WO2015056982A1 - 만능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 - Google Patents

만능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 Download PDF

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김수나
박원석
권유욱
박영배
김효수
백재승
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/02—Coculture with; Conditioned medium produced by embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present specification relates to a method for inducing pluripotent stem cells by reprogramming and / or dedifferentiating adult differentiated cells, to pluripotent stem cells prepared by the method and to a composition comprising the pluripotent stem cells.
  • the present disclosure also relates to a pharmaceutical composition or cosmetic composition comprising pluripotent stem cells.
  • the present invention also relates to a composition for stem cell activation, skin cell proliferation, skin regeneration or anti-aging.
  • Stem cells are cells capable of differentiating into the various cells constituting biological tissues, which collectively refer to the undifferentiated cells obtained before the differentiation obtained in each tissue of the embryo, fetus and adult.
  • pluripotent stem cells refer to stem cells having versatility capable of differentiating into all three germ layers of endoderm, mesoderm, and ectoderm.
  • stem cells In classifying stem cells, depending on the anatomical location, the function of the cell, the type of antigen expressed on the cell surface, the transcription factors, the proteins produced by the cell, and the stem cells They can be sorted according to the specific cell types they can produce.
  • the most commonly used and relatively clear classification of these various classifications depends on the individual from which the stem cells were isolated. When separated from the embryo (embryo) it can be divided into embryonic stem cells (ESry cells) and adult stem cells (adult stem cells) when separated from the adult.
  • embryonic stem cells embryonic stem cells
  • adult stem cells adult stem cells
  • ES cells embryonic stem Embryonic stem cells
  • adult stem cells adult stem cells
  • Embryonic stem cells formed from this inner cell mass are one individual. It can be said to be a pluripotent stem cell that has the potential to differentiate into the cells of all the tissues that make up. In other words, embryonic stem cells are undifferentiated cells capable of unlimited proliferation, can differentiate into all cells, and unlike adult stem cells, can make germ cells and can be inherited for the next generation.
  • Embryonic stem cells such pluripotent stem cells
  • Embryonic stem cells have serious religious and ethical problems of embryo destruction in the cell manufacturing process, and because of their lack of immunocompatibility between individuals due to limited embryos, transplant rejection reactions when developed as cell therapeutics can not avoid.
  • various methods have been attempted to artificially prepare cells with pluripotent cells such as embryonic stem cells or embryonic stem cells using adult-derived cells.
  • Representative methods include somatic cell nuclear transfer (SCNT), cell fusion with ES cell, and reprogramming by defined factor.
  • SCNT somatic cell nuclear transfer
  • the somatic cell nuclear transfer method has a big limitation in that its efficiency is very low and a large number of eggs are needed which can contain ethical problems.
  • the cell fusion method has a big problem in terms of cell stability because the induced cells have two more pairs of genes.
  • the most recently introduced technology, the specific factor injection method uses a virus containing a carcinogen and has a serious problem of cancer cell formation.
  • the present inventors have obtained dedifferentiated stem cells as extracts of induced pluripotent stem cells (iPS) derived from animals, but there are some limitations.
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • One aspect of the present invention is to solve the problems of the prior art as described above, to propose a method for producing a pluripotent stem cells with no ethical problems and secured stability, safety.
  • the present invention proposes a method of inducing human-derived dedifferentiated stem cells that were difficult to realize in the prior art.
  • the present inventors have developed a method that can induce pluripotent stem cells having the same genetic background as the adult from which the cells are separated using adult-derived cells, and thus from adult-derived cells having various genetic backgrounds. By deriving the same result, it is suggested that the method of the present invention is a suitable invention capable of producing pluripotent stem cells.
  • an aspect of the present invention provides a method for inducing stem cells by treatment of adult extracts, plant extracts, plant stem cell extracts or compositions containing them, such as shikimic acid, shikimic acid do.
  • one aspect of the present invention comprises the steps of extracting an extract comprising the active ingredient in plant stem cells or all kinds of induced pluripotent plant stem cells induced by various methods; Injecting the extract into adult-derived cells; And it provides a method for producing a custom pluripotent stem cells comprising the step of producing a pluripotent cells, such as embryonic stem cells through the culture of the cells injected with the extract.
  • an aspect of the present invention comprises the steps of injecting Shikimic acid, plant extracts containing Shikimic acid, plant stem cell extract or composition comprising them into adult-derived cells; And it provides a method for producing a stem cell further comprising the step of culturing cells injected with shikimic acid, extract or composition.
  • the extract may be a callus extract.
  • the method may further comprise the step of treating the cell membrane permeation promoting compound for the adult cells before the injection of the extract.
  • the cell membrane permeation promoting compound may include streptolysin O and digitonin, but is not limited thereto, as long as it facilitates the injection of the shikimic acid or extract according to the present invention into the cell membrane.
  • the method may further comprise the step of culturing the adult-derived cells injected with the extract to the support cell layer to further culture.
  • the support cell may include, but is not limited to, STO cells.
  • an aspect of the present invention comprises the steps of extracting an extract containing the active ingredient in plant stem cells, callus or all kinds of induced pluripotent plant stem cells induced by various methods; Injecting the extract into adult-derived cells; The extract-injected cells are cultured in a general cell culture solution and transferred to a culture condition with a feeder cell layer, and further comprising culturing in embryonic stem cell culture, to provide a customized pluripotent stem cell production method.
  • one aspect of the present invention provides a stem cell produced by the method.
  • one aspect of the present invention provides a composition comprising a stem cell.
  • the present invention by using Shikimic acid, plant extracts or plant stem cell extracts containing the same, reprogramming and / or dedifferentiating the differentiated cells of the adult inducible Pluripotent stem cell (inducible Pluripotent stem cell) : iPSC), a method for inducing a pluripotent stem cell prepared by the method and a cell therapy comprising the pluripotent stem cells.
  • the plant extract or plant stem cell extract containing shikimic acid used in the present invention is Sequoiadendron giganteum , yellow iris ( Iris pseudoacorus ), fat pork (pork potato) ( Helianthus tuberosus ), silver blue spruce (blue spruce) ) ( Picea pitchs ), Glauka spruce (white spruce) ( Picea glauca ), Eucalyptus ( Eucalyptus sieberiana ), Eucalyptus regnans , Western cypress ( Thuja plicata ), Date palm (Red Ceda, Phoenix dactylifera ), dahlia Dahlia variabilis , luminous tree ( Malus baccata ), Pear ( Pyrus communis ), wheat ( Triticum ), pine ( Pinus densifloraa ), gom ( Pinus thunbergii ), Isolum ( Ilicium anisatum ), Magnolia
  • the present invention also relates to a composition for stem cell activation, skin regeneration, or anti-aging or a pharmaceutical or cosmetic composition comprising the stem cells prepared by the above method.
  • the best method of producing stem cells, plant stem cells or plants including extracts of all kinds of induced Pluripotent Plant Stem cells derived from various methods, shikimic acid, shikimic acid Extracts or compositions comprising them can be used, and this method will also be a wide variety of fabrication methods that can be applied to all cells of all species, including humans of various genetic backgrounds.
  • the method of the present invention by using a plant-derived stem cell extract, it is possible to manufacture a custom pluripotent stem cells with no ethical problems and secured safety.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the entire experimental process of inducing pluripotent stem cells according to the method of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing induced pluripotent stem cells observed on day 5 after treatment with plant stem cell extract.
  • FIG. 3 is a diagram showing induced pluripotent stem cells observed on day 8 of treatment with plant stem cell extracts and on day 2 of transfer to feeder cells.
  • FIG. 4A is a diagram showing induced pluripotent stem cells observed after 4 passages after transfer to feeder cells at 32 days of treatment with plant stem cell extracts. 4B shows a typical embryonic stem cell.
  • FIG. 5 is a diagram showing the alkaline phosphatase staining results of induced pluripotent stem cells observed after four passages after transfer to feeder cells after treatment with plant stem cell extracts.
  • FIG. 6A is a diagram showing induced pluripotent stem cells observed after 7 passages after transfer to feeder cells at 50 days of treatment with plant stem cell extracts and alkaline phosphatase staining of the cells. The figure shows the result.
  • FIG. 6B is a diagram showing the results of staining of human pluripotent stem cells and alkaline phosphatase induced by 4 factor virus of Yamanaka.
  • Figure 7 is a diagram showing the gene expression of pluripotent stem cells induced by the method of the present invention.
  • Shikimic acid represents Shikimic acid having a structure of the present formula [Formula 1].
  • Figure 9 is a schematic diagram showing the entire experimental process of inducing pluripotent stem cells using the plant stem cell extract containing Shikimic acid or the same according to the method of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing the expression of Oct3 / 4 gene in HDF after treatment with shikimic acid or sequoia callus extract.
  • Figure 11 shows the expression of Oct3 / 4 gene in HDF after treatment with sikimic acid at different concentrations.
  • FIG. 12 is a diagram showing the increase in the expression of ALP after treatment with shikimic acid or sequoia callus extract.
  • Figure 13 is a diagram showing the increase in the expression of ALP after treatment with sikimic acid by concentration.
  • FIG. 14 is a diagram showing the colony generating ability of the dermal cells after treatment with shikimic acid or sequoia callus extract.
  • 15 is a graph showing colony production of dermal cells after treatment with shikimic acid or sequoia callus extract.
  • 16 is a diagram showing the colony generating ability of the dermal cells after treatment with shikimic acid by concentration.
  • Figure 17 is a graph showing the colony generating capacity of dermal cells after treatment with shikimic acid by concentration.
  • 18 is a graph showing the increase in the proliferative capacity of dermal cells after treatment with shikimic acid or sequoia callus extract.
  • Korean Patent Application No. 10-2013-0123860 filed October 17, 2013, is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes. This application also claims the benefit of Korean Patent Application No. 10-2013-0123860, which is hereby incorporated by reference in its entirety.
  • c) providing a method of inducing a customized pluripotent stem cell comprising the step of culturing the cells injected with the extract, and producing a pluripotent cell such as an embryonic stem cell.
  • one aspect of the present invention is Shikimic acid; Plant extracts comprising shikimic acid; Plant stem cell extract comprising shikimic acid; Or it provides a method for producing a stem cell comprising treating the composition containing them to adult derived cells.
  • an aspect of the present invention comprises the steps of injecting Shikimic acid, plant extracts containing Shikimic acid, plant stem cell extracts containing Shikimic acid or a composition containing them to adult-derived cells; And it provides a method for producing a stem cell further comprising the step of culturing cells injected with shikimic acid, extract or composition.
  • the extract herein may be a callus extract.
  • the plant extract or plant stem cell extract may comprise shikimic acid, caffeic acid or ferulic acid.
  • “Simkimic acid” as used herein may have the following general formula (1), and means the broadest concept including precursors, derivatives, and the like thereof.
  • the molecular weight of the shikimic acid may also be 174.15 g / mol.
  • caffeic acid may have the following Chemical Formula 2, and means the broadest concept including a precursor derivative thereof, and the like, and may have a molecular weight of 180.16 g / mol. Caffeic acid also means phenolic compounds contained in fruits such as pears, including coffee beans, and medicinal plants such as basil, thyme, bananas, tarragon, oregano, and dandelion.
  • ferulic acid may have the following Chemical Formula 3, and means the broadest concept including a precursor derivative thereof, and the like, and may have a molecular weight of 191.18 g / mol. Ferulic acid is also a precursor to lignin, which forms the cell walls of plants, and is abundantly contained in plant cell walls and is found in plant seeds such as wheat, oats, coffee, apples, oranges, and peanuts.
  • 'stem cells' refers to master cells that can be regenerated without limitation to form specialized cells of tissues and organs.
  • Stem cells are developable pluripotent or pluripotent cells. Stem cells can divide into two daughter cells, or one daughter cell and one derived ('transit') cell, and then proliferate into mature, fully formed cells of the tissue.
  • the term 'embryonic stem cell' refers to a cell having pluripotency as a cell cultured after separation from an inner cell mass (blast cell) of blastocyt, which is an early development after fertilization. Refers to.
  • iPS induced pluripotent stem cells or induced pluripotent stem cells (iPS) extract' refers to pluripotent stem cells or induced pluripotent stem cells induced or cultured in various ways in vitro
  • Induced Pluripotent Stem cells (iPS) refers to a material that is separated by a method such as centrifugation after crushing finely by a physical-chemical method.
  • plant stem cell is a cambium-derived plant stem cell.
  • it includes pure plant stem cells (CMC Cambial Meristematic Cell) in the physically intact state in the formation layer sandwiched between the water and phloem of the plant.
  • plant stem cells is the broadest concept as including all kinds of induced pluripotent plant stem cells derived by various methods.
  • callus (callus, or callus, wound tissue, or oily tissue) is an undifferentiated irregular cell mass that is representative of tumor tissue formed by meristems formed around the wound when the plant is injured. to be. Plants are composed of meristems that divide into cells and permanent tissues that do not. Cells are formed when the cells of the meristem are first placed in the nutrient medium and grown. Thereafter, an embryonic embryo is formed and differentiated into plants. This callus is also commonly called “plant stem cells.” There is no restriction
  • pluripotent stem cell' is a multifunctional (pluripotent) that can be differentiated into all three germ layers constituting the living body (endoderm), mesoderm (mesoderm), ectoderm (ectoderm) Refers to stem cells). Embryonic stem cells are traditionally called stem cells in this category.
  • custom pluripotent stem cells' used in the present invention refers to the genetically identical donor cells and induced pluripotent stem cells used to make pluripotent stem cells, which are derived from a custom pluripotent stem cell originated from a donor cell. Indicate that it is a cell
  • 'custom pluripotent stem cells', 'dedifferentiated stem cells', 'induced pluripotent stem cells' may be used interchangeably.
  • the term 'adult-derived cell' refers to a cell derived from an adult that is born and alive as opposed to an embryonic cell.
  • the term "differentiation” refers to a phenomenon in which structures or functions are specialized while cells divide and proliferate and grow, that is, a cell or tissue of an organism has a shape or function to perform a task given to each. It means to change.
  • a relatively simple system is divided into two or more qualitatively different sub systems. For example, qualitatively between parts of a living organism that were almost homogeneous in the first place, such as head or torso distinctions between eggs that were initially homogenous in the development, or cells such as muscle cells or neurons.
  • Phosphorus difference or as a result, is a state divided into subclasses or subclasses that can be distinguished qualitatively.
  • the plant may be a sequoia.
  • the plant stem cells may be callus (callus).
  • the plant stem cells may be sequoia stem cells.
  • the plant stem cell extract may be a callus extract.
  • the extract may be Sequoia callus extract.
  • the sequoia may be a sequoiadendron giganteum .
  • the extract or composition may comprise shikimic acid.
  • the composition may comprise a concentration of 10-MuM to 30 mM simkimic acid based on the total volume of the composition.
  • the composition is based on the total volume of the composition of the shikimic acid, plant extract or plant stem cell extract 10uM or more, 20uM or more, 30uM or more, 50uM or more, 100uM or more, 1mM or more, 5mM or more It may include 10mM or more, 20mM, or 30mM or more, and may include 1M or less or 100M or less.
  • the shikimic acid included in the composition may be included at a concentration of at least 0.1 mM, at least 0.5 mM, at least 0.6 mM, at least 0.7 mM, at least 0.8 mM or at least 0.9 mM based on the total volume of the composition or at most 5 mM, at most 4 mM, at most 3 mM, 2 mM Or less, 1.5 mM or less, 1.4 mM or less, 1.3 mM or less, 1.2 mM or less, or 1.1 mM or less.
