WO2016006885A1 - 자극된 줄기세포 배양액의 발모 촉진능 및 이의 용도 - Google Patents

자극된 줄기세포 배양액의 발모 촉진능 및 이의 용도 Download PDF

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WO2016006885A1
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stem cells
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오원일
이장영
최수진
전홍배
김주연
임훈
신승현
박원석
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메디포스트(주)
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing hair loss and promoting hair growth, comprising a culture medium of stem cells stimulated with a specific inducer of TGF- ⁇ as an active ingredient, a method for preparing the same, and a method for using the same.
  • Hair loss from hair loss from the scalp is caused by a number of factors, including internal factors such as hereditary constitution or the action of testosterone; Mental stress in daily life; And external factors such as the accumulation of lipid peroxide in the scalp and are known to cause hair loss symptoms through a highly complex process.
  • Baldness does not come out of hair, but gradually becomes thinner and fluffy, and as the process progresses, the nipples in the hair root become smaller. The smaller the nipple, the thinner the hair, the shorter the hair cycle, and the new hair becomes thinner. As balds continue to progress, the hair turns into fluffy hairs, and the hair cycle becomes shorter, after which it grows a little and falls out. Also, attention has been paid to alopecia areata, which is known to be caused by autoimmune diseases, and temporary hair loss after physical and mental stress, such as endocrine diseases, nutritional deficiencies, drugs, and childbirth.
  • hair growth or hair regrowth agents e.g. minoxidil, finasteride
  • the research and development of domestic alopecia treatment drugs is a technically insufficient position compared to developed countries, and research and development related to hair loss prevention, hair growth promotion, and hair regeneration are very urgent. Hair loss research has been published since 1950, but hair regeneration has been considered impossible for the past 50 years due to lack of reproducibility.
  • Korean Patent Registration No. 10-0771171 (2007.10.29) describes a method for separating and proliferating hair follicle stem cells and differentiating them into hair follicle cells and a composition for treating baldness.
  • -2008-0097593 (2008.11.06.) Describes a cell therapeutic agent formed by appropriately mixing adipose tissue-derived stem cells and hair follicle cells.
  • Republic of Korea Patent Registration 10-1218101 (2013.01.03.) Describes a hair growth promoting or hair loss prevention composition comprising a culture medium of fetal-derived mesenchymal stem cells in the amniotic fluid.
  • TGF- ⁇ which is known to cause hair loss
  • cord blood-derived stem cells to secrete proteins that are effective for hair growth.
  • the present invention was completed by confirming that the culture medium cultured by stimulating stem cells with TGF- ⁇ shows a much better hair growth promoting effect than conventionally known cases.
  • the present invention uses a stem cell culture stimulated with a specific hair degenerative inducer, which stimulates stem cells to secrete hair tissue differentiation-related signaling proteins.
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing hair loss and promoting hair growth using the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method of effectively using the composition.
  • the present invention utilizes a function of growing hair very effectively by stimulating stem cells with a specific hair degenerative inducer including TGF- ⁇ to secrete hair tissue differentiation-related signaling proteins.
  • a specific hair degenerative inducer including TGF- ⁇ to secrete hair tissue differentiation-related signaling proteins.
  • At least one hair selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, BMP2 / 4 and the like It provides a composition for preventing hair loss and promoting hair growth containing a stem cell culture stimulated with a catagen inducer as an active ingredient.
  • the hair loss prevention and hair growth promoting effect is because the stem cells stimulated with the hair degenerative inducer secrete Wnt3a, Bcl-2 and CyclinD-1, which are known as hair tissue differentiation-related signaling proteins.
  • At least one hair selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF and BMP2 / 4 Stem cell cultures stimulated with retrograde inducers
  • the stem cells are bone marrow-derived, cord blood-derived, adipose-derived, blood-derived, liver-derived, skin-derived, gastrointestinal tract, placental-derived, nerve-derived, adrenal, epithelial and uterine-derived human tissue adult stem cells, and It may be any one or more stem cells selected from the group consisting of embryonic stem cells, preferably derived from bone marrow, cord blood, or fat; More preferably, adult stem cells derived from cord blood, for example, mesenchymal stem cells derived from cord blood, are most preferred. Furthermore, it is most preferable to use the cord blood as the cord blood.
  • the stem cell culture medium stimulated with the hair degenerative inducer is preferably in a final concentration of 10 to 30%, more preferably in a final concentration of 25%.
  • the culture medium may be any basal medium suitable for animal cell growth as a basal medium, non-limiting examples include Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco modified Eagle Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute Medium ) And KM (Keratinocyte Medium).
  • MEM Minimal Essential Medium
  • DMEM Dulbecco modified Eagle Medium
  • KM Keratinocyte Medium
  • KBM Keratinocyte Basal medium
  • EpiLife KM Keratinocyte-EpiLife medium
  • Stem cell culture stimulated with a factor for example, it can be obtained by stimulating stem cells for 22 to 26 hours by adding it to the stem cells, and then cultured for a period selected from 1 day to 3 days. More specific examples may refer to embodiments of the present invention.
  • the stem cells stimulated with the hair degenerative inducer including TGF- ⁇ during the stem cell culture period secrete Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 and the like, which are known as signaling proteins related to hair tissue differentiation.
  • Stem cell culture of the present invention is characterized in that it comprises one or more proteins selected from the group consisting of Wnt3a, Bcl-2, and CyclinD-1.
  • composition of the present invention can be prepared and provided in the form of a pharmaceutical composition or cosmetic composition.
  • the present invention is another embodiment, composed of the above-described TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF and BMP2 / 4 It is possible to provide a preferred method of using the composition for preventing hair loss and promoting hair growth, which comprises a stem cell culture medium stimulated with one or more hair degenerative inducers selected from the group as an active ingredient.
  • the present invention can provide a hair loss treatment method for promoting hair growth using the hair growth promoting composition containing the stem cell culture medium stimulated with the hair degenerative inducer as an active ingredient.
  • transdermal administration preferably by topical spreading or injection, most preferably by topical application.
  • the present invention treats stem cells with factors including hair degenerative inducers, such as TGF- ⁇ and BMP, most preferably TGF- ⁇ , which are known to cause hair loss, and thus secrete proteins effective for hair growth. Based on the discovery that it can be made, it provides both the excellent hair loss prevention and hair growth promoting efficacy of the stimulated stem cell culture and its various uses.
  • hair degenerative inducers such as TGF- ⁇ and BMP, most preferably TGF- ⁇ , which are known to cause hair loss, and thus secrete proteins effective for hair growth.
  • 1 is a graph evaluating the cell proliferation capacity of hDPCs treated with various source-derived stem cell cultures and controls stimulated with TGF- ⁇ .
  • Figure 2 is a result of the Wessett blot confirming the signaling system related protein expression levels related to hair tissue differentiation contained in TGF- ⁇ -stimulated stem cell culture.
  • Figure 3 shows the results of confirming the growth of the length of DP cells after treatment with the TGF- ⁇ stimulated stem cell culture and the control group.
  • FIG. 4 is a graph and stereoscopic micrographs of the number of hair follicle formation after treatment with TGF- ⁇ stimulated stem cell cultures and controls.
  • Figure 5 is a photo of the hair growth pattern after applying treatment to the cord blood-derived stem cell culture and control cells stimulated with TGF- ⁇ for 3 weeks to CH3 mice.
  • FIG. 5 is a photograph showing the hair growth pattern after applying TGF- ⁇ -stimulated fat and bone marrow-derived stem cell cultures and controls to CH3 mice for 4 weeks (28 days).
  • Promote hair growth or "anti-hair loss” is a term having a similar meaning to each other, and includes all effects in the art to promote hair production and hair growth and to prevent hair from falling out or weakening.
  • “Stem cell” means a cell that can develop into any tissue. There are two basic features: first, self-renewal, which produces itself by repeating division, and the ability to differentiate into cells with specific functions according to the environment.
  • (Medium) Mesenchymal Stem Cells is a type of undifferentiated adult stem cells isolated from human or mammalian tissue and may be derived from various tissues. Among adult stem cells, hematopoietic stem cells are mainly non-adherent, but mesenchymal stem cells are mainly adherent cells.
  • cord-derived mesenchymal stem cells cord blood-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived mesenchymal stem cells, nerve-derived mesenchymal stem cells, skin-derived mesenchymal stem cells, amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells and It may be a placental-derived mesenchymal stem cell, preferably cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • “Stem cell culture medium” is a substance containing a component contained in the culture medium obtained by culturing stem cells, the stem cells for producing the culture medium is not limited in its kind.
  • the stem cells from which the culture is made can be embryonic stem cells and can also be adult stem cells.
  • adult stem cells can be derived from adult stem cells of all tissues.
  • the culture medium was prepared using umbilical cord blood-derived adult stem cells.
  • TGF- ⁇ may be added to stem cells to stimulate stem cells for 22 to 26 hours, and then may be obtained by culturing for 1 to 3 days.
  • differentiation refers to a phenomenon in which the structures or functions of each other are specialized during the division and proliferation of cells, that is, the shape or function of living cells, tissues, etc. changes in order to perform the tasks given to them. .
  • a relatively simple system is divided into two or more qualitatively different sub systems.
  • proliferation or “growth” of a cell refers to a cell that divides and is homogeneous, usually increasing in the body of a multicellular organism. In time, it is common for traits to be changed (differentiated) and controlled at the same time.
  • Medium refers to a mixture for growth and proliferation of cells and the like in vitro including elements essential for the growth and proliferation of cells such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, minerals and the like.
  • the medium of the present invention is a medium for growth and proliferation of stem cells.
  • Base medium is a mixture containing essential sugars, amino acids, water, and the like necessary for a cell to survive, and is a mixture excluding serum, nutritional substances, and various growth factors.
  • the basic medium of the present invention may be prepared by artificially synthesizing or using a commercially prepared medium.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • EDM Endothelial differentiation medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F-12
  • ⁇ -MEM ⁇ -Minimal Essential Medium
  • G-MEM Gasgow's Minimal Essential Medium
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium but are not limited thereto.
  • Treatment means an approach to obtain beneficial or desirable clinical results.
  • beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, alleviation of symptoms, reduction of disease range, stabilization of disease state (ie, not worsening), delay or slowing of disease progression, disease state Improvement or temporary mitigation and alleviation (partially or wholly), detectable or not detected.
  • Treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventive measures. Such treatments include not only the disorders to be prevented but also the treatments required for already occurring disorders. "Palliating" a disease may reduce the extent of the disease state and / or undesirable clinical signs and / or slow or lengthen the time course of progression as compared to untreated treatment. It means losing.
  • an “effective amount” is an appropriate amount that affects a beneficial or desirable clinical or biochemical result.
  • An effective amount can be administered once or more.
  • An effective amount is an amount suitable to temporarily alleviate, ameliorate, stabilize, reverse, slow or slow the progression of a disease state. In the present invention, the amount is to alleviate or delay the progression of hair loss or improve the promotion of hair growth. If the recipient animal can tolerate the administration of the composition, or if the administration of the composition to that animal is suitable, the composition indicates "pharmaceutically or physiologically acceptable". If the amount administered is physiologically important, it can be said that the agent has been administered in a "therapeutically effective amount.” The agent is physiologically meaningful if the presence of the agent has resulted in a physiologically detectable change in the recipient patient. .
  • “About” means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for reference quantities, levels, values, numbers, frequencies, percentages, dimensions, sizes, quantities, weights, or lengths. , Amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by about 3, 2 or 1%.
