在一个实施方案中,从单一细胞类型而来的同质的生长因子富集的条件培养基被用于护肤霜配方制剂。在其他的变化中,混合从不同细胞类型来的条件培养基以提供最佳的生长因子和分泌的结构蛋白成分。
在一些实施方案中,富含生长因子的条件培养基可以在将其与用于各种不同的局部应用的各种配方制剂进行组合之前进行稀释,浓缩和/或保藏,所述配方制剂如面部精华素、眼霜、皮肤修复霜、自晒黑乳液等。可通过本领域已知的任何常规的方法进行浓缩,包括例如,冷冻干燥、真空干燥、蒸发等。此外,特定的生长因子可通过亲和层析或蛋白质/肽纯化的其它常规方法进行浓缩。稀释的方法可包括添加去离子水。保存方法可以包括尤其是,冷冻干燥、喷雾干燥、泡沫干燥等。在一个实施方案中,培养基用7微米的过滤器进行过滤,然后向培养基加入防腐剂和其它成分和/或补充剂,并将培养基保存在冰箱中。另外,条件培养基可进行进一步的处理,例如,亲和层析、差异浓缩或去除特定培养基成分,其详述如下。
移取细胞条件培养液之后,可能需要进一步处理所得到的上清液。这样的处理可以包括,但并不限于,离心、产物的分离和纯化、培养基稀释或培养基的浓缩,其通过水通量过滤装置或使用Cell&TissueCulture:Laboratory Procedures,supra,pp29D:0.1-29D:0.4所描述的方法过滤(defiltration好像错误)。
条件培养基可以进一步加工为了产品的分离和纯化来去除例如不需要的蛋白酶。为了保持最佳的生物活性用于产物的分离和纯化的方法,对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。例如,想要纯化生长因子、调节因子、肽激素、抗体等。这些方法包括,但不限于,条件培养基的凝胶层析(使用如Sephadex基质)、离子交换、使用如交联的琼脂糖的不溶性基质的金属螯合亲和层析、HPLC纯化和疏水性相互作用层析。在Cell&Tissue Culture;Laboratory Procedures,supra.中更详细地描述了这些技术。当然,这取决于条件培养基和/或其衍生产品的所需应用,必须采取适当的措施以保持无菌。可选地,灭菌可能是必要的并可以通过本领域的普通技术人员已知的方法实现,比方说例如,加热和/或注意保存所需的生物活性的过滤除菌。
在一个实施方案中,培养基被过滤或离心以防止包含细胞。如果生长因子的浓度过高,可接着进行稀释,例如,用PBS或去离子水。可选地,如果生长因子水平不是足够高,可浓缩条件培养基。稀释的或浓缩的培养基可接着与霜/凝胶配方制剂组合。
正如前面所提到的,所述条件培养基包含了大量的可被浓缩的产品。例如,人的皮肤成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白的前体,这些前体的一小部分整合到细胞外基质。这种整合需要去除末端肽(N-和C-肽),其显着降低了胶原分子的溶解度(所分泌的胶原蛋白的其余部分保持在溶解状态是由于缺乏蛋白质水解)。一般来说,水溶性胶原蛋白可在中性pH条件下在高盐浓度下获得。参见Kielty,C.M.,I.Hopkinson,等人(1993),Collagen:The Collagen Family:Structure,Assembly,和Organization in the Extracellular Matrix,ConnectiveTissue and Its Heritable Disorders:molecular,genetic and medicalaspects.P.M.Royce and B.Steinmann.New York,Wiley-Liss,Inc.:103-149)。
应当理解,下列方案是通过举例的方式提供并可使用相关领域的技术人员已知的方法进行修改:为了纯化的胶原蛋白,将成纤维细胞调理适应的240毫升培养基加入到240毫升5M氯化钠(培养基相对盐1:1比例)并在4℃下沉淀16小时。4000xg离心该悬浮液约20分钟。弃上清。用10ml的50mM Tris-HCl(pH为7.5)和2.4M氯化钠的溶液洗涤沉淀。4000xg离心20分钟并弃上清。将沉淀重悬于10ml的0.5M乙酸。要去除前肽,加0.1ml的胃蛋白酶(100mg/ml)(SigmaChemical,St.Louis,Mo.)并在4℃消化16小时(这样去除前肽,但留下完好的三重螺旋)。4000xg离心该悬浮液20分钟。回收上清液并弃沉淀。加入2.1毫升5M的NaCl和0.5M乙酸,至终体积为15毫升(最终NaCl浓度为0.7M)。在4℃下沉淀约16小时。4000xg离心悬浮液20分钟并弃上清。沉淀溶解于0.5ml的0.5M乙酸溶液中。胶原蛋白的纯度应该是至少90%,并且可以由本领域已知的标准方法例如SDS-PAGE电泳分析。
条件培养基组合物可以包括任何已知的定义的或未定义的培养基,并可以使用任何真核细胞类型调理适应。可以通过间质细胞、角质细胞、黑色素细胞、实质细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞来调理适应培养基。细胞类型会影响条件培养基的属性。例如,用星形胶质细胞和神经元细胞调理适应的培养基,将加工合成一定特征的代谢物和蛋白质从而这种条件培养基优选地用于一定神经修复的应用。细胞培养还可以与实质细胞进行培养,例如皮肤、骨、肝、神经、胰腺等的细胞,其导致在条件培养基中含有该组织类型特征性的胞外蛋白和其他代谢物。因此,依照本发明的一个实施方案,被不同类型细胞所调理的培养基可以按不同比例混合,以提供一种制剂其适于输送细胞或组织特异性条件特征的组合。例如,在护肤霜的一个实施方案中,来自成纤维细胞培养的条件培养基(富含用于保持健康皮肤的微环境的肽生长因子和细胞外蛋白质)可以与一定量的来自角质细胞培养的条件培养基(富含具有角蛋白形成表皮组织特征的胞外蛋白和其他代谢物)。事实上,在一些实施方案中,来自代表各种组织的细胞培养的条件培养基可被配制用于解决特定的药妆品应用(例如,与年龄有关的结缔组织和弹性基质的衰减、斑点状色素沉着和面部肌肉紧张度)。
此外,每种细胞类型也可以如上详述的进行基因改造。基因改造可用来改变培养基中一种以上成分的浓度,比方说例如,上调蛋白质、引入新的蛋白质、或调节离子浓度。而且,包括异质的原代细胞培养的细胞和/或细胞系可被克隆、突变,和/或筛选所需的表型、基因型、对培养条件的响应(例如,温度、pH、药学试剂等)、蛋白质的分泌特性等。
商业应用
在特定实施方案中,富含生长因子的条件培养基可以外用配方制剂的形式使用(下文详述),如霜、乳液、精华素、或水凝胶,以减少或消除皱纹、眉间纹、疤痕以及修复其他皮肤状况。在其它实施方案中,包含富含生长因子的条件培养基的注射配方制剂可以使用在化妆品应用,类似于的使用。事实上,富含生长因子的条件培养基可以与其他的注射剂组合使用,以提供对皮肤老化的增强的治疗。在其它实施方案中,也可将条件培养基添加到眼影、水粉饼化妆品、压块或其它化妆品。在其它优选的实施方案中,本发明的组合物可以配制用于刺激头部和睫毛的毛发生长的外部应用。
在其它实施方案中,富含生长因子的条件培养基可被用作食品添加剂和膳食补充剂。优选地,条件培养基含有各种营养成分,包括必需氨基酸、维生素和矿物质,其在暴露于细胞之前存在于新鲜的培养基中,并保持以显著的和有利的水平存在。本发明的条件培养基可以是被浓缩和/或冷冻干燥的,例如,可以以用于消化的胶囊剂或片剂的形式作为膳食补充剂施用。另外,所述组合物也可以液体或粉末的形式直接加入到食物以提高其营养成分。在一些实施方案中,条件培养基的配方制剂可以补充以常规的营养补充剂,例如维生素、矿物质、氨基酸、多糖、抗氧化剂、抗生素等。
在本发明的又一实施方案中,富含生长因子的条件培养基可用于补充细胞培养基——用于培养中的其他细胞的生长。本发明的条件培养基包含有益于促进细胞附着和生长的因子。而且,细胞培养基也可以通过基因工程改造的细胞来调理,并且所述细胞可能包含例如增加的纤连蛋白或胶原蛋白的浓度其有利于促进细胞附着到支架或培养表面。
在本发明的一个另外的实施方案中,富含生长因子的条件培养基可用于药物应用,例如,作为具有药物效用的特定生长因子或其他蛋白的来源。如上所讨论,感兴趣的特定因子可以通过常规方法差异浓缩和/或纯化,如亲和层析。同样地,本发明所述条件培养基可有益于各种药物应用。