  • Shikimic acid may be included in a concentration of 0.8mM to 1.2mM based on the total volume of the composition. Most preferably, the shikimic acid may be included at a concentration of 1 mM based on the total volume of the composition.
  • the plant extract or plant stem cell extract may comprise from 0.0001% (w / v) to 45% (w / v) of the sikimic acid based on the total volume of the extract.
  • shikimic acid When included in this range of shikimic acid may have an excellent Oct3 / 4 gene expression effect, ALP expression effect, fibroblast proliferation effect.
  • the plant extract or plant stem cell extract herein is based on the total volume of the extract Shikimic acid, 0.001% (w / v) or more, 0.01% (w / v) or more, 0.1% ( w / v) or more, 1% (w / v) or more, 5% (w / v) or more, 10% (w / v) or more, 15% (w / v) or more, 20% (w / v) or more , 25% (w / v) or more, or 30% (w / v) or more, 45% (w / v) or less, 40% (w / v) or less, 38% (w / v) Up to 36% (w / v), up to 34% (w / v), up to 33% (w / v), or up to 32% (w / v).
  • the plant extract or plant stem cell extract herein may comprise from 32% (w / v) to 34% (w / v) of the shikimic acid based on the total volume of the extract, more preferably Preferably 32.75% (w / v).
  • the composition is a plant extract or plant stem cell extract based on the total volume of the composition in consideration of the concentration of the shikimic acid and the extract of the concentration of shikimic acid contained in the extracts described above And may be at a concentration of contained shikimic acid based on the total volume of the composition.
  • the plant extract or plant stem cell extract included in the composition based on the total volume of the composition is at least 0.001 ug / ml, at least 0.01 ug / ml, at least 0.1 ug / ml, at least 1 ug / ml, at least 10 ug / ml , Over 50ug / ml, over 100ug / ml, over 0.3mg / ml, over 0.4mg / ml, over 0.5mg / ml, over 0.6mg / ml, over 0.7mg / ml, over 1mg / ml, over 1.5mg / ml Or more, 2 mg / ml, 5 mg / ml or more, 10 mg / ml or more, 20 mg / ml or more, or 50 mg / ml or more and 1 g / ml or less, or 10 g / ml,
  • Measurement of shikimic acid included in the plant extract or plant stem cell extract herein is 250 * 4.60 mm, 5 micron as a Gemini 5u C18 110 A (5 ⁇ m, 4.6 X 250nm, Phenomenex) column using Waters 1525 ⁇ Binary HPLC Pump It may have a standard of, and may be measured by using the mobile solvent A as water (containing 0.1% TFA) and the solvent B as acetonitrile (containing 0.1% TFA).
  • “Sequoia” herein includes redwood ( Sequoia sempervirens ), Big Tree ( Sequoiadendron giganteum ) or Metasequoia glyptostroboides .
  • Redwood also known as the American Cedar, is a pine tree, the cypress family, and grows only on the northwest coast of California, the southwest of Oregon, and New Zealand. It is 2500 to 3000 years old and the largest tree in the world with a maximum height of 112m. 2.5 to 4.5 m in diameter, 50 to 100 m in height, and bark 20 to 30 cm thick. Leaves are similar to yeast, 1-3cm in length, with sharp tips and distinct veins. The leaf surface is dark green and the back side is white.
  • the Big Tree ( Sequoiadendron giganteum ) is the only species in the Sequoia dendron, growing at 1500 to 2500 meters above sea level in the western Sierra Nevada Mountains of California, USA, 3.5 to 6 meters in diameter, 60 to 90 meters in height, and around 10 meters in diameter. .
  • the leaves are similar to cedar and 1cm long, arranged in a spiral shape, but the leaves on the mature branches look like scales.
  • Metasequoia glyptostroboides is a tree of the cypressaceae family and is the only surviving species in the genus Metasequoia. In the country of origin, it grows up to 35m of toil and the bark is grayish brown and stripped vertically. The branches spread to the side, and the leaves are opposite each other in a line, and are 10 ⁇ 23mm long and 1.5 ⁇ 2mm wide. It has a sharp tip and leaves of brown and red color. Flowers bloom in February-March, male and female, and male flowers are gunshot inflorescences hanging from the ends of axillary branches. There are 20 stamens. Female flowers hang on the ends of branches and bloom in March. Fruits are coniferous, 18 ⁇ 25mm long, round, ripe and brown, with oval seeds with wings. It is a deciduous coniferous tree and its origin is Sichuan, Hubei, China, and is distributed in Korea and China.
  • Callus is an undifferentiated irregular cell mass, which is typical of tumor tissue formed by the meristem that forms around the wound when the plant is injured. Plants are composed of meristems that divide into cells and permanent tissues that do not. Cells are first formed by culturing cells in nutrient media and growing. Thereafter, an embryonic embryo is formed and differentiated into plants. Callus is also called 'plant stem cells'.
  • extract includes all materials obtained by extracting the components of natural products, regardless of the extraction method, extraction solvent, extracted components or the form of the extract, and extracts the substances obtained by extracting the components of natural products. It is a broad concept that includes all of the materials that can be obtained by processing or processing in a method.
  • Sequoia as used herein may be included in the form of an extract, or may be included as a ground powder of the herbal medicine, or dry ground powder of the herbal medicine, but is not limited thereto.
  • the sequoia used in the present specification is not limited to the method of obtaining, and may be grown and used or purchased and commercially available, and may mean all of them including the ground and the underground of the sequoia.
  • the ground portion may include sequoia fruit, leaves and stems, and the underground portion may include roots, but is not limited thereto.
  • plant extract includes all substances obtained by extracting a plant component, such as sequoia, regardless of the extraction method, the extraction solvent, the extracted component or the form of the extract, and the heat in the process of extracting the component. , Including a material obtained by an extraction method including a process of treating with an acid, a base, an enzyme, and the like, and extracting a plant component such as a sequoia It is a broad concept that includes all of the materials that can be obtained by treatment.
  • plant stem cell extract includes all substances obtained by culturing stem cells of plants such as sequoias and extracting the active ingredient, regardless of the extraction method, extraction solvent, extracted component or extract form. It is an active ingredient of a stem cell of a plant such as sequoia, which includes a substance obtained through an extraction method including a process of treating with heat, acid, base, enzyme, etc. in extracting the component. It is a broad concept that includes all materials that can be obtained by extracting the material obtained by extracting and then processing or processing by other methods.
  • the method of the present invention includes culturing plant stem cells or all kinds of induced pluripotent plant stem cells derived by various methods and preparing extracts therefrom, which can be carried out according to general methods known in the art. .
  • culturing plant stem cells or all kinds of induced pluripotent plant stem cells induced by various methods and treating them with proteolytic enzymes collecting suspended solids or reacting and filtering plant stem cells at 65 ° C. for 2 hours.
  • the protein or shikimic acid derived from each cell can be extracted.
  • callus powder may be used.
  • Sequoia callus extract in the present specification is i) inducing callus (callus) from Sequoia; ii) solid cell culture of the callus to establish a stem cell line; iii) producing a large amount of the active ingredient through suspension cell culture; And it can be obtained through the step of extracting the produced active ingredient.
  • a method of extracting an active ingredient from Sequoia callus may be extracted by a plant culture method of a cell line derived from a tissue explant of the plant, such as an extraction method known from Korean Patent Publication No. 2007-0113193. It can be extracted by adding a mixture of alcohols of 5-carbon atoms or less to a stable plant cell line derived from Sequoia, but is not limited to the above extraction method.
  • sequoia callus extract or sequoia callus powder may be used commercially available herein.
  • the sequoia callus extract may be prepared by dissolving sequoia callus powder in a solvent, wherein the solvent includes at least one selected from the group consisting of water, an organic solvent, and a mixture of water and an organic solvent.
  • the water may include distilled water or purified water
  • the organic solvent may be selected from the group consisting of alcohols, acetone, ether, ethyl acetate, diethyl ether, ethyl methyl ketone, and chloroform, including C 1 to C 5 lower alcohols.
  • BG butylene glycol
  • EtOH ethanol
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the concentration of the shikimic acid or protein extract derived from the plant is preferably 10 ug / ml to 1 mg / ml based on the total volume of the composition including the extract, more preferably about 500 ug / ml. If the concentration of the protein extract is out of the above range because the induction efficiency of the customized pluripotent stem cells or the cells treated with the extract may be killed.
  • the method of the present invention comprises the step of injecting the protein extract isolated from plant stem cells or all kinds of induced pluripotent plant stem cells induced by various methods into adult derived cells.
  • the adult-derived cells may include human dermal fibroblasts or neonatal human dermal fibroblasts.
  • cell membrane permeation promoting compounds e.g., streptolysin O or digitonin
  • permeabilization reversible small holes
  • the method for producing pluripotent stem cells comprising
  • the cell pellet is resuspended in embryonic stem cell culture medium and seeded in a dish;
  • the present invention includes the steps of culturing cells injected with shikimic acid, extracts or compositions, to produce cells with pluripotency, such as embryonic stem cells.
  • the adult-derived cells injected with them are cultured using a general cell culture medium, and then transferred to a culture condition with a feeder cell layer to perform further culture. Can be.
  • DMEM normal cell cultures
  • FBS normal cell cultures
  • 10-100U / ml penicillin, 20-80mg / ml streptomycin are used until colonies are formed after the injection of the above-mentioned sikimic acid, extract or composition.
  • the colonies were formed, and then transferred to the culture conditions with the feeder cell layer and subcultured every 5-8 days in the embryonic stem cell culture medium, and the medium was exchanged daily.
  • Supporting cells of the present invention may include, but are not limited to, STO cells.
  • Pluripotent stem cells induced by the extract were 15-25% KSR (Knockout serum replacement), 1-4 mM L-glutamine, 0.05-0.2 mM non-essential amino acids, 0.05-0.2 in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) / F12 Cultures can be incubated with addition of mM ⁇ -mercaptoethanol, 30-70 U / ml penicillin, 30-70 mg / ml streptomycin, and 1-30 ug / ml bFGF. It will be readily appreciated by those skilled in the art that the concentration of the compound added to the DMEM may vary within a range capable of achieving the effects of the present invention.
  • the present invention comprises the steps of a) extracting the protein from the plant stem cells or all kinds of induced pluripotent plant stem cells induced by various methods;
  • the method of the present invention is indistinguishable from embryonic stem cells from adult-derived cells using shikimic acid, plant extracts, plant stem cells or all kinds of induced pluripotent plant stem cell extracts derived from various methods or compositions containing them. It is characterized by the ability to make cells with such pluripotency.
  • the inventors confirmed that pluripotent stem cells are induced through the method of the present invention.
  • the pluripotent stem cells induced by the present invention in the shape of the cells are almost identical to the embryonic stem cells (see FIG. 4).
  • the characteristic gene Nanog, Oct4
  • one aspect of the present invention provides a pluripotent stem cell induced by the method which is an aspect of the present invention.
  • the present inventors have confirmed that the self-renewal, which is a characteristic of stem cells, by successive passages of 8-12 times through the above method (see FIG. 6).
  • one aspect of the present invention provides a composition comprising pluripotent stem cells prepared according to the method of an aspect of the present invention.
  • One aspect of the present invention relates to a composition comprising one or more of shikimic acid, a plant extract comprising shikimic acid, and a plant stem cell extract comprising shikimic acid as an active ingredient.
  • the composition may be a pharmaceutical composition, a food composition or a cosmetic composition.
  • the composition may be a composition for stem cell activation, skin regeneration or anti-aging.
  • a method of administering a composition comprising shikimic acid, a plant extract containing shikimic acid, a plant stem cell extract containing shikimic acid, or a composition comprising one or more thereof to an individual in need of stem cell activation It may be related to a stem cell activation method comprising.
  • the administration may be in accordance with the method or dosage of administration described herein.
  • the present invention comprises administering to a subject in need of skin regeneration, shikimic acid, a plant extract containing shikimic acid, a plant stem cell extract containing shikimic acid, or a composition comprising one or more thereof. It may be related to the skin regeneration method.
  • the present invention comprises administering to a subject in need of anti-aging, shikimic acid, a plant extract containing shikimic acid, a plant stem cell extract comprising shikimic acid, or a composition comprising one or more thereof. It may be related to an anti-aging method.
  • the present invention provides a stem cell activation use, skin regeneration use, or anti-aging of shikimic acid, a plant extract containing shikimic acid, a plant stem cell extract containing shikimic acid, or a composition comprising at least one of them. It may be related to the use.
  • the present invention includes a stem extract, a plant extract comprising a shikimic acid, a plant stem cell extract containing a shikimic acid, or one or more thereof for use in stem cell activation, skin regeneration, or anti-aging. It may be related to the composition.
  • the composition may be a cell therapeutic agent.
  • the cell therapeutic agent may be used for the formation of hepatocytes, adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, neurons, cardiomyocytes, vascular endothelial cells and the like.
  • the present invention comprises administering shikimic acid, a plant extract comprising shikimic acid, a plant stem cell extract comprising shikimic acid, or a composition comprising one or more thereof to an individual in need of cell therapy. It may be related to a method of cell treatment.
  • the present invention may be directed to a cell therapeutic use of shikimic acid, a plant extract comprising shikimic acid, a plant stem cell extract comprising shikimic acid, or a composition comprising one or more thereof.
  • the present invention may be directed to shikimic acid, a plant extract comprising shikimic acid, a plant stem cell extract comprising shikimic acid, or a composition comprising one or more thereof for use in cell therapy.
  • the term 'cell therapeutic agent' refers to a medicinal product (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues prepared by isolation, culture, and special manipulation from humans.
  • a drug used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions, such as proliferating, selecting, or otherwise altering the biological properties of a living autologous, allogeneic, or heterologous cell in order to restore it.
  • Cell therapy agents are largely classified into somatic cell therapy and stem cell therapy according to the degree of differentiation of cells, and the present invention relates in particular to stem cell therapy.
  • One aspect of the present invention provides a food composition comprising shikimic acid, a plant extract containing shikimic acid, a plant stem cell extract or pluripotent stem cells according to the present specification.
  • the composition may contain other components and the like that can give a synergistic effect to the main effect within a range that does not impair the main effect of the present invention.
  • additives such as perfumes, pigments, fungicides, antioxidants, preservatives, humectants, thickeners, inorganic salts, emulsifiers and synthetic polymer materials may be further included to improve physical properties.
  • the food composition includes, but is not limited to, health food compositions, functional food compositions, supplements, processed food compositions, food additives and the like.
  • One aspect of the present invention provides a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising shikimic acid, a plant extract containing shikimic acid, a plant stem cell extract or pluripotent stem cells according to the present specification.
  • the cosmetic composition contains a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base.
  • compositions obtained by dispersing the oil phase in solutions, gels, solids, pasty anhydrous products, aqueous phases, emulsions obtained by dispersing the aqueous phase in oil phases, multi emulsions, suspensions, micro emulsions, micro Capsules, microgranulocytes, ionic (liposomal) and nonionic vesicle dispersants, foams, aerosols or patches containing further compressed propellant may be used.
  • These compositions can be prepared according to conventional methods in the art.
  • the cosmetic composition may contain other ingredients in addition to the above substances in a range that does not impair the main effect, and preferably may have a synergistic effect on the main effect, and other cosmetics in addition to the active ingredient of the present invention Depending on the formulation of the composition or the purpose of use, those skilled in the art can appropriately select and blend without difficulty.
