CN114990064B - 一种造血干细胞、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种造血干细胞、其制备方法及其应用;造血干细胞包括表面分子标记为CD34+CD45‑CD90+的造血干细胞和表面分子标记为CD34‑CD45‑CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞中的至少一种;造血干细胞的制备方法包括:消化步骤;第一阶段分化步骤:以包括细胞因子bFGF、BMP4和VEGF的培养体系对EB小体进行悬浮培养;第二阶段分化步骤:以包括细胞因子bFGF、VEGF和SCF的培养体系对EB小体继续悬浮培养;第三阶段分化步骤;该方法通过标准的、定量的手段实现体外诱导分化人诱导多能干细胞iPSC产生高纯度和高潜能造血干细胞,具有可控性和可操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种造血干细胞、其制备方法及其应用,属于细胞生物学和干细胞学技术领域。
背景技术
造血干细胞(HSC)移植是临床上多种疾病的有效干预及治疗手段,但目前仍缺乏体外有效扩增原代自体以及异体造血干细胞的方法,并且体外扩增原代造血干细胞也会造成造血干细胞的复制性衰老,这些因素都极大地限制了造血干细胞的临床应用。
目前在科研界已开始探索采用人诱导多能干细胞iPSC分化产生造血干细胞,这种策略将能很好地解决体外扩增原代造血干细胞的困境,但是目前体外诱导分化iPSC产生HSC的体系并不完善,存在以下不足:1)前期所用诱导体系依赖于滋养层细胞,难以做到标准统一,在临床应用时可能参杂滋养层细胞;2)诱导分化所用时间过长,部分体系诱导周期长达3周或更久;3)由于诱导分化所用细胞因子组合不同,部分体系诱导产生的HSC干性不高,呈现一定比例的CD45阳性细胞,或掺杂多种不同分化程度的细胞群体;4)部分体系采用贴壁iPSC一步到位诱导HSC,而iPSC克隆大小及密度与HSC分化成熟速率密切相关,因此这些体系难以做到标准化。包括目前广泛市售Stemcell公司的诱导分化iPSC产生HSC的试剂盒也明显存在上述问题。
现有技术的方法通过直接贴壁分化iPSC,在初始阶段可扩增造血干细胞前体包括中胚层细胞及造血内皮细胞(Hemogenic endothelium)。但该方法从造血内皮细胞中产生造血干细胞的效率百分比并不高,因为其前体细胞在贴壁生长条件下在诱导分化前期主要以增殖为主,会明显抑制其定向分化,而且贴壁生长时细胞密度较高时,相邻细胞可能存在NOTCH信号通路的抑制,从而抑制造血干细胞分化。该方法所诱导产生造血干细胞为CD45+,类似于脐带血来源的造血干细胞,可快速分化为下游免疫细胞群,但可能已属于分化后期的造血干细胞,不具有在体内长期保持自我更新能力,不能或不能高效重建全面的骨髓造血功能。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的第一个目的在于提供一种造血干细胞,为经过有效的分化产生干性极佳的能够长期进行自我更新的造血干细胞。
本发明的第二个目的在于提供一种上述造血干细胞的制备方法,该方法通过标准的、定量的手段实现体外诱导分化人诱导多能干细胞iPSC产生高纯度和高潜能造血干细胞,具有可控性和可操作。
本发明的第三个目的在于提供造血干细胞的应用,造血干细胞用于制备制剂,并可用于体内骨髓重建。
实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到:一种造血干细胞,造血干细胞包括表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞和表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞中的至少一种。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到:一种造血干细胞的制备方法,包括:
消化步骤:将克隆生长的iPSC进行消化,获得单细胞,诱导产生类胚体小体;
第一阶段分化步骤:以包括细胞因子bFGF、BMP4和VEGF的培养体系对类胚体小体进行悬浮培养;
第二阶段分化步骤:以包括细胞因子bFGF、VEGF和SCF的培养体系对完成第一阶段分化步骤的类胚体小体继续悬浮培养;
第三阶段分化步骤:以包括细胞因子SCF、IL-3、G-CSF、FLT3-L和TPO的培养体系对完成第二阶段分化步骤的类胚体小体继续悬浮培养;得到表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞。
进一步地,消化步骤中,iPSC生长至汇合度70-80%进行消化。
进一步地,第一阶段分化步骤中,培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;BMP4的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL。
进一步地,第二阶段分化步骤中,培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL;SCF的浓度为10-200ng/mL。