在另一个实施例中,本发明所述条件培养基可用于伤口和/或烧伤愈合。事实上,受伤的、阳光损伤的、烧伤和老化的皮肤可能具有有多个共同的病理特征。因此,富含生长因子的条件培养基在伤口愈合中的应用的下列描述,也可适用于阳光损伤、烧伤和老化的皮肤。富含生长因子的条件培养基的用途的例子包括,但不限于,将条件培养基应用到绷带(粘性的或非粘性的)的纱布上以及在外部应用中使用以促进和/或加速伤口愈合。条件培养基可以进行加工以浓缩或减少一个或多个成分以增强伤口愈合。该组合物可被冻干/冷冻干燥,并作为伤填料添加或添加到现有的伤口填充组合物中以加速伤口愈合。可选地,培养基可以被加入到水凝胶组合物中并作为用于外部伤口处理和防粘连应用的膜来使用。富含生长因子的条件培养基可由表达具有改进的伤口愈合属性的基因产物的细胞来产生,即,表达具有抗疤痕属性的基因产物的工程改造的细胞。
当皮肤组织遭到物理上的损害,展现大量生物活性的多肽生长因子被释放到受损害区域以促进愈合。伤口愈合是一个复杂的过程,其涉及到多个阶段并是能够以受控的方式来将缺口封闭到外皮以形成功能完善的组织。这个过程起始于止血作用随后是涉及嗜中性粒细胞和巨噬细胞的炎症阶段。这个过程接着为肉芽组织的发展和再上皮化来闭合伤口。随后,瘢痕组织形成并且在随后数月中改造成近似于原来的解剖结构。理想的情况下,疤痕组织最小化,从而可形成健康的组织,在组织结构上和生理上类似于原来的正常组织的功能完善的组织。愈合过程中的每个阶段受控于通过调节蛋白(如细胞因子、生长因子、炎症介质)以及细胞接触机制的细胞相互作用。例如,炎症介质如IL-6、IL-8和G-CSF,诱导淋巴细胞分化和急性期蛋白,以及中性粒细胞浸润、成熟和活化、在伤口愈合的炎症阶段重要的过程。在伤口愈合过程中所涉及的调节蛋白的其它实例为VEGF其在炎症和肉芽组织形成过程中诱导血管生成,骨形态发生蛋白(BMPs)其诱导骨形成,角质细胞生长因子(KGF)其激活角质细胞,以及TGF-β其诱导细胞外基质的沉积。
在慢性伤口中,愈合过程在止血之后和再上皮化之前在一个点被中断,并显然是无法重新启动。在伤口基底处看到的大多数炎症与感染相关,但炎症引起富含蛋白酶的环境其降解调节蛋白从而干扰伤口愈合过程。类似地,在一些病况,如糖尿病,伤口愈合所需要的一些调节蛋白供应不足。例如,已发现在小鼠模型中的非胰岛素依赖型糖尿病(例如,的db/db小鼠)VEGF和PDGF的分泌和PDGF受体的表达与正常小鼠的伤口中的水平相比全部被抑制。
因此,本发明的富含生长因子的条件培养基包含许多调节蛋白,其被认为在伤口愈合是重要的并在体内模型中的伤口愈合中已显示被耗尽。同样,条件培养基中也可能是对治疗其他类型的组织损伤有用,如外伤或先天性的,其中组织缺陷或损伤的维修和/或再生是所需的,因为许多这种生长因子可能存在于调理过的细胞培养基中,取决于用于调理培养基的细胞类型,所述生长因子包括,例如FGFs、PDGFs、EGFs、BMPs、VEGF、KGF和TGFs。应激蛋白如GR78和MSP90,诱导如TGF-β的生长因子的局部分泌。TGF-β,包括TGFβ-l、TGFβ-2、TGFβ-3、TGFβ-4和TGFβ-5(并可用于培养基中来上调条件培养基中的这些TGFs的水平),调节生长和分化,并加速伤口愈合(Noda等人1989,Endocrin.124:2991-2995;Goey et al.1989,J.Immunol.143:877-980,Mutoe et al.1987,Science237:1313-1335)。促细胞分裂剂如PDGF,增加组织形式中细胞化和肉芽组织的速率(Kohler等人1974,Exp.Cell.Res.87:297-301)。正如前面提到的,细胞优选地为人的以尽量减少免疫原性的问题。
在一个方面,生长因子和条件培养基的组合包括TGF Beta-1、TGF Beta-2、TGF Beta-3、IL-3、IL-6、IL-7和IL-8,其中条件培养基以至少为20%(wt%)浓度存在。在相关方面,所述组合包括约1-3ng/mL的TGF Beta-1、约100-160pg/ml的TGF Beta-2、约50-100pg/ml的TGF Beta-3、约60pg/ml的IL-3、约11pg/ml的IL-6、约50pg/ml的IL-7、约4-10pg/ml的IL-8,并且其中条件培养基以约30-42%(wt%)浓度存在。
由于条件培养基包含如此大量的伤口愈合因子,条件培养基可有利地使用到治疗伤口和烧伤愈合,包括皮肤伤口、断骨、胃溃疡、胰腺、肝、肾、脾、血液血管损伤和其他内部伤口。而且,在条件培养基也可以与其他活性剂如抗生素和止痛药进行组合。实施方案包括以外用的药膏或软膏的条件培养基的配方制剂。
可选地,如上所讨论,条件培养基可与绷带(粘性的或非粘性的)结合以促进和/或加速伤口愈合。条件培养基可在任何状态下使用,即,液体或固体,冷冻干燥或干燥成粉末,作为用于外部伤口处理和防粘连应用的膜,或作为一种可注射的,参见PCT WO96/39101,通过引用整体并入本文。
可选地,调理的细胞培养基中可与聚合或交联的水凝胶一起配制,如在美国专利号5,709,854;5,516,532;5,654,381;以及WO98/52543所描述的,上述每一个都通过引用整体并入本文。可用于形成水凝胶的材料的实例包括改性的藻酸盐。藻酸盐是从海藻中分离的碳水化合物聚合物,其可通过暴露于二价阳离子如钙而被交联形成水凝胶,例如在WO94125080中所述,其公开的内容通过引用并入本文。海藻酸是在二价阳离子的存在下离子交联的,在水中,在室温下,形成水凝胶基质。如本文所用,术语“改性的藻酸盐”是指具有被修饰的水凝胶性能的化学修饰的藻酸盐。
此外,通过暴露于一价阳离子形成凝胶的多糖,包括细菌多糖如结冷胶和植物多糖如角叉菜胶,所述多糖可使用类似于上述那些用于交联藻酸盐的方法进行交联形成水凝胶。
改性透明质酸衍生物也可能是有用的。如本文所用,术语“透明质酸”是指天然和化学修饰的透明质酸。改性透明质酸可以被设计并用预先选定的化学修饰来合成以调节交联和生物降解的速率和程度。
共价键可交联的水凝胶前体也是有用的。例如,水溶性多胺如壳聚糖,可以与水溶性二异硫氰酸酯(diisothiocyanate)如聚乙二醇二异硫氰酸酯交联。
可选地,可使用的聚合物包括取代基,其在与自由基引发剂接触时通过自由基反应被交联,如Naughton等人在US专利号6,372,494中公开的那些,其通过引用整体并入本文。
在又一实施方案中,条件培养液,和/或特定的条件培养液的浓缩物,例如,产生入培养基的细胞外基质蛋白,可用于涂覆手术缝线。自然分泌的细胞外基质可向条件培养基提供类型I和III型胶原、纤连蛋白,纤连蛋白(terascin)、粘多糖、多功能蛋白聚糖,核心蛋白聚糖和各种其他分泌的人类真皮基质的蛋白质,以及在上面所讨论的各种生长因子,其参与协调编排从细胞外基质和细胞构建模块组装真皮组织。同样地,调理后的细胞培养基或来自条件培养基的细胞外基质蛋白可能被用于涂覆传统的植入装置,包括人工血管,在手术治疗方法中在体内纠正缺陷,从而产生高级的植入装置。植入物应是由用于更换或替代有缺陷功能的生物相容的惰性材料制成,并是不可生物降解的或可生物降解的。通过用含有这些胞外蛋白和生长因子的培养基涂覆植入装置,植入物招引适当的细胞附着导致产生在植入部位的高级组织。因此,涂有调理后细胞培养基或来自培养基的蛋白质的手术缝合线、绷带和植入物,提高细胞(如白细胞和成纤维细胞)招募到受伤部位,并诱导细胞增殖和分化,导致改善伤口愈合。
在又一实施方案中,培养基可与作为媒介物的药学接受的载体进行配制用于内部施用。培养基也可以被进一步处理以浓缩或减少一个或多个包含在培养基中的因子或成分,例如,为了如本文所述任何给定的应用,使用免疫亲和层析富集生长因子,或相反地,除去不太想要的成分。
当然,在专门组织处的伤口可能需要专门组织调理过的培养基。例如,神经组织受伤可能需要包含在神经细胞培养调理过的培养基中的蛋白质。可衍生特定的产物,或可选地,可通过免疫亲和层析富集条件培养基或从特定培养基中提高所需蛋白质的表达比方说,例如,NGF。NGF控制的特性包括,但不限于,胆碱能神经递质的功能(乙酰胆碱酯酶(AChE)和乙酰胆碱合成酶(ChAT))、神经元细胞的大小、以及II型NGF受体的表达;NGF分泌到被神经胶质和其他神经细胞所调理的条件培养基,然后其可以使用在用于神经愈合的组合物中。