  • the cosmetic composition of the present invention may include other ingredients which are usually formulated into the cosmetic composition as necessary in addition to the active ingredient, and examples thereof include oil-fat ingredients, humectants, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic Powders, ultraviolet absorbers, preservatives, fungicides, antioxidants, stabilizers, thickeners, glycerin, pH regulators, alcohols, pigments, flavorings, blood circulation accelerators, cooling agents, limiting agents, purified water and the like.
  • Other compounding components that may be included in the cosmetic composition is not limited thereto, and the compounding amount of the above components is possible within a range that does not impair the object and effect of the present invention.
  • the formulation of the cosmetic composition is not particularly limited and may be appropriately selected as desired.
  • supple lotion, nourishing lotion, essence, nourishing cream, massage cream, pack, gel, makeup base, foundation, powder, lipstick, patch, spray, eye cream, eye essence, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water One selected from the group consisting of cleanser, hair shampoo, hair conditioning, hair treatment, hair essence, hair lotion, scalp hair tonic, scalp essence, hair gel, hair spray, hair pack, body lotion, body cream, body oil and body essence It may be prepared in the above formulation, but is not limited thereto.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising shikimic acid, a plant extract containing shikimic acid, a plant stem cell extract or pluripotent stem cells according to the present specification.
  • Such pharmaceutical compositions may contain, in addition to the active ingredient, preservatives, stabilizers, hydrates, emulsifiers, salts and / or buffers for osmotic pressure control, diluents (e.g.
  • lactose dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose or glycine
  • Glidants such as silica, talc, stearic acid and magnesium or calcium salts or polyethylene glycols thereof or binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose or polyvinylpi
  • binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose or polyvinylpi
  • Pharmaceutical adjuvant or other therapeutically useful substances such as rolidine).
  • other pharmaceutical additives such as disintegrants, absorbents, colorants, flavors, or sweeteners such as starch, agar, alginic acid or sodium salts thereof may be included.
  • compositions can be formulated in various oral or parenteral dosage forms according to conventional methods.
  • the oral dosage forms include, for example, tablets, pills, hard and soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, powders, powders, fine granules, granules, pellets, and the like, and these formulations include surfactants in addition to the active ingredients.
  • Diluents such as lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and glycine
  • glidants such as silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and polyethylene glycols.
  • Tablets may also contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and polyvinylpyrrolidine, optionally starch, agar, alginic acid or its sodium salt Pharmaceutical additives such as disintegrants, absorbents, colorants, flavors, and sweeteners.
  • binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and polyvinylpyrrolidine, optionally starch, agar, alginic acid or its sodium salt
  • Pharmaceutical additives such as disintegrants, absorbents, colorants, flavors, and sweeteners.
  • the tablets can be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
  • parenteral administration agent may be, for example, formulations such as injections, drops, ointments, lotions, gels, creams, sprays, suspensions, emulsions, suppositories, and patches, but are not limited thereto. no.
  • the pharmaceutical composition according to an aspect of the present invention may be administered parenterally, rectally, topically, transdermally, subcutaneously, and the like.
  • the composition is based on the formulation and criteria suitable for each administration. In particular, in the case of intravenous injection, all additives not suitable for this are excluded, and the purity of the composition itself is also very high.
  • the applied amount of the active ingredient will vary depending on the age, sex, weight, disease, pathological condition, route of administration and prescriber's judgment of the subject to be treated. Application amount determination based on these factors is within the level of skill in the art. Typical dosages are preferably 30 ug / ml to 1 mg / ml, but are not limited thereto.
  • pluripotent stem cells prepared by the method according to the present invention it is preferable to be used in the formulation of the injection in the pharmaceutical composition.
  • Pluripotent stem cells prepared by the method according to the present invention are injected into the skin similarly to botox that is commonly used for the purpose of removing wrinkles by injection into the skin to activate skin stem cells, and to promote the proliferation of skin cells, etc. Through the effects of skin regeneration, anti-aging, improve elasticity, it can exhibit such effects as wrinkles.
  • One aspect of the present invention also provides a composition including, but not limited to, shikimic acid, a plant extract comprising shikimic acid, a plant stem cell extract, or an experimental reagent or medium composition comprising pluripotent stem cells.
  • callus powder as a plant-derived stem cell extract.
  • Callus powder that can be used in the present invention is not limited and may be purchased commercially.
  • Sequoia callus extract induces callus from the leaves of Sequoia and solid cultures to establish stem cell lines and suspension cell culture to produce active ingredients in large quantities. After production it is extracted and obtained. Extracting the active ingredient from the sequoia callus can be extracted by the plant culture method of cell lines derived from the tissue explant of the plant, such as the extraction method known in Korea Patent Publication No. 2007-0113193, although it can be eluted by adding a mixture of alcohols of 5-carbon atoms or less to a stable plant cell line derived from Sequoia, it is not limited to the above extraction method.
  • sequoia callus power (commercially available from BiofdNC) was used. Specifically, human dermal fibroblasts (human dermal fibroblasts) were made into individual cells using trypsin-EDTA, followed by washing with cold PBS (phosphate buffered saline). The cell pellet was resuspended to 100 ⁇ l / 100,000 cells of cold Ca2- and Mg2-free Han's balanced salt solution (HBSS) and transferred to a 1.5 ml tube.
  • HBSS Han's balanced salt solution
  • digitonin (20ug / ml) and transport solution 110 mM potassium acetate, 5 mM sodium acetate, 2 mM magnesium acetate, 1 mM EGTA instead of SLO
  • 200ul of 2 mM DTT, proteaseinhibitor cocktail, 20 mM HEPES pH7.3 200ul of 2 mM DTT, proteaseinhibitor cocktail, 20 mM HEPES pH7.3
  • the sample was reacted for 50 minutes in a 37 °C water bath, mixed up and down once every 10 minutes.
  • the reaction sample is placed on ice and 200 ⁇ l of cold HBSS is added, followed by centrifugation at 120 g for 5 minutes at a swing-out rotor at 4 ° C.
  • the cell pellet was resuspended with 200 ⁇ l of plant stem cell extract to 1 ⁇ l / 1000 cells.
  • Callus powder was used as a plant stem cell extract (500 ug / ml).
  • ATP-regeneration system (10 mM creatine phosphate, and 25 g / ml creatine kinase), 1 mM nucleotide triphosphate, respectively, was added and reacted for 1 hour in a 37 ° C. water bath, mixed up and down once every 10 minutes.
  • 1 ml of ES cell medium containing 2 mM CaCl 2 was added to reseal the plasma membrane and reacted in a 37 ° C. incubator for 2 hours.
  • the cell pellet was resuspended in embryonic stem cell culture medium and seeded in a dish coated with 0.1% gelatin.
  • Example 2 A step of producing cells with pluripotency, such as embryonic stem cells, by culturing the cells injected with the extract
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FIG 1 is a schematic diagram showing the entire experimental process of inducing pluripotent stem cells according to the method of the present invention.
  • 2 to 4 show that pluripotent stem cells were induced at 5, 10 and 32 days of culture, respectively, and FIGS. 5 and 6 show alkaline phosphatase at 32 and 50 days of culture, respectively.
  • the pluripotent stem cells induced according to the method of the present invention show alkaline phosphatase staining positive (purple) characteristic of embryonic stem cells.
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • pluripotent stem cells hiPS
  • hES embryonic stem cells
  • Sequoia callus extract dissolved in a solvent mixed with BG and EtOH in the sequoia extract obtained according to the method of Example 4 was analyzed by using an HPLC machine.
  • LC spectrum of the sequoia extract is as shown in Figure 8 and the results are shown in Table 1 below.
  • % Area represents% (w / v) of the substance contained in the sequoia extract.
  • Neonatal human dermal fibroblasts (NHDF-Neonatal) (CC-2509, Lonza, USA) were treated with 10 ⁇ M and 10 mM of shikimic acid, respectively. NHDF-Neonatal without any treatment was set as negative control.
  • Shikimic acid the main component of Sequoia callus extract
  • the shikimic acid or the extract including the same according to the present invention is injected into the somatic cells, the Oct3 / 4 gene can be expressed to induce customized pluripotent stem cells.
  • Test Example 3-1 Test for Confirming Increased Expression of Alkaline Phosphatase (ALP), a Stem Cell Activity Marker
  • ALP Alkaline Phosphatase
  • the HDF treated with Sequoia callus extract has a lot of stained portion compared to normal (HDF), indicating that the expression of ALP is significantly increased.
  • the treatment of sequoia callus extract can confirm that the ALP is expressed more than the treatment with shikimic acid.
  • ALP is expressed in cells three days after the expression of genes such as Oct4, a marker known to play an important role in the early stage of dedifferentiated stem cell formation ( marker). Therefore, when the sequoia callus extract according to the present invention is injected into the somatic cells, the expression of ALP is significantly increased, and since the Oct4 gene is expressed, the customized pluripotent stem cells can be induced.
  • Sequoia callus extract according to the present invention has a remarkable effect of activating stem cells in the light of promoting the expression of the stem cell activity marker ALP.
  • Test Example 3-2 Experiment of Confirming Increased Expression of Alkaline Phosphatase (ALP), a Stem Cell Activity Marker
  • NHDF- neo four exit (Neonatal) (CC-2509, Lonza, USA) acid 10uM, 10mM Sikkim gae to 1x10 6 were each treated.
  • NHDF-Neonatal without any treatment was set as negative control.
  • 100,000 cells were attached to 6-well plates, and on day 12, 7 days later, fixed with 3.8% formaldehyde in PBS for 15 minutes at room temperature, followed by diluting 200ul of NBT / BCIP® ALP substrate solution in 10 ml of ALP buffer.
  • 0.5ml of the solution was treated 20 hours later and observed 40 times with an Olympus CKX41 optical microscope. The results obtained through observation are shown in FIG. 13.
  • ALP is a marker known to play an important role in the early stage of dedifferentiated stem cell formation as it begins to be expressed three days after the gene such as Oct4. . Therefore, when the shikimic acid and the plant extract containing the same according to the present invention are injected into the somatic cells, the expression of ALP is significantly increased, and also the Oct4 gene is expressed, thereby inducing customized pluripotent stem cells.
  • the Shikimic acid and the plant extract containing the same according to the present invention shows a remarkable effect of activating stem cells in the light of promoting the expression of the stem cell activity marker ALP.
  • NHDF- neo leaving four was filtered with an embodiment (CC-2509, Lonza, USA ) 5x10 5 gae buffer Sami Billy hybridization buffer (Permeablization buffer) and digi tonin (digitonin) process and 0.4um filter to 10ug / ml in The sequoia callus extract according to 4 (BG and EtOH mixed solvent) 100ppm, 200ppm and 20ppm DMSO solution was treated. NHDF-Neonatal without any treatment was set as negative control. On day 10 of the passage, 200 cells were adhered to a 60 mm plate, and on day 23, ice-cold methanol was washed on ice with ice-cold PBS, and stored at -20 ° C.
  • sequoia callus extract according to the present invention can be confirmed that significantly promote the proliferation of fibroblasts.
  • the sequoia extract according to the present invention has an effect of promoting skin regeneration.
  • 200 cells were attached to a 60 mm plate, and on day 17, ice-cold methanol was washed on ice with ice-cold PBS and stored at -20 degrees. The cells were fixed for 10 minutes. 1% crystal violet in Ethanol stock solution was diluted 1/10 in PBS to make an experimental solution. After treatment for 5 to 10 minutes, the cells were dyed and washed 4 times with PBS.
  • shikimic acid according to the present invention significantly promotes the proliferation of fibroblasts.
  • sekimic acid and sequoia extract containing the same according to the present invention have an effect of promoting skin regeneration.
  • sequoia callus extract according to the present invention can be confirmed that significantly promote the division of fibroblasts.
  • the sequoia extract according to the present invention in view of significantly promoting fibroblast division of dermal cells, the sequoia extract according to the present invention can be seen that exhibits the effect of promoting skin regeneration.
  • Sikkim acid or sequoia callus extract according to Example 4 40ug, vitamin E 9mg, vitamin C 9mg, palm oil 2mg, vegetable hardened oil 8mg, beeswax 4mg and lecithin 9mg are mixed and mixed according to a conventional method to prepare a soft capsule filler Manufacture. 400 mg per capsule is filled to prepare a soft capsule.
  • a soft capsule sheet is prepared at a ratio of 66 parts by weight of gelatin, 24 parts by weight of glycerine, and 10 parts by weight of sorbitol solution and filled with the filler to prepare a soft capsule containing 400 mg of the composition according to the present invention.
  • Sikkim acid or sequoia callus extract according to Example 4 40 ⁇ g, vitamin E 9mg, vitamin C 9mg, galactooligosaccharide 200mg, lactose 60mg and maltose 140mg were mixed and granulated using a fluidized bed dryer and then sugar ester (sugar ester) 6 mg is added. Tablets are prepared by tableting 500 mg of these compositions in a conventional manner.
  • Sikkim acid or 40 ug of sequoia callus extract according to Example 4 vitamin E 9mg, vitamin C 9mg, anhydrous glucose of 250mg and starch 550mg were mixed, molded into granules using a fluidized bed granulator, and then packed into a fabric To prepare.
  • Injectables were prepared by conventional methods according to the compositions set forth in Table 4 below.
  • Table 4 Compounding ingredient content Sikkim acid or sequoia callus extract according to example 4 40 ⁇ g Sterile Distilled Water for Injection Quantity pH regulator Quantity
  • Injections are prepared in the above amounts per ampoule (2 ml) according to the conventional method for preparing injections.
  • composition shown in Table 5 was prepared in the conventional method for the flexible cosmetic.
  • Table 5 Compounding ingredient Content (% by weight) Sikkim acid or sequoia callus extract according to example 4 0.2 glycerin 3.0 Butylene glycol 2.0 Propylene glycol 2.0 Carboxy Vinyl Polymer 0.1 Fiji-12 nonylphenyl ether 0.2 Polysorbate 80 0.4 ethanol 10.0 Triethanolamine 0.1 Preservative, coloring, flavoring Quantity Purified water Remaining amount
  • Nutritional longevity was prepared according to the composition described in Table 6 below in a conventional manner.
  • Table 6 Compounding ingredient Content (% by weight) Sikkim acid or sequoia callus extract according to example 4 1.0 glycerin 3.0 Butylene glycol 3.0 Propylene glycol 3.0 Carboxy Vinyl Polymer 0.1 Beeswax 4.0 Polysorbate 60 1.5 Caprylic / Capric Triglycerides 5.0 Squalane 5.0 Sorbitassquioleate 1.5 Liquid paraffin 0.5 Cetearyl Alcohol 1.0 Triethanolamine 0.2 Preservative, coloring, flavoring Quantity Purified water Remaining amount
  • Nutritional cream was prepared in a conventional manner according to the composition shown in Table 7.
