CN114591894B - 一种皮肤多能前体干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞的制备方法及其应用。其中，所述制备方法包括：提供贴壁生长的表皮细胞；利用皮肤多能前体干细胞诱导液对所述表皮细胞进行化学重编程诱导培养至皮肤多能前体干细胞阶段；其中，所述皮肤多能前体干细胞诱导液包括TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸。本发明使用TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸的特定浓度配比组合实现了最佳诱导效果，对表皮细胞进行化学重编程处理，激活了表皮细胞的干性基因，增加了其分化能力，可以短期内高效获得高质量的具有多种皮肤附属器分化潜能的皮肤多能前体干细胞。

Description

一种皮肤多能前体干细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及皮肤附属器再生技术领域，特别是涉及一种基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞制备方法及其应用。
背景技术
我国每年有数百万的烧伤创伤患者。其中，大面积深度烧创伤常常累及真皮深层或皮肤全层，容易造成汗腺等皮肤附属器严重受损，使得皮肤不能正常排汗，严重影响患者的生活质量。
研究表明，皮肤中存在着丰富的干细胞，可帮助维持毛囊等皮肤附属器的生理周期，并在一定程度上对损伤的附属器(例如汗腺等)进行修复。但严重烧创伤时，创面内残存的干细胞其在数量和质量上均无法得到保证，不足以支撑皮肤附属器的结构修复及功能重建。因此，如何获得优质、足够数量、且具有向多种皮肤附属器方向分化潜能的干细胞，以满足临床治疗对于再生组织外观及功能的需求，是再生医学及创面修复学领域亟待解决的关键科学问题。
基于小分子化合物的全化学重编程作为一种新的细胞替代疗法，为大面积严重烧创伤的治疗及功能康复提供了新策略；其具有易操作、易储存、可调控、成本低、更安全等优点，同时规避了转基因及病毒载体潜在的安全性问题。
但是，现有技术中小分子介导的体细胞重编程普遍效率不高，且缺乏靶向皮肤附属器再生的前体干细胞诱导策略。因此，我们将基于小分子重编程技术，进行皮肤多能前体干细胞诱导新体系的构建，为制备具有多向分化潜能的临床级皮肤前体干细胞，提供安全高效的谱系命运转归方法。
发明内容
本发明实施例提供了一种基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞制备方法及其应用，以解决现有技术无法与临床对接，快速、高效、安全地实现皮肤附属器再生与再造的痛点问题。
为了解决上述问题，本申请是这样实现的：
本发明实施例提供了一种基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞制备方法，其中，包括：
提供贴壁生长的表皮细胞；
利用皮肤多能前体干细胞诱导液对所述表皮细胞进行化学重编程诱导培养至皮肤多能前体干细胞阶段；
其中，所述皮肤多能前体干细胞诱导液包括TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸。
可选地，所述的方法中，所述TGFβ抑制剂为E-616452、糖原合酶激酶3抑制剂为CHIR99021。
可选地，所述的方法中，E-616452的浓度为1～5μM，CHIR99021的浓度为5～20μM，苯环丙胺的浓度为5～10μM、莽草酸的浓度为5～10μM。
可选地，所述的方法中，诱导培养的温度为37℃、CO2的体积分数为5％，且每两天换液一次。
可选地，所述的方法中，诱导培养时间为5～7天。
可选地，所述的方法中，所述皮肤多能前体干细胞诱导液还包括EpiLife基础培养基、L-谷氨酰胺、人角质形成细胞生长添加剂、抗生素及胰岛素。
本发明实施例提供了一种皮肤多能前体干细胞，其中，由上述的方法制备而成。
本发明实施例提供了一种如上述的皮肤多能前体干细胞的应用方法，其中，包括：
将所述皮肤多能前体干细胞置于分化培养基中进行分化培养。
可选地，所述的方法中，所述分化培养基为皮脂腺分化培养基或汗腺分化培养基。
可选地，所述的方法中，所述皮脂腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、细胞培养添加剂、胰岛素、罗格列酮、端锚聚合酶抑制剂、青霉素/链霉素双抗；