  • the present invention relates to a specific function of the culture medium of stem cells treated with specific factors, that is, to prevent hair loss and promote hair growth and use thereof.
  • TGF- ⁇ Factors that can be used for remarkable hair loss prevention and hair growth promoting function of the stem cell culture of the present invention is a catagen inducer, TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- at least one factor selected from the group consisting of ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, BMP2 / 4 and the like. Most preferably, TGF- ⁇ is included and used.
  • Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells.
  • Embryonic stem cells or adult stem cells can be used depending on the source, and in the present invention, various origins are preferred.
  • Adult stem cells derived from tissues for example, tissue derived stem cells such as fat, uterus, bone marrow, muscle, placenta, umbilical cord blood or skin (epithelial) can be used.
  • the mesenchymal stem cells (MSCs) are preferred.
  • the mesenchymal stem cells are generally hematopoietic supporting cells (stroma), and have the ability to differentiate into various mesodermal cells including bone, cartilage, fat, and muscle cells, and can easily proliferate while maintaining undifferentiated state. There is a characteristic.
  • adipose, bone marrow and umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were used.
  • cord blood-derived mesenchymal stem cells are used.
  • Umbilical cord blood refers to umbilical cord blood that comes out of the umbilical cord at birth, and contains hematopoietic stem cells and vascular endothelial progenitor cells that make white blood cells, red blood cells, and platelets, and mesenchymal stem cells that make cartilage, bones, muscles, and nerves. Very high value.
  • the characteristics of umbilical cord blood are that the number of hematopoietic stem cells is higher than that of bone marrow or peripheral blood, and their maturity is more immature and much better than the hematopoietic stem cells found in bone marrow.
  • a preferred embodiment of the present invention is mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood-derived blood (hUCB-MSC) is used.
  • the cord blood-derived mesenchymal stem cells when used as a cell therapy, unlike other tissue-derived stem cells have almost no immune rejection reaction, and (ii) from the placenta discarded properly and properly harvested from the stem cells obtained (Iii)
  • direct administration to the diseased site is possible.
  • the paracrine effect is activated to secrete secretome factors (proteins and cytokines) that can treat, regenerate, or recover the disease site. There is this.
  • any method known in the art may be used (Pittinger MF, Mackay AM, et al., Science, 284: 143-7, 1999).
  • the collected cord blood is centrifuged to separate mononuclear cells, and then washed several times to remove foreign substances. After washing, the mononuclear cells are planted in a culture vessel at an appropriate density and cultured. The cells proliferate in a monolayer, of which homogeneous and spindle-shaped long cells are observed. The cells that proliferate in colony form are mesenchymal stem cells. Subsequently, when cells grow to a confluent level, subcultures are performed and grown until the required number of cells is reached.
  • the present invention is characterized by stimulating stem cells by treating the stem cells, preferably a specific hair degenerative inducer.
  • the catagen inducer is selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF and BMP2 / 4 At least one factor, most preferably TGF- ⁇ .
  • the catagen inducer is treated with a concentration of 8-15 ng / ml, preferably 8-12 ng / ml, and most preferably 9-11 ng / ml relative to the cell volume. In one embodiment of the present invention was treated at about 10 ng / ml at the time when the cell confluence is determined to be 80% or more.
  • the TGF- ⁇ is a cytokine with various functions, and regulates the expression of TGF- ⁇ -related genes through Smads, a transcription factor present in the cytoplasm, thereby controlling cell growth and differentiation, inflammatory responses, cell death programs, and cell matrix synthesis. As a substance known to be closely related, it is reported to be involved in necrosis of hair follicle cells.
  • DHT dihydrotestosterone
  • 5-alpha-reductaes a reductase that causes DHT to enter normal hair cells and signal nuclear DNA cell destruction. It is known to occur by delivery.
  • hair follicle necrosis factor Cell Apoptosis Factor
  • BMP BMP
  • DKK-1 DKK-1
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇
  • hair degeners selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, and BMP2 / 4 groups
  • Stem cell culture stimulated with the retrograde inducer comprises at least one protein selected from the group consisting of Wnt3a, Bcl-2, and CyclinD-1.
  • the stem cell culture stimulated with a hair degenerative inducer for example, TGF- ⁇
  • a hair degenerative inducer for example, TGF- ⁇
  • Stimulated stem cells are preferably used by culturing for a period selected from 1 to 3 days. Representative methods of preparation may be referred to embodiments of the present disclosure.
  • the present invention includes a method for producing a stem cell culture for preventing hair loss and promoting hair growth, which is characterized by stimulating and culturing stem cells with the hair degenerative inducer.
  • the stem cell culture is preferably such that the final concentration is about 10 to 50%, more preferably 10 to 30%, even more preferably 20 to 30%, most preferably to form a final concentration of about 25% Manufacture it all.
  • stem cells according to the present invention can be proliferated and cultured according to methods known in the art.
  • Suitable media are any use that can be developed in the laboratory for the cultivation of animal cells and especially mammalian cells, or can be prepared in the laboratory with the appropriate components necessary for animal cell growth, such as anabolic carbon, nitrogen and / or micronutrients. Possible media can be used.
  • the medium may be any basic medium suitable for animal cell growth, and as a non-limiting example, a basic medium generally used for culture includes Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco modified Eagle Medium (DMEM), and Roswell Park Memorial Institute. Medium) and KM (Keratinocyte Medium), and any medium used in the art can be used without limitation.
  • MEM Minimal Essential Medium
  • DMEM Dulbecco modified Eagle Medium
  • KM Keatinocyte Medium
  • ⁇ -MEM medium ⁇ -MEM medium (GIBCO), KM (Keratinocyte medium), KBM (Keratinocyte Basal medium), EpiLife KM (Keratinocyte-EpiLife medium) medium, DMEM medium (Welgene), MCDB 131 medium (Welgene), IMEM medium (GIBCO), DMEM / F12 medium, PCM medium, M199 / F12 (mixture) (GIBCO), and MSC expansion medium (Chemicon).
  • GEBCO ⁇ -MEM medium
  • KM Keratinocyte medium
  • KBM Keratinocyte Basal medium
  • EpiLife KM Keratinocyte-EpiLife medium
  • DMEM medium Welgene
  • MCDB 131 medium Welgene
  • IMEM medium IMEM medium
  • DMEM / F12 medium PCM medium
  • M199 / F12 mixture
  • MSC expansion medium Chemicon
  • anabolic sources of carbon, nitrogen and micronutrients can be added, including but not limited to serum sources, growth factors, amino acids, antibiotics, vitamins, reducing agents, and / or sugar sources.
  • serum sources including but not limited to serum sources, growth factors, amino acids, antibiotics, vitamins, reducing agents, and / or sugar sources.
  • one of ordinary skill in the art can appropriately culture by a known method by selecting or combining a medium most suitable for stem cells derived from various tissues.
  • ⁇ -MEM medium, K-SFM medium and the like were used.
  • the culture can be carried out while adjusting conditions such as a suitable culture environment, time, temperature, and the like based on common knowledge in this field.
  • the mesenchymal stem cells are cultured in ⁇ -MEM medium until cell confluence is propagated at about 80-90%, preferably about 90%, and, for example, using PBS or the like. And then further incubated in K-SFM medium for about 20-25 hours, preferably 24 hours.
  • the term "confluence (%)" is a term commonly used in the art that expresses 'cell concentration per area (saturation)', and relatively indicates the number of cells per unit area (cell concentration) in cell culture. It is a unit frequently used by those skilled in the art in experiments.
  • the present invention also includes a method for producing a stem cell and a culture medium of such a small size of less than 8 ⁇ m.
  • it may further comprise the step of treating the stem cells cultured in the medium according to the invention with trypsin.
  • Treatment of trypsin with cultured stem cells yields stem cells in the form of a single cell.
  • trypsin inhibits aggregation between cells so that the cells are treated to have a single cell form. It can be used as long as it can be used.
  • Cultivation of the stem cells can be carried out using a commonly known container.
  • it can be cultured using a three-dimensional bioreactor (bioreactor or spinner), or can be cultured in a general adhesive container.
  • the present invention comprises at least one hair selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, and BMP2 / 4 groups described above.
  • the present invention relates to the use of an exceptionally excellent hair loss prevention and hair growth promoting function of a stem cell culture stimulated with a retrograde inducer.
  • the stem cell culture stimulated by the factor contains Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1, etc., which are known as signaling proteins related to hair tissue differentiation, and are not only effective in slowing down the symptoms of hair loss, but are actually dermal (dermal).
  • Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1, etc. which are known as signaling proteins related to hair tissue differentiation, and are not only effective in slowing down the symptoms of hair loss, but are actually dermal (dermal).
  • papilla Hair growth, hair growth and growth effects are also shown by promoting cell production and length growth, increasing the number and size of hair follicles, and increasing the thickness of the scalp tissue.
  • a drug that reduces DHT, which causes hair loss, has been used so far for propecia, which is made of finasteride.
  • the drug suppresses the action of 5-alpha reductase, which reduces DHT, and thus treats hair loss.Profescia blocks 5- ⁇ reductase, which inhibits DHT production and slows down the progression of masculine alopecia. Because there is only a treatment for men, hair loss prevention agent, not a hair regrowth had a limit.
  • At least one hair selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, and BMP2 / 4 groups of the present invention
  • a degenerative inducer most preferably TGF- ⁇
  • TGF- ⁇ has the advantage of functioning as an anti-hair loss and at the same time an excellent hair growth agent.
  • At least one hair selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, and BMP2 / 4 group of the present invention. Hair loss prevention and hair growth promoting function characteristics of the stem cell culture stimulated by the retrograde inducer will be described.
  • Human hair periodically goes through the process of growing, degenerating, and resting, and the hair is lost and regenerated.
  • the hair cycle is controlled through hormonal control or many growth factors.
  • the dermal papilla cells have cycles of growth, anagen, catagen, and telogen, which begin to degenerate. After receiving the signal from neighboring cells, they enter the growth phase and regenerate the cells. As a result, new hair is produced.
  • Stem cell cultures stimulated with the above factors of the present invention have a permanent hair growth effect by normalizing hair cycle regulation, not a temporary effect by hormones and the like.
  • Hair follicles are the appendages of the skin that only mammals have. They form and develop from the birth stage by the interaction between the epithelium and the mesenchyme.
  • hair follicle development is initiated by signals from the dermis, resulting in thickening of the epidermal layer to form a plate.
  • Epithelial signals from these thickened epithelial flaps cause aggregation of dermal cells derived from the mesenchyme, and dermis signals come back from the aggregates formed.
  • This signal promotes the proliferation of epithelial cells and at the same time induces the infiltration of epithelial cells into the dermis, enveloping the periphery of aggregates, resulting in the formation of dermal papilla.
  • the first hair follicle structure develops and the epithelial cell proliferates and differentiates to develop hair follicles into mature hair follicles.
  • hair follicle matrix cells and hair papilla cells interact with the hair follicle's basement membrane to cause specialized differentiation of the matrix cells, resulting in hair production and growth. This interaction also triggers the hair follicle cycle, maintains organs and determines biological characteristics such as hair thickness and shape.
  • ORS hair follicle epidermal hair follicle cells
  • DP mesenchymal-derived dermal papilla
  • the stem cell culture stimulated with the above factors of the present invention also effectively increases the thickness and length of the skin, thereby improving both the overall environment associated with hair growth.