  • Table 8 Compounding ingredient Content (% by weight) Sikkim acid or sequoia callus extract according to example 4 2.0 glycerin 8.0 Butylene glycol 4.0 Liquid paraffin 45.0 Beta Glucan 7.0 Carbomer 0.1 Caprylic / Capric Triglycerides 3.0 Beeswax 4.0 Cetearyl Glucoside 1.5 Sesqui oleic acid sorbitan 0.9 Vaseline 3.0 paraffin 1.5 Preservative, coloring, flavoring Quantity Purified water Remaining amount
  • Table 9 Compounding ingredient Content (% by weight) Sikkim acid or sequoia callus extract according to example 4 0.2 glycerin 4.0 Polyvinyl alcohol 15.0 Hyaluronic acid extract 5.0 Beta Glucan 7.0 Allantoin 0.1 Nonyl Phenyl Ether 0.4 Polysorbate 60 1.2 Ethanol preservative 6.0 Preservative, coloring, flavoring Quantity Purified water Remaining amount
  • Table 10 Compounding ingredient content Sikkim acid or sequoia callus extract according to example 4 20 ⁇ g Vitamin A Acetate 70 ⁇ g Vitamin E 1.0mg Vitamin B1 0.13mg Vitamin B2 0.15mg Vitamin B6 0.5mg Vitamin B12 0.2 ⁇ g Vitamin c 10mg Biotin 10 ⁇ g Nicotinic acid amide 1.7mg Folic acid 50 ⁇ g Calcium Pantothenate 0.5mg Ferrous sulfate 1.75mg Zinc oxide 0.82 mg Magnesium carbonate 25.3 mg Potassium phosphate monobasic 15 mg Dicalcium Phosphate 55 mg Potassium citrate 90 mg Calcium carbonate 100mg Magnesium chloride 24.8 mg
  • composition ratio of the said vitamin and mineral mixture was mixed and consisted with the component suitable for a healthy food in a preferable Example, the compounding ratio may be arbitrarily modified.
  • Table 11 Compounding ingredient content Sikkim acid or sequoia callus extract according to example 4 20 ⁇ g Citric acid 1000 mg oligosaccharide 100 g Taurine 1 g Purified water Remaining amount
  • the above ingredients are mixed according to a conventional method for preparing a health beverage, then stirred and heated at 85 ° C. for about 1 hour, and then the resulting solution is filtered and sterilized.

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Abstract

본 발명은 시킴산, 시킴산을 함유하는 식물추출물 또는 식물 줄기세포 및 식물 역분화 줄기세포 (callus)의 추출물을 사용하여 성체의 분화된 세포를 재프로그램화 시킴으로써 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 및 상기 만능줄기세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 배아줄기세포와 같은 능력을 가진 만능줄기세포를 만드는데 난자를 사용하지 않기 때문에 윤리 문제를 해결할 수 있고, 무엇보다도 인체에 해가 없는 것이 검증된 식물 줄기세포 추출물을 사용하므로 안전성이 확보된 만능줄기세포를 제조할 수 있으며, 또한 각 개체에 맞추어진 면역적합성 세포 치료제를 개발하는데 이용될 수 있을 것이다. 이에 더하여, 질병을 가진 개체로부터 만능줄기세포를 유도함으로써 질환의 원인 규명 및 치료방법을 연구하는데 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 발명은 시킴산 또는 시킴산을 함유하는 식물추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

Description

만능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포
본 명세서는 성체의 분화된 세포를 재프로그램화 및/또는 역분화를 일으킴으로써 만능줄기세포를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 및 상기 만능줄기세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한 본 명세서는 만능줄기세포를 포함하는 약학 조성물 또는 미용 조성물에 관한 것이다.
또한 본 명세서는 줄기세포 활성화용, 피부세포 증식용, 피부재생용 또는 항노화용 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 여러 가지 줄기세포분류 중 만능줄기세포(pluripotent stem cell)라 함은 생체를 구성하는 내배엽, 중배엽, 외배엽인 3가지 배엽(germ layer) 모두로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭한다.
줄기세포를 분류함에 있어, 해부학적인 존재부위에 따라, 세포의 기능에 따라, 세포표면에 표현된 항원의 종류에 따라, 전사인자에 따라, 세포가 생성 하는 단백질에 따라, 그리고 그 줄기세포가 만들어 낼 수 있는 특정 세포종류에 따라 분류할 수 있다.
이러한 여러 가지 분류 중 가장 흔히 이용되고 비교적 명확한 분류는 줄기세포가 분리된 개체에 따른 것이다. 배아(embryo)에서 분리된 경우 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 성체에서 분리된 경우 성체줄기세포(adult stem cell)로 나눌 수 있다.
또 다른 흔한 분류는 하나의 줄기세포로부터 몇 종류의 분화된 세포를 만들어 낼 수 있는가에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotent) 줄기세포로 나눌 수 있으며, 일반적으로 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)는 만능줄기세포로, 성체줄기세포(adult stem cell)는 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotent) 줄기세포로 구분할 수 있다.
수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyt)의 내부세포덩어리(세포내괴, inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 내부세포덩어리로부터 형성된 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)는 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 만능줄기세포(pluripotent stem cell)라 할 수 있다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다.
이와 같은 만능줄기세포인 배아줄기세포는 세포 제조과정에서 배아의 파괴라는 심각한 종교적 그리고 윤리적 문제점이 존재하며, 제한된 배아로부터 유래하기에 각 개체간의 면역 적합성 부재로 인하여 세포 치료제로 개발 시 이식거부반응을 피할 수 없다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 성체에서 유래한 세포를 이용하여 맞춤형 배아줄기세포 또는 배아줄기세포와 같은 만능성을 가진 세포를 인위적으로 제조하기 위한 여러 가지 방법들이 시도되어 왔다.
대표적인 방법으로 체세포 핵치환법(somatic cell nuclear transfer, SCNT), 세포 융합법(fusion with ES cell), 특정인자주입법(reprogramming by defined factor)이 있다. 체세포 핵치환법은 그 효율이 매우 낮고, 윤리적 문제를 내포할 수 있는 난자가 대량으로 필요하다는 점에서 큰 제한점이 있다. 세포융합법은 유도된 세포는 2쌍의 유전자를 더 가지고 있어 세포의 안정성 측면에서 큰 문제점이 있다. 가장 최근에 발표된 기술인 특정인자주입법은 발암유전자를 포함하는 바이러스를 이용한 방법으로 암세포 형성이라는 심각한 문제점이 있다.
세포 치료제 개발을 위한 맞춤형 만능줄기세포를 확보하기 위하여 윤리적 문제가 없고 안정성, 안전성이 확보된 제조방법 개발이 요구되고 있다.
이러한 요구에 따라 체세포에 4가지 유전자를 도입시킴으로써 역분화를 통해 줄기세포인 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는 방법이 연구되었다(Takahashi K, Yamanaka S(2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676). 이는 성체세포를 이용하므로 윤리적으로 문제되지 않으며 자가 세포를 사용하므로 면역거부반응이 없어 종래의 문제점을 해결 하는 발판을 마련하였다.
본 발명자 등은 동물 유래의 유도만능줄기세포 (iPS, induced pluripotent stem cells) 추출물로 역분화 줄기세포를 획득한 바 있으나, 여기에는 몇 가지 제약이 있다.
첫째, 이 방법을 수행하기 위해서는 대량 (20mg 이상)의 iPSC 추출물이 필요하다. 따라서, 비용 및 노동력이 많이 요구되는 인간유래 역분화 줄기세포로부터 추출물을 분리하여 이를 이용한 역분화 유도는 아직 성공하지 못한 상태이다. 예를 들면, 20mg의 추출물을 얻기 위해 인간유래 역분화 줄기세포를 준비하려면 숙련된 기술자가 3개월 이상 이 일에 매진해야 하며, 그 비용은 상당하다.
둘째, 동물 줄기세포 또는 그에 상응하는 역분화 줄기세포의 경우 추출물을 분리하는 과정에서 완전히 파쇄 되지 못하고 살아남아서 역분화를 유도할 체세포에 처리했을 때, 역분화가 유도된 세포와 추출물에 남아있는 역분화 줄기세포와의 구별이 용이하지 않아서 실험의 성공여부를 즉시 알 수 없고, 이들의 유전체(genomic) DNA를 분석해야 비로소 알 수 있다. 결국 시간과 비용이 많이 낭비될 소지가 있다.
셋째, 아직 단백질로 인간유래 역분화 줄기세포가 만들어진 사례가 극히 드물기 때문에 바이러스로 만들어진 인간유래 역분화 줄기세포의 추출물을 이용해야 한다. 이 때, 바이러스에 의해 유도된 암 유발 물질 등이 섞여 있을 수 있으므로 향후 임상적용에 걸림돌이 될 수 있다.
본 발명의 일 측면은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 윤리적 문제가 없고 안정성, 안전성이 확보된 만능줄기세포의 제조방법을 제시하고자 한다. 또한 종래 기술로는 실현하기 힘들었던 인간유래 역분화 줄기세포를 유도하는 방법을 제시하고자 한다.
본 발명자들은 성체에서 유래한 세포를 이용하여, 세포를 분리한 성체와 동일한 유전적 배경을 가지는 만능줄기세포를 유도할 수 있는 방법을 개발하게 되었으며, 따라서 여러 다양한 유전적 배경을 가진 성체유래 세포로부터 동일한 결과를 도출함으로써 본 발명의 방법이 만능줄기세포를 만들어 낼 수 있는 적합한 발명임을 제시하고자 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면은 시킴산, 시킴산 을 포함하는 식물 추출물, 식물 줄기세포 추출물 또는 이들을 포함하는 조성물을 성체유래세포에 처리하여 줄기세포를 유도하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 일 측면은 식물 줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포에서 그 유효성분을 포함하는 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계; 및 상기 추출물이 주입된 세포를 배양 과정을 거쳐 배아줄기세포와 같은 만능성을 가진 세포를 제작하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 일 측면은 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물 추출물, 식물 줄기세포 추출물 또는 이들을 포함하는 조성물을 성체 유래 세포에 주입하는 단계; 및 시킴산, 추출물 또는 조성물이 주입된 세포를 배양하는 단계를 더 포함하여 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 추출물은 캘러스 추출물 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 방법은 추출물 주입 전, 상기 성체세포에 대하여 세포막 투과 촉진 화합물을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세포막 투과 촉진 화합물은 스트렙토리신 O(streptolysin O) 및 디기토닌(digitonin) 을 포함할 수 있으나 본 발명에 따른 시킴산 또는 추출물이 세포막 안으로 주입되는 것을 용이하게 하는 것이면 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서 상기 방법은 상기 추출물이 주입된 성체 유래 세포를 지지세포층으로 옮겨서 추가로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 지지세포는 STO 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다..
또한, 본 발명의 일 측면은 식물 줄기세포, 캘러스 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포에서 그 유효성분을 포함하는 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계; 상기 추출물이 주입된 세포를 일반세포 배양액으로 배양하고 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 추가로 배아줄기세포 배양액으로 배양하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능 줄기세포 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 방법에 의해 제조된 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 측면은 줄기세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 시킴산(Shikimic acid), 이를 함유하는 식물추출물 또는 식물 줄기세포 추출물을 사용하여 성체의 분화된 세포를 재프로그램화 및/또는 역분화를 일으킴으로써 맞춤형 만능줄기세포(inducible Pluripotent stem cell : iPSC)를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 및 상기 만능줄기세포를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 사용되는 시킴산을 함유하는 식물추출물 또는 식물 줄기세포 추출물은 세콰이어(Sequoiadendron giganteum), 노란꽃창포 (Iris pseudoacorus), 뚱딴지(돼지감자)(Helianthus tuberosus), 은청가문비 (블루가문비)(Picea pungens), 글라우카가문비(화이트가문비)(Picea glauca), 유칼립투스 (Eucalyptus sieberiana), 유칼리나무(Eucalyptus regnans), 웨스턴 측백나무 (Thuja plicata), 대추야자 (Red Ceda , Phoenix dactylifera), 다알리아 바리아빌리스 (Dahlia variabilis), 야광나무 (Malus baccata) , 서양배 (Pyrus communis) , 밀 (Triticum), 소나무 (Pinus densifloraa), 곰솔 (Pinus thunbergii ), 붓순나무 (Illicium anisatum), 태산목 (Magnolia grandiflora) , 약모밀(어성초) (Houttuynia cordata), 바위취(범의귀) (Saxifraga stolonifera ), 말단 생식절 아르주나 (Terminalia arjuna), 유향수 (Pistacia lentiscus), 서양 까치밥나무 (Ribes aureum), 컴프리 (Symphytum officinalis), 악타이아 파키포다 (Actaea pachypoda), 박쥐나무 (Alangium salvifollium), 은행나무 (Gingko biloba), 푸른 여로 (Veratrum viride), 산토끼꽃류 (Dipsacus laciniatus), 아가스타체 (Agastache urticifolia), 목향 (Inula helenium), 서양물레나물(세인트존스워트) (Hypericum spp ), 코멜리나 벵갈렌시스 (Commelina bengalensis), 김네마(당살초) (Gymnema sylvestris), 가자 (Terminalia chebula), 홍화 붓순나무 (Illicium floridanum) , 붓순나무과 (Illicium diffengri), 홍회향 (Illicium henryi), 팔각회향 (Illicium verum), 붓순나무과 (Illicium lancealatum), 붓순나무과 (Illicium pachyphyllum), 미국 붓순나무 (Illicium anisatum), 붓순나무 (Illicium religiosum), 헤미데스무스 인디커스 (Hemidesmus indicus , Sarvia), 시스터스 인카누스 (Cistus incanus), 사이다 악투아 (Sida acuta), 노박덩굴 (Celastrus paniculata), 글리코미스과 (Glycosmis muricata), 제충국 (Tanacetum parthenium , Pyrethrum), 밀 (Triticum aestivum), 하이페리쿰 (Hypericum dolabriforme), 산토끼꽃 (Dipsacus pilosus), 물고추나물 (Triadenum walteri), 하이페리쿰(세인트존스워트)(Hypericum flondosum), 및 터미날리아 팔리드 (Terminalia pallid)의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물이 더 포함될 수 있다. (참고문헌 Denis V. Bochkov et.al., Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources,J chem. Biol. (2012) 5;5-17)
또한 상기 방법에 의해 제조된 줄기세포를 포함하는 줄기세포 활성화용, 피부재생용, 또는 항노화용 조성물 또는 이를 포함하는 약학 또는 미용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 줄기세포 제작의 가장 좋은 방법으로, 식물줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기 세포(induced Pluripotent Plant Stem cells)의 추출물, 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물 추출물 또는 이들을 포함하는 조성물을 이용할 수 있으며, 또한 이 방법은 다양한 유전적 배경을 가진 인간을 포함하는 모든 종의 세포에 모두 적용될 수 있는 광범위한 제작방법이 될 것이다. 또한 본 발명의 방법은 식물유래 줄기세포 추출물을 사용함으로써, 윤리적 문제가 없고 안전성이 확보된 맞춤형 만능줄기세포의 제조를 가능하게 한다.
도 1은 본 발명의 방법에 따라 만능줄기세포를 유도하는 전체 실험 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 5일째 관찰된 유도 만능줄기세포를 나타내는 그림이다.
도 3은 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 8일째, 지지세포(feeder cell)로 옮긴지 2일째 관찰된 유도 만능줄기세포를 나타내는 그림이다.
도 4A는 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 32일째, 지지세포(feeder cell)로 옮겨서 4번의 계대배양 후 관찰된 유도 만능줄기세포를 나타내는 그림이다. 도4B는 전형적인 배아줄기세포를 나타내는 그림이다.
도 5는 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 32일째, 지지세포(feeder cell)로 옮겨서 4번의 계대배양 후 관찰된 유도 만능줄기세포의 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase) 염색 결과를나타내는 그림이다.
도 6A는 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 50일째, 지지세포(feeder cell)로 옮겨서 7번의 계대배양 후 관찰된 유도 만능줄기세포를 나타내는 그림과 그 세포의 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase) 염색 결과를 나타내는 그림이다. 도6B는 야마나카의 4 factor 바이러스를 이용하여 유도된 인간 만능줄기세포와 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase) 염색결과를 나타내는 그림이다.