所述汗腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸、细胞培养添加剂、骨形态发生蛋白4、外胚层发育不良蛋白、青霉素/链霉素双抗。
本发明实施例包括以下优点：
本发明实施例中，使用TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸，共同对表皮细胞进行化学重编程处理，激活了表皮细胞的干性基因，增加了其分化能力，不仅得到了皮肤多能前体干细胞，而且规避了转基因法带来的致瘤性，具有易操作、易储存、可调控、成本低、更安全等优点，可以短期内高效获得高质量的具有多种皮肤附属器分化潜能的皮肤多能前体干细胞，进而可以通过所建立的皮肤多能前体干细胞实现多种皮肤附属器的再生，具有极大的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞制备方法的流程示意图；
图2为表皮细胞的扫描电镜图，倍率为10；
图3为皮肤多能前体干细胞的扫描电镜图，倍率为10；
图4为表皮细胞和皮肤多能前体干细胞中皮肤相关干性标志物LGR6表达倍数关系图；
图5为表皮细胞和皮肤多能前体干细胞中皮肤相关干性标志物P63表达倍数关系图；
图6为表皮细胞和皮肤多能前体干细胞中皮肤相关干性标志物WNT6表达倍数关系图；
图7为表皮细胞和皮肤多能前体干细胞中皮肤相关干性标志物HAND1表达倍数关系图；
图8为皮肤多能前体干细胞中皮肤相关干性标志物LGR6的增幅情况示意图；
图9为表皮细胞的克隆效果示意图；
图10为皮肤多能前体干细胞的克隆效果示意图；
图11为诱导的汗腺细胞isgs的扫描电镜图，倍率为10；
图12为诱导的汗腺细胞isgs的扫描电镜图，倍率为40；
图13为表皮细胞和细胞isgs中的角蛋白5的表达情况表达倍数关系图；
图14为表皮细胞和细胞isgs中的角蛋白18的表达情况表达倍数关系；
图15为诱导的皮脂腺细胞iog的扫描电镜图，倍率为10；
图16为细胞iog的油红染色实验效果示意图；
图17为表皮细胞和细胞iog中的脂肪酸合酶的表达情况表达倍数关系图；
图18为表皮细胞和细胞iog中的粘蛋白1的表达情况表达倍数关系图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
请参阅图1，示出了本发明实施例所提供的基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞制备方法的流程示意图。如图1所示，本发明实施例所提供的基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞制备方法，包括步骤S101～步骤S102：
步骤S101、提供贴壁生长的表皮细胞；
步骤S102、利用皮肤多能前体干细胞诱导液对所述表皮细胞进行化学重编程诱导培养至皮肤多能前体干细胞阶段；
其中，所述皮肤多能前体干细胞诱导液包括TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸。
其中，TGFβ抑制剂可以促进化学重编程之中间质-上皮转化的发生，而糖原合酶激酶3抑制剂激活Wnt信号通路，提高化学重编程效率，促进多能性的表达和维持；苯环丙胺是一种H3K4/9组蛋白去甲基化酶赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)的抑制剂，能够在组蛋白层面发生作用，影响基因的表达、延伸、抑制；莽草酸是一种植物愈伤组织提取物，可以促进重编程的发生，提高重编程的效率，以及维持干性基因的激活。
本发明实施例所提供的皮肤多能前体干细胞制备方法中，使用TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸，共同对表皮细胞进行化学重编程处理，激活了表皮细胞的干性基因，增加了其分化能力，不仅得到了皮肤多能前体干细胞，而且规避了转基因法带来的致瘤性，具有易操作、易储存、可调控、成本低、更安全等优点，可以短期内高效获得高质量的具有多种皮肤附属器分化潜能的皮肤多能前体干细胞，所建立的皮肤多能前体干细胞可以实现多种皮肤附属器的再生，具有极大的临床应用价值。
可选地，在一种实施方式中，上述步骤S101具体包括：
将人表皮细胞进行体外培养，表皮细胞培养基由EpiLife基础培养基、10uL/mL的人角质形成细胞生长添加剂(HKGS)及100unit/mL的青霉素/链霉素双抗(penicillin/streptomycin)组成，并在37℃、5vt％的CO2环境中培养，并在第一次接种后，等待20min，待细胞贴壁后，进行第一次换液，剔除状态较差的悬浮未贴壁的细胞，获得贴壁生长的表皮细胞。