  • the present invention is a hair degenerative factor, in particular, TGF- ⁇ , BMP, etc. are known to be a hair loss-inducing substance, but a novel fact that can be treated to stem cells to secrete proteins that are effective for hair growth On the basis of the effect of improving the overall environment required for hair growth.
  • in vitro experiments using a mouse was confirmed exceptionally excellent hair growth efficacy of TGF- ⁇ -treated cord blood-derived stem cell culture.
  • C3H mice Unlike typical mice, which typically have a rest period of about 2 weeks, C3H mice are more useful as alopecia areata mouse models because they can maintain at least 4 weeks. In other words, by confirming the effect of inducing the hair growth cycle of C3H mice to the generator can be evaluated the degree of excellent hair growth ability.
  • the present invention is in one aspect selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, and BMP2 / 4 group It relates to a hair growth promoting composition comprising a stem cell culture stimulated with at least one hair degenerative factor, most preferably TGF- ⁇ as an active ingredient, a method for preparing the same, and a method for preventing hair loss and promoting hair growth using the same. .
  • v / v may be contained in an effective concentration in the range that does not exhibit cytotoxicity 10 to 50% (v / v), preferably about 10 to 30% (v / v), preferably 20 to 30% (v / v) ), Most preferably 25% (v / v), but is not limited thereto.
  • compositions of the present invention include pharmaceutical compositions and / or cosmetic compositions.
  • the present invention provides one or more selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, and BMP2 / 4 group It is possible to provide a pharmaceutical composition for preventing hair growth or promoting hair growth, comprising a stem cell culture medium stimulated with a hair degenerative inducer, most preferably, a factor including TGF- ⁇ as an active ingredient.
  • Hair loss is largely divided into scar alopecia and non- scar alopecia, and non- scar alopecia includes congenital alopecia, male baldness, alopecia areata, but the present invention is not limited to all of these cases.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex of the patient, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. In general, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, and may be 0.01-2000 mg / kg (body weight) per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, may be administered by intravenous infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. Preferably parenteral administration. It is preferable that the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of the disease to be applied.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is more preferably administered in a manner that is applied topically (locally) to the skin.
  • the site to which the composition of the present invention can be applied can be applied to any part of the body that requires hair growth as well as the scalp. For example, it may be used to improve the condition of hair or hair damaged areas or wide forehead or M forehead, eyelashes or eyebrows, and alopecia for the purpose of simple cosmetic effect due to trauma scars.
  • composition of the present invention is preferably administered by a transdermal administration method using an application method or an injection method, more preferably an application method.
  • the composition of the present invention has an advantage of exerting excellent hair loss prevention and hair growth promoting effect by simply applying it to the scalp about once to three times.
  • the needle tip hole of the syringe is placed upwards to allow sufficient diffusion to the dermal layer in the skin and then to the capillaries, i.e., to prevent the short passage of the dermal layer into the body immediately. It is advisable to inject it into the dermal layer in a facing state.
  • the invention is selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, and BMP2 / 4 group It relates to a cosmetic composition for preventing hair growth or promoting hair growth comprising a stem cell culture medium stimulated with at least one hair degenerative factor, most preferably TGF- ⁇ as an active ingredient.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, may be formulated in an emulsion, cream, lotion, pack, foundation, lotion, essence, hair cosmetic, etc. It is not limited.
  • shampoos for promoting hair growth by adding conventional additives, such as , Shampoos and rinses, mixed rinses and treatments, liquid hair regrowth and the like, and aerosol types of these formulations.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel
  • animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of spray, additionally chloro fluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, and microcrystals are used as carrier components.
  • Soluble cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • the carrier component is aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide.
  • Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the components included in the cosmetic composition of the present invention may include components conventionally used in cosmetic compositions in addition to the active ingredient, and include conventional auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers. It may include.
  • Preparation of the cosmetic composition may be prepared by any method commonly used.
  • the cosmetic composition for preventing hair loss and promoting hair growth is preferably used by a method of transdermal administration such as directly applying or injecting it into the scalp or hair.
  • the coating amount of the mixed extract which is an active ingredient included in the composition of the present invention is 40 mg / kg or less, preferably 20 mg / kg to 40 mg / kg based on an adult.
  • the cosmetic composition of the present invention may be used alone or in duplicate, or may be used in combination with other cosmetic compositions other than the present invention.
  • the cosmetic composition with excellent skin protection effect according to the present invention can be used according to a conventional method of use, the number of times of use can be varied according to the user's skin condition or taste.
  • the present invention is selected from the group consisting of TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , FGF-5, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , K17, NT-3, NT-4, BDNF, and BMP2 / 4 group
  • the present invention relates to a method for treating hair loss by promoting hair growth using a hair growth promoting composition containing, as an active ingredient, a stem cell culture medium stimulated with one or more hair degenerative inducers, most preferably TGF- ⁇ .
  • a transdermal administration method using an application method or an injection method.
  • the needle tip hole of the syringe facing upwards to allow sufficient diffusion into the dermal layer in the skin and then to the capillaries, i.e., to prevent short flow through the dermis and immediately flow into the body.
  • inject the active ingredient of the invention it is preferable to inject the active ingredient of the invention.
  • the function of the stem cell culture stimulated with the hair degenerative inducer described above was mainly described in the pharmaceutical composition and the cosmetic composition, but the present invention includes the stem cell culture stimulated with the hair degenerative inducer as an active ingredient. It will be apparent to those skilled in the art that the present invention can be variously used as a composition of various forms and methods of using the same for preventing hair loss and promoting hair growth.
  • human cord blood-derived mesenchymal stem cells provided by MediPost Co., Ltd. (Korea) were used.
  • the cells may be obtained from the umbilical cord blood collection step and the step of separating and culturing the mesenchymal stem cells from the umbilical cord blood. Details of each step are as follows.
  • the umbilical cord vein is collected from the umbilical vein that is left out of the uterus after birth, and in the case of cesarean section, the umbilical cord is delivered out of the uterus. Collect from vein.
  • the cord blood when the cord blood is collected from the umbilical vein extracted from the uterus after delivery, the umbilical vein is collected from the umbilical vein connecting the placenta and the fetus after the newborn is born by aseptic manipulation. After securing the umbilical vein, the cord blood is collected in a cord blood collection bag (bag) containing anticoagulant using a collecting needle.
  • bag cord blood collection bag
  • the present inventors centrifuged the collected cord blood to separate mononuclear cells, and then washed several times to remove foreign substances. After washing, mononuclear cells were incubated in a culture vessel at an appropriate density. When the cells proliferated in a single layer, it was confirmed that the cells observed in the phase contrast microscope were homogeneous and the cells proliferating in the colony form of long-shaped cells of spindle shape were mesenchymal stem cells. Subsequently, when cells grew to a level of confluent, the cells were passaged and expanded until the required number of cells was reached.
  • adipocytes ATCC, USA
  • bone marrow-derived cells LONZA, USA
  • Sample group conditioned media was prepared from hUCB-MSC, AD-MSC and BM-MSC, respectively.
  • hUCB-MSC hUCB-MSC
  • AD-MSC hUCB-MSC
  • BM-MSC BM-MSC
  • thaw and culture cells in storage stored in an LN2 tank
  • cell confluence is approximately 90% in ⁇ -MEM (GIBCO) medium containing 2% FBS. Incubate until propagated.
  • the plate was washed three times with PBS (phosphate buffered saline) and incubated in keratinocyte medium without phenol red for 24 hours, and then the culture solution was collected, and this was repeated for 3 days.
  • the collected culture solution was filtered (Top Filer System, Nunc) and then refrigerated and frozen and used.
  • TGF- ⁇ (10ng / ml) was treated in a medium without phenol red for 24 hours. Stem cells were stimulated.
  • TGF- ⁇ treated medium was washed three times with PBS, then replaced with fresh K-SFM medium without phenol red, and the 24-hour incubation was repeated for 3 days and harvested. After filtering the collected TGF- ⁇ treated cultures, the final concentration was used to dilute to 10%, 25%, 50% in K-SFM medium not added with phenol red when used in the experiment.
  • the C3H mouse (Jackson lab, Japan) used in the experiment of the present invention is to start the resting period when removing the hair, unlike other species is a mouse used as a hair growth efficacy model because the time to switch to the growth phase is very long. That is, unlike other mouse species, the resting period is very long without resting induction drug treatment is an excellent animal model to confirm the hair growth efficacy ( Journal of Investigative Dermatology (2005) 124, 288-289).
  • the C3H mouse has a black color in the growth phase when the hair grows, and pink when the hair is in the degenerative phase. Thus, the hair growth can be confirmed by observing the skin color of the mouse.
  • the inventors obtained 7-week-old C3H mice and allowed them to adapt to the environment through a week-long purifying process.
  • the umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture of the present invention was inoculated into the mouse model to observe the resting period of the hair cycle (degeneration phase) and the time of conversion from the growth phase.
  • the case of injecting PBS was used as a negative control.
  • mice were anesthetized for hair removal. Anesthetics were mixed with 5 ml zoletil (Bar code # 3UHC, Korea) and 3.36 ml Rompun (Bayer Korea Co., Ltd., 2094L, Korea), followed by the addition of saline 7.47 ml (Supreme, REG # 10055, Korea). After preparing the ml solution, mice were anesthetized with 20ul of the solution using an insulin syringe (BD Ultra-Fine TM II, Korea).
  • BD Ultra-Fine TM II insulin syringe
  • the mouse was depilated using a hair trimmer.
  • the mouse was placed on a clean paper, and the hair was first removed in the direction opposite to the direction in which the hair was grown, left for 24 hours, and then checked again to remove the remaining hair.
  • the culture solution of the present invention was applied to the outer skin layer of the mouse to which the anesthetic agent was administered at 100ul intervals for 12 hours, and rubbed in the same direction eight times so as not to get around the skin.
  • the culture solution was applied to 4 points each 100 ⁇ l and observed the amount, thickness, color position and the like of hair growth through visual observation every day.
  • each medium was incubated for 24 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, followed by starvation for 24 hours, followed by 24, 48, 72, 96 hours of incubation.
  • MTT Assay Method Each 5 mg / ml concentration MTT reagent was treated to a final concentration of 1 mg / ml in each experimental group, and further incubated for 4 hours. The supernatant was discarded and dissolved in DMSO, and the solution was 200 ⁇ l each in 96 wells. The plate was transferred to an absorbance at 570 nm wavelength of the ELISA reader.
  • Laryngeal biopsy tissue was prepared in saline, separated into one follicular unit with a blade to cut the bulb, and the hair shaft was removed.
  • One of the two syringes holds the lower part of the hair bulb (the lower part of the DP), and the other side slightly touches the upper part of the hair bulb (the upper part of the DP), causing the dermal papilla (DP) to fall out. To come out.
  • Hair organs were collected through laryngeal biopsy tissue, and then prepared in saline, trimmed with hair follicle units, and cut just below the sebaceous gland. Then, the medium was changed every 3 days and the length was measured.
  • the primary human DPCs (human DERMAL PAPILLA CELLS) were used to determine the efficacy of the cultures in in vitro experiments.
  • each medium was incubated for 24 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, followed by starvation for 24 hours, and then at 24, 48, 72 under each experimental condition. After 96 hours of incubation, cytotoxicity and proliferation were measured by MTT assay.
  • the candidates were treated with hDPCs, and the protein levels of the signaling system related to hair tissue differentiation were confirmed by Western blot. 2 is shown.