도 7은 본 발명의 방법으로 유도된 만능줄기세포의 유전자 발현을 보여주는 그림이다.
도 8은 본 발명에 따른 세콰이어 캘러스 추출물의 HPLC 결과를 나타낸 그래프이다. 여기서 Shikimic acid는 본 명세서 [화학식 1]의 구조를 갖는 시킴산을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 방법에 따라 시킴산 또는 이를 포함하는 식물 줄기세포 추출물을 이용하여 만능줄기세포를 유도하는 전체 실험과정을 나타내는 모식도이다.
도 10은 시킴산 또는 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 뒤 HDF에서 Oct3/4 유전자의 발현을 보여주는 그림이다.
도 11은 시킴산을 농도별로 처리한 뒤 HDF에서 Oct3/4 유전자의 발현을 보여주는 그림이다.
도 12는 시킴산 또는 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 뒤 ALP의 발현 증가를 보여주는 그림이다.
도 13는 시킴산을 농도별로 처리한 뒤 ALP의 발현 증가를 보여주는 그림이다.
도 14은 시킴산 또는 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 뒤 진피세포의 콜로니 생성력을 나타낸 그림이다.
도 15는 시킴산 또는 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 뒤 진피세포의 콜로니 생성력을 나타낸 그래프이다.
도 16은 시킴산을 농도별로 처리한 뒤 진피세포의 콜로니 생성력을 나타낸 그림이다.
도 17는 시킴산을 농도별로 처리한 뒤 진피세포의 콜로니 생성력을 나타낸 그래프이다.
도 18는 시킴산 또는 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 뒤 진피세포의 증식력 증가를 나타낸 그래프이다.
2013년 10월 17일에 출원된 한국 특허 출원번호 10-2013-0123860호는 모든 목적으로서 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한 본 출원은 그 전체가 본 명세서에서 참조로 포함되는 한국 특허 출원번호 10-2013-0123860호의 이익을 주장한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은
a) 식물 줄기세포 또는 유도된 만능 식물 줄기세포에서 그 유효성분을 포함하는 추출물을 추출하는 단계;
b) 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계; 및
c) 상기 추출물이 주입된 세포를 배양 과정을 거쳐, 배아줄기세포와 같은 만능성을 가진 세포를 제작하는 단계를 포함하는 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 일 측면은 시킴산; 시킴산을 포함하는 식물 추출물; 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물; 또는 이들을 포함하는 조성물을 성체유래세포에 처리하는 것을 포함하는 줄기세포 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 일 측면은 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물 추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물 또는 이들을 포함하는 조성물을 성체 유래 세포에 주입하는 단계; 및 시킴산, 추출물 또는 조성물이 주입된 세포를 배양하는 단계를 더 포함하여 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 추출물은 캘러스 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물은 시킴산(shikimic acid), 카페산(caffeic acid) 또는 페룰산(ferulic acid)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "시킴산"은 하기 화학식 1을 가질 수 있으며, 이것의 전구체, 유도체 등을 포함하는 가장 광범위한 개념을 의미한다. 또한 시킴산의 분자량은 174.15g/몰 일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014009702-appb-I000001
본 명세서에서 "카페산"은 하기 화학식 2를 가질 수 있으며, 이것의 전구체 유도체등을 포함하는 가장 광범위한 개념을 의미하고, 그 분자량은 180.16g/몰 일 수 있다. 또한 카페산은 커피콩을 포함한 배와 같은 과일과 바질, 타임, 바나나, 타라곤, 오레가노, 민들레등과 같은 약용식물에 포함되어 있는 페놀 화합물을 의미한다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2014009702-appb-I000002
본 명세서에서 "페룰산"은 하기 화학식 3을 가질 수 있으며, 이것의 전구체 유도체등을 포함하는 가장 광범위한 개념을 의미하고, 그 분자량은 191.18g/몰 일 수 있다. 또한 페룰산은 식물의 세포벽을 형성하는 리그닌의 전구체에 해당하며 식물의 세포벽에 풍부하게 들어있는 성분으로 밀이나 귀리, 커피, 사과, 오렌지, 땅콩 등의 식물 씨앗에 들어있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2014009702-appb-I000003
본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.
본 발명에서 사용된 용어 '배아줄기세포'는 수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyt)의 내부세포덩어리(세포내괴, inner cell mass)에서 분리 후 배양한 세포로 만능성(pluripotency)을 지니는 세포를 지칭한다.
본 발명에서 사용된 용어 '역분화 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기세포 (induced Pluripotent Stem cells, iPS) 추출물'은 시험관 내에서 여러 가지 방법으로 유도 및 배양한 역분화 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기세포 (induced Pluripotent Stem cells, iPS)를 물리-화학적 방법을 통하여 잘게 부순 후 원심분리 등의 방법으로 분리한 물질을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 용어 "식물 줄기세포"는 형성층 유래 식물줄기 세포이다. 특히, 식물의 물관과 체관의 경계선상에 끼인 형성층에서 물리적으로 전혀 손상받지 않은 상태의 순수 식물줄기세포 (CMC Cambial Meristematic Cell)를 포함한다. 또한 본 명세서에서 "식물 줄기세포"는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포를 포함하는 것으로서 가장 광범위한 개념이다.
본 발명에서 사용된 용어 "캘러스"(Callus, 혹은 유합조직, 창상조직, 유상조직)는 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 식물은 크게 세포분열을 하는 분열조직과 그렇지 않은 영구조직으로 구성되어 있는데 처음 분열조직의 세포를 영양 배지에 넣고 키우면 캘러스가 형성된다. 그 후 부정배가 형성되고 식물체로 분화된다. 이 캘러스는 흔히 "식물의 줄기세포"라고도 불린다. 본 발명에 사용되는 캘러스의 종류에는 제한이 없다.
본 발명에서 사용된 용어 '만능줄기세포'는 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer), 즉 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm) 모두로 분화할 수 있는 다기능성(만능성)을 지닌 줄기세포를 지칭한다. 전통적으로 배아줄기세포가 이 범주에 속하는 줄기세포라 할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '맞춤형 만능줄기세포'는 만능줄기세포를 만들기 위해 사용한 공여세포와 유도된 만능줄기세포가 유전적으로 동일함을 지칭하며, 이는 맞춤형 만능줄기세포가 공여세포로부터 기원하여 유도된 세포임을 나타
낸다.
본 명세서에서 '맞춤형 만능줄기세포', '역분화 줄기세포', '유도(된) 만능 줄기세포'는 서로 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '성체유래 세포'는 배아세포와 반대되는 용어로, 태어나서 생존하는 성체로부터 유래한 세포를 지칭한다.
본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 식물은 세콰이어일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 식물 줄기세포는 캘러스(callus)일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 식물 줄기세포는 세콰이어 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 식물 줄기세포 추출물은 캘러스 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 추출물은 세콰이어 캘러스 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 세콰이어는 빅트리(Sequoiadendron giganteum) 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 추출물 또는 조성물은 시킴산을 포함할 수 있다.
본 발명이 일 측면에 있어서, 조성물은 그 조성물의 총 부피를 기준으로시킴산을 10uM 내지 30 mM의 농도로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 그 조성물의 총 부피를 기준으로 시킴산, 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물을 10uM 이상, 20uM 이상, 30uM 이상, 50uM 이상, 100uM 이상, 1mM 이상, 5mM 이상, 10mM 이상, 20mM, 또는 30mM 이상 포함할 수 있으며, 1M이하 또는 100M이하로 포함할 수 있다. 조성물에 포함된 시킴산의 함량이 10uM 이하인 경우 본 발명에 따른 효과를 나타내기 힘들 수 있으며, 30mM 이상인 겨우 피부에 자극을 줄 수 있다. 바람직하게 시킴산은 조성물의 총 부피를 기준으로 0.1mM 이상, 0.5mM 이상, 0.6mM 이상, 0.7mM 이상, 0.8mM 이상 또는 0.9mM 이상의 농도로 포함될 수 있으며 또는 5mM 이하, 4mM 이하, 3mM 이하, 2mM 이하, 1.5mM 이하, 1.4mM 이하, 1.3mM 이하, 1.2mM 이하, 또는 1.1mM 이하의 농도로 포함될 수 있다. 더욱 바람직 하게 시킴산은 조성물의 총 부피를 기준으로 0.8mM 내지 1.2mM의 농도로 포함될 수 있다. 가장 바람직 하게 시킴산은 조성물의 총 부피를 기준으로 1mM의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물은 그 추출물의 총 부피를 기준으로 시킴산을 0.0001%(w/v) 내지 45%(w/v)로 포함할 수 있다. 이와 같은 범위의 시킴산을 포함하는 경우 우수한 Oct3/4 유전자 발현 효과, ALP 발현 효과, 섬유아세포의 증식 촉진 효과를 가질 수 있다. 상기와 같은 관점에서, 본 명세서에서 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물은 그 추출물의 총 부피를 기준으로 시킴산을, 0.001%(w/v) 이상, 0.01%(w/v) 이상, 0.1%(w/v) 이상, 1%(w/v) 이상, 5%(w/v) 이상, 10%(w/v) 이상, 15%(w/v) 이상, 20%(w/v) 이상, 25%(w/v) 이상, 또는 30%(w/v) 이상으로 포함할 수 있으며, 45%(w/v) 이하, 40%(w/v) 이하, 38%(w/v) 이하, 36%(w/v) 이하, 34%(w/v) 이하, 33%(w/v) 이하, 또는 32%(w/v) 이하로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에서 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물은 그 추출물의 총 부피를 기준으로 시킴산을, 32%(w/v) 내지 34%(w/v)로 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 32.75%(w/v)로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 그 조성물의 총 부피를 기준으로 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물을 상기 시킴산 및 추출물들의 농도를 고려하여 추출물들에 포함된 시킴산의 농도가 상기에 기재한 조성물의 총 부피를 기준으로 포함된 시킴산의 농도가 되도록 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물의 총 부피를 기준으로 조성물에 포함된 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물은 0.001ug/ml 이상, 0.01ug/ml 이상, 0.1ug/ml 이상, 1ug/ml 이상, 10ug/ml 이상, 50ug/ml 이상, 100ug/ml 이상, 0.3mg/ml이상, 0.4mg/ml이상, 0.5mg/ml이상, 0.6mg/ml이상, 0.7mg/ml이상, 1mg/ml 이상, 1.5mg/ml이상, 2mg/ml이상, 5mg/ml 이상, 10mg/ml 이상, 20mg/ml 이상, 또는 50mg/ml 이상일 수 있으며 1g/ml이하, 또는 10g/ml이하 일 수 있다.
본 명세서에서 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물에 포함된 시킴산의 측정은 Waters 1525μ Binary HPLC Pump를 이용하여 Gemini 5u C18 110 A(5μm, 4.6 X 250nm, Phenomenex 사)컬럼 으로서 250 * 4.60 mm, 5 마이크론의 규격을 갖는 것이며, 이동상의 용매 A를 물(0.1% TFA함유)로 하고 용매 B를 아세토나이트릴(0.1% TFA함유)로 하여 측정한 것일 수 있다.
본 명세서에서 "세콰이어"는 레드우드(Sequoia sempervirens), 빅트리(Sequoiadendron giganteum) 또는 메타세콰이어(Metasequoia glyptostroboides)를 포함하는 것이다.
레드우드(Sequoia sempervirens)는 소나무목 측백나무과의 나무로서 미국삼나무라고도 하며, 미국 캘리포니아의 북서해안과 오리건의 남서부와 뉴질랜드 등지에서만 자란다. 수령은 2500~3000년 정도이며 최대 높이가 112m나 되는 세계에서 가장 큰 나무이다. 지름 2.5∼4.5 m, 높이 50∼100m이고 수피는 두께가 20∼30 cm에 달한다. 잎은 주목과 비슷하고 길이 1∼3cm로서 끝이 뾰족하며 주맥이 뚜렷하다. 잎 표면은 짙은 녹색이고 뒷면은 흰빛이 돈다.
빅트리(Sequoiadendron giganteum)는 세쿼이아덴드론속의 유일한 종이며, 미국 캘리포니아의 시에라네바다산맥의 서쪽 해발고도 1500~2500m에서 자라는데, 지름 3.5~6m, 높이 60~90m에 달하고 뿌리 근처의 지름은 10m 내외이다. 잎은 삼나무와 비슷하고 길이 1cm 정도로서 나선 모양으로 배열하지만 성숙한 가지에 달린 잎은 비늘같이 생긴다.
메타세콰이어(Metasequoia glyptostroboides)는 측백나무과의 나무로 메타세콰이어속 중 유일하게 생존하고 잇는 종이다. 원산지에서는 수고 35m까지 자라고 수피는 회색빛을 띤 갈색이고 세로로 벗겨진다. 가지는 옆으로 퍼지고 잎은 두 줄로 마주나며 길이 10~23mm, 너비 1.5~2mm의 선모양이다. 끝이 뾰족하고 갈색, 붉은색의 단풍이 든다. 꽃은 2~3월에 암수한그루로 피고 수꽃은 총상화서로 잎겨드랑이 가지 끝에 달려 밑으로 늘어지며 20개의 수술이 있다. 암꽃은 가지 끝에 달리며 3월에 개화한다. 열매는 구과이고 길이 18~25㎜의 둥근모양이고 갈색으로 익으며 벌어져 날개가 달린 타원모양의 종자가 나온다. 낙엽침엽교목으로 원산지는 중국 쓰촨 성, 후베이 성 이고 한국, 중국 등에 분포하며 주로 공원수로 식재된다.
캘러스(Callus, 혹은 유합조직, 창상조직, 유상조직)는 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로, 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 식물은 크게 세포분열을 하는 분열조직과 그렇지 않은 영구 조직으로 구성되어 있는데, 처음 분열조직의 세포를 영양 배지에 넣고 키우면 캘러스가 형성된다. 그 후 부정배가 형성되고 식물체로 분화된다. 캘러스는 흔히 '식물의 줄기세포'라고도 불린다.
본 명세서에서 "추출물"은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 것이며 또한 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다.
본 명세서에서 사용되는 세콰이어는 추출물의 형태로 포함되거나, 생약 자체의 분쇄물, 또는 생약의 건조 분쇄물로서 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 아울러 본 명세서에서 사용되는 세콰이어는 그 입수 방법에 제한이 없으며, 재배하여 사용하거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있으며, 세콰이어의 지상부 및 지하부를 포함하는 그 전부를 의미할 수 있다. 지상부의 경우 세콰이어의 열매, 잎 및 줄기 등을 포함할 수 있으며 지하부의 경우 뿌리 등을 포함할 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "식물 추출물"은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 세콰이어와 같은 식물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 것이며 그 성분을 뽑아내는 과정에서 열, 산(acid), 염기(base), 효소 등으로 처리하는 공정을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어진 물질을 포함하며 또한 세콰이어와 같은 식물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다.
본 명세서에서 "식물 줄기세포 추출물"은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 세콰이어 등 식물의 줄기세포를 배양한 뒤 그 유효성분을 뽑아냄으로써 얻어지는 물질을 모두 포함하는 것이며 그 성분을 뽑아내는 과정에서 열, 산(acid), 염기(base), 효소 등으로 처리하는 공정을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어진 물질을 포함하며 또한 세콰이어와 같은 식물의 줄기세포의 유효성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다.