内源性NGF的缺乏可能会加剧特定的人神经退行性疾病,存在着成人CNS神经元再生的明显的无能为力。特别是,神经损伤伴随着远离损伤处的神经纤维的退化,轴突与细胞体的隔离的结果。在中枢神经系统中,在受伤的部位没有显着的生长,通常导致受损的神经元的死亡。NGF在成人中枢神经系统的胆碱能神经元在细胞体水平(如隔膜)、中介组织空间(例如,神经桥)和神经再支配区域(例如,海马结构)的再生能力中起着至关重要的作用。另外,NGF可有利于改善认知缺陷。例如神经胶质细胞调理过的培养基,可以提供外源性NGF和其他神经生长因子,从而新的轴突可以从受伤神经的切口端长出(例如,形成生长锥)延伸到原来的连接位点。
而且,大脑和脊髓的损伤往往伴随着对相随的轴索退化的神经胶质反应,导致疤痕组织。这种疤痕组织最初被认为是神经生长的一种物理屏障,然而,更大的意义在于神经细胞的外环境中亲神经元因子的存在或不存在。星形细胞似乎是能够合成层粘连蛋白来响应损伤(层粘连蛋白也可以在条件培养基中发现)。胶原蛋白和纤连蛋白,特别是层粘连蛋白,已被发现促进从在体外培养的神经细胞或神经元外植体的轴突的生长。这些胞外基质蛋白似乎提供一种粘着基底,其有利于生长锥的向前移动和轴突的延伸。因此,可能会存在的亲神经元的因子和支持基质的存在可能是成功的神经再生所需的,因为再生似乎要求:神经元的细胞体能够安装适当的生物合成的反应;损伤部位周围的环境能够支撑轴突的延伸和最终的功能性的重新连接。如星形细胞和神经胶质细胞的神经细胞调理过的培养基包含的在脑和脊髓损伤中的神经再生所必需的亲神经元的生长因子和细胞外基质蛋白。
同样地,治疗皮肤、骨、肝、胰腺、软骨和其他专门组织可用其各自专门细胞类型调理过的培养基进行处理,其导致产生含有用于治疗各自组织类型的伤口的该组织类型的特征性细胞外蛋白质和其它代谢物的条件培养基。
调理过的细胞培养基也可加入到如下装置中,其用于牙周手术以便促进均匀的组织修复,提供生物降解性的隐形眼镜、角膜盾或骨移植物,提供手术的空隙填充物,促进软组织增加,特别是在皮肤中为了减少皮肤皱纹,以及用作为了控制失禁的尿道括约肌增强物。
在另一个实施方案中,该组合物可冻干/冷冻干燥,并作为伤口填料添加(例如,填补为了移植的发栓留下的孔)或添加到现有的伤口填充组合物中以促进伤口愈合。在另一个实施方案中,用基因工程改造细胞调理过的培养基来增加在培养基中伤口愈合蛋白质的浓度。例如,细胞可能被工程改造来表达如上面列出的任何生长因子的基因产物。
在另一个实施方案中,富含生长因子的条件培养基可被配制在为了刺激头部和睫毛的毛发生长的外用治疗中。例如,可以使用人毛乳头细胞调理培养基。毛乳头细胞是一种间充质干细胞,其在头发的形成、生长和恢复中起着举足轻重的作用(Matsuzaki等人,WoundRepair Regen,6:524-530(1998))。条件培养基优选地被浓缩作并为一种外用配方制剂应用。条件培养基的组合物可以使用有利于化合物穿透到皮肤的试剂为了外部应用进行配制,所述试剂例如,DMSO等,或者其他的亲脂性载体,其中包括使用脂质体,并作为外部应用使用来刺激头发生长。可选地或者另外地,也可以使用超声波提高条件培养基组合物穿透或渗透角质层。预期所述组合物在外部使用时通过提供生长因子及其他增加上皮细胞迁移到毛囊的因子来促进或恢复头发生长。除了在条件培养基中发现的生长因子,可以使用其他活性剂,如米诺地尔。
脱发的发病机制中,存在毛发生长中期(毛囊在生长和休息的阶段之间的过渡阶段)和静止期(休息期)的血液供应减少。衍生自调理过的细胞培养基中的生物活性分子,可使用本领域已知的检测法针对用于这些阶段进行确定和优化,所述检测法包括用于男性图型性秃顶的藏猕猴模型,参见例如,Brigham,P.a.,A.Cappas,和H.Uno,TheStumptailed Macaque as a Model for Androgenetic Alopecia Effect;ofTopical Minoxidil Analyzed by Use of the Folliculogram,ClinDermatol,1988,6(4):p.177-87;Diani,A.R.和C.J.Mills,Immunocytochemical Localization of Androgen Receptors in theScalp of the Stumptail Macaque Monley,a Model of AndrogeneticAlopecia,J.Invest Dermatol,1994,102(4):p.511-4;Holland,J.M.,Animal Models of Alopecia,Clin Dermatol,1988,6(4):p.159-162;Pan,H.J.,等人,Evaluation of RU58841as an Anti-Androgen inProstate PC3Cells and a Topical Anti-Alopecia Agent in the BaldScalp of Stumptailed Macaques,Endocrine,1998,9(1):p.39-43;Rittmaster,R.S.,等人,The Effects ofN,N-diethyl-4-methyl-3-oxo-4-aza-5alpha-androstane-17beta-carboxamide,a5alpha-reductase Inhibitor and Antiandrogen,on theDevelopment of Baldness in the Stumptail Macaque,J.ClinEndocrinol Metab,1987,65(1):p.188-93(其中每个通过引用将其全部纳入)。其他模型包括测量从秃的和多毛的区域培养的毛囊的毛囊增殖的差异,新生大鼠模型以及斑秃的大鼠模型中,参见Neste,D.V.,The Growth of Human hair in Nude Mice,Dermatol Clin.,1996,14(4):p.609-17;McElwee,K.J.,E.M.Spiers,和R.F.Oliver,In VivoDepletion of CD8+T Cells Restores Hair Growth in the DEBR Modelfor Alopecia Areata,Br J Dermatol,1996,135(2):p.211-7;Hussein,A.M.,Protection Against Cytosine Arabinowide-Induced Alopecia byMinoxidil in a Rat Animal Model,Int J Dermatol,1995,34(7):p.470-3;Oliver,R.F.,等人,The DEBR Rat Model for Alopecia Areata,J Invest Dermatol,1991,96(5):p.978;Michie,H.J.,等人,Immunobiological Studies on the Alopecic(DEBER)Rat,Br JDermatol,1990,123(5):p.557-67(其中每个通过引用将其全部纳入)。
其他活性试剂
而且,可加入的产品包括,但不限于,抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、类固醇、止痛药、抗肿瘤药物、试验药物或任何会导致与条件培养基中的因子一起的补充的或协同的组合的化合物。
药学试剂也可纳入所述条件培养基配方制剂的优选实施方案中,包括例如,维生素或矿物质的添加。例如,那些通过涉及氨基酸、核酸(DNA,RNA)、蛋白质或肽(例如,RGD肽)、碳水化合物部分、多糖、脂质体或其他细胞成分或细胞器(例如受体和配体)的相互作用或机制来直接或间接行使功能。
下列试剂被认为在细胞外或在特定的膜受体位点发挥作用。这些包括肾上腺皮质激素和其他离子通道阻断剂、生长因子、抗体、受体阻断剂、融合毒素、细胞外基质蛋白、肽、或其它生物分子(例如激素、脂类、基质金属蛋白酶等)、辐射、抗炎剂(包括细胞因子如白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)、γ干扰素(干扰素-γ)和调节炎症反应的曲尼司特)。生长因子受体激动剂也在可能的活性剂的范畴内,其可与条件培养基的配方制剂混合。