  • the TGF- ⁇ -stimulated umbilical cord blood-derived stem cells of the present invention effectively secrete hair tissue differentiation-related signaling proteins such as Wnt3a, Bcl-2, and CyclinD-1, and the culture medium containing them is the best hair growth resulting from hair growth. It can be confirmed that it has an effect (FIG. 2).
  • human primary DP was collected from human scalp tissue and cultured in a laboratory plate as an ex vivo model capable of observing hair growth potential.
  • DP length growth promotion was observed and observed according to the material to be treated.
  • the experimental group and the control group were treated to observe the primary DP length growth, and the effective CM was screened or compared with the hair growth efficacy of the CM.
  • the patch assay model was used to determine the hair follicle forming ability of the primed culture medium in the cord blood stem cells.
  • Hair growth efficacy was evaluated by topical application of the culture of the present invention to telogen phase C3H / HeJ mice.
  • AD-MSC and BM-MSC were also treated with CM and TGF- ⁇ -stimulated CM to mice, and after 28 days, the hair growth effect was evaluated. As a result, the culture solution stimulated with TGF- ⁇ was applied. In one mouse it was confirmed that the hair growth effect is excellent (Fig. 6).
  • the hair growth effect of the TGF- ⁇ -stimulated stem cell culture of the present invention is very excellent in terms of hair growth rate, amount, thickness, and the like.
  • TGF- ⁇ known as a hair loss-inducing substance
  • umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell cultures stimulated with TGF- ⁇ of the present invention show better hair growth ability than known stem cell-based materials, and thus are very useful as anti-hair loss and hair growth promoting therapeutics. It is believed to be possible.
  • Stem cell culture stimulated with a hair degenerative inducer including TGF- ⁇ according to the present invention contains Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1, and the like, which are known as hair tissue differentiation signaling proteins. Therefore, by reducing the transition time from the resting phase to the growth phase during the hair cycle, promoting the generation and length growth of dermal papilla cells, increasing the number and size of hair follicles, and also increasing the thickness of the scalp skin, very excellent hair loss prevention and hair growth It has a facilitating effect and will be very useful in areas where it can be used.

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Abstract

본 발명은 TGF-β를 포함하는 특정 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 상기 모발 퇴행기 유도인자가 줄기세포를 자극하여 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질로 알려진 Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 등을 분비시킴으로써 매우 효과적으로 헤어를 성장시키는 기능을 이용하는 용도에 관한 것이다.

Description

자극된 줄기세포 배양액의 발모 촉진능 및 이의 용도
본 발명은 TGF-β를 포함하는 특정 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로 자극된 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
산업발전과 환경오염, 스트레스, 고령화의 진전에 따라 탈모증이나 박모증이 점차 심화되고 있으며, 웰빙시대를 맞이하여 삶의 질과 외모에 대한 관심이 고조되고 있다.
두피로부터 모발이 빠지는 탈모증은 여러 가지 요인에 의해 발생되는 데, 예를 들어, 유전적인 체질이나 남성 호르몬의 작용과 같은 내적인 요인; 일상생활에서의 정신적인 스트레스; 및 두피에서의 과산화지질의 축적과 같은 외적인 요인을 포함하고, 매우 복잡한 과정을 통해 탈모 증상이 야기되는 것으로 알려져 있다.
대머리는 머리털이 빠져서 나지 않는 것이 아니고 점차 가늘어져 솜털로 되는 것이고, 진행되면서 모근에 존재하는 모유두가 작아진다. 모유두가 작아지면 머리털의 굵기도 가늘어지면 동시에 모주기도 짧아지며 새로 자라나온 털은 더욱 가늘어진다. 대머리가 계속 진행되면 머리털은 솜털로 변하며 모주기는 더욱 짧아져 조금 자란 후 빠진다. 또한 자가 면역 질환으로 발생된다고 알려진 원형 탈모증과 내분비 질환, 영양 결핍, 약물, 출산 등 신체적, 정신적 스트레스 후 발생하는 일시적인 탈모도 관심을 받고 있다.
최근에는 남성형 탈모뿐만 아니라 여성들의 비만성 탈모를 비롯하여 젊은 층에서의 탈모가 점차 확산되어가는 추세에 있다. 2009년 국민건강보험공단 건강정책연구원 발간 자료에 의하면 2008년 국내 탈모진료 환자 수는 2001년과 비교하여 60% 이상 증가 하였다. 뿐만 아니라, 어린이와 청소년 탈모환자의 수는 2006년 2만 1643명에서 2011년 2만 3025명으로 5년 새 6.4% 가량 증가하고 있다.
이러한 탈모현상을 개선하기 위해 많은 종류의 모발성장 또는 발모제가 시판되고 있다. 현재 국내 탈모 서비스 시장 규모는 Economy21 자료에 의하면, 화장품 및 의약외품은 80%, 의약품은 20% 수준이고, 그 중에서도 병원을 찾는 탈모증 인구는 5%뿐이다. 현재 발모관리제품 사용자 중 불만족자는 72.7% 수준이고, 공인된 미국 식약의약품안전청(FDA) 승인 약물치료제는 지금으로부터 약 15년 전 1998년에 출시된 미녹시딜(Minoxidil)제제와 피나스테라이드(Finasteride)제제 2가지 외에는 검증된 치료법이 없어 다양한 탈모 원인들을 두 가지 치료제 제제만으로는 완치될 수 없는 실정이다. 특히 피나스테리드 제제로 만들어진 프로페시아(Propecia)는 탈모 방지제이지 발모제도 아니다. 프로페시아는 5-α 리덕타아제를 차단함으로써 DHT생성을 억제하여 남성형 탈모 증세가 진행 되는 것을 최대한 늦추는 효과가 있을 뿐이다.
현재 시판중인 모발성장 또는 발모제(예컨대, 미녹시딜, 피나스테라이드)의 경우, 호르몬제 적용에 따른 부작용 문제, 또는 모근이 활성화 되어있는 부위에서만 효과를 나타내기 때문에 탈모방지에는 효과가 있지만 장기간 휴지기 상태에 있는 모발의 성장(즉, 발모) 효과는 미미하거나, 지속적으로 먹거나 발라주어야만 효과를 발휘하는 등의 문제가 있어 탈모증이나 박모증 해결을 위한 경제적이고 안정적인 기술개발이 필요한 상황이다. 국내 탈모증 치료제 연구개발은 선진국과 비교하여 기술적으로 부족한 위치이고, 탈모방지 및 발모촉진, 모발의 재생과 관련된 연구 및 개발은 매우 시급한 실정이다. 탈모관련 연구는 1950년 이후 모발 및 모근 재생 관련 논문이 발표 되었으나 재현성 부족 등으로 지난 50년 동안 모발 재생은 불가능한 것으로 인식되었다.
그러나 1990년 미국 펜실베니아 의과대학교 Costarelis 교수는 모낭 줄기세포를 처음으로 발견 하고(Cell, 1990), 사람의 모낭 줄기세포를 처음으로 분리를 성공하여 (J.Clin.Invest, 2006) 그 동안 재현이 불가능하였던 모낭의 재생 가능성에 대한 결과를 발표 함으로서(Nature, 2007) 대머리 자체를 근본적으로 치유하려는 연구 가능성을 열어 주었다.
최근 유전자를 이용한 탈모 치료 방법 및 줄기세포를 이용한 탈모 치료 방법이 개발되고 있다. 본 발명의 배경이 되는 기술로 대한민국 등록특허 10-0771171(2007.10.29)에는 모낭 줄기세포를 분리, 증식하여, 모낭 세포로 분화시키는 방법 및 대머리 치료용 조성물에 대해 기재되어 있고, 대한민국 공개특허 10-2008-0097593(2008.11.06.)에는 지방조직 유래 줄기세포 및 모낭세포를 적절히 혼합하여 조성된 세포치료제에 대해 기재되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 10-1218101(2013.01.03.)에는 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모 방지용 조성물에 관해 기재되어 있다.
그러나, 줄기세포를 이용하는 이들의 발모 효능이 충분하지 않아 여전히 탈모 치료제로서 줄기세포들을 이용한 다양한 시도들이 이루어지고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용하여 이들의 발모 효능을 연구하던 중, 헤어 손실 유발 물질로 알려져 있는 TGF-β를 제대혈 유래 줄기세포에 처리함으로써 오히려 헤어 성장에 효과적인 단백질을 분비한다는 사실을 발견하고, 이렇게 TGF-β로 줄기세포를 자극시켜 배양한 배양액이 종래 공지의 경우보다 월등히 우수한 발모 촉진 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
선행기술 문헌
특허문헌
1. 대한민국 특허공보 제10-0771171 (2007.10.29)
2. 대한민국 특허공보 제10-1422559 (2014.07.17)
3. 대한민국 공개 특허공보 제10-2013-0009117 (2013.01.23)
4. 대한민국 공개 특허공보 제10-2014-0125735 (2014.10.29)
5. 대한민국 공개특허 10-2008-0097593 (2008.11.06.)
6. 대한민국 등록특허 10-1218101 (2013.01.03.)
비특허문헌
1. Dong L, Hao H, Xia L, Liu J, Ti D, Tong C, Hou Q, Han Q, Zhao Y, Liu H, Fu X, Han W; Treatment of MSCs with Wnt1a-conditioned medium activates DP cells and promotes hair follicle regrowth.; Sci Rep. 2014 Jun 25;4:5432. doi: 10.1038/srep05432.
2. Park BS, Kim WS, Choi JS, Kim HK, Won JH, Ohkubo F, Fukuoka H.; Hair growth stimulated by conditioned medium of adipose-derived stem cells is enhanced by hypoxia: evidence of increased growth factor secretion. ; Biomed Res. 2010 Feb;31(1):27-34.
3. Jeong YM, Sung YK, Kim WK, Kim JH, Kwack MH, Yoon I, Kim DD, Sung JH.; Ultraviolet B preconditioning enhances the hair growth-promoting effects of adipose-derived stem cells via generation of reactive oxygen species.; Stem Cells Dev. 2013 Jan 1;22(1):158-68. doi: 10.1089/scd.2012.0167. Epub 2012 Aug 13.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허가 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 줄기세포를 자극하여 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질을 분비시키는, 특정 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액을 이용한 것으로,
본 발명의 주요한 목적은 특정 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 탈모를 방지하고 발모를 촉진시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 효과적으로 이용하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 TGF-β를 포함하는 특정 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로 줄기세포를 자극하여 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질을 분비시킴으로써 매우 효과적으로 헤어를 성장시키는 기능을 이용하는 다양한 용도를 제공한다.
일 구체예로서, TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공한다. 바람직하게는 TGF-β를 포함하는 1 이상의 인자에 의해 자극된 줄기세포 배양액을 제공한다.
탈모 방지 및 발모 촉진 효과는 상기 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포가 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질로 알려진 Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 등을 분비시키는 효과를 가지기 때문인 것으로,
보다 구체적으로는 상기 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은
(i) 헤어 주기(hair cycle) 중 휴지기(telogen phage)에서 성장기(anagen phage)로의 전환 시간 단축,
(ii) 모유두(dermal papilla) 세포 생성 및 길이 성장의 촉진,
(iii) 모낭의 수 및 크기 증가, 및
(iv) 두피 피부의 두께 증가 등의 효능을 보유하고 있기 때문이다..