可选地，在一种实施方式中，上述TGFβ抑制剂具体为E-616452，上述糖原合酶激酶3抑制剂具体为CHIR99021。
上述实施方式中，使用化学小分子进行重编程的方法，具有易操作、易储存、可调控、成本低、更安全等优点。
可选地，在一种具体实施方式中，上述E-616452的浓度为1～5μM，CHIR99021的浓度为5～20μM，苯环丙胺的浓度为5～10μM、莽草酸的浓度为5～10μM，其中：TGFβ抑制剂(E-616452)可以促进化学重编程之中间质-上皮转化的发生，上皮化发生对于细胞干性的激活是极其重要的一步，并且可以进一步增加细胞的可重编程性；糖原合酶激酶3抑制剂(CHIR99021)的加入激活细胞Wnt信号通路，保证细胞在外胚层谱系的框架之内，提高化学重编程效率的同时，增强细胞多能性基因的表达和维持；苯环丙胺使组蛋白发生去甲基化，促进细胞本身基因的表达、延伸、抑制，干性得到极大的提升；莽草酸在以上小分子的协同作用之下，不对细胞本身造成损伤的同时，整体促进重编程作用的发生，在提高重编程的效率的基础之上，维持皮肤多能前体干细胞干性基因的激活。上述特定浓度配比组合，对皮肤多能前体干细胞的诱导再生效果尤佳，可以实现最佳诱导效果。
可选地，在一种具体实施方式中，上述诱导培养的温度为37℃、CO2的体积分数为5％，且每两天换液一次，诱导培养5～7天，即可获得化学重编程的皮肤多能前体干细胞。
可选地，在一种具体实施方式中，上述皮肤多能前体干细胞诱导液还包括EpiLife基础培养基、L-谷氨酰胺、人角质形成细胞生长添加剂、抗生素及胰岛素。也即上述皮肤多能前体干细胞诱导液由EpiLife基础培养基、L-谷氨酰胺、人角质形成细胞生长添加剂、抗生素、胰岛素及小分子TGF抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸共同组成。
其中，上述L-谷氨酰胺的浓度为2mM，人角质形成细胞生长添加剂(HKGS)的浓度为10uL/mL，抗生素的浓度为0.4ug/mL，胰岛素的浓度为10ug/mL。
本发明实施例中，通过组合使用TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸这四种小分子，能够诱导生成皮肤多能前体干细胞，且将所诱导生成的皮肤多能前体干细胞分化能力提高数十倍，可以快速再生出皮肤的多种附属器，从而解决了皮肤多种附属器的再生问题。
在实际应用中，可以将TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸的小分子组合试剂注入创面，对创面附近的表皮细胞进行化学重编程，原位产生能再生皮肤多种附件的干细胞。
本发明实施例还提供了一种皮肤多能前体干细胞，其中，由上述的方法制备而成。
本发明诱导产生皮肤多能前体干细胞，创建了一种新的皮肤附属器获得方法，通过皮肤附属器分化体系可以得到多种皮肤附属器，为皮肤功能的修复提供了更简便的新方法。
本发明实施例还提供了一种上述皮肤多能前体干细胞的应用方法，其中，包括：
将所述皮肤多能前体干细胞置于分化培养基中进行分化培养。
本发明实施例中，通过将皮肤多能前体干细胞置于分化培养基中，并在37℃、CO2的体积分数为5％的条件下，按每两天换液一次的方式诱导培养5～7天，即可完成皮肤多能前体干细胞的分化培养。
其中，通过配置不同的分化培养基可以将上述皮肤多能前体干细胞分化培养生成不同的皮肤附属器。
可选地，上述分化培养基可以为用于分化培养皮脂腺的皮脂腺分化培养基或用于分化培养汗腺的汗腺分化培养基。
可选地，上述皮脂腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、细胞培养添加剂、胰岛素、罗格列酮、端锚聚合酶抑制剂、青霉素/链霉素双抗；
上述汗腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸、细胞培养添加剂、骨形态发生蛋白4、外胚层发育不良蛋白、青霉素/链霉素双抗。
具体地，上述皮脂腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、5vt％～10vt％胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺、100μM的非必需氨基酸、5uL/mL的B27、10ug/mL的胰岛素、10μM的罗格列酮、5μM的XAV939以及100unit/mL的青霉素/链霉素双抗；