其他类群的试剂在细胞膜上发挥其功效。其包括参与的信号转导级联反应的那些,如偶联蛋白、膜相联和细胞质的蛋白激酶及效应器、酪氨酸激酶、生长因子受体和粘附分子(选择素和整合素)。
一些化合物是在细胞质中有活性的,包括例如,肝素、核酶、细胞毒素(cytoxins)、反义寡核苷酸和表达载体。其他的治疗方法是指向细胞核的。这些包括基因整合、原癌基因、特别是那些对细胞分裂重要的、核蛋白、细胞周期基因和转录因子。
特定的生长因子,可以按照本发明实施方案的使用白介素和干扰素,包括但不限于:
·表皮生长因子(EGF):促进间充质、神经胶质和上皮细胞的增殖;
·血小板衍生生长因子(PDGF):促进结缔组织,神经胶质和平滑肌细胞的增殖;和
·成纤维细胞生长因子(FGFs):促进多种细胞增殖;抑制一些干细胞;诱导在早期胚胎中胚层形成;
·转化生长因子-β(TGFs-β):
·转化生长因子-α(TGF-α):可能对正常的伤口愈合是重要的;
·神经生长因子(NGF):促进神经轴突生长和神经细胞的存活;
·促红细胞生成素(Epo):促进红细胞的增殖和分化;
·胰岛素样生长因子-I(IGF-I):促进多种类型细胞的增殖;以及
·胰岛素样生长因子-II(IGF-II):促进多种细胞类型的增殖,主要来胚胎来源的。
在一些实施方案中,白细胞介素可用于促进局部的免疫功能和/或调节炎症反应。一些白介素和其主要活性包括但不限于,下列:
·IL1-α和β:APCs和T细胞的共刺激,炎症;
·IL-2:B细胞和活化T细胞的增殖,NK功能;
·IL-3:造血前体细胞的生长;
·IL-4:B细胞增殖,嗜酸性粒细胞和肥大细胞的生长和功能,B细胞上IgE和MHC II类分子的表达,抑制单核因子的产生;
·IL-5:嗜酸性粒细胞的生长和功能;
·IL-6:急性期反应,B细胞增殖,血栓形成,与T细胞上的M-1和TNF的协同;
·IL-7:T和B淋巴细胞生成;
·IL-8:中性粒细胞和T细胞的化学趋化物;
·IL-9:造血的和胸腺生成的作用;
·IL-10:抑制细胞因子的产生,促进B细胞增殖和抗体生产,抑制细胞免疫,肥大细胞的生长;
·IL-11:协调的造血的和血小板生成的作用;
·IL-12:NK细胞的增殖,INF-γ的产生,促进细胞介导的免疫功能;以及
·IL-13:IL-4类似活性。
在一些实施方案中,干扰素可用于提高局部的免疫功能和/或调节炎症反应。一些干扰素和其主要活性包括但不限于,下列:
·INF-α和-β:抗病毒作用,诱导所有体细胞上的Ⅰ类MHC,NK细
胞和巨噬细胞的活化;
·INF-γ:诱导所有体细胞上的Ⅰ类MHC,诱导在APCs和体细胞上的II类MHC,激活巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞,促进细胞介导的免疫力,抗病毒效果;
·肿瘤坏死因子-α(TNF-α):诱导其他的自分泌生长因子的表达,增加细胞对生长因子的应答,并诱导导致增殖的信号传导通路;
·肿瘤坏死因子-β(TNF-β):(也称为淋巴细胞毒素)杀死多种不同类型细胞的能力,以及在其他细胞上诱导终末分化的能力。一个显着的对TNF-β的非增殖应答是呈现在血管内皮细胞的表面上脂蛋白脂酶的抑制;
·集落刺激因子(CSFs):刺激在成人的骨髓中特定的多能干细胞的增殖。粒细胞-、巨噬细胞-CSFs。Epo和IL-3也被认为是CSF。
市售的用作治疗老化皮肤最新的肽之一是Lys-Thr-Thr-Lys-Ser(SEQ ID NO:1),也被称为KTTKS(SEQ ID NO:1)。在田纳西州大学进行的美国国立卫生研究院资助的研究,证实了这五肽可以促进培养的成纤维细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原以及纤连蛋白的合成(J.Biol.Chem.268[14]:9941-44,1993)。为了提高这种亲水性肽的穿透力,添加上棕榈酰——16个碳的脂肪酸部分。
目前,含有Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)的几种产品,包括REGENERIST、STRIVECTIN-SD、STRIXADERM-MD,被专利保护、制造和用于商业用途销售。
Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2),商业上称为MATRIXYL,已显示出穿透人的皮肤并保持在真皮中;根据未发表的报告。
在一项双盲的媒介受控制的Sederma公司赞助的对49名妇女的研究中,在巴黎在2002年的世界皮肤科大会上海报中展示,Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)(3ppm)每日两次在脸部和颈部应用4个月之后,减少皮肤粗糙度的13%,减少皱纹量的36%,并减少皱纹深度的27%。在2个月和4个月对六名妇女进行的皮肤活检显示弹性蛋白纤维的密度和厚度增加,而改善了在真皮表皮交界处的IV型胶原。
由宝洁公司(Procter&Gamble)赞助的临床研究支持Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)对光老化皮肤的好处。
在旧金山的2003年美国科学院皮肤学年会上的海报展示的一项研究中,具有中度至严重的光损伤的92名妇女参加了面部分开、随机的、双盲、媒介受控的研究。受试者接受12周的每天两次应用面部保湿霜的治疗,所述保湿霜含有3ppm的Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)。Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)显著改善面部细纹和皱纹,通过数码照片的图像分析和专家评分作为衡量,并没有产生负面影响皮肤的屏障,其通过经皮水分丢失来衡量。
进行了另外的研究比较了在相同媒介中Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)(3ppm)相对于视黄醇(700ppm)的作用。在巴黎的2002年世界皮肤科大会展示的一项研究中,16名妇女在面部一侧的鱼尾纹上使用Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)并在另一侧用视黄醇,持续4个月。
在2个月结束时,Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)比视黄醇提供了更大的效益;在4个月时,两种试剂表现相似并都减少了高达50%的皱纹。研究者指出,Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)提供这些益处但没有经常与视黄醇使用相关联的刺激作用。
因此,在本发明的一个实施方案中,护肤霜包括富含生长因子的条件培养基和任何形式的KTTKS(SEQ ID NO:1)的使用在一起的组合,其包括Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)。
在西班牙巴塞罗那的Lipotec SA开发和合成这种肽,并在美国由Centerchem公司分销。阿基瑞林在一些药妆品中被发现,包括AVOTOX,DDF的Wrinkle Relax(HDS化妆品公司)以及INHIBIT(Natura Bisse)。大多数产品含有5%-10%的阿基瑞林;INHIBIT可能具有最高的浓度在20%并且0.5盎司花费$135。
已经进行了广泛的体外研究来阐明阿基瑞林的作用机制(J.Biol.Chem.272[5]:2634-39,1997)。其中一项研究表明,肽行使作用通过防止形成可溶的N-乙基马来酰亚胺-敏感融合附件蛋白(SNAP)受体复合物,从而抑制囊泡对接。儿茶酚胺的释放,包括肾上腺素和去甲肾上腺素,被阿瑞吉林在体外抑制。研究者建议,该合成的肽可具有可行的医疗应用,因为它模仿在体外梭菌神经毒素的作用。
针对外部应用阿瑞吉林的功效的临床试验是有限的。5%的阿瑞吉林与油和水的乳剂的开放标签试验,每天使用两次,对10名妇女进行。