이 때, 상기 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 지방 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래의 인간조직 성체 줄기세포, 및 배아 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 골수 유래, 제대혈 유래, 또는 지방 유래; 더욱 바람직하게는 제대혈 유래의 성체 줄기세포, 예를 들어, 제대혈 유래의 간엽줄기세포가 가장 바람직하다. 나아가 상기 제대혈은 인간 유래의 것을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은 최종 농도가 10 내지 30%인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 최종 농도 25%를 이루고 있는 것이 좋다.
또한, 상기 배양액은 기본 배지로 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지를 사용할 수 있으며, 비제한적인 예로서, MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), KM(Keratinocyte Medium)를 들 수 있다. 바람직하게는 KM(Keratinocyte medium), KBM(Keratinocyte Basal medium), EpiLife KM(Keratinocyte-EpiLife medium) 배지를 사용한다.
특히, 상기 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은, 예를 들어, 줄기세포에 이를 첨가하여 22~26 시간 동안 줄기세포를 자극시킨 후, 1일 내지 3일로부터 선택된 기간 동안 배양시켜 수득할 수 있다. 보다 구체적인 예는 본 발명의 실시예를 참조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 줄기세포 배양기간 동안 TGF-β를 포함하는 상기 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포가 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질로 알려진 Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 등을 분비하는 바, 본 발명의 줄기세포 배양액은 이러한 Wnt3a, Bcl-2, 및 CyclinD-1로 구성된 군에서 선택되는 1이상의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물의 형태로 제조하여 제공할 수 있다.
한편, 본 발명은 다른 구체예로서, 상기 설명한 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 바람직한 이용방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서 상기 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진 조성물을 이용하는, 발모를 촉진하는 탈모 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법들에 있어서, 바람직하게는 국부 도포법(topical spreading) 또는 주사법(injection)을 이용하여 경피 투여로 투여하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 국부 도포법을 이용한다.
이처럼, 본 발명은 헤어 손실 유발 물질로 알려져 있는 TGF-β, BMP 등의 모발 퇴행기 유도인자, 가장 바람직하게는 TGF-β를 포함하는 인자를 줄기세포에 처리함으로써, 오히려 헤어 성장에 효과적인 단백질을 분비시킬 수 있다는 사실의 발견에 기초한 것으로, 상기 자극된 줄기세포 배양액의 우수한 탈모 방지 및 발모 촉진 효능 및 이의 다양한 용도를 모두 제공한다.
도 1은 TGF-β로 자극된 다양한 소스 유래 줄기세포 배양액 및 대조군을 처리한 hDPCs의 세포 증식능을 평가한 그래프이다.
도 2는 TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액에 함유되어 있는 모발조직분화와 관련된 신호전달체계 관련 단백질 발현 수준을 확인한 웨스텃 블랏 실험 결과이다.
도 3은 TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액 및 대조군을 처리한 후의 DP 세포의 길이 성장을 확인한 결과이다.
도 4는 TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액 및 대조군을 처리한 후의 모낭 형성 수에 대한 그래프 및 입체 현미경 사진이다.
도 5는 TGF-β로 자극된 제대혈 유래 줄기세포 배양액 및 대조군을 CH3 마우스에 3주간 도포 처리한 후, 헤어 성장 양상을 확인한 사진이다.
도 5는 TGF-β로 자극된 지방 및 골수 유래 줄기세포 배양액 및 대조군을 CH3 마우스에 4주(28일)간 도포 처리한 후, 헤어 성장 양상을 확인한 사진이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"발모 촉진" 또는 "탈모 방지"는 서로 유사한 의미를 가지는 용어로서, 당업계에서 헤어 생성 및 헤어 성장을 촉진하고 헤어가 빠지거나 약해지는 것을 방지하는 효과를 모두 포함한다.
"줄기세포(stem cell)"는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.
"(중)간엽줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포의 한 종류로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 성체 줄기세포 중 조혈모세포는 주로 부유상태(non-adherent)로 존재하지만 간엽줄기세포는 주로 부착성 세포들이다. 특히, 제대 유래 간엽줄기세포, 제대혈 유래 간엽줄기세포, 골수 유래 간엽줄기세포, 지방 유래 간엽줄기세포, 근육 유래 간엽줄기세포, 신경 유래 간엽줄기세포, 피부 유래 간엽줄기세포, 양막 유래 간엽줄기세포 및 태반 유래 간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 유래 간엽줄기세포이다. 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.
"줄기세포 배양액"이란 줄기세포를 배양하여 얻은 배지에 포함된 구성 성분을 포함하는 물질로서, 상기 배양액을 제조하기 위한 줄기세포는 그 종류에 제한을 받지 않는다. 예를 들면, 배양액을 제조하는 줄기세포는 배아 줄기세포일 수 있고 또한 성체 줄기세포일 수 있다. 나아가 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체 줄기세포에서 유래할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 제대혈 유래 성체 줄기세포를 사용하여 배양액을 제조하였다. 바람직하게는 줄기세포에 TGF-β를 첨가하여 22~26 시간 동안 줄기세포를 자극시킨 후, 1일 내지 3일로부터 선택된 기간 동안 배양시켜 수득할 수 있다.
"분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다.
세포의 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다.
"배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 줄기세포의 성장 및 증식을 위한 배지이다.
"기본배지"는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 본 발명에서는 탈모의 진행을 완화 또는 지연시키거나 발모의 촉진을 개선시키는 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다. .
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 특정 인자들을 처리한 줄기세포의 배양액의 특정 기능, 즉, 탈모 방지 및 발모 촉진 기능 및 이의 이용에 관한 것이다.,
본 발명의 줄기세포 배양액의 현저한 탈모 방지 및 발모 촉진 기능 향상을 위해 사용될 수 있는 인자는 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로서, TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 인자이다. 가장 바람직하게는 TGF-β를 포함시켜 사용한다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로서, 소스 유래에 따라 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게는 다양한 기원 조직으로부터 유래된 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포를 사용할 수 있다. 특히, 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)인 것이 바람직하다. 상기 간엽줄기세포는 일반적으로 조혈작용을 돕는 지지세포(stroma)로서, 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포로 분화하는 능력을 지녔으며, 미분화상태를 유지하면서 쉽게 증식시킬 수 있는 특징이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 지방, 골수 및 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSCs)를 사용하였다.
가장 바람직하게는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용한다.
제대혈이란 출산 때 탯줄에서 나오는 탯줄혈액을 말하는 것으로, 백혈구와 적혈구,혈소판 등을 만드는 조혈모세포 및 혈관내피전구세포를 다량 함유하고, 연골과 뼈, 근육, 신경 등을 만드는 간엽줄기세포도 갖고 있어 의료가치가 매우 높다. 제대혈의 특성은 조혈모세포 수가 골수나 말초혈에 비하여 높은 농도로 존재할 뿐 아니라, 그 성숙도가 더욱 미숙하며 골수에서 발견되는 조혈모세포보다도 증식, 자기 복제 및 분화능력이 훨씬 뛰어나다는 것이다. 또한, 버려지는 제대(Umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있으므로, 본 발명의 바람직한 일 태양은 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 간엽줄기세포(hUCB-MSC)를 이용하는 것이다.
특히, 상기 제대혈 유래 간엽줄기세포는 (i) 세포치료제로 이용할 때, 타 조직 유래 줄기세포와 달리 면역 거부 반응이 거의 없고, (ii) 통상적으로 버려지는 태반 및 제대로부터 채취하므로 줄기세포 수득에 있어서 대상자의 고통이 수반되지 않으며 (iii) 적용할 때, 질환이 있는 부위로 직접적인 투여가 가능하다. 이 때, 실제 해당 부위에 이식되면 파라크린 효과(paracrine effect)가 활성화되어 질환 부위를 치료, 재생 또는 회복시킬 수 있는 세크리톰 인자(secretome factors)(단백질, 사이토카인)을 분비시켜 치유하게 하는 장점이 있다.
상기와 같이 채취된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리ㆍ배양하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용할 수 있고(Pittinger MF, Mackay AM, et al.,Science, 284:143-7, 1999; Lazarus HM, Haynesworth SE, et al., Bone Marrow Transplant, 16:557-64,1995), 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-0494265호의 방법을 비롯하여 기존에 사용되어 온 방법을 사용할 수 있다. 일 구체예로서 다음을 들 수 있다.
채취된 제대혈을 원심분리하여 단핵세포들을 분리한 후, 여러 번 세척하여 이물질들을 제거한다. 세척 후 적절한 밀도로 단핵세포들을 배양용기에 심어 배양하면, 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는데 이 중 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성(homogeneous)이면서, 방추형 모양(spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 콜로니 형태로 증식하는 세포가 간엽줄기세포이다. 이후 세포가 컨플루언트(confluent)한 정도로 자라게 되면 계대배양을 실시하여, 필요한 만큼의 세포수가 될 때까지 증식시킨다.
특히, 본 발명은 상기 줄기세포, 바람직하게는 특정 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)를 처리하여 줄기세포를 자극시키는 것을 특징으로 한다. 상기 퇴행기 유도인자(catagen inducer)는 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1이상의 인자를 포함하고, 가장 바람직하게는 TGF-β을 포함한다.
상기 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)는 세포 부피 대비 농도 8~15ng/ml, 바람직하게는 8~12ng/ml, 가장 바람직하게는 9~11ng/ml로 처리한다. 본 발명의 일 실시예에서는 세포 컨플루언스가 80% 이상으로 판단되는 시점에서 약 10 ng/ml로 처리하였다.
상기 TGF-β는 다양한 기능을 가진 사이토카인으로서 세포질에 존재하는 전사인자인 Smads를 통해 TGF-β 관련 유전자의 발현을 조절하여 세포의 성장과 분화,염증반응,세포 사멸프로그램 및 세포의 매트릭스 합성에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있는 물질로서, 모낭 세포의 괴사에도 관여하는 것으로 보고되고 있다.
탈모의 가장 큰 원인은 디하이드로테스토스테론(DHT)이라는 호르몬이 테스토스테론과 5-알파 리덕타아제(5-α-reductaes)라는 환원효소에 결합하여 정상적인 모발세포에 DHT가 들어와 핵의 DNA 세포파괴 신호를 전달시켜서 발생하는 것으로 알려져 있다. 이때 모발 세포의 DNA 파괴 신호에 의해 모낭 세포괴사인자(Cell Apoptosis Factor)이 주변 모낭세포를 공격하여 모낭의 소형화를 일으키거나 파괴하여 머리카락이 빠지게 되는데 이러한 모낭 세포괴사인자로 알려진 것들은 BMP, DKK-1, TGF-β가 있다. (J.Cell.Sci 2006, J.Anat.2003). 즉, 상기 TGF-β 또는 BMP 등은 헤어 손실(hair loss) 유발 물질로 알려져 있는 물질이다.
그러므로, 이들을 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 위해 줄기세포에 처리한다는 것은 당업자에게 있어서도 쉽게 생각하기 어려운 기술적 사항이지만, 본 발명의 중요한 일 특징을 이루는 구성이다.
본 발명자들은 상기 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자를 줄기세포에 처리하여, 줄기세포를 자극시키면 헤어 성장에 효과적인 물질들을 분비시킬 수 있음을 처음으로 규명하였다.
상기 인자로 자극된 줄기세포는 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질로 알려진 Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 등을 분비하고, 이러한 단백질들에 의해 탈모 방지 및 발모 촉진 기능이 더욱 향상될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은 상기 Wnt3a, Bcl-2, 및 CyclinD-1로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 단백질을 포함한다.