본 발명의 방법은 식물 줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포를 배양하고 이로부터 추출물을 제조하는 단계를 포함하는데, 이는 당업계에 공지된 일반적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 식물 줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포를 배양하고 이를 단백질 분해 효소로 처리한 후 부유액을 수합하거나 식물 줄기세포를 65℃에서 2 시간동안 반응시켜 필터링함으로써, 각각의 세포로부터 유래하는 단백질 또는 시킴산을 추출할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 캘러스 파우더를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 세콰이어 캘러스 추출물은 i) 세콰이어로부터 캘러스(callus)를 유도하는 단계; ii)캘러스를 고체배양(solid cell culture)하여 줄기세포주(stem cell line)를 확립하는 단계; iii)세포주를 현탁배양(suspension cell culture)을 통해 유효 성분을 대량으로 생산하는 단계; 및 생산된 유효성분을 추출하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서 세콰이어 캘러스로부터 유효성분을 추출하는 방법은 한국공개특허 제 2007-0113193호에 공지된 추출방법과 같이 상기 식물의 조직 외식체(tissue explant)로부터 유래되는 세포주의 식물성 배양 방법으로 추출할 수 있으며, 세콰이어 유래의 안정한 식물세포주에 5-탄소원자 이하의 알코올의 혼합물을 가하여 용출시켜 추출할 수 있으나, 상기의 추출 방법에 한정되지는 않는다.
또한 본 명세서에서 세콰이어 캘러스 추출물 또는 세콰이어 캘러스 파우더는 상업적으로 구입하여 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 세콰이서 캘러스 추출물은 세콰이어 캘러스 파우더를 용매에 용해시켜 제조되는 것일 수 있으며, 이때 용매는 물, 유기용매 및 물과 유기용매의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함한다. 상기 물은 증류수 또는 정제수를 포함할 수 있고, 유기 용매는 C1~C5의 저급 알코올을 예로 들 수 있는 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트, n-부탄올, BG(부틸렌글리콜)와 EtOH(에탄올)의 혼합 용매 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide)용매 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 추출물 제조와 관련하여, 기존의 단백질 추출 방법을 응용하여 고농도의 단백질 추출물을 제조할 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다. 상기 식물로부터 유래한 시킴산 또는 단백질 추출물의 농도는 추출물을 포함하는 조성물의 전체 부피를 기준으로 10ug/ml 내지 1mg/ml 가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 500 ug/ml 내외이다. 단백질 추출물의 농도가 상기 범위를 벗어나면 맞춤형 만능줄기세포의 유도 효율이 저하되거나 추출물이 처리된 세포가 사멸할 우려가 있기 때문이다.
본 발명의 방법은 식물 줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포에서 분리한 단백질 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계를 포함한다.
상기 성체유래세포는 인간유래 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast) 또는 인간 진피 섬유아세포(Neonatal human dermal fibroblasts) 를 포함할 수 있다.
주입을 위하여 세포막 투과 촉진 화합물(예를 들면, 스트렙토리신 O 또는 디기토닌)을 세포에 처리하여 가역적인 조그만한 구멍을 뚫어(투과화, permeabilization) 추출물이 세포내로 유입될 수 있도록 처치한다. 투과화 과정을 거친 후 추출물과 함께 배양(incubation)하는 과정을 통하여, 성체유래 세포 내로 시킴산, 식물 추출물, 식물 줄기세포 추출물, 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포 추출물 또는 이들을 포함하는 조성물을 주입한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 만능줄기세포 제조방법은,
1. 본 명세서에 따른 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 식물 줄기세포 추출물 또는 이들을 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
2. 시킴산, 추출물 또는 조성물을 성체유래세포에 주입하는 단계;
3. 상기 성체유래세포를 일반세포배양액을 사용하여 배양하는 단계;
4. 상기 배양된 세포를 지지세포층이 있는 배양조건으로 옮겨 추가로 배양하는 단계;
5. 배양된 만능줄기세포를 회수하는 단계;
를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 시킴산, 추출물 또는 조성물을 성체유래세포에 주입하는 단계는,
1. 성체유래세포를 낱개의 세포로 한 후 재현탁하여 튜브로 옮기는 단계;
2. 원심분리 후 세포 펠렛을 재현탁하여 수조에서 반응시키는 단계;
3. 세포막 투과 촉진 화합물을 첨가하는 단계;
4. 샘플을 수조에서 위아래로 섞어주면서 반응시키는 단계;
5. 반응이 끝난 샘플을 원심분리하는 단계;
6. 세포 펠렛을 시킴산, 추출물 또는 조성물로 재현탁하는 단계;
7. ATP-재생시스템을 통하여 수조에서 위아래로 섞어주며 반응시키는 단계;
8. 반응 후 ES세포배지를 첨가하여 배양기에서 반응시키는 단계;
9. 세정 후, 세포 펠렛을 배아줄기세포 배양 배지로 재현탁 시킨 후 디쉬에 시딩(seeding)하는 단계;
를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 시킴산, 추출물 또는 조성물이 주입된 세포를 배양과정을 거쳐, 배아줄기세포와 같은 만능성을 가진 세포를 제작하는 단계를 포함한다.
상기의 시킴산, 추출물 또는 조성물의 주입 과정 후 일반 세포 배양액을 사용하여 이들이 주입된 성체유래 세포를 배양한 후, 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 추가로 배양하는 과정을 수행할 수 있다.
더욱 구체적으로는 상기의 시킴산, 추출물 또는 조성물 주입 과정 후 콜로니가 형성될 때 까지 일반 세포 배양액(DMEM, 5-15% FBS, 10-100U/ml 페니실린, 20-80mg/ml 스트렙토마이신)을 사용하여 추출물이 주입된 성체유래 세포를 배양한 후, 콜로니가 생긴 이후 에는 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 배아줄기세포 배양액에서 5-8일마다 계대배양하며 배지는 매일 교환하며 배양하는 과정을 수행할 수 있다. 본 발명의 지지세포는 STO 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 추출물에 의해 유도된 만능줄기 세포는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12에 15-25% KSR (Knockout serum replacement), 1-4 mM L-글루타민, 0.05-0.2mM 비필수 아미노산, 0.05-0.2mM β-머캅토에탄올, 30-70U/ml 페니실린, 30-70mg/ml 스트렙토마이신, 및 1-30 ug/ml bFGF가 첨가된 배양액에서 배양할 수 있다. 상기 DMEM에 첨가되는 화합물의 농도는 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서 변할 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 식물 줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포에서 단백질을 분리하는 추출물 제조 단계;
b) 세포막 투과 촉진 화합물을 성체 유래 세포에 처리하고 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계; 및
c) 상기 추출물이 주입된 세포를 일반세포 배양액으로 배양한 후 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮긴 다음, 배아줄기세포 배양액으로 배양하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 시킴산, 식물추출물, 식물줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포 추출물 또는 이들을 포함하는 조성물을 이용하여 성체유래 세포로부터 배아줄기세포와 구분이 안될 정도이고 그와 같은 만능성을 가진 세포를 만들 수 있다는 것에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 상기 본 발명의 방법을 통해 만능줄기세포가 유도됨을 확인하였다.
구체적으로, 세포의 모양에 있어서 본 발명에 의해 유도된 만능줄기 세포는 그 모양이 배아줄기세포와 거의 동일함을 알 수 있다 (도 4 참조). 또한 배아줄기세포의 특징적인 유전자 (Nanog, Oct4)의 발현여부를 조사한 결과 본 발명에 의해 유도된 만능줄기세포에서 배아줄기세포와 동일하게 상기 유전자가 발현됨을 확인하였다(도 7 및 도 10 참조).
또한, 본 발명의 일 측면은 본 발명의 일 측면인 방법에 의해 유도된 만능줄기세포를 제공한다.
본 발명자들은 상기 방법을 통해 8-12번의 계대배양을 성공하여 줄기세포의 특징인 자가 재생(self-renewal)이 되는 것을 확인하였다 (도 6 참조).
또한 본 발명의 일 측면은 본 발명의 일 측면인 방법에 따라 제조된 만능줄기세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물 및 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 약학 조성물, 식품조성물 또는 미용 조성물 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 줄기세포 활성화용, 피부재생용 또는 항노화용 조성물인 것일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 줄기세포 활성화가 필요한 개체에 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 줄기세포 활성화 방법에 관한 것일 수 있다. 상기 투여는 본 명세서에 기재되어 있는 투여방법 또는 투여량에 따르는 것일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 피부 재생이 필요한 개체에 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피부 재생 방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 항노화가 필요한 개체에 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 항노화 방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물의 줄기세포 활성화 용도, 피부 재생 용도 또는 항노화 용도에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 줄기세포 활성화, 피부 재생, 또는 항노화에 사용하기 위한 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 세포 치료제인 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 치료제는 간세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 혈관내피세포 등의 형성에 이용될 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 세포 치료가 필요한 개체에 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 세포 치료 방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물의 세포 치료 용도에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 세포 치료에 사용하기 위한 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '세포 치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포 치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포 치료제, 줄기세포 치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 일측면은 본 명세서에 따른 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 식물 줄기세포 추출물 또는 만능줄기세포를 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에서 상기 조성물은, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화 방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기 염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01~5 중량%, 보다 구체적으로는 0.01~3 중량% 범위일 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 상기 식품 조성물은 건강 식품 조성물, 기능성 식품 조성물, 보조 영양제, 가공 식품 조성물, 식품 첨가물 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면은 본 명세서에 따른 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 식물 줄기세포 추출물 또는 만능줄기세포를 포함하는 미용 조성물을 제공한다. 상기 미용 조성물은 화장품학 또는 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소 적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 멀티 에멀젼, 현탁액, 마이크로 에멀젼, 마이크로 캡슐, 미세 과립구, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제, 포말(foam), 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 또는 패치 형태로 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유하는 것도 무방하며, 본 발명의 유효 성분 이외에 다른 성분을 기타 화장품 조성물의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화장품 조성물은 상기 유효 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품 조성물에 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있고, 이의 예로서 유지 성분, 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 안정화제, 증점제, 글리세린, pH 조절제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다. 상기 화장품 조성물에 포함될 수 있는 기타 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니고, 또한 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 가능하다.
상기 화장품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 유연 화장수, 영양 화장수, 에센스, 영양 크림, 마사지 크림, 팩, 젤, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 립스틱, 패치, 분무제, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌져, 모발 샴푸, 모발 컨디셔닝, 모발 트리트먼트, 모발 에센스, 모발 로션, 두피 헤어토닉, 두피 에센스, 헤어젤, 헤어 스프레이, 헤어팩, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일 및 바디 에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면은 본 명세서에 따른 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 식물 줄기세포 추출물 또는 만능줄기세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 약학 조성물은 유효 성분 이외에 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오즈 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 또는 폴리에틸렌 글리콜) 또는 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로오즈 또는 폴리비닐피롤리딘) 등의 약제학적 보조제 또는 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있다. 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 또는 감미제 등의 다른 약제학적 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.
상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효 성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 상기 비경구 투여제는 예를 들어, 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 약학 조성물은 비경구, 직장, 국소, 경피, 피하 등으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 각 투여법에 적합한 제형 및 기준에 준한다. 특히, 정맥 주사의 경우 이에 적합하지 못 한 모든 첨가물을 배제하며, 조성물 자체의 순도 또한 매우 높게 제조된다.
상기 유효 성분의 적용량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 질환, 병리 상태, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적인 투여량은 30ug/ml 내지 1mg/ml 가 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 본 명세서에 따른 방법으로 제조된 만능줄기세포의 경우 약학 조성물에 있어서 주사제의 제형으로 사용되는 것이 바람직하다. 본 명세서에 따른 방법으로 제조된 만능줄기세포의 경우 피부에 주사하여 주름을 제거하는 용도로써 보편적으로 사용되고 있는 보톡스와 유사하게 피부에 주사되어 피부 줄기세포를 활성화 시키고, 피부 세포의 증식을 촉진하는 등의 효과를 통해 피부재생, 항노화, 탄력 증진, 주름 개선과 같은 효과를 나타낼 수 있는 것이다.
본 발명의 일측면은 본 명세서에 따른 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물, 식물 줄기세포 추출물 또는 만능줄기세포를 포함하는 실험용 시약 또는 배지 조성물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 조성물 또한 제공한다.
이하, 하기 실시예를 들어 본 발명의 실시 형태를 구체적으로 설명하겠으나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 식물세포 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계
본 발명자들은 식물유래 줄기세포 추출물로 캘러스 파우더를 사용하였다. 본 발명에 사용될 수 있는 캘러스 파우더에는 제한이 없으며 상업적으로 구입하여 사용할 수도 있다.
세콰이어 캘러스 추출물은 세콰이어의 잎사귀로부터 캘러스(callus)를 유도한 후 고체배양(solid cell culture)하여 줄기세포주(stem cell line)를 확립하고 현탁배양(suspension cell culture)을 통해 유효 성분을 대량으로 생산한 후 추출하여 얻는다. 세콰이어 캘러스로부터 유효성분을 추출하는 방법은 한국공개특허 제 2007-0113193호에 공지된 추출방법과 같이 상기 식물의 조직 외식체(tissue explant)로부터 유래되는 세포주의 식물성 배양 방법으로 추출할 수 있으며, 세콰이어 유래의 안정한 식물세포주에 5-탄소원자 이하의 알코올의 혼합물을 가하여 용출시켜 추출할 수 있으나, 상기의 추출 방법에 한정되지는 않는다.
하기 실시예에서는 상업적으로 구입한 세콰이어 캘러스 파우더 (sequoia callus power)(㈜바이오에프디엔씨에서 구입)를 사용하였다. 구체적으로, 인간유래 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast)를 트립신-EDTA를 이용하여 낱개의 세포로 한 후, 콜드(cold) PBS (phosphate buffered saline)으로 세정하였다. 세포 펠렛을 콜드(cold) Ca2- 및 Mg2-프리(free) HBSS(Hank's balanced salt solution) 100㎕/100,000 세포가 되게 재현탁하고 1.5ml 튜브로 옮겼다. 120g, 5분간, 4℃로 수평로터(swing-out rotor)에서 원심분리한 후 상등액은 버리고 세포 펠렛을 다시 콜드(cold) HBSS 97.7㎕로 재현탁하여 37℃ 수조(water bath)에서 2분간 반응시켰다. 스트렙토리신 O(SLO, 콜드(cold) HBSS 중에 1:10 희석된 100 g/ml 스톡)2.3㎕를 첨가하였다 (최종 SLO 농도: 230 ng/ml). 또는 이 과정에서 SLO 대신 디기토닌 (20ug/ml)과 수송 용액(transport solution)(110 mM 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 5 mM 소디움 아세테이트(sodium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(magnesium acetate), 1mM EGTA, 2 mM DTT, 단백질 분해효소 저해제 혼합물(proteaseinhibitor cocktail), 20 mM HEPES pH7.3) 200ul를 첨가할 수 있다. 샘플을 37℃ 수조에서 50분간 반응시키는데, 10분에 한 번씩 위아래로 섞어주었다. 반응이 끝난 샘플을 얼음 위에 올려놓고 콜드(cold) HBSS 200㎕를 첨가한 후, 120 g, 5분간, 4℃로 수평로터(swing-out rotor)에서 원심분리한다. 이러한 세포투과(permeabilization) 과정을 거 친 후에, 세포 펠렛을 1㎕/1000 세포가 되도록 200㎕의 식물 줄기세포 추출물로 재현탁하였다. 식물 줄기세포 추출물로는 캘러스 파우더를 사용하였다 (500ug/ml). 그리고, ATP-재생 시스템 (10 mM 크레아틴 포스페이트, 및 25g/ml 크레아틴 키나아제), 각각 1mM 뉴클레오티드 트리포스페이트를 첨가하고 37℃ 수조에서 1시간 반응시키는데, 10분에 한번씩 위아래로 섞어주었다. 반응이 끝난 후, 원형질막을 재 봉합하기 위하여 2 mM CaCl2가 함유된 ES 세포 배지 1㎖을 첨가하여 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS 세정 후, 세포 펠렛을 배아줄기세포 배양 배지로 재 현탁 시킨 후 0.1% 젤라틴이 코팅된 디쉬에 시딩(seeding) 하였다.