眶周皱纹的硅胶副本采用激光扫描共聚焦显微镜分析,并表明了15天的治疗之后17%的改善,30天的治疗之后27%的改善。
虽然阿瑞吉林清楚地表明有趣的体外活性,但是更大、更客观的临床研究来确认其疗效是必要的。在人的皮肤上进行的渗透性研究也将是必要的,因为这种肽必须穿透肌肉来发挥其提议的作用机制。
治疗配方制剂
在使用手术、注射剂、硅胶或其他产品之外或作为其替代选择,条件培养基可以配制用于预防、减少和/或消除皱纹、眉间纹、疤痕和其他与老化相关的皮肤状况。老化的皮肤其特征在于胶原蛋白合成的减少和胶原蛋白分解的增加。一些生长因子刺激胶原蛋白的生产。条件培养基中含有生长因子和炎症介质,比方说,例如,PDGF、IGFs、FGFs、TGFs、EGF、VEGF、HGF、IL-6、G-SCF和KGF,以及细胞外基质蛋白如I型和III型胶原蛋白、纤连蛋白、粘连蛋白(terascin)、粘多糖、多功能蛋白聚糖,核心蛋白聚糖和在修复身体异常和外观缺陷有用的各种其他分泌型人真皮基质蛋白。除了条件培养基,促进胶原蛋白合成的肽例如KTTKS(SEQ ID NO:1)和Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2),阿基瑞林,一种抑制肌肉诱发的皮肤起皱的合成肽,也可以作为其他的活性剂被包括在外用配方制剂中。
在一个实施方案中的调理过的细胞培养基为配制为药妆品面霜、乳液、和/或精华素,用于外部应用,其中具有或不具有额外的生长因子、肽、和/或其他蛋白质和生物活性物质,包括但不限于本文所讨论的那些。
除了上面讨论的其他活性剂,典型的护肤霜配方制剂可包括一个或多个下列常规类型的成分:
·润肤剂,以植物油、矿物油、乳木果油、可可油、矿脂、胆固醇、硅胶或动物油(包括鸸鹋、水貂和羊毛脂)的形式。这些润滑成分软化和光滑皮肤,同时帮助其保持水分。在一些实施方案中,荷荷巴油,角鲨烯和羊毛脂代表列举的润肤剂,因为他们具有与皮脂(皮肤的天然保湿剂)的最大相似性,是最不易导致粉刺(堵塞毛孔),并与皮肤的生物化学最兼容。增稠剂,如甘油三酯、棕榈酸、豆蔻酸和硬脂酸,是蜡质的,但对保湿配方制剂的基底和质地是必需的。
·水结合剂,是使水保持在皮肤中的成分。湿润剂(包括山梨糖醇、乙二醇、丙三醇和PCA钠),其吸引水到皮肤,在设计来治疗/预防由太阳和脱水破损的皮肤的配方制剂中是所需的,但是它们在促进皮肤的水潴留益处较少。
·舒缓剂和抗刺激物,如没药醇、尿囊素、牛蒡、芦荟、甘草根、甘草次酸、绿茶和洋甘菊提取物,可以添加来帮助肌肤处理可能引起刺激的成分。
·维生素和抗氧化剂,包括维生素A、C和E,可用于促进细胞更新、愈合和脱水。
·α-羟基酸(AHAs)和β羟基酸(BHAs)已经显示出清洁毛孔、去除死皮,导致更光滑更湿润的皮肤。AHA配方制剂包括乙醇酸和乳酸,而水果或柠檬酸、甘蔗、或者甚至是酸奶的使用是可以被取代的。一种BHA的成分是水杨酸。然而,高水平的AHAs在特定皮肤类型可感到刺痛。而且,因为AHA增加太阳敏感性,防晒(例如,物理和/或化学防晒剂的添加)对于整合了AHA的配方制剂是所需的。
在一个实施方案中,所配制的护肤霜将治疗有效量的条件培养基(或其浓缩物或提取物)与增稠剂、保湿剂、尿囊素、纯净水和至少一种防腐剂相组合。
在另一个实施方案中,所述增稠剂包括聚乙二醇(PEG)、基于植物的脂肪醇(复数)、和共聚物(复数)的组合。
一些优选的基于植物的脂肪醇包括癸醇,辛基癸醇,月桂醇,月桂基-肉豆蔻醇,肉豆蔻醇,十六烷基硬脂醇及其各种共混物、鲸蜡醇、和硬脂醇。
共聚物可以包括常规使用的药妆品的那些,为本领域技术人员所已知的。
在另一个实施方案中,所述增稠剂包括PEG-150、癸醇和SMDI共聚物。
一些湿润剂包括,但不限于:PCA钠、甘油、丙二醇、山梨糖醇、透明质酸、尿素、和乳酸。
一些防腐剂包括,但不限于:杂环化合物、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯,双咪唑烷基脲、苯氧基乙醇、DMDM乙内酰脲、山梨酸、苯甲醇、甲醛、三氯生和EDTA。
一些杂环类化合物包括,但不限于:甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮、和咖啡因。
在一个实施方案中,配制的霜剂将条件培养基(或其浓缩物或提取物)与PEG-150/癸醇/SMDI共聚物、PCA钠、尿囊素、纯净水、甲基异噻唑啉酮和对羟基苯甲酸甲酯相组合。
在其它实施方案中,条件培养基可配制成以皮肤贴剂、注射剂、水凝胶为形式的药物,并配制成本领域技术人员已知的任何其他适当的配方制剂。
药物配方制剂可通过各种不同途径使用本领域技术人员熟知的标准程序递送给受试者。例如,这些递送可以是位点特定的或一般的外部施用,包括使用透皮印片。此外,它们可被配制作为受控制的缓释媒介发挥功能。
包含在条件培养基中的治疗性产物包括,但不限于,肽、生长因子、酶、激素、细胞因子、抗原、抗体、凝血因子和调节蛋白。治疗性蛋白质包括,但不局限于,炎性介质、血管生成因子,因子VIII、因子IX、促红细胞生成素、α-1抗胰蛋白酶、降钙素、葡糖脑苷脂酶、人生长激素和衍生物、低密度脂蛋白(LDL),促红细胞生成素(EPO)、载脂蛋白E、IL-2受体及其拮抗剂、胰岛素、球蛋白、免疫球蛋白、催化性抗体、白介素、胰岛素样生长因子、超氧化物歧化酶、免疫应答子改性剂、BMPs(骨形态发生蛋白)、甲状旁腺激素和干扰素、神经生长因子、组织纤溶酶原激活剂、和集落刺激因子。当然,培养基可以被进一步处理,以浓缩或减少一个或多个包含在培养基中的因子或成分,例如,对于如本文所述任何给定的应用,使用免疫亲和层析富集一种生长因子,或相反地,去除一种不太想要的组分。
本领域的技术人员通常使用的检测可被用来测试的特定一个或多个因子的活性,从而确保通过收获后处理保持和/或产生可接受水平的生物活性(例如,治疗上有效的活性)。这些治疗性因子的剂量为本领域技术人员熟知,并且可以在药学纲要中发现,如PHYSICIANS DESKREFERENCE,Medical Economics Data Publishers;REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES,Mack Publishing Co.;GOODMAN&GILMAN,THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS,McGraw Hill Publ,THE CHEMOTHERAPYSOURCE BOOK,Williams and Wilkens Publishers。
任一上述生长因子、药物或其他活性剂的治疗有效剂量可常规使用本领域的技术人员熟知的技术来确定。“治疗有效的”剂量是指足以导致所治疗的过程和/或疾病的至少一种症状的改善的化合物的量。
可通过在细胞培养或实验动物中标准的药学流程来确定所述药物的毒性和疗效,例如用于确定LD50(使50%的群体致死的剂量)和ED50(在50%的群体中有疗效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数,它可以表示为LD50/ED50的比例。呈现出大的治疗指数的化合物是优选的。虽然呈现出毒副作用的化合物也可以使用,必须小心设计一种递送系统其将这类化合物靶向受影响的组织位点,以尽量减少对不受影响细胞的潜在损害,从而减少副作用。
从细胞培养检测和动物研究获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。所述化合物的剂量优选地位于一个浓度范围内其包括ED50带很少毒性或没有毒性。剂量在此范围内可能会发生变化,取决于采用的剂型和使用的施用途径。对于本发明的所述方法中使用的任何化合物,可从细胞培养测定初步估计治疗有效剂量。循环血浆浓度范围包括在细胞培养中所确定的IC50(即,实现了对症状的最大抑制的一半的所述试验化合物的浓度)。这样的信息可以用来更准确地确定在人中的有用的剂量。血浆中水平可被测量,例如,通过高效液相层析。
在一些实施方案中,分泌到培养基中的一些生长因子具有如下浓度:
·TGF Beta-1在约0.01-100ng/mL,约0.1-10ng/mL,或约1-3ng/mL.