进一步地,第三阶段分化步骤中,培养体系中SCF的浓度为10-200ng/mL;IL-3的浓度为10-200ng/mL;G-CSF的浓度为10-200ng/mL;FLT3-L的浓度为10-200ng/mL;TPO的浓度为10-200ng/mL。
进一步地,第三阶段分化步骤还包括:悬浮培养后,将类胚体小体在层纤连蛋白预先包被的未经处理、低贴附的培养皿中,以包括细胞因子SCF、IL-3、G-CSF、FLT3-L和TPO的培养体系进行贴壁培养;得到表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞。
进一步地,第一阶段分化步骤、第二阶段分化步骤和第三阶段分化步骤中,培养体系还包括wnt信号通路激活剂。
进一步地,wnt信号通路激活剂为CHIR99021。
实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到:一种造血干细胞的制剂,制剂包括表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞和表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞中的至少一种。
相比现有技术,本发明的有益效果在于:
1、本发明的造血干细胞干性极佳,能够长期进行自我更新;
2、本发明造血干细胞的制备方法通过标准的、定量的手段实现体外诱导分化人诱导多能干细胞iPSC产生高纯度和高潜能造血干细胞,具有可控性和可操作性,克服了贴壁分化方法中由于每次铺板细胞克隆大小浮动所导致的诱导效果不稳定和细胞成熟时间参差不齐的问题;
3、本发明造血干细胞的制备方法可重复地诱导分化,设置特定的条件,成功并高效地获得优质造血干细胞,所获得得造血细胞表达CD34的特征不同,反映其干细胞多能性也会有所不同,大大地提升了诱导造血干细胞的效率,提高了产量;
4、本发明造血干细胞的应用可以制备用于体内骨髓重建的制剂。
附图说明
图1为实施例1经离心产生大小均匀的EB小体;
图2为实施例1 Day8 EB小体;
图3为实施例1 Day12 EB小体
图4为实施例1成熟造血干细胞的表面分子表型鉴定;
图5为实施例2 Day8 EB小体;
图6为实施例2 Day10 EB小体贴壁分化细胞的分子表型分析;
图7-12为实施例3 CFU集落生成实验;
图13为实施例4骨髓造血重建实验结果。
具体实施方式
下面,结合附图以及具体实施方式,对本发明做进一步描述:
一种造血干细胞的制备方法,包括:
消化步骤:将克隆生长至汇合度70-80%的iPSC进行消化,获得单细胞,制成单细胞悬液,在圆底微孔板中加入单细胞悬液(含10000-50000个细胞),低转速离心后,培养箱培养24h,诱导产生类胚体小体(Embryonic Bodies,EB);
第一阶段分化步骤:以包括细胞因子bFGF、BMP4和VEGF的培养体系对EB小体进行悬浮培养;培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;BMP4的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL;第一阶段分化诱导造血内皮前体细胞产生;培养体系中,bFGF的添加有助于EB小体的稳定,而BMP4及VEGF的同时添加则有助于EB小体中的细胞快速向造血前体细胞分化;
第二阶段分化步骤:以包括细胞因子bFGF、VEGF和SCF的培养体系对完成第一阶段分化步骤的EB小体继续悬浮培养;培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL;SCF的浓度为10-200ng/mL;初步诱导造血干细胞HSC产生;其中VEGF的添加能够继续促进造血内皮细胞的分化,而SCF的添加则可以诱导造血内皮细胞向造血干细胞分化;
第三阶段分化步骤:以包括细胞因子SCF、IL-3、G-CSF、FLT3-L和TPO的培养体系对完成第二阶段分化步骤的EB小体继续悬浮培养;得到表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞;
还可以将悬浮培养后的EB小体置于层纤连蛋白预先包被的未经处理、低贴附的培养皿中,以包括细胞因子SCF、IL-3、G-CSF、FLT3-L和TPO的培养体系进行贴壁培养;得到表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞;
培养体系中SCF的浓度为10-200ng/mL;IL-3的浓度为10-200ng/mL;G-CSF的浓度为10-200ng/mL;FLT3-L的浓度为10-200ng/mL;TPO的浓度为10-200ng/mL;
细胞因子对细胞的刺激顺序、时间长短以及刺激剂量,使得分化到达最优化效果;实现在同一体系中获得高纯度的表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞和表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞;
涉及细胞因子的NCBI基因编号如下:
bFGF Gene ID:2247;BMP4 Gene ID:652;VEGF Gene ID:7422;SCF Gene ID:4254;IL-3 Gene ID:3562;G-CSF Gene ID:1440;FLT3-L Gene ID:2323;TPO Gene ID:7066。