바람직한 일 구체예로서, 모발 퇴행기 유도인자, 예를 들어, TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액은 줄기세포에 TGF-β를 첨가하여 22~26 시간, 가장 바람직하게는 약 24시간 동안 줄기세포를 자극시키는 방법에 의해 수득할 수 있다. 자극된 줄기세포는 1일 내지 3일로부터 선택된 기간 동안 배양하여 사용하는 것이 바람직하다. 대표적인 제조방법은 본 발명 명세서 실시예를 참조할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 다른 구체예로서, 상기 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로 줄기세포를 자극시켜 배양하는 것을 특징으로 하는, 탈모 방지 및 발모 촉진용 줄기세포 배양액 제조방법을 포함한다.
상기 줄기세포 배양액은 최종 농도가 약 10 내지 50%, 더욱 바람직하게는 10 내지 30%, 더더욱 바람직하게는 20~30%가 되도록 하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 약 25%의 최종 농도를 형성토록 제조한다.
이 때, 본 발명에 따른 줄기세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용 가능한 배지를 사용할 수 있다.
상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), KM(Keratinocyte Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), KM(Keratinocyte medium), KBM(Keratinocyte Basal medium), EpiLife KM(Keratinocyte-EpiLife medium) 배지, DMEM 배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다. 그러나 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 다양한 조직 기원 유래 줄기세포에 가장 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다. 일 구체예에서는 α-MEM 배지, K-SFM 배지 등을 사용하였다.
또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.
일 구체예로서, 간엽줄기세포를 α-MEM 배지에서 세포 컨플루언스가 약 80~90%, 바람직하게는 약 컨플루언스 90% 정도로 증식될 때까지 배양하고, 예를 들어, PBS 등을 사용하여 세척한 다음, 이어서 K-SFM 배지에서 약 20~25 시간, 바람직하게는 24시간 동안 추가 배양할 수 있다.
"컨플루언스(%)"라는 용어는 '면적당 세포농도(포화도)'를 표현하는, 당업계에서 통상적으로 사용되는 용어로, 세포 배양에 있어서 단위 면적당 세포수(세포농도)를 상대적으로 나타내는, 당업자들이 실험에 있어서 자주 사용하는 단위이다. 본 발명은 이러한 8㎛이하의 작은 크기의 줄기세포 및 이의 배양액을 제조하는 방법도 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 배지에서 배양된 줄기세포를 트립신으로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양된 줄기세포에 트립신을 처리하면 단세포 형태의 줄기세포를 얻을 수 있는데, 이때 트립신은 세포 간의 응집을 억제하여 세포가 단세포(single cell)의 형태를 갖도록 처리되는 것으로, 세포 간의 응집 형성을 억제할 수 있는 물질이면 대체하여 사용할 수 있다.
상기 줄기세포의 배양은 통상적으로 알려진 용기를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 3차원 생물반응장치(bioreactor 또는 spinner)를 이용하여 배양하거나, 일반 부착성 용기에서 배양할 수 있다.
본 발명은 상기 설명한 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액이 가지는 유난히 뛰어한 탈모 방지 및 발모 촉진 기능의 이용에 관한 것이다.
특히, 상기 인자로 자극된 줄기세포 배양액은 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질로 알려진 Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 등을 함유하고 있어, 단순히 탈모 증상을 늦추는 효과만 있는 것이 아니라, 실제 모유두(dermal papilla) 세포 생성 및 길이 성장의 촉진, 모낭의 수 및 크기 증가, 두피 조직의 두께 증가 등의 효과에 의해 발모능, 즉 헤어 생성 및 성장 효과도 가지고 있다.
탈모의 원인이 되는 DHT를 감소시키는 약물로 지금까지 사용화되고 있는 것은 피나스테리드 (finasteride)제제로 만들어진 프로페시아(propecia)가 있다. 그러나 이 약물은 5-알파 리덕타아제 작용을 억제시켜 DHT가 감소되어 탈모를 치료하는 원리로서 프로페시아가 5-α 리덕타아제를 차단함으로써 DHT생성을 억제하여 남성형 탈모 증세가 진행되는 것을 최대한 늦추는 효과가 있을 뿐이기 때문에 남성에게 해당되는 치료제이고 탈모 방지제이지 발모제도 아니라는 한계를 가지고 있었다.
그러나, 본 발명의 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자, 가장 바람직하게는 TGF-β를 포함하는 인자로 자극된 줄기세포 배양액은 탈모 방지제이면서 동시에 우수한 발모제로서 기능하는 장점이 있다.
이하, 본 발명의 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액의 탈모 방지 및 발모 촉진 기능 특성에 대해 기술한다.
(i) 헤어 주기 중 휴지기(telogen phage)로부터 성장기(anagen phage)로의 전환 시간을 단축시킨다.
인간의 모발은 주기적으로 생장기, 퇴행기, 휴지기를 반복하며 모발이 빠지고 다시 생성되는 과정을 거치게 되는데, 모발의 주기는 호르몬 조절이나 많은 성장인자 등의 조절을 통하여 이루어진다. 모유두세포는 성장이 활발한 생장기(anagen), 퇴행이 시작되는 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)의 주기를 가지고 있으며, 휴지기 이후에 인접세포로부터 신호를 전달받으면 다시 성장기로 접어들어 세포의 재생성이 이루어지며 결과적으로 새로운 모발의 생성으로 나타나게 된다.
본 발명의 상기 인자로 자극된 줄기세포 배양액은 호르몬 등에 의한 일시적 효과가 아니라, 헤어 주기 조절(hair cycle regulation)을 정상화시킴으로써 영구적 모발 성장 효과를 가진다.
(ii) 모유두(dermal papilla, DP) 세포 생성 및 길이 성장을 촉진시키고, 모낭의 수 및 크기를 현저히 증가시킨다.
모낭(hair follicle)은 포유동물만이 가지고 있는 피부의 부속기관으로 상피와 중간엽 사이의 상호작용에 의해서 태생기부터 발생이 시작되어 형성된다.
태생기에 모낭 발생은 진피의 신호에 의하여 시작되며 그 결과로 상피층이 두꺼워져 판형을 형성하게 된다. 이 두꺼워진 상피판에서 나오는 상피의 신호는 중간엽 유래의 진피세포의 응집을 유발시키게 되고, 형성된 응집체로부터 다시 진피의 신호가 나오게 된다. 이 신호는 상피세포의 증식을 촉진시키면서 동시에 상피세포의 진피내로의 침투를 유도하여 응집체의 주변을 감싸게 하고, 이 결과로 모유두가 형성된다. 이렇게 최초의 모낭구조가 발생되며 계속해서 상피세포의 증식과 분화가 이루어지면서 모발을 형성하는 성숙 모낭으로 발전하게 된다. 성숙 모낭에서 모낭 모기질 세포와 모유두 세포가 모낭의 기저막을 통해 일어나는 상호작용에 의해 모기질 세포의 특화된 분화가 일어나며, 이 결과로 모발이 생성되고 성장하게 된다. 또한 이 상호작용은 모낭의 주기를 발생시키며 기관을 유지하고 모발의 굵기 및 형태 등의 생물학적 특징을 결정한다
이와 같은 모낭에서 생물학적 특성을 조절하는 두 가지 중요한 요소는 모낭상피인 외측모근초 세포(ORS)와 중간엽 유래의 모유두(DP)이며, 모주기의 반복을 통하여 모발은 성장하고 탈락하게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는, hDPCs, ORS, hKC, HaCaT 세포를 이용하여 TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액이 DP 세포를 효과적으로 증식시킴을 확인하였다.
그리고 동물 실험을 통해 1차 DP 세포 모낭의 길이 성장 촉진, 모낭 형성능 촉진, 헤어 성장의 속도, 양이 매우 우수함을 확인하였다.
(iii) 두피 피부의 두께도 증가시킨다.
뿐만 아니라, 본 발명의 상기 인자로 자극된 줄기세포 배양액은 피부의 두께 및 길이 또한 효과적으로 증가시킴으로써, 헤어 성장과 관련된 전반적인 환경을 모두 개선시킨다.
이처럼, 본 발명은 상기 모발 퇴행기 유도인자들, 특히, TGF-β, BMP 등은 헤어 손실 유발 물질로 알려져 있는 물질이지만, 이를 줄기세포에 처리하여 오히려 헤어 성장에 효과적인 단백질들을 분비할 수 있는 신규 사실에 기초하여, 헤어 성장에 필요한 전반적인 환경들을 개선시키는 효과를 발휘한다.
본 발명의 일 실시예에서는 in vitro 및 ex vivo 실험뿐만 아니라, 마우스를 이용한 in vivo 실험을 통해 TGF-β 처리된 제대혈 유래 줄기세포 배양액의 유난히 우수한 발모 효능을 확인하였다.
발모(hair growth) 가능성을 관찰할 수 있는 in vivo 실험으로는 헤어 성장 사이클(hair growth cycle)이 정상적인 마우스에서 휴지기(telogen phase)를 단축하고 생성기(anagen phage)를 빨리 유도하는 효과를 확인함으로써 가능하다. 이 때, 마우스는 멜라닌 색깔(melanin color)을 가지는 헤어를 관찰할 수 있는 C57/BL6 마우스 또는 C3H 마우스를 사용하는 경우가 통상적이다. 발모를 가능하게 하는 DP 증식 및 헤어 모낭 증식을 관찰할 수 있는 누드 마우스를 사용한다. 본 발명에서도 발모 효능 확인에 사용하고 있는, 종래 당업자에게 공지된 임의의 마우스를 사용하여도 무방하다.
그러나, 바람직하게는 C3H 마우스를 사용하는 것이 좋다. 휴지기가 보통 2주 정도인 일반적 마우스와 달리, C3H 마우스는 최소 4주 이상 유지 가능하므로 원형 탈모증 마우스 모델로 더욱 유용하다. 즉, C3H 마우스의 헤어 성장 주기를 생성기로 유도시키는 효능을 확인함으로써 발모능의 우수한 정도를 평가할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 일 관점에서 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자, 가장 바람직하게는 TGF-β가 포함된 인자로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진 조성물 및 이의 제조 방법, 그리고 이를 이용하는 탈모 방지 및 발모 촉진 방법에 관한 것이다.
세포독성을 나타내지 않는 범위의 유효 농도로 10~50%(v/v), 바람직하게는 약 10~30%(v/v)으로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 20~30%(v/v)이고, 가장 바람직하게는 25%(v/v)로 함유될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 구체예로서, 약학적 조성물 및/또는 화장료 조성물을 포함한다.
약학적 조성물
본 발명은 다른 관점에서 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자, 가장 바람직하게는 TGF-β가 포함된 인자로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모 방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
탈모는 크게 반흔성 탈모와 비반흔성 탈모로 구분되고, 비반흔성 탈모에는 선천성탈모, 남성형탈모, 원형탈모 등이 포함되는데, 본 발명에서는 이러한 경우를 모두 포함할 뿐만 아니라 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 이에 한정되는 것이 아니며 1일 당 0.01-2000 mg/kg(체중)일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구로 투여한다. 본 발명의 약학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 피부에 국소적(국부적)으로 적용되는 방식으로 투여되는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 부위는 두피뿐만 아니라 발모를 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다. 예를 들면, 외상으로 인한 흉터로 모발 또는 털이 손상된 부위 또는 단순 미용효과를 목적으로 하는 넓은 이마 또는 M형 이마, 속눈썹 또는 눈썹 및 무모증의 상태 호전에도 사용할 수 있다.
바람직하게는 도포법 또는 주사법을 이용한, 더욱 바람직하게는 도포법을 이용한 경피 투여 방법으로 본 발명의 조성물을 투여한다.