·TGF Beta-2在约0.1-1000pg/mL,约1-1000pg/mL,或约100-160pg/mL.
·TGF Beta-3在约0.1-1000pg/mL,约1-1000pg/mL,或约50-100pg/mL.
·IL-3在约0.1-1000pg/mL,约1-1000pg/mL,或约60pg/mL.
·IL-6在约0.1-1000ng/mL,约1-100ng/mL,或约11ng/mL.
·IL-7在约0.1-1000pg/mL,约1-100pg/mL,或约~50pg/mL.
·IL-8在约0.1-1000ng/mL,约1-100ng/mL,或约~4-10ng/mL.
在另一个实施方案中,来自黑色素细胞和/或其它类型细胞的富含生长因子的的条件培养基可与来自成纤维细胞的条件培养基相组合。黑色素细胞所分泌的FGF-2的浓度范围通常在约10-10,000pg/mL,约100-1000pg/mL,或约400-450pg/mL。
在一个实施方案中,公开了包括护肤霜、容器、标签和提供应用所述护肤霜的方法的说明书的试剂盒,所述护肤霜包含条件培养基或者其提取物或浓缩物,其来自培养的基本上同质化的包皮衍生的成纤维细胞,其中产生条件培养基是通过在二维培养中将营养培养基与所述细胞温育,在适于促进至少一种生长因子分泌到营养培养基中的条件下,并且其中条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述至少一种生长因子以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。说明书可以是小册、CD、或其他电脑可读的介质。进一步,说明书可提供关于含有可下载内容的网站的信息。
下列的实施例是用来举例说明而不是限制本发明。
实施例
1.人包皮成纤维细胞的分离
I.材料
·100mm无菌组织培养皿
·150mm无菌组织培养皿
·无菌手术刀片
·无菌弯钳
·无菌半弯剪
·50ml离心管
·1、5、10ml移液管
·移液器
·Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DME/高修改)
·胎牛血清(FBS)
·抗生素-抗真菌剂(ABAM)
·L-谷氨酰胺(L-GLU)
·磷酸盐缓冲液(PBS)
·胰蛋白酶-EDTA1X(0.25%胰蛋白酶1mM EDTA-4Na。用2.5g的胰蛋白酶(250)和0.38g的EDTA-4Na在1升无Ca和Mg++的HBSS制备。
转移培养基:
加入到500ml瓶装的DMEM中:
FBS50ml
ABAM5ml
生长培养基(GM):
加入到500ml瓶装的DMEM中:终浓度
FBS50ml10%
ABAM5ml1%
L-glu5ml292μg/ml
II.分离技术
包皮是从新生儿包皮环切术后获得的并由其父母捐赠的。样品在室温下用5ml转移培养基转移到无菌的离心管中。用无菌移液管从管中取出样品,并放置在一个100mm的组织培养皿中。用PBS-CMF/1%ABAM洗涤细胞3次。用弯剪刀和镊子修剪掉皮下脂肪组织。
对样品进行了水平分割成0.5×1.0cm2小块并表皮面朝下放置在一个100mm的组织培养皿中。然后加入十毫升的胰蛋白酶-EDTA0.25%并冷藏(4℃)过夜(16-18小时)。
样品从冰箱中取出,使用两个镊子将表皮从真皮上分离。在这种条件下表皮容易从真皮脱落。暴露于胰蛋白酶的单细胞被去除并置于离心管中,加入15ml的GM以终止胰蛋白酶的作用。然后将所得溶液在Sorvall Highconic固定角度转子中800xg离心10分钟。
通过用真皮外植体并将其切碎成细片分离成纤维细胞,其中将其置于100mm的培养皿。包皮洗净,用剪刀绞碎,通过胰蛋白酶处理分离成单细胞。得到的细胞生长于一种培养基中,其由80%的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM,无丙酮酸,高血糖配方)辅以20%胎牛血清(FBS;Hyclone,Logan,UT);20%SR;或者20%人血清(Chemicon International,Temecula,CA),2mM的L-谷氨酰胺,0.1mM的β-巯基乙醇,和1%非必需氨基酸储液(GibcoInvitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。包皮细胞使用胰蛋白酶-EDTA(0.5%胰蛋白酶和0.25%EDTA;gibco Invitrogen)每5-7天进行拆分。十毫升的成纤维细胞培养基加入到细胞中,然后将其放在培养箱中无扰动培养48小时。在平皿约50-60%汇合的情况下,细胞传代和扩大一次。对于永生化细胞,扩大培养物转染pBsSVD2005,按照制造商的说明(即,Addgene,Inc.,Cambridge,MA)。
去除耗尽的培养基进行胰酶消化。细胞中加入5ml的胰蛋白酶0.25%,在37℃/5%的CO2温育10分钟。经常在显微镜下检查培养物,以确保细胞脱落。在必要的情况下,可敲打平皿侧壁来帮助驱赶细胞。
当证实了细胞脱落,添加5ml的GM来停止胰蛋白酶的作用。单细胞置于离心管中,并在Sorvall Highconic的固定角度转子中800xg离心8分钟。除去上清液,得到的细胞用5%-20%FBS的DMEM重悬。
2.细胞培养方法
此方案是用于与Nunc MicroHex微载体(Nalge NuncInternational,Denmark)一起使用的波浪生物反应器。Nunc MicroHex是2D、具有边长为125微米的平面六边形聚苯乙烯载体。
I.接种
用空气和10%的CO2对细胞袋(Wave Biotech)充气直到刚性。加入培养基并且入口和出口的过滤器被夹紧。然后以约15个摇动每分钟(rpm)和大约7度的角度摇动细胞袋。允许温度和pH值进行平衡。初始体积为最终培养体积的约50%。然后加入微载体和细胞悬浮液。一般情况下,加入初始细胞密度为约细胞每毫升。入口和出口的过滤器保持夹紧,并以约20rpm的速度和大约7度的角度继续摇动。附着过程持续经过几个小时或过夜。
II.操作
一旦细胞附着,加入剩余量的培养基以使培养达到最终体积。细胞生长中监测细胞密度、活力和代谢。监测含氧水平并且响应于培养的氧需求调理rpm和角度。最好是保持低转速和角度同时保持足够的氧气并保持微载体/细胞悬浮。随着细胞继续生长,培养基最终耗尽。通过关闭摇动来更换培养基。随着平台向前倾斜,微载体/细胞复合物在几分钟之内静置于细胞袋的底部边缘。然后泵出培养基而不移出任何微载体。培养物体积的约90%以这种方式除去。加入新鲜预热的培养基并在以前的设置下恢复摇动细胞袋。
III.摇动速度
摇动速度取决于培养体积、细胞密度和细胞袋尺寸或培养瓶或培养皿。对于2L和10L的细胞袋,速度初始设定为约15至20rpm转。随着细胞密度的增加,速度增加至约20至25rpm。
IV.摇动角度
2L和10L的细胞袋,初始角度6度就足够了。当达到最大细胞密度,约7-8度的角度是优选的。
V.通气速率
细胞袋保持刚性充气。在细胞袋充气膨胀过程,使用高达约0.5升每分钟(lpm)的流速。一旦观察到旺盛生长,流速设置到对于2L袋子约0.1lpm,对于10L细胞袋约0.2lpm。
VI.操作温度
用于哺乳动物细胞的典型的操作温度是36-37℃。
VII.pH控制
pH值控制是非常关键的。由于波浪生物反应器的高气体传输能力,pH值可能会迅速漂移。使用下面的流程:
a.细胞袋最初是用10%CO2/空气来充气膨胀。充气膨胀后,培养基和微载体加入到生物反应器并且关闭入口和出口的空气过滤器。为了使pH值和温度完全平衡,允许细胞袋在约15rpm摇动1-2小时。接种前,取样检查pH并在必要时调节。
b.在入口和出口过滤器保持关闭的情况下,微载体与细胞一起接种。
c.监测pH值、葡萄糖浓度和细胞密度。一旦pH值和葡萄糖水平开始下降,通过顶部空间的连续气流被切换到5%的CO2/空气。这发生在24-60小时内。一旦旺盛的细胞生长发生,培养基pH值没有向上漂移和在扫气中CO2浓度行使功能来控制pH值。