造血干细胞包括表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞和表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞中的至少一种;用于制备制剂,并可用于体内骨髓重建。
实施例1:
一种造血干细胞的制备方法,包括:
-1Day消化步骤:将克隆生长至汇合度70-80%的iPSC用Accutase消化成单细胞,洗涤并用mTeSR培养基重悬,制成单细胞悬液,在圆底96孔板中加入单细胞悬液(含20000个细胞),100xg离心1min后,产生大小均匀的EB小体如图1所示,培养箱培养24h,诱导产生EB小体;
Day0–Day2第一阶段分化步骤:将成型的EB小体转移到低贴附的24孔板中,一个孔放置5个EB小体,以包括1×ITS-X、细胞因子bFGF、BMP4和VEGF的培养体系对EB小体进行悬浮培养48h;培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;BMP4的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL;
Day2–Day4第二阶段分化步骤:去除第一阶段分化步骤的培养体系,以包括Stemline II、1×ITS-X、细胞因子bFGF、VEGF和SCF的培养体系对完成第一阶段分化步骤的EB小体继续悬浮培养48h;培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL;SCF的浓度为10-200ng/mL;
Day4–Day6第三阶段分化步骤:去除第二阶段分化步骤的培养体系,以包括Stemline II、1×ITS-X、细胞因子SCF、IL-3、G-CSF、FLT3-L和TPO的培养体系对完成第二阶段分化步骤的EB小体继续悬浮培养48h;培养体系中SCF的浓度为10-200ng/mL;IL-3的浓度为10-200ng/mL;G-CSF的浓度为10-200ng/mL;FLT3-L的浓度为10-200ng/mL;TPO的浓度为10-200ng/mL;
Day6–Day12:继续采用第三阶段培养体系,每隔48h进行半量换液,Day8 EB小体中的造血干细胞逐渐解离脱落如图2所示,Day12 EB小体中的造血干细胞逐渐解离脱落,并形成单细胞如图3所示,得到表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞如图4所示。
实施例2:
一种造血干细胞的制备方法,包括:
-1Day消化步骤:将克隆生长至汇合度70-80%的iPSC用Accutase消化成单细胞,洗涤并用mTeSR培养基重悬,制成单细胞悬液,在圆底96孔板中加入单细胞悬液(含20000个细胞),100xg离心1min后,培养箱培养24h,诱导产生EB小体;
Day0–Day2第一阶段分化步骤:将成型的EB小体转移到低贴附的24孔板中,一个孔放置5个EB小体,以包括1×ITS-X、细胞因子bFGF、BMP4和VEGF的培养体系对EB小体进行悬浮培养48h;培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;BMP4的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL;
Day2–Day4第二阶段分化步骤:去除第一阶段分化步骤的培养体系,以包括Stemline II、1×ITS-X、细胞因子bFGF、VEGF和SCF的培养体系对完成第一阶段分化步骤的EB小体继续悬浮培养48h;培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL;SCF的浓度为10-200ng/mL;
Day4–Day6第三阶段分化步骤:去除第二阶段分化步骤的培养体系,以包括Stemline II、1×ITS-X、细胞因子SCF、IL-3、G-CSF、FLT3-L和TPO的培养体系对完成第二阶段分化步骤的EB小体继续悬浮培养48h;培养体系中SCF的浓度为10-200ng/mL;IL-3的浓度为10-200ng/mL;G-CSF的浓度为10-200ng/mL;FLT3-L的浓度为10-200ng/mL;TPO的浓度为10-200ng/mL;
Day6–Day10:悬浮培养后的EB小体置于层纤连蛋白预先包被的未经处理、低贴附的培养皿中,继续采用第三阶段培养体系贴壁培养,每隔48h进行换液,Day8,造血干细胞从EB小体中迁移出来并进一步增殖扩增、分化,如图5所示,得到表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞,如图6所示。
实施例3:
为验证所分化造血干细胞的功能性,证明其可成功分化产生下游免疫细胞群,因此我们用分化成熟的造血干细胞进行集落形成实验。本次实验所用试剂盒为stemcell的Starter Kit for MethocultTM H4434。
1)将实施例1中成熟的造血干细胞用PBS清洗完成后,用含2%v/v FBS的IMDM进行重悬,其中每100uL重悬液包含5X104个造血干细胞。