이 때, 도포법을 이용하는 경우에는 본 발명의 조성물은 간단하게 1회 내지 3회 정도 두피에 도포하는 것만으로도 우수한 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 발휘할 수 있는 장점이 있다.
또한, 주사법을 사용하는 경우에는, 피부 내 진피층으로의 확산이 충분히 이루어진 후 모세혈관으로 이행될 수 있도록, 즉, 진피층을 짧게 지나면서 즉시 체내로 흘러가는 것을 방지하기 위해 실린지의 바늘끝 구멍을 위로 향하는 상태로 진피층에 주입하는 것이 좋다.
화장료 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서, TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자, 가장 바람직하게는 TGF-β가 포함된 인자로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 통상의 첨가제를 가하여 모발성장촉진을 위한 샴푸, 헤어린스, 헤어토닉, 헤어젤, 헤어로션, 헤어팩, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어트리트먼트, 염모제, 헤어컨디셔너, 이들의 혼합형, 예컨대, 샴푸와 린스의 혼합형, 린스와 트리트먼트의 혼합형, 액상의 발모제 타입 등의 조성물로 제조될 수 있으며, 이들 제형의 에어졸 타입도 포함한다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제조는 통상적으로 사용되는 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다.
상기 탈모 예방 및 발모 촉진용 화장료 조성물은 두피나 모발에 직접 도포하거나 주입하는 등의 경피 투여 방법으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함된 유효성분인 혼합 추출물의 도포량은 성인 기준으로 40mg/kg 이하이며, 바람직하게는 20mg/kg 내지 40mg/kg이다.
조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법을 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 보호 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
탈모 치료 방법
또한, 본 발명은 다른 관점에서 TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF, 및 BMP2/4군으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자, 가장 바람직하게는 TGF-β가 포함된 인자로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진 조성물을 이용하는, 발모를 촉진하는 탈모 치료 방법에 관한 것이다.
상기 탈모 치료방법에 있어서, 사용하는 줄기세포 배양액 또는 조성물에 관한 구체적인 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 탈모 치료방법에 있어서, 특히, 도포법 또는 주사법을 이용한 경피 투여 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 이 때, 피부 내 진피층으로의 확산이 충분히 이루어진 후 모세혈관으로 이행될 수 있도록, 즉, 진피층을 짧게 지나면서 즉시 체내로 흘러가는 것을 방지하기 위해 실린지의 바늘끝 구멍을 위로 향하는 상태로 진피층에 본 발명의 유효성분을 주입하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이, 앞서 설명한 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액의 기능을, 약학적 조성물 및 화장료 조성물 중심으로 설명하였으나, 본 발명은 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진 효과에 대한 다양한 형태의 조성물 및 이들의 이용방법으로서 다양하게 활용할 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명하다 할 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명자들은 해당 실시예에서는 제대혈, 지방 및 골수 유래 줄기세포 및 TGF-β를 이용하였지만, 그 밖의 다른 소스 유래 줄기세포와 다른 모발 퇴행기 유도인자(Current Biology 19, R132-R142, February 10, 2009; J Invest Dermatol 124:675-685, 2005)도 이용할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
재료 및 방법
1. 줄기세포 배양액 준비
(1) 줄기세포 분리 및 배양
본 발명에서는 메디포스트(주)(한국)에서 제공받은 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용하였다. 상기 세포는 제대혈 채취 단계 및 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리 및 배양하는 단계로부터 얻어질 수 있으며, 각 단계에 대한 자세한 내용은 다음과 같다
제대혈 채취 단계에서는, 정상질식분만의 경우, 아기출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취하거나, 또는 제왕절개의 경우에는 아기 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다.
본 발명에서 출산 후 자궁 밖으로 만출된 제대 정맥으로부터 제대혈을 채취할 때는, 신생아가 태어난 후 태반과 태아를 연결하고 있던 제대정맥으로부터 무균적 조작법에 의해 채취한다. 제대정맥을 확보한 후, 채취 침을 이용하여 항응고제가 함유된 제대혈 채취백(주머니)에 제대혈을 채취한다.
상기와 같이 채취된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리ㆍ배양하는 방법은 대한민국 등록특허 제10-0494265호의 방법을 비롯하여 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할 수 있다(Pittinger MF, Mackay AM, et al.,Science, 284: 143-7, 1999; Lazarus HM, Haynesworth SE, et al., Bone Marrow Transplant, 16: 557-64,1995).
본 발명자들은 채취된 제대혈을 원심분리하여 단핵 세포들을 분리한 후, 여러 번 세척하여 이물질들을 제거하고. 세척 후 적절한 밀도로 단핵 세포들을 배양용기에 심어 배양하였다. 단일층을 이루면서 세포들이 증식하면, 이들 중에서 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성(homogeneous)이면서, 방추형 모양(spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 콜로니 형태로 증식하는 세포가 간엽줄기세포임을 확인하였다. 그리고, 세포가 컨플루언트(confluent)한 정도로 자라게 되면 계대배양을 실시하여, 필요한 만큼의 세포 수가 될 때까지 증식시켰다.
또한, 지방세포(Adipocyte)(ATCC, USA) 및 골수(Bone marrow) 유래 세포(LONZA, USA) MSC도 배양하여 추가 실험에 사용하였다. 이들을 각각 AD-MSC 및 BM-MSC로 이하 기재한다.
(2) 샘플군 배양액(Conditioned Media) 제조
hUCB-MSC, AD-MSC 및 BM-MSC로부터 각각 샘플군 배양액(conditioned media)을 제조하였다. 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서, 저장상태(LN2 tank에 보관함)의 세포를 해동하여 배양하고, 이 때 2% FBS를 함유하는 α-MEM(GIBCO) 배지에서 세포 컨플루언스가 90% 정도로 증식될 때까지 배양하였다.
그 후, PBS(phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 페놀 레드(phenol red)가 첨가되지 않은 케라티노사이트 배지에서 24시간 배양한 다음 배양액을 수거하였고, 이를 3일 동안 반복하여 수행하였다. 그리고, 수거한 배양액은 각각 필터링(Top Filer System, Nunc)한 후 냉장 및 냉동 보관하여 사용하였다.
(3) 자극된 배양액(Stimulated CM) 제조
CM을 만드는 방법과 앞서 기재한 방법과 거의 동일하나, 제대혈, 지방 및 골수 유래 줄기세포를 배양할 때, 페놀 레드(phenol red)가 없는 배지에서 TGF-β (10ng/ml)을 처리하여 24시간 동안 줄기세포를 자극시켰다.
상기 TGF-β를 처리한 배지를 PBS로 3회 세척 후, 페놀 레드가 첨가되지 않은 K-SFM 새 배지로 교체하고, 24시간 배양을 3일 동안 반복하고 수거하였다. 상기 수거한 TGF-β 처리된 배양액을 각각 필터링 한 후, 실험에 사용시 페놀 레드가 첨가되지 않은 K-SFM배지에 최종 농도가 10%, 25%, 50% 되게 희석하여 사용하였다.
2. 헤어 성장 관찰용 C3H 마우스 준비
실험을 위한 장소로는 메디포스트 (IRB승인번호: 131021-1) 및 경기 바이오센터(IACUC 과제번호: IACUC2014-4-10)를 이용하였고, C3H 마우스는 (주)새론바이오로부터 구입한 후 Jackson lab에서 제작하였다.
특히, 본 발명의 실험에 사용한 C3H 마우스(Jackson lab, Japan)는 헤어를 제거하면 휴지기를 시작하게 되는데 다른 종과는 달리 성장기로 전환하기까지의 시간이 매우 길어서 발모 효능 모델로 사용되는 마우스이다. 즉, 다른 마우스 종과 달리, 휴지기 유도 약물 처리 없이도 휴지기 기간이 매우 길어서 발모 효능을 확인하기에 우수한 동물 모델이다(Journal of Investigative Dermatology (2005) 124, 288-289).
상기 C3H 마우스는 모발이 자라는 시기인 성장기에는 피부의 표면이 검정색으로 변하고 모발이 퇴행기 시기에 있을 때는 핑크색을 나타내므로, 마우스의 피부색을 관찰함으로써 모발이 자라는 시기를 확인할 수 있다.
본 발명자들은 7주령의 C3H 마우스를 입수하고 1주일의 순화 과정을 통해 환경에 적응할 수 있도록 하였다. 그리고, 본 발명의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액을 상기 마우스 모델에 접종하여 헤어 주기의 휴지기(퇴행기) 및 이로부터 성장기로 전환되는 시점을 관찰하고자 하였다. 본 실시예에서는 PBS을 주입한 경우를 음성 대조군으로 사용하였다.
한편, 제모를 위해 상기 마우스를 마취시켰다. 마취제는 5ml zoletil (Bar code # 3UHC, Korea)에 3.36ml Rompun (바이엘코리아주식회사, 2094L, Korea)을 섞어준 후, 식염수(saline) 7.47ml(중외제약, REG# 10055, Korea)을 첨가함으로써 15.83ml 용액을 제조한 후, 인슐린 주사기(BD Ultra-FineTM II, Korea)를 이용하여 상기 용액 20ul 로 마우스를 마취시켰다.
그리고, 마취가 됐음을 확인 후 헤어 트리머(hair trimmer)를 이용하여 마우스를 제모하였다. 상기 마우스를 깨끗한 종이에 올리고 털이 자란 방향과 반대방향으로 털을 1차 제거한 후, 24시간 동안 방치한 다음 재차 확인하여 남아있는 잔여 털을 제거하였다.
3. 본 발명의 줄기세포 배양액의 국부적 도포
국부적(topical) 방법으로는, 상기 마취제를 투여한 마우스의 피부 외층으로 본 발명의 배양액을 100ul씩 12시간 간격으로 도포하고 8번 같은 방향으로 문질러서 주변에 묻지 않도록 하면서 피부에 스며들도록 하였다. 상기 배양액은 100μl씩 4 포인트에 도포하고 매일 육안 관찰을 통해 헤어 성장의 양, 두께, 색 위치 등을 관찰하였다.
4. MTT 분석
세포의 독성 및 증식을 시험하기 위하여 각각의 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양 한 후, 24시간 기아상태를 유지하고, 이후 각각의 실험 조건으로 24, 48, 72, 96시간 배양하였다.
그리고 완료된 각각의 실험군은 MTT 분석을 통해 세포 독성 및 증식률을 측정하였다. 실험의 신뢰성 확보 실험을 세 번 이상 반복하여 확인하였다.
MTT 분석 실험법 확립 배양이 완료된 각각의 실험군에 5mg/ml 농도 MTT시약을 최종농도 1 mg/ml이 되도록 처리하여 4시간 추가 배양하였고, 상등액을 버리고 DMSO로 녹인 후, 그 용액을 200 μl씩 96 웰 플레이트에 옮겨 ELISA 리더기의 570nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
5. 1차 세포로서 Primary hDPCs 및 Primary ORS 분리
후두부 생검 조직을 식염수에 넣어 준비하고, 블레이드(blade)로 하나의 모낭 유닛(Follicular unit)으로 분리하여 벌브(bulb)를 자른 후, 모간(hair shaft)을 제거하였다. 두 개의 주사기(syringe) 중 한 쪽은 헤어 벌브의 아랫부분(DP의 아랫부분)을 고정하고, 다른 한쪽은 헤어 벌브의 윗부분 (DP의 윗부분)을 살짝 건드려 모유두 세포(dermal papilla, DP)가 빠져 나오도록 하였다.