d.增加摇动的速率和角度以保持氧浓度。
e.小心更换耗尽的培养基。当细胞适应于新鲜培养基时监测pH值并调节CO2浓度。
VIII.规模扩大
如下给出Nunc微载体上细胞系的典型规模扩大:
a.500mL培养基被用来填充2L细胞袋。加入13克MicroHex载体并使pH值达到平衡。溶液中加入足够的细胞接种物,得到的起始细胞数至少为0.3×106个细胞/mL(1.5×108细胞总数)。摇动速度设定为约15rpm和角度约6度过夜。该系统保持在操作温度下。
b.第二天加入500mL培养基,并调节rpm至约18,而调节角度至约6度。
c.继续再培养一天直到pH值开始下降。入口和出口过滤器不封闭并且开始连续空气/CO2气流。仔细监测培养物中的氧含量。rpm调节至约20。
d.继续再培养几天直到血糖水平和低pH值表示培养基耗尽。更换50%的培养基,仔细监测pH值。rpm调节至约22并且角度调节至约7度。
e.继续每隔一天更换50%的培养基。
配方制剂
当细胞达到约80-95%汇合时,然后将条件培养基加入到如下所述各种组合物。
AQ皮肤解决方案活性精华素
AQ皮肤解决方案眼部精华素
AO皮肤解决方案护发复合物
实施例1.比较研究
护肤霜组合物(AQ皮肤解决方案中血清)被如上配制,条件是皮肤调理剂(即,条件培养基)的浓度是可变的(即,占42%、30%、20%;wt%)。组合物外部施用到受试人的皮肤上并由RN工作人员或医师工作人员进行物理评价。
受试者
使用年龄介于25-72岁的20个受试者(13名女性,7名男性)进行这项研究。志愿者签署了全面的知情同意文件。
使用标准评分系统是基于10个问题,其包括94%女性其皮肤的整体外观,皮肤纹理/平滑度的改善,皮肤的紧致和弹性的增加,细纹和皱纹出现的减少。
给予受试者4个产品的未标记的容器其中包括安慰剂。研究周期—75天。AQ产品与TNS RECOVERY COMPLEXTM(Skin Medica)、BIO-GEL生物恢复性生物凝胶(Neocutis)、和Revive保湿再生霜(ReVive)进行了比较。本研究的结果示于图2(皮肤调理剂占42%)。
结果
如图2所示,相比于TNS、BIO-GEL和ReVive的产品,AQ产品在每个时间点显示出至少2倍更好的结果。图3显示了皮肤的纹理、皱纹、细纹、紧致度和整体改善平均百分比改善评分。
为了确定疗效所需的皮肤调理剂的最少量,检测了具有不同浓度皮肤调理剂的AQ产品。检测结果显示在图3-5中,包括时间点分析(即图6-8)。
从数据可以看出,5%似乎是疗效所需的最小浓度。
实施例2.痤疮疤痕
护肤霜组成(AQ皮肤解决方案活性精华素)配制方法同上。将组合物外部施用于人类受试者的皮肤并且由工作人员RN或工作人员医师进行物理评价。
受试者
使用年龄介于25-72岁的20个受试者(13名女性,7名男性)进行这项研究。志愿者签署了全面的知情同意文件。
AQ皮肤解决方案精华素通过用透皮的皮肤印片施用给予受试者。研究的结果示于图9和10。
结果
如之前和之后的照片所示,(即,图9和图10),AQ产品从受试者的皮肤上减少或完全去除痤疮疤痕。
实施例3.男性图型性秃顶
这项研究的目标是在治疗雄激素性脱发(AGA)中测试自然产生的生长因子,特别是AQ的活性护发精华素的组合物。
受试者
在这项研究中包括年龄在25至65岁之间的72位受试者(男性和女性),身体健康,有轻度至中度AGA。志愿者签署了全面的知情同意文件。受试者用AQ活性护发精华素治疗15周。
结果
在基线和然后在最后一次访问进行疗效测量。测量分别为:1)调查人员评估头发生长和2)患者治疗效果和对外观满意度的自我评估。
患者自我评估
在此分析中研究受试者评估的参数为以下问题:a)秃斑的大小;b)头发出现;c)头发生长;d)脱发率;和e)对头发外观的满意度。其他测量包括头发丝浓密度、长度、强度(张力)、预防脱发、头皮恢复活力和整体增长。
本研究结果显示对治疗的非常积极的响应(见图11、12和13)。不知情的调查人员评估报告显示,在最后一次访问时超过90%的服用了有活性的研究配方制剂的研究受试者被评为有改善。
结论
本研究建立了在治疗脱发中自然产生的生长因子的有效性,并表明护发精华素在正常成年哺乳动物上产生全新的毛囊。
研究者们能够通过对头皮应用因子的组合诱导再生反应,包括新毛囊形成。这项工作表明在皮肤上诱导这种原始的状态触发相应的胚胎分子通路,其不同于在成人皮肤的相应细胞中有活性的那些通路,其允许用来重新长出头发的新的外用治疗而之前不认为在正常成人皮肤上具有治疗效益。
实施例4.皮肤恢复青春和皱纹减少
本研究选择的受试者
年龄在岁之间的八十一位(81)男性和女性,总体健康情况良好、没有哺乳或怀孕、在面部具有表现出来的细纹或深皱纹,包括在双眼睛周围至少隐约可见的暗区和至少略微粗糙和颗粒感的下眼睑。志愿者签署了全面的知情同意文件。
不包括在内的受试者
具有影响面部区域或眼睛下方的任何活跃的皮肤疾病或任何皮肤病史的受试者不被包含在内。另外,要求受试者停止其使用可提高皮肤状况和有助于减少皱纹的任何产品的现有方案。允许化妆及防晒产品。6个月内进行整容手术影响面部皮肤的受试者,也从本研究中排除。
治疗方案
在超过6周(42天)一段时间内,AQ活性精华素在早晨和晚上应用到面部皮肤,包括眼眶周围的皮肤面积。要求受试者记录每个应用AQ活性精华素。
在基线和6周后评估。
受试者的评估通过:
1-临床评估:
·在标准条件下的临床摄影。
·VISIA-CR成像(Canfield Scientific,Inc.,Fairfield,NJ)。
·皮肤质量的临床评价,包括眼眶周围的皮肤,表1中给出的用1-10点的视觉评分系统。
2-自我评估:
·面部皮肤的质量,包括眼眶周围的皮肤,通过受试者使用所提供的调查问卷。
结果
表1.皮肤质量的临床评分。
临床评估 | 分数 |
纹理 | 1-10 |
皱纹 | 1-10 |
细纹 | 1-10 |
紧致度 | 1-10 |
1=没有改善(最低可能的分数)
2-9=不同程度的改善
10=极大改善(最高可能的分数)
全部结果都显示出统计学显著性的p=0.05。所有受试者(100%)都报告对皮肤精华素很好的耐受。所有受试者(100%)都喜欢皮肤精华素的感觉,而98%会在6周的研究期之后继续定期使用。改进表示为治疗之前(基线)的平均得分和之后的平均得分之间的差异,其以平均基线得分的百分比表示,并包括所有79位完成研究的受试者(图14和15)。连同本研究,我们进行了比较研究,比较AQ活性精华素相对于具有类似属性或声称类似属性的其他产品。本研究的目的有两个:1)显示AQ活性精华素与在市面上的其他产品相比的有效性,以及2)除了使用安慰剂组(图16),作为该研究的阴性对照使用。此外,要求受试者在每瓶的数量、精华素的质量、香味、再次购买和总体满意度方面评估AQ活性精华素(图17)。
这项研究包括的之前和之后的照片基于以下标准选择:
1-皮肤类型和皮肤损伤
2-年龄和性别
3–改善度
结论
本研究表明,含有人生长因子和细胞因子与抗氧化因子相结合的专利(proprietary)混合物的皮肤精华素(AQ活性精华素),对于在轻度至中度的皮肤伤害/老化的情况下面部皮肤恢复青春是安全和有效的。精华素的疗效、良好的耐受性,包括娇弱的眼眶周围皮肤区域,产品的易用性和愉悦的感官属性解释为什么大部分(98%)将继续定期使用AQ活性精华素。
虽然本发明的多种优选实施方案及其变化已详细描述,而目的相同的使用和应用的其它修改和方法对本领域的技术人员是显而易见的。因此,应当理解,各种应用、修改、材料和替换可由等同物构成而不脱离本发明的精神或权利要求的范畴。应当理解,本发明并不限定于此处所述的为了示例说明的实施方案,而是通过很好的阅读所附的权利要求来对其定义,包括全范围的等同物而其中每个元素都是有权要求的。
Claims (35)
