WO2020027278A1 - 心筋細胞の製造方法 - Google Patents

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culture
dimensional
production method
embryoid bodies
cells
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French (fr)
Inventor
芳樹 澤
繁 宮川
絵望子 伊東
延子 寒川
真季 武田
善紀 吉田
勝久 松浦
清水　達也
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
国立大学法人京都大学
学校法人東京女子医科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cardiomyocytes.
  • ES cells embryonic pluripotent stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Non-Patent Document 1 A method has been reported in which the process from embryoid body formation to induction of differentiation into myocardium is performed while culturing using a low-adhesion culture substrate.
  • the present inventors have found that in a method in which the process from embryoid body formation to induction of differentiation into myocardium is performed while culturing using a low-adhesion culture substrate, a large amount of cardiomyocytes can be efficiently produced. I found a problem that I could not do.
  • the present inventors can isolate a plurality of embryoid bodies and spheroid culture, respectively, using a culture substrate having a plurality of compartments, by spheroid culture of pluripotent stem cells, a plurality of embryoid bodies It has been found that the above problem can be solved by forming and then subjecting these embryoid bodies to three-dimensional suspension culture to induce differentiation into cardiomyocytes.
  • the present invention has been completed by further study based on such findings, and includes the following aspects.
  • Item 1 (1) A step of forming a plurality of embryoid bodies by spheroid-culturing pluripotent stem cells using a culture substrate having a plurality of compartments capable of isolating a plurality of embryoid bodies and culturing spheroids respectively And (2) a method for producing cardiomyocytes, comprising the step of subjecting the plurality of embryoid bodies obtained in the step (1) to three-dimensional suspension culture to induce differentiation into cardiomyocytes.
  • Item 2. The production method according to Item 1, wherein the culture substrate is a culture substrate having a plurality of substantially uniform compartments.
  • Item 3. Item 3. The production method according to Item 1 