上述汗腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、5vt％～10vt％胎牛血清、100μM的非必需氨基酸、5uL/mL的B27、25ng/mL的骨形态发生蛋白4、20ng/mL的外胚层发育不良蛋白、以及100unit/mL的青霉素/链霉素双抗。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
细胞培养
(1)将人表皮细胞进行体外培养，表皮细胞培养基由EpiLife基础培养基、10uL/mL的人角质形成细胞生长添加剂(HKGS)及100unit/mL的青霉素/链霉素双抗(penicillin/streptomycin)组成，并在37℃、5vt％的CO2环境中培养，并在第一次接种后，等待20min待细胞贴壁后，进行第一次换液，剔除状态较差的悬浮未贴壁的细胞，获得贴壁生长的表皮细胞CON；
(2)利用皮肤多能前体干细胞诱导液，在温度为37℃、CO2的体积分数为5％的条件下，每两天换液一次，对所述表皮细胞进行进行化学重编程诱导培养5天至皮肤多能前体干细胞阶段，即可获得皮肤多能前体干细胞ISC；
其中，皮肤多能前体干细胞诱导液由EpiLife基础培养基、2mM的L-谷氨酰胺、10uL/mL的人角质形成细胞生长添加剂、0.4ug/mL的抗生素、10ug/mL的胰岛素及2μM的E-616452、10μM的CHIR99021、5μM的苯环丙胺及10μM的莽草酸共同组成。
扫描电镜实验
对细胞CON及细胞ISC进行扫描电镜检测，其结果分别如图2、3所示。
如图2所示，表皮细胞呈现出正常表皮细胞形态；如图3所示，细胞ISC呈现出胞核密度增加、核质比增加、细胞以小团块聚集的克隆性增殖现象，说明细胞诱导培养成功。
特异性干性标志物鉴定
利用实时荧光定量PCR检测细胞CON和细胞ISC中皮肤相关干性标志物LGR6、P63、WNT6、HAND1表达倍数关系，其结果分别如图4～7所示。同时，按照时间顺序，实时定量荧光测定干性marker的增幅情况，其结果如图8所示。
通过图4～7可以看出，在诱导体系中，干性最高可以提高达20倍，表明本方案对于干性提高具有极大的作用。
通过图8可以看出，更换多能前体干细胞培养基之后，第5天可以获得最佳的效果，时间再长会影响细胞自身状态，干性marker表达也不及第5天。
克隆形成实验
对细胞CON和细胞ISC分别进行以下步骤：
(1)取对数生长期的细胞，分别用0.25％胰酶消化并吹打成单个细胞，将细胞悬浮在两种细胞各自的培养基之中备用；
(2)将每组细胞以200、400、600个细胞接种在10mL37℃预温培养基的皿中，轻轻转动，使细胞分散均匀，置37℃、5％二氧化碳及饱和湿度的细胞培养箱中培养2-3周；
(3)当培养皿之中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清，用pbs小心清洗2次，加5mL 4％的多聚甲醛固定细胞15min，然后去掉固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，然后计算克隆形成率(克隆数/接种细胞数)。
细胞CON和细胞ISC的克隆效果分别如图9和图10所示。
对比可知，皮肤多能前体干细胞克隆形成率明显高于表皮细胞的克隆形成率，表明诱导的细胞具有干细胞增殖能力高的特性，即诱导的细胞具有极强的干性。
汗腺分化实验
将所述皮肤多能前体干细胞置于汗腺分化培养基中，并在37℃、CO2的体积分数为5％的条件下，按每两天换液一次的方式诱导培养5天，获得诱导的汗腺细胞isgs；
其中，上述汗腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、5vt％～10vt％胎牛血清、100μM的非必需氨基酸、5uL/mL的B27、25ng/mL的骨形态发生蛋白4、20ng/mL的外胚层发育不良蛋白、以及100unit/mL的青霉素/链霉素双抗。
对细胞isgs进行电镜扫描，其结果如图11～12所示；通过图11～12可知，将诱导的皮肤多能前体干细胞更换汗腺分化诱导培养基5天之后，即可观察到分化诱导的细胞具有典型的汗腺样细胞形态。
利用实时荧光定量PCR检测细胞CON和细胞isgs中相关的marker角蛋白5(CK5)及角蛋白18(CK18)的表达情况表达倍数关系，其结果如图13～14所示。通过图13～14可知，分化体系之中，汗腺相关重要标记物角蛋白5表达降低，角蛋白18表达增加，汗腺相关marker有相应表达，表明皮肤多能前体干细胞能发挥其汗腺分化功能。