1.用于治疗和/或预防皮肤缺陷的护肤霜,包括条件培养基或者其提取物或浓缩物,其来自培养的基本上同质化的包皮衍生的成纤维细胞,其中产生所述条件培养基是通过在二维培养中将营养培养基与所述细胞温育,在适于促进至少一种生长因子分泌到营养培养基中的条件下,并且其中所述条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述至少一种生长因子以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。
2.权利要求1的护肤霜,其中条件包括将所述细胞与二维的聚苯乙烯微载体的培养。
3.权利要求2的护肤霜,其中所述细胞来自指定为ATCC保藏号PTA-11681的细胞系。
4.权利要求1的护肤霜,其中所述细胞用SV40的大T抗原转化。
5.权利要求4的护肤霜,其中所述细胞来自指定为ATCC保藏号PTA-11680的细胞系。
6.权利要求1的护肤霜,其中所述护肤霜进一步包括一种或多种溶剂,一种基质溶剂,一种或多种植物性药物,以及一种或多种润肤剂。
7.权利要求1的护肤霜,其中至少一种生长因子选自EGF、PDGF、FGF、TGF-β、TGF-α、NGF、Epo、IGF-I、IGF-II、IL-1-α、IL-1-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、INF-α、INF-β、INF-γ、TNF-a、TNF-β、GM-CSF、和M-CSFs,或其组合。
8.权利要求7的护肤霜,其中所述组合包括TGF Beta-1、TGFBeta-2、TGF Beta-3、IL-3、IL-6、IL-7和IL-8,并且其中所述条件培养基以至少约5-20%(wt%)浓度存在。
9.权利要求8的护肤霜,其中所述组合包括约1-3ng/mL的TGFBeta-1、约100-160pg/mL的TGF Beta-2、约50-100pg/mL的TGFBeta-3、约60pg/mL的IL-3、约11pg/mL的IL-6、约50pg/mL的IL-7和约4-10pg/mL的IL-8,并且其中所述条件培养基是以约30-42%(wt%)存在。
10.权利要求2的护肤霜,进一步包括增稠剂。
11.权利要求10的护肤霜,其中所述增稠剂包括聚乙二醇(PEG)、基于植物的脂肪醇和共聚物的组合。
12.权利要求11的护肤霜,其中所述基于植物的脂肪醇选自癸醇、辛基癸醇、月桂醇、月桂基-肉豆蔻醇、肉豆蔻醇、十六烷基硬脂醇、鲸蜡醇、和硬脂醇。
13.权利要求11的护肤霜,其中所述增稠剂包括PEG-150、癸醇和SMDI共聚物。
14.权利要求2的护肤霜,进一步包括保湿剂。
15.权利要求14的护肤霜,其中所述保湿剂选自PCA钠、甘油、丙二醇、山梨糖醇、透明质酸、尿素和乳酸。
16.权利要求2的护肤霜,进一步包括尿囊素。
17.权利要求2的护肤霜,其中基质为纯净水。
18.权利要求2的护肤霜,进一步包括至少一种防腐剂。
19.权利要求18的护肤霜,其中所述至少一种防腐剂选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯,双咪唑烷基脲、苯氧基乙醇、DMDM乙内酰脲、山梨酸、苯甲醇、甲醛和三氯生。
20.权利要求18的护肤霜,其中所述至少一种防腐剂是杂环类化合物,其选自甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮和咖啡因。
21.权利要求2的护肤霜,进一步包括PEG-150、癸醇、SMDI共聚物、PCA钠、尿囊素、纯净水、甲基异噻唑啉酮和对羟基苯甲酸甲酯。
22.权利要求1的护肤霜,进一步包括额外试剂。
23.权利要求22的护肤霜,其中所述额外试剂包括Pal-KTTKS(SEQ ID NO:2)或阿基瑞林。
24.权利要求1的护肤霜,进一步包括第二种条件培养基或者其提取物或浓缩物,其中第二种条件培养基是通过在二维培养中将营养培养基与第二种基本上同质化的真核细胞温育,在适于促进至少一种第二类生长因子或者一种以上细胞外基质蛋白分泌的条件下,并且其中在所述条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述生长因子或细胞外基质蛋白以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。
25.治疗和/或预防皮肤缺陷的方法包括:
施用护肤霜到有需要的受试者的皮肤,所述护肤霜包含条件培养基或者其提取物或浓缩物,其来自培养的基本上同质化的包皮衍生的成纤维细胞,其中产生条件培养基是通过在二维培养中将营养培养基与所述细胞温育,在适于促进至少一种生长因子分泌到营养培养基中的条件下,并且其中所述条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述至少一种生长因子以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。
26.权利要求25的方法,其中护肤霜是通过外部施用来应用。
27.权利要求26的方法,其中外部施用是通过透皮的皮肤印片或射频微针设备或点阵激光。
28.权利要求25的方法,其中所述皮肤缺陷选自皮肤老化、皮肤皱纹、雄激素性脱发(AGA)、睫毛损失、阳光晒伤、烧伤、手术疤痕、撕裂伤、妊娠纹、痤疮疤痕、糖尿病溃疡、伤口和阴道干涩。
29.权利要求25的方法,其中所述护肤霜进一步包括一种或多种溶剂,一种基质溶剂,一种或多种植物性药物,以及一种或多种润肤剂。
30.权利要求29的方法,其中至少一种生长因子选自EGF、PDGF、FGF、TGF-β、TGF-α、NGF、Epo、IGF-I、IGF-II、IL-1-α、IL-1-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、INF-α、INF-β、INF-γ、TNF-a、TNF-β、GM-CSF、和M-CSFs,或其组合。
31.权利要求30的方法,其中所述组合包括TGF Beta-1、TGFBeta-2、TGF Beta-3、IL-3、IL-6、IL-7和IL-8,并且其中所述条件培养基以至少约5-20%(wt%)浓度存在。
32.权利要31的方法,其中所述组合包括约1-3ng/mL的TGFBeta-1、约100-160pg/mL的TGF Beta-2、约50-100pg/mL的TGFBeta-3、约60pg/mL的IL-3、约11pg/mL的IL-6、约50pg/mL的IL-7和约4-10pg/mL的IL-8,并且其中所述条件培养基是以约30-42%(wt%)存在。
33.权利要求25的方法,其中所述护肤霜进一步包括第二种条件培养基或者其提取物或浓缩物,其中第二种条件培养基是通过在二维培养中将营养培养基与第二种基本上同质化的真核细胞温育,在适于促进至少一种第二类生长因子或者一种以上细胞外基质蛋白分泌的条件下,并且其中在所述条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述生长因子或细胞外基质蛋白以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在。
34.一种成纤维细胞系,其中所述细胞系为ATCC保藏号PTA-11680或ATCC保藏号PTA-11681。
35.一种试剂盒,包括:
a)护肤霜,包括条件培养基或者其提取物或浓缩物,其来自培养的基本上同质化的包皮衍生的成纤维细胞,其中产生所述条件培养基是通过在二维培养中将营养培养基与所述细胞温育,在适于促进至少一种生长因子分泌到营养培养基中的条件下,并且其中所述条件培养基或者其提取物或浓缩物中的所述至少一种生长因子以足以治疗或预防皮肤缺陷的量存在;
b)容器;
c)标签;和
d)提供应用所述护肤霜的方法的说明书。
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