[실시예 2] 추출물이 주입된 세포를 배양과정을 거쳐, 배아 줄기세포와 같은 만능성을 가진 세포를 제작하는 단계
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% FBS, 50U/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 일반세포 배양배지에서, 37℃를 유지하며 5% CO2가 공급되는 배양기에서 배양하였다. 0.1% 젤라틴이 코팅된 디쉬에 식물줄기 세포 추출물(캘러스 파우더)이 주입된 성체유래 세포(인간유래 피부섬유아 세포)를 상기의 배지로 배양하여 첫 2일 후 배지를 교환해 주었다. 10일 동안 매일 배지를 교환해주며 배양한 후, 미토마이신 C(MMC)가 처리된 지지세포 (feeder cell, STO cell) 위에 1:2의 비율로 옮겼다. 이후 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12에 20% KSR (Knockout serum replacement), 2 mM L-글루타민, 0.1mM 비필수 아미노산, 0.1mM β-머캅토에탄올, 50U/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 10 ug/ml bFGF가 첨가된 배양액에서 배지를 매일 교환해주며 7일에 한번 주기로 새로운 지지세포 위로 옮겼다. 평균적으로 약 21일 째 분석에 필요한 맞춤형 줄기세포를 배양할 수 있었다.
도 1은 본 발명의 방법에 따라 만능줄기세포를 유도하는 전체 실험 과정을 나타내는 모식도이다. 도 2 내지 도 4는 각각 배양 5일째, 10일째, 및 32일째 만능줄기세포가 유도된 것을 보여주며, 도 5 및 도 6은 각각 배양 32일째 및 배양 50일째의 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase) 염색소견을 보여준다. 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase) 염색은 통상의 염색 키트를 이용하여 확인하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 유도된 만능줄기 세포가 배아줄기세포의 특징인 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase) 염색 양성 소견(보라색)을 나타냄을 알 수 있다.
[실시예 3] 맞춤형 만능줄기세포의 특성 분석 (유전자 발현분석)
배양된 세포를 회수한 후, TRIzol 시약(Invitrogen)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 Nanog, Oct-3/4 및 대조유전자인 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 이들 유전자의 발현을 확인한 후 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 유도된 만능줄기세포 (hiPS)는 배아줄기세포(hES) 의 특징적인 Nanog, Oct-3/4의 유전자 발현을 보임을 알 수 있다.
[실시예 4] 시킴산을 포함하는 세콰이어 캘러스 추출물(Sequoiadendron giganteum Callus culture extract)의 제조
실시예 1에 따른 세콰이어 캘러스 파우더 20mg을 1ml의 DMSO 용매에 용해시키고, 마찬가지로 세콰이어 캘러스 파우더 1g을 10ml의 BG와 EtOH이 혼합된 용매에 용해시켜 시킴산을 포함하는 세콰이어 캘러스 추출물을 제조하였고, 이를 아래 시험예에서 시료로 사용하였다.
[시험예 1] 세콰이어 캘러스 추출물의 성분분석
실시예 4의 방법에 따라서 얻어진 세콰이어 추출물 중 BG와EtOH이 혼합된 용매에 용해된 세콰이어 캘러스 추출물을 HPLC기계를 이용하여 그 성분을 분석하였다.
본 시험예에서 추출물의 분석은 Waters 1525μ Binary HPLC Pump를 이용하여 측정한 것으로서, 250 * 4.60 mm, 5 마이크론의 규격을 갖는 Gemini 5u C18 110 A(5μm, 4.6 X 250nm, Phenomenex 사)컬럼을 사용하고, 이동상의 용매 A를 물(0.1% TFA함유)로 하고 용매 B를 아세토나이트릴(0.1% TFA함유)로 하고, 230nm의 UV 램프를 사용한 것이며 유속은 1ml/분, 진행 시간(Run time)은 46분, 추출물의 주입량은 20ul로 하여 측정한 것이다.
세콰이어 추출물의 LC 스펙트럼은 도 8과 같으며 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에서 % Area는 세콰이어 추출물에 들어있는 물질의 %(w/v)를 나타내는 것이며, 이를 통해, 세콰이어 캘러스 추출물에는 다른 성분들 보다 시킴산이 많이 함유되어 있음을 알 수 있다. 또한 세콰이어 캘러스 추출물에는 시킴산 외에도 카페산 및 페룰산이 들어있는 것을 확인할 수 있다.
표 1
RT Area % Area Height
1 3.589 2413779 7.91 122548
2(시킴산) 4.248 9990137 32.75 633894
3 17.115 2660895 8.72 146243
4(카페산) 18.666 7252283 23.78 363051
5(페룰산) 21.672 5225473 17.13 320196
6 22.411 2775302 9.10 159198
7 28.044 183049 0.60 15075
[시험예 2-1] Oct 3/4 발현 증가 확인 실험
인간 진피 섬유아세포(Neonatal human dermal fibroblasts, NHDF-Neonatal) (CC-2509,Lonza,USA) 5 x105 개에 퍼미어빌리제이션 버퍼 (permeablization buffer와 디기토닌(digitonin) 10ug/ml를 처리하며 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 (BG와 EtOH 혼합 용매)20ug/ml 및 시킴산 5ug/ml를 각각 처리하였다. 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)을 음성대조군으로 설정하였다. 처리 후 3일째에 세포를 4 챔버 슬라이드(chamber slide)에 5,000 개씩 붙여, 1일 뒤인 4일째에 PBS에 있는 3.8% 포름알데하이드(38% 파라포름알데하이드를 희석한 것)로 고정시켜서 상온에서 10분간 둔 후, oct3/4 항체 (Genetex, GTX100622, x200) 및 Alexa Fluor® 488 고트 안티-래빗(goat anti-rabbit) IgG를 이용하여 면역-세포화학(Immuno-cytochemistry)을 실시하여 Carl Zeiss Confocal microscope LSM510 로 400배로 관찰하여 이미지를 얻었다. 관찰을 통해 얻은 이미지는 도 10에 나타내었다. 또한 OCT3/4 ICC 실험 결과로 얻은 Carl Zeiss Confocal microscope 이미지를 샘플당 4장 이상, 평균 5장씩을 분석하여, OCT3/4 양성 세포(positive cell)의 비율을 구하고, 이의 평균, 표준편차를 구하여 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
처리한 화합물 OCT3/4 양성세포 수 (사진당) 총 세포수 (사진 당) OCT3/4 양성세포의 비율 OCT3/4 양성세포의 평균 비율(%)
#1 #2 #3 #4 #5 #1 #2 #3 #4 #5 #1 #2 #3 #4 #5 평균 표준편차(STDEV)
음성 대조군 0 0 0 0 0 11 6 17 20 13 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0% 0%
세콰이어 캘러스 추출물 ( BG * EtOH ) 20 μg/ ml 0 3 4 6 3 6 6 10 13 11 0.0 0.5 0.4 0.5 0.3 33% 5%
시킴산 (Shikimic acid , 물) 5 μg/ ml 2 4 1 5 12 14 7 9 0.2 0.3 0.1 0.6 29% 5%
도 10에서 볼 수 있듯이, 실험예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 HDF의 경우 음성 대조군인 노말(normal) HDF에 비하여 Oct3/4 유전자가 많이 발현된 것을 확인할 수 있으며, 이는 시킴산으로 처리한 것 보다 많은 것으로 확인된다.
또한 표 2에서 볼 수 있듯이, Oct3/4 유전자에 대해 양성인 세포의 퍼센트를 살피면 세콰이어 캘러스 추출물을 BG(Butyl glycol) 및 EtOH의 용매로 추출한 경우 양성인 세포 갯수의 평균 퍼센트가 33%로 가장 높았으며, 이는 시킴산 보다 높은 수치에 해당함을 확인하였다.
[시험예 2-2] Oct 3/4 발현 증가 확인 실험
인간 진피 섬유아세포(Neonatal human dermal fibroblasts, NHDF-Neonatal) (CC-2509,Lonza,USA) 1 x106 개에 시킴산 10uM, 10mM을 각각 처리하였다. 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)을 음성대조군으로 설정하였다. 처리 후 5일째에 세포를 4 chamber slide에 5,000 개씩 붙여, 3일 뒤인 84일째에 PBS에 있는 3.8% 포름알데하이드(38% 파라포름알데하이드를 희석한 것)로 고정시켜서 상온에서 10분간 둔 후, oct3/4 항체 (Genetex, GTX100622, x200) 및 Alexa Fluor® 488 고트 안티-래빗(goat anti-rabbit) IgG를 이용하여 면역-세포화학(Immuno-cytochemistry)을 실시하여 Carl Zeiss Confocal microscope LSM510 로 400배로 관찰하여 이미지를 얻었다. 관찰을 통해 얻은 이미지는 도 11에 나타내었다. 또한 OCT3/4 ICC 실험 결과로 얻은 Carl Zeiss Confocal microscope 이미지를 샘플당 4장 이상, 평균 5장씩을 분석하여, OCT3/4 양성세포의 비율을 구하고, 이의 평균, 표준편차를 구하여 하기 표 3에 나타내었다.
표 3
처리한 화합물 OCT3/4 양성세포 수 (사진당) 총 세포수 (사진 당) OCT3/4 양성세포의 비율 OCT3/4 양성세포의 평균 비율(%)
#1 #2 #3 #4 #5 #1 #2 #3 #4 #5 #1 #2 #3 #4 #5 평균(Average) 표준편차(STDEV)
음성 대조군 0 0 0 0 0 11 6 17 20 13 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0% 0%
시킴산 ( Shikimic acid, 물) 10uM 18 4 10 14 24 54 27 33 53 60 0.33 0.15 0.30 0.26 0.40 29% 2%
10mM 11 11 12 0 18 33 32 59 36 39 0.33 0.34 0.20 0.00 0.46 27% 4%
도 11에서 볼 수 있듯이, 시킴산을 처리한 HDF의 경우 무처리 노말(normal) HDF에 비하여 Oct3/4 유전자가 많이 발현된 것을 확인할 수 있으며, 이는 시킴산이 많을수록 증가하는 것으로 확인된다.
또한 표 3에서 볼 수 있듯이, Oct3/4 유전자에 대해 양성인 세포의 퍼센트를 살피면 물을 용매로 시킴산을 처리한 경우 양성인 세포 갯수의 평균 퍼센트가 27-29%로 나타났으며, 이는 무처리군에 비해 유의미하게 높은 수치에 해당함을 확인하였다.
따라서 위와 같은 결과를 통하여 세콰이어 캘러스 추출물의 주성분인 시킴산은 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는데 핵심적인 역할을 하는 Oct3/4 유전자를 현저히 발현시키는 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 시킴산 또는 이를 포함하는 추출물을 체세포에 주입하면 Oct3/4 유전자를 발현시켜 맞춤형 만능줄기세포를 유도할 수 있다.
[시험예 3-1] 줄기세포 활성 마커인 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase, ALP)의 발현 증가 확인 실험
NHDF-네오네이탈(Neonatal)(CC-2509,Lonza,USA) 5 x105 개에 퍼미어빌리제이션 버퍼(permeablization buffer)와 디기토닌(digitonin) 10ug/ml을 처리하며 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물(BG와 EtOH 혼합 용매) 20ug/ml 및 시킴산 5ug/ml을 처리하였다. 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)을 음성대조군으로 설정하였다. 6일째에 세포를 12 웰 플레이트(well plate)에 5,000 개씩 붙였고, 5일 뒤인 11일째에 PBS에 있는 3.8% 포름알데하이드로 고정시켜서 상온에 15분간 둔 후, NBT/BCIP® ALP 기질 용액(substrate solution) 200ul을 ALP 버퍼(buffer) 10ml에 희석해 0.5ml씩 처리하고 20시간 뒤 Olympus CKX41광학 현미경으로 40배로 관찰하였다. 관찰을 통해 얻은 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에서 볼 수 있듯이, 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 HDF의 경우 노말(normal) HDF에 비하여 염색된 부분이 많으며 이는 ALP의 발현이 현저하게 증가한 것을 나타낸다. 또한 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 것은 시킴산을 처리한 것보다 ALP가 많이 발현된 것을 확인할 수 있다.
섬유아세포가 맞춤형 만능줄기세포로 진행되는 과정에 있어서, ALP는 Oct4 등의 유전자를 세포 내에 발현시킨 뒤 3일 뒤부터 발현되기 시작하는 것으로서 역분화줄기세포 형성 초기에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 마커(marker)이다. 따라서 본 발명에 따른 세콰이어 캘러스 추출물을 체세포에 주입하면 ALP의 발현이 현저히 증가하게 되고, 또한 Oct4 유전자를 발현시키게 되므로 맞춤형 만능줄기세포를 유도할 수 있다.
본 실험 결과에 비추어 본 발명에 따른 세콰이어 캘러스 추출물은 줄기세포 활성 마커인 ALP의 발현을 촉진하는 것에 비추어 줄기세포를 활성시키는 현저한 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 3-2] 줄기세포 활성 마커인 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase, ALP)의 발현 증가 확인 실험
NHDF-네오네이탈(Neonatal)(CC-2509,Lonza,USA) 1x106 개에 시킴산 10uM, 10mM을 각각 처리하였다. 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)을 음성대조군으로 설정하였다. 5일째에 세포를 6 웰 플레이트에 100,000 개씩 붙였고, 7일 뒤인 12일째에 PBS에 있는 3.8% 포름알데하이드로 고정시켜서 상온에 15분간 둔 후, NBT/BCIP® ALP 기질 용액 200ul을 ALP 버퍼 10ml에 희석해 0.5ml씩 처리하고 20시간 뒤 Olympus CKX41광학 현미경으로 40배로 관찰하였다. 관찰을 통해 얻은 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에서 볼 수 있듯이, 시킴산을 처리한 HDF의 경우 노말(normal) HDF에 비하여 남색으로 진하게 염색된 부분이 많으며 이는 ALP의 발현이 현저하게 증가한 것을 나타낸다. 또한 시킴산의 농도가 증가할수록 ALP가 많이 발현된 것을 확인할 수 있다.
섬유아세포가 맞춤형 만능줄기세포로 진행되는 과정에 있어서, ALP는 Oct4 등의 유전자를 세포 내에 발현시킨 뒤 3일 뒤부터 발현되기 시작하는 것으로서 역분화줄기세포 형성 초기에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 마커이다. 따라서 본 발명에 따른 시킴산 및 이를 함유하는 식물추출물을 체세포에 주입하면 ALP의 발현이 현저히 증가하게 되고, 또한 Oct4 유전자를 발현시키게 되므로 맞춤형 만능줄기세포를 유도할 수 있다.