주사기 끝에 모유두 세포를 올리고, DMEM+20% FBS+1% 항생제(antibiotics)+1% 훈기존(Fungizone)을 섞어 35mm 타입 I 콜라겐 코팅 디쉬에 모유두 세포(DP)를 10개 정도 넣고 10일간 배지 교환 없이 부족한 양만 첨가해 주며 배양하였다. 모유두 세포가 디쉬에 붙었는지 확인 한 후 3일에 한번씩 배지를 교환해 주고 세포 컨플루언스가 도달하거나 4주차가 되었을 때 계대 배양하여 사용하였다.
6. 패치 분석법(patch assay)
C57BL/6 마우스의 새끼를 낳은 날 바로 피부(skin)를 벗겨내고 식염수로 핏기를 제거한 후, 포비딘으로 소독하고 다시 식염수로 세척하여 포비딘을 제거하였다.
벗긴 피부로부터 지방층을 제거한 후, 콜라겐/디스파제(dispase)를 처리하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 포셉으로 진피(dermis)와 표피(epidermis)를 분리하고, 15분간 볼텍싱한 후 체(strainer)로 조직을 걸러준 후, 원심분리기로 세포를 분리( cell down)하였다. 세포를 계수하여 1*10^6개로 나누고 배양액을 100μl씩 넣은 후, 재현탁하여 세포를 풀어주었다. 누드 마우스의 등 쪽 4군데에 인슐린 실린지를 이용하여 피하에 주사하고, 주사 2주 후 피부를 생검하여 안쪽에 생성된 모낭의 개수를 확인하였다.
7. 일차 헤어 기관(primary hair organ) 배양
후두부 생검 조직을 통해 헤어 기관(hair organ)을 채취 한 후, 식염수에 넣어 준비하고, 모낭 유닛으로 트리밍(trimming)한 다음 피지선(sebaceous gland) 바로 밑까지 절단하였다. 그리고, 3일마다 배지를 갈아주고 길이를 측정하였다.
실시예 1 : TGF -β로 자극된 줄기세포 배양액의 발모효능 확인
발모(hair growth)의 시작은 DP(dermal papillar) 생성 및 증식에서 가능하므로, hUCB-MSC-CM의 DP 성장을 증가시키는 양상을 관찰하여 발모 가능성을 검토하고자하였다.
TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액과 비자극된 배양액의 발모효능 평가는 새로운 배지에 배양액(conditioned media)의 최종농도가 10%, 25%, 50% 되도록 처리하였고, 이를 in vivo 및 ex vivo 실험에 활용하였다.
1-1 in vitro 실험
primary human DPCs(human DERMAL PAPILLA CELLS)를 이용하여 in vitro 실험에서 배양액 효능을 확인하고자 하였다.
먼저, 세포의 독성 및 증식을 시험하기 위하여 각각의 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양 한 후, 24시간 기아상태를 유지 한 이후 각각의 실험 조건으로 24, 48, 72, 96시간 배양하여 MTT 분석을 통해 세포 독성 및 증식률을 측정하였다.
그 결과, 도 1 및 하기 표에 나타낸 바와 같이, TGF-β로 자극된 제대혈 유래 줄기세포 배양액에서 세포의 생존능(viability)이 가장 높게 확인되었다.
또한, 추가로 AD-MSC 및 BM-MSC에 대한 증식도 함께 관찰하였다(도 1 및 표 1).
[표 1]
Figure PCTKR2015006919-appb-I000001
이러한 결과로부터, TGF-β로 자극된 줄기세포들이 세포 증식능이 훨씬 우수하게 나타남을 알 수 있었다.
1-2 웨스턴 블럿 실험
한편, TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액들의 모발 조직 분화 관련한 신호전달 체계를 확인하기 위하여 hDPCs에 배양액 후보를 처리한 후, 모발 조직 분화와 관련된 신호전달체계의 단백질 수준을 웨스턴 블럿으로 확인하여 도 2에 도시하였다.
그 결과, TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액에서 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질로 알려진 Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 등의 발현이 높게 나타남을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 TGF-β의 자극이 줄기세포에 모발조직분화 영향력을 가지고 있음을 보여준다.
즉, 본 발명의 TGF-β로 자극된 제대혈 유래 줄기세포는 Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 등의 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질들을 효과적으로 분비함으로써 이들을 포함하는 배양액이 헤어 성장에 따른 가장 우수한 발모 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다.(도 2)
1-3 ex vivo 실험
본 발명자들은 추가로 일차 헤어 기관(Primary hair organ) 배양을 통한 발모 효능 Ex vivo 실험을 수행하였다.
이를 위해, 발모(hair growth) 가능성을 관찰할 수 있는 ex vivo 모델로서 인간 일차 DP를 인간의 두피(scalp) 조직에서 모낭을 채취하여 실험실용 플레이트에서 배양하였다. 이 때 처리하는 물질에 따라 DP 길이 성장 촉진을 비교 관찰하였다. 즉, 실험군 및 대조군을 처리하여 일차 DP 길이 성장을 관찰하였고, 효과 있는 CM을 선별 혹은 CM의 발모 효능 비교관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 비자극(non-stimulated) 배양액 및 TGF-β로 자극된 배양액이 모두, 미처리 대조군과 비교하면 헤어 증식을 유도하였지만, 특히, TGF-β로 자극된 배양액의 경우가 비자극 배양액보다 발모 효능이 더 높음을 알 수 있었다. (도3 A)
또한, 4차례의 반복 실험에서, 모낭의 성장길이를 비교하였을때, 비자극 배양액 보다 TGF-β-로 자극된 줄기세포 배양액의 경우, 모낭의 평균적 성장 길이가 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. (도3 B)
실시예 2 : 패치 분석
패치 분석 모델(Patch assay model)을 이용하여 제대혈 줄기세포에 프라이밍(Priming)된 배양액의 모낭 형성 능력을 확인코자 하였다.
패치 분석 모델로 Ex vivo 실험을 수행한 결과, 대조군인 배지 또는 비자극 배양액 처리군에 비하여 TGF-β로- 자극된 줄기세포 배양액의 경우가 1차(primary) 모낭 형성 효능이 현저히 우수한 것으로 나타났다.
특히, TGF-β-로 자극된 줄기세포 배양액에서 1차 모낭형성 수가 가장 높게 관찰되었다. (도 4A).
입체 현미경을 통한 관찰을 통해서도 배지 또는 비자극 배양액 처리군에 비하여 TGF-β-로 자극된 배양액의 경우가 모낭 형성 효과가 매우 우수함을 분명하게 확인할 수 있었다. (도 4B).
실시예 3 : 마우스에 국부 도포 처리
휴지기(telogen phase)의 C3H/HeJ 마우스에 본 발명의 배양액을 국부적으로(topical) 도포 처리하여 발모 효능을 평가하였다.
탈모 방지능 및 발모 촉진능 평가를 위해, 여러 인자들로 자극시킨 배양액을 이용하여 동물실험을 비교평가하였다. 각 마우스 등 쪽의 4 부위에, 하루에 2번씩 도포하여 발라 주고, 약 3주 후에 발모 양상을 확인하였다.
그 결과, 배지 또는 비자극 배양액 처리군에 비하여 TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액의 경우가 우수한 헤어 성장 효과를 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었고, 그 중에서도 TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액은 헤어 성장 정도에 있어서 발모 속도, 양, 두께 등 여러 부분에서 종래 보고되어 왔던 연구 결과들과 비교하여도 가장 뛰어난 효과를 보이는 것으로 관찰되었다. (도 5)
또한, 추가로 AD-MSC 및 BM-MSC에 대해서도 CM 및 TGF-β로 자극된 CM을 마우스에 도포 처리하여 28일 후 그 발모 효과를 비교 평가한 결과, TGF-β로 자극된 배양액을 도포처리한 마우스에서 헤어 성장 효과가 우수하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
이러한 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 TGF-β로 자극된 줄기세포 배양액의 헤어 성장 효과는 발모 속도, 양, 두께 등의 관점에서 매우 우수하다는 것을 in vivo 모델을 이용하여 증명할 수 있다.
이러한 결과들을 통해, 헤어 손실 유발 물질로 알려져 있는 TGF-β를 제대혈 유래 줄기세포에 처리함으로써 오히려 헤어 성장에 효과적인 단백질을 분비시킬 수 있음을 알 수 있었다.
특히, 본 발명의 TGF-β로 자극된, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 기존의 공지된 줄기세포 기반의 물질들보다 더 우수한 발모능을 보여주는 바, 탈모 방지 및 발모 촉진 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 발명에 의한 TGF-β를 포함하는 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은 모발조직 분화 관련 신호전달 단백질로 알려진 Wnt3a, Bcl-2, CyclinD-1 등을 함유하고 있다. 그러므로 헤어 주기 중 휴지기로부터 성장기로의 전환 시간을 단축하고 모유두(dermal papilla) 세포 생성 및 길이 성장의 촉진시키며, 모낭의 수 및 크기 증가, 그리고, 두피 피부의 두께도 증가시킴으로써 매우 우수한 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 나타내는 바, 이를 활용할 수 있는 분야에서 매우 유용할 것이다.

Claims (18)

  1. TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로 자극된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 모발 퇴행기 유도인자는 TGF-β를 포함하는 1 이상의 인자인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 지방 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래의 인간조직 성체 줄기세포, 및 배아 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 이상의 줄기세포를 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 줄기세포는 제대혈, 지방 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 줄기세포는 제대혈 유래인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은
    줄기세포에 모발 퇴행기 유도인자를 첨가하여 22~26 시간 동안 줄기세포를 자극시킨 후, 1일 내지 3일로부터 선택된 기간 동안 배양시켜 수득한 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은 Wnt3a, Bcl-2, 및 CyclinD-1로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은 최종 농도가 10 내지 30%인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 모발 퇴행기 유도인자로 자극된 줄기세포 배양액은 다음의 기능을 보유하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물:
    (i) 헤어 주기(hair cycle) 중 휴지기(telogen phage)에서 성장기(anagen phage)로의 전환 시간 단축,
    (ii) 모유두(dermal papilla) 세포 생성 및 길이 성장의 촉진,
    (iii) 모낭의 수 및 크기 증가, 및
    (iv) 두피 피부의 두께 증가
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
  11. TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로 줄기세포를 자극시켜 배양하는 것을 특징으로 하는, 탈모 방지 및 발모 촉진용 줄기세포 배양액 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 모발 퇴행기 유도인자는 TGF-β를 포함하는 것을 특징으로 하는, 탈모 방지 및 발모 촉진용 줄기세포 배양액 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대혈, 지방 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는, 탈모 방지 및 발모 촉진용 줄기세포 배양액 제조방법.
  14. 국부 도포법(topical spreading) 또는 주사법(injection)을 이용하여 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 경피 투여로 투여하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 이용방법.
  15. TGF-β, IFN-γ, FGF-5, IL-1β, TNF-α, K17, NT-3, NT-4, BDNF 및 BMP2/4 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 모발 퇴행기 유도인자(catagen inducer)로 자극된 줄기세포 배양액을 이용하는 탈모 치료 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 모발 퇴행기 유도인자는 TGF-β를 포함하는 1 이상의 인자인 것을 특징으로 하는 탈모 치료 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 줄기세포는 제대혈, 지방 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 탈모 치료 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 자극된 줄기세포 배양액은 Wnt3a, Bcl-2, 및 CyclinD-1로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 치료 방법.
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