2)在15mL离心管中加入2mL的完全MethoCultTM培养液,并加入200uL造血干细胞悬液,充分混匀。
3)将2.2mL充分混匀的细胞混合液平均分配到两个35mm的细胞培养皿中,盖好盖子,每个培养皿1.1mL细胞混合液。
4)将两个35mm的细胞培养皿放入到10mm的细胞培养皿中,再放置一个空的35mm培养皿,加入1mL灭菌水,敞口放置,最终盖上10mm细胞培养皿的盖子,放入细胞培养箱中进行培养。
5)14天后,在显微镜下观察不同免疫细胞克隆的形成,其分化产生不同血液细胞群落的能力如图7-12所示。
实施例4:
为在体内验证所分化造血干细胞的分化造血能力,我们进一步通过免疫缺陷老鼠进行骨髓重建。
1)根据实施例1,诱导产生成熟的造血干细胞;
2)购买4周大小的免疫缺陷老鼠NOD/ShiLtJGpt-Prkdc em26cd52Il2rgem26cd22/Gpt,并饲养于无菌环境中;
3)将免疫缺陷老鼠进行电离辐照,辐照强度为2.5Gray。
4)小鼠辐照24h后,经尾静脉注射5×105个造血干细胞。
5)饲养3个月后,取小鼠骨髓细胞,经红细胞裂解液处理后,用于流式细胞术检测骨髓当中的造血干细胞,造血前体细胞以及成熟的免疫细胞,成功在体内进行移植并完成下游造血分化,产生下游前体细胞及成熟免疫细胞如图13所示,图中P1-1:CD45-CD34+CD38-造血干细胞;P1-2:CD45-CD34+CD38+造血干细胞;P2-1:CD45+CD38+CD34+造血干细胞;P2-2:CD45+CD34+CD38-髓系/淋巴系前体细胞;P3-1:CD45+CD38+CD34-成熟淋巴细胞。
对于本领域的技术人员来说,可根据以上描述的技术方案以及构思,做出其它各种相应的改变以及变形,而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种造血干细胞,其特征在于,所述造血干细胞包括表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞和表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞中的至少一种。
2.一种造血干细胞的制备方法,其特征在于包括:
消化步骤:将克隆生长的iPSC进行消化,获得单细胞,诱导产生类胚体小体;
第一阶段分化步骤:以包括细胞因子bFGF、BMP4和VEGF的培养体系对类胚体小体进行悬浮培养;
第二阶段分化步骤:以包括细胞因子bFGF、VEGF和SCF的培养体系对完成第一阶段分化步骤的类胚体小体继续悬浮培养;
第三阶段分化步骤:以包括细胞因子SCF、IL-3、G-CSF、FLT3-L和TPO的培养体系对完成第二阶段分化步骤的类胚体小体继续悬浮培养;得到表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞。
3.如权利要求2所述的造血干细胞的制备方法,其特征在于,消化步骤中,iPSC生长至汇合度70-80%进行消化。
4.如权利要求2所述的造血干细胞的制备方法,其特征在于,
所述第一阶段分化步骤中,培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;BMP4的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL。
5.如权利要求2所述的造血干细胞的制备方法,其特征在于,
所述第二阶段分化步骤中,培养体系中bFGF的浓度为10-200ng/mL;VEGF的浓度为10-200ng/mL;SCF的浓度为10-200ng/mL。
6.如权利要求2所述的造血干细胞的制备方法,其特征在于,
所述第三阶段分化步骤中,培养体系中SCF的浓度为10-200ng/mL;IL-3的浓度为10-200ng/mL;G-CSF的浓度为10-200ng/mL;FLT3-L的浓度为10-200ng/mL;TPO的浓度为10-200ng/mL。
7.如权利要求2所述的造血干细胞的制备方法,其特征在于,
所述第三阶段分化步骤还包括:悬浮培养后,将类胚体小体在层纤连蛋白预先包被的未经处理、低贴附的培养皿中,以包括细胞因子SCF、IL-3、G-CSF、FLT3-L和TPO的培养体系进行贴壁培养;得到表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞。
8.如权利要求2所述的造血干细胞的制备方法,其特征在于,
第一阶段分化步骤、第二阶段分化步骤和第三阶段分化步骤中,培养体系还包括wnt信号通路激活剂。
9.如权利要求8所述的造血干细胞的制备方法,其特征在于,所述wnt信号通路激活剂为CHIR99021。
10.一种造血干细胞的制剂,其特征在于,所述制剂包括表面分子标记为CD34+CD45-CD90+的造血干细胞和表面分子标记为CD34-CD45-CD90+CD49f+CD133+CXCR4+的造血干细胞中的至少一种。
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造血干细胞的发生及生物学特性;程范军;《国外医学输血及血液学分册》;第24卷(第5期);第377-380页 * |
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