본 실험 결과에 비추어 본 발명에 따른 시킴산 및 이를 함유한 식물추출물은 줄기세포 활성 마커인 ALP의 발현을 촉진하는 것에 비추어 줄기세포를 활성시키는 현저한 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 4-1] 진피세포의 콜로니 생성력 증가 실험
NHDF-네오네이탈(Neonatal)(CC-2509,Lonza,USA) 5x105 개에 퍼미어빌리제이션 버퍼(Permeablization buffer)와 디기토닌(digitonin) 10ug/ml로 처리하고 0.4um필터로 여과한 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물(BG와 EtOH 혼합 용매) 100ppm, 200ppm과 DMSO 용액 20ppm을 처리하였다. 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)을 음성대조군으로 설정하였다. 이를 계대배양 한지 10일째에 세포를 60mm 플레이트에 200개씩 붙인 후, 23일째에 얼음 위에서 아이스-콜드(ice-cold) PBS로 세척하고, -20도에 보관한 아이스-콜드(ice-cold) 메탄올로 세포를 10분간 고정하였다. 에탄올 원액(Ethanol stock solution)에 있는 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 PBS에 1/10으로 희석하여 실험 용액(working solution)을 만든 뒤 이를 세포에 5~10분간 처리하여 염색한 후, PBS로 4회 세척하고, 사진촬영을 하였다. 정량 분석을 위해 50% 에탄올, 40% DW, 10% 아세트산으로 구성된 용리 버퍼(elution buffer)를 준비한 후, 5분간 세포에 처리하여 용출시켰다. 이후 96웰 플레이트 에 200ul씩 옮겨 580nm에서 흡광도를 측정하였다. 사진촬영에 따른 결과는 도 14에 나타내었다. 그리고 흡광도 측정에 따른 결과는 음성대조군을 기준으로 하여 배수의 결과로 도 15에 나타내었다.
도 14 에서 볼 수 있듯이, 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 경우 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)인 음성대조군에 비하여 염색된 부분이 상당히 많으며 이는 진피세포가 활발히 분화하여 콜로니를 많이 생성한 것을 의미하고 세포 분화를 촉진하는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 15에서 볼 수 있듯이, 세콰이어 캘러스 추출물을 처리한 경우 음성대조군에 비하여 콜로니 생성력의 증가 정도가 약 2.6배 증가하였으며, 이는 통계적으로 유의미한 것이다. 또한 시킴산의 경우 음성대조군에 비해 약 3.8배가 증가하였다.
따라서 본 발명에 따른 세콰이어 캘러스 추출물은 섬유아세포의 증식을 현저히 촉진한다는 것을 확인할 수 있다.
또한 진피세포의 섬유아세포 증식을 현저히 촉진하는 점에 비추어 본 발명에 따른 세콰이어 추출물은 피부재생을 촉진하는 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 4-2] 진피세포의 콜로니 생성력 증가 실험
NHDF-네오네이탈(Neonatal)(CC-2509,Lonza,USA) 1x106 개에 시킴산 10uM, 50uM, 100uM, 1mM, 10mM을 각각 처리하였다. 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)을 음성대조군으로 설정하였다. 이를 계대배양 한지 5일째에 세포를 60mm 플레이트에 200개씩 붙인 후, 17일째에 얼음 위에서 아이스-콜드(ice-cold) PBS로 세척하고, -20도에 보관한 아이스-콜드(ice-cold) 메탄올로 세포를 10분간 고정하였다. 에탄올 원액(Ethanol stock solution)에 있는 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 PBS에 1/10으로 희석하여 실험 용액을 만든 뒤 이를 세포에 5~10분간 처리하여 염색한 후, PBS로 4회 세척하고, 사진촬영을 하였다. 정량 분석을 위해 50% 에탄올, 40% DW, 10% 아세트산으로 구성된 용리 버퍼를 준비한 후, 5분간 세포에 처리하여 용출시켰다. 이후 96 웰 플레이트에 200ul씩 옮겨 580nm에서 흡광도를 측정하였다. 사진촬영에 따른 결과는 도 16에 나타내었다. 그리고 흡광도 측정에 따른 결과는 음성대조군을 기준으로 하여 배수의 결과로 도 17에 나타내었다.
도 16 에서 볼 수 있듯이, 시킴산을 처리한 경우 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)인 음성대조군에 비하여 염색된 부분이 상당히 많으며 이는 진피세포가 활발히 분화하여 콜로니를 많이 생성한 것을 의미하고 세포 분화를 촉진하는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 17에서 볼 수 있듯이, 시킴산을 처리한 경우 음성대조군에 비하여 콜로니 생성력의 증가 정도가 약 1.27~5.06배 증가하였으며, 이는 통계적으로 유의미한 것이다. 특히 시킴산을 1mM 처리한 경우에 콜로니의 생성력이 가장 많이 증가하였으며, 이를 통해 1mM 농도의 시킴산을 처리하는 것이 가장 많이 세포의 증식을 촉진한다는 것을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 시킴산은 섬유아세포의 증식을 현저히 촉진한다는 것을 확인할 수 있다.
또한 진피세포의 섬유아세포 증식을 현저히 촉진하는 점에 비추어 본 발명에 따른 시킴산 및 이를 함유한 세콰이어 추출물은 피부재생을 촉진하는 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 5] 진피세포의 증식력 증가 실험
96 웰 플레이트에 NHDF-네오네이탈(Neonatal)(CC-2509,Lonza,USA)를 2,000개씩 붙인 후, 다음 날 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물(BG 및 EtOH용매) 20ug/ml 및 시킴산 5ug/ml을 처리하였다. 아무런 처리도 하지 않은 NHDF-네오네이탈(Neonatal)을 음성대조군으로 설정하였다. 이를 7일간배양하였고 (7일째에 컨플루언시(Confluency)가 90% 이하가 되도록), 그 후 6일 뒤에 WST-1을 10ul씩 처리하고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군(negative control) 샘플을 기준으로 배수로 결과를 그래프로 도 18에 나타내었다.
도 18에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 세콰이어 캘러스 추출물을 처리하는 경우 음성대조군에 비하여 세포 분열 정도가 약 1.5배 이상 증가하였음을 확인할 수 있으며, 이는 통계적으로 유의미한 것이다. 또한 시킴산의 경우 정상대조군에 비해 2배가 증가하였다.
따라서 본 발명에 따른 세콰이어 캘러스 추출물은 섬유아세포의 분열을 현저히 촉진한다는 것을 확인할 수 있다.
또한 진피세포의 섬유아세포 분열을 현저히 촉진하는 점에 비추어 본 발명에 따른 세콰이어 추출물은 피부재생을 촉진하는 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
아래 상기 조성물의 제형예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하는 것이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 연질 캡슐
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 40ug, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 9mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 혼합하여 연질 캡슐 충진액을 제조한다. 1 캡슐당 400㎎씩 충진하여 연질 캡슐을 제조한다. 그리고, 상기와 별도로 젤라틴 66 중량부, 글리세린 24 중량부 및 솔비톨액 10 중량부의 비율로 연질 캡슐 시트를 제조하고 상기 충진액을 충진시켜 본 발명에 따른 조성물 400mg이 함유된 연질 캡슐을 제조한다.
[제형예 2] 정제
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 40μg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 갈락토올리고당 200㎎, 유당 60㎎ 및 맥아당 140㎎을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6㎎을 첨가한다. 이들 조성물 500mg을 통상의 방법으로 타정하여 정제를 제조한다.
[제형예 3] 드링크제
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 40ug, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300㎖를 가하여 각 병에 200㎖씩 되도록 충진한다. 병에 충진한 후 130℃에서 4∼5초간 살균하여 드링크제를 제조한다.
[제형예 4] 과립제
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 40ug, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 무수결정 포도당 250㎎ 및 전분 550㎎을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조한다.
[제형예 5] 주사제
하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조하였다.
표 4
배합 성분 함량
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 40μg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조 방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 함량으로 주사제를 제조한다.
[제형예 6] 유연화장수(스킨로션)
하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연화장수를 제조하였다.
표 5
배합 성분 함량 (중량 %)
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 0.2
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 2.0
프로필렌글리콜 2.0
카르복시비닐폴리머 0.1
피이지-12 노닐페닐에테르 0.2
폴리솔베이트 80 0.4
에탄올 10.0
트리에탄올아민 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 7] 영양화장수(밀크로션)
하기 표 6에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조하였다.
표 6
배합 성분 함량 (중량 %)
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 1.0
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
밀납 4.0
폴리솔베이트 60 1.5
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5.0
스쿠알란 5.0
솔비타세스퀴올레이트 1.5
유동파라핀 0.5
세테아릴 알코올 1.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 8] 영양크림
하기 표 7에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다.
표 7
배합 성분 함량(중량%)
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 2.0
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
유동파라핀 7.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 5.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
폴리솔베이트 60 1.2
트리에탄올아민 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 9] 마사지 크림
하기 표 8에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 마사지 크림을 제조하였다.
표 8
배합 성분 함량(중량%)
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 2.0
글리세린 8.0
부틸렌글리콜 4.0
유동파라핀 45.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
밀납 4.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄 0.9
바세린 3.0
파라핀 1.5
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 10] 팩
하기 표 9에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다.
표 9
배합 성분 함량(중량%)
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 0.2
글리세린 4.0
폴리비닐알콜 15.0
히알루론산 추출물 5.0
베타글루칸 7.0
알란토인 0.1
노닐 페닐에테르 0.4
폴리솔베이트 60 1.2
에탄올 방부제 6.0
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 11] 건강 식품
하기 표 10에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 건강식품을 제조하였다.
표 10
배합 성분 함량
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 20μg
비타민 A 아세테이트 70μg
비타민 E 1.0mg
비타민 B1 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2μg
비타민 C 10mg
비오틴 10μg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50μg
판토텐산 칼슘 0.5mg
황산 제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
[제형예 12] 건강 음료
하기 표 11에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 건강음료를 제조하였다.
표 11
배합 성분 함량
시킴산 또는 실시예 4에 따른 세콰이어 캘러스 추출물 20μg
구연산 1000mg
올리고당 100 g
타우린 1g
정제수 잔량
통상의 건강 음료 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균한다.
[제형예 13] 만능줄기세포를 포함하는 주사제
하기 표 12에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 본 명세서의 실시예 2에 따른 만능줄기세포를 포함하는 주사제를 제조하였다.
표 12
배합 성분 함량
실시예 2에 따른 만능줄기세포 40μg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (19)

  1. 시킴산; 시킴산을 포함하는 식물 추출물; 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물; 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 성체 유래 세포에 처리하는 것을 포함하는 줄기세포 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 식물 줄기세포 추출물은 역분화된 만능 식물 줄기세포의 추출물인 것인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 제조 방법은 시킴산, 추출물 또는 조성물을 성체 유래세포에 주입하는 단계; 및 시킴산, 추출물 또는 조성물이 주입된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 시킴산을 포함하는 식물 추출물은 세콰이어(Sequoiadendron giganteum), 노란꽃창포 (Iris pseudoacorus), 뚱딴지(돼지감자)(Helianthus tuberosus), 은청가문비 (블루가문비)(Picea pungens), 글라우카가문비(화이트가문비)(Picea glauca), 유칼립투스 (Eucalyptus sieberiana), 유칼리나무(Eucalyptus regnans), 웨스턴 측백나무 ( Thuja plicata ), 대추야자 ( Red Ceda , Phoenix dactylifera ), 다알리아 바리아빌리스 ( Dahlia variabilis ), 야광나무 ( Malus baccata ) , 서양배 ( Pyrus communis ) , 밀 ( Triticum ), 소나무 ( Pinus densifloraa ), 곰솔 ( Pinus thunbergii ), 붓순나무 ( Illicium anisatum ), 태산목 ( Magnolia grandiflora ) , 약모밀(어성초) ( Houttuynia cordata ), 바위취(범의귀) (Saxifraga stolonifera ), 말단 생식절 아르주나 ( Terminalia arjuna ), 유향수 ( Pistacia lentiscus ), 서양 까치밥나무 ( Ribes aureum ), 컴프리 ( Symphytum officinalis ), 악타이아 파키포다 ( Actaea pachypoda ), 박쥐나무 ( Alangium salvifollium ), 은행나무 ( Gingko biloba ), 푸른 여로 ( Veratrum viride ), 산토끼꽃류 ( Dipsacus laciniatus ), 아가스타체 ( Agastache urticifolia ), 목향 ( Inula helenium ), 서양물레나물(세인트존스워트) (Hypericum spp ), 코멜리나 벵갈렌시스 ( Commelina bengalensis ), 김네마(당살초) ( Gymnema sylvestris ), 가자 ( Terminalia chebula ), 홍화 붓순나무 ( Illicium floridanum ) , 붓순나무과 ( Illicium diffengri ), 홍회향 ( Illicium henryi ), 팔각회향 ( Illicium verum ), 붓순나무과 ( Illicium lancealatum ), 붓순나무과 ( Illicium pachyphyllum ), 미국 붓순나무 ( Illicium anisatum ), 붓순나무 ( Illicium religiosum ), 헤미데스무스 인디커스 ( Hemidesmus indicus , Sarvia), 시스터스 인카누스 ( Cistus incanus ), 사이다 악투아 ( Sida acuta ), 노박덩굴 ( Celastrus paniculata ), 글리코미스과 ( Glycosmis muricata ), 제충국 ( Tanacetum parthenium , Pyrethrum), 밀 ( Triticum aestivum ), 하이페리쿰 ( Hypericum dolabriforme ), 산토끼꽃 ( Dipsacus pilosus ), 물고추나물 ( Triadenum walteri ), 하이페리쿰(세인트존스워트)( Hypericum flondosum ), 및 터미날리아 팔리드 ( Terminalia pallid )의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 더 포함하는 것인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 식물 줄기세포 추출물은 캘러스 추출물인 것인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 식물 줄기세포는 세콰이어 줄기세포를 이용하며, 자세하게는 세콰이어는 빅트리(Sequoiadendron giganteum)인 것인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 조성물은 그 조성물의 총 부피를 기준으로 시킴산을 10uM 내지 30mM의 농도로 포함하거나, 또는 추출물을 0.001ug/ml 내지 2mg/ml의 농도로 포함하는 것인 방법.
  8. 제 3항에 있어서,시킴산, 추출물 또는 조성물 주입 전, 상기 성체 유래 세포에 세포막 투과촉진물질을 처리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 세포막 투과촉진화합물은 스트렙토리신 O 또는 디기토닌인 것인 방법.
  10. 제 3항에 있어서,시킴산, 추출물 또는 조성물이 주입된 성체 유래 세포를 지지세포층으로 옮겨서 추가로 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 지지세포는 STO 세포인 것인 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 줄기세포.
  13. 유효성분으로서 제 12항의 줄기세포를 포함하는 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 성체 유래 세포는 조성물이 투여되는 개체로부터 유래된 세포이며 줄기세포는 상기 개체에 대한 특이적인 맞춤형 줄기세포인 것인 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,조성물은 세포치료제인 것인 조성물.
  16. 시킴산, 시킴산을 포함하는 식물추출물 또는 시킴산을 포함하는 식물 줄기세포 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 활성화용, 피부세포 증식용, 피부재생용 또는 항노화용 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 조성물은 그 조성물의 총 부피를 기준으로 시킴산을 10uM 내지 30mM의 농도로 포함하거나, 또는 식물 추출물 또는 식물 줄기세포 추출물을 0.001ug/ml 내지 2mg/ml의 농도로 포함하는 것인 조성물.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 조성물은 약학 조성물 또는 미용 조성물.
  19. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 시킴산을 함유하는 식물추출물은 청구항 4항에 기재된 식물추출물인 조성물.
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