对细胞isgs进行免疫荧光染色检测汗腺表面标记蛋白的表达，结果表明诱导的细胞具有汗腺细胞的典型的表面标志物，说明在分化培养基的作用下，皮肤多能前体干细胞能发挥其汗腺分化功能。
皮脂腺分化实验
将所述皮肤多能前体干细胞置于皮脂腺分化培养基中，并在37℃、CO2的体积分数为5％的条件下，按每两天换液一次的方式诱导培养5天，获得诱导的皮脂腺细胞iog；
其中，上述皮脂腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、5vt％～10vt％胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺、100μM的非必需氨基酸、5uL/mL的B27、10ug/mL的胰岛素、10μM的罗格列酮、5μM的XAV939以及100unit/mL的青霉素/链霉素双抗。
对细胞iog进行电镜扫描，其结果如图15所示；对细胞iog进行油红染色实验，其结果如图16所示。通过图15～16可知，分化诱导的细胞具有典型的皮脂腺样细胞形态。并且可以表现出皮脂腺典型的油红染色阳性特征，表明诱导的细胞具有皮脂腺功能。
利用实时荧光定量PCR检测细胞CON和细胞iog中相关的marker脂肪酸合酶(FASN)及粘蛋白1(MUC1)的表达情况表达倍数关系，其结果如图17～18所示。通过图17～18可知，诱导的皮脂腺样细胞皮脂腺的marker均有提升，表明皮肤多能前体干细胞能发挥其皮脂腺分化功能。
对细胞iog进行免疫荧光染色检测汗腺表面标记蛋白的表达，结果表明诱导的细胞具有皮脂腺细胞的典型的表面标志物，说明在分化培养基的作用下，皮肤多能前体干细胞能发挥其皮脂腺分化功能。
以上结果说明：利用本发明提供的使用TGFβ抑制剂、糖原合酶激酶3抑制剂、苯环丙胺及莽草酸，共同对表皮细胞进行化学重编程处理，激活了表皮细胞的干性基因，增加了其分化能力，不仅得到了皮肤多能前体干细胞，而且规避了转基因法带来的致瘤性，具有易操作、易储存、可调控、成本低、更安全等优点，可以短期内高效获得高质量的具有多种皮肤附属器分化潜能的皮肤多能前体干细胞，通过所建立的皮肤多能前体干细胞可以实现多种皮肤附属器的再生，具有极大的临床应用价值。
以上对本发明所提供的一种基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞及其制备方法、应用，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (2)

1.一种基于小分子重编程的皮肤多能前体干细胞制备方法，其特征在于，包括：
提供贴壁生长的表皮细胞；
利用皮肤多能前体干细胞诱导液对所述表皮细胞进行化学重编程诱导培养至皮肤多能前体干细胞阶段；所述诱导培养的温度为37℃、CO2的体积分数为5％，且每两天换液一次，诱导培养5天，即可获得化学重编程的皮肤多能前体干细胞；
其中，所述皮肤多能前体干细胞诱导液由EpiLife基础培养基、2mM的L-谷氨酰胺、10uL/mL的人角质形成细胞生长添加剂、0.4ug/mL的抗生素、10ug/mL的胰岛素及2μM的E-616452、10μM的CHIR99021、5μM的苯环丙胺及10μM的莽草酸共同组成。
2.一种如权利要求1所述方法制备的皮肤多能前体干细胞的非疾病治疗目的的应用方法，其特征在于，包括：
将所述皮肤多能前体干细胞置于分化培养基中进行分化培养；
其中，分化培养包括：在37℃、CO2的体积分数为5％的条件下，按每两天换液一次的方式诱导培养5天；
所述分化培养基为皮脂腺分化培养基或汗腺分化培养基；
所述皮脂腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、5vt％～10vt％胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺、100μM的非必需氨基酸、5uL/mL的B27、10ug/mL的胰岛素、10μM的罗格列酮、5μM的XAV939以及100unit/mL的青霉素/链霉素双抗；
所述汗腺分化培养基包括DMEM/F12基础培养基、5vt％～10vt％胎牛血清、100μM的非必需氨基酸、5uL/mL的B27、25ng/mL的骨形态发生蛋白4、20ng/mL的外胚层发育不良蛋白、以及100unit/mL的青霉素/链霉素双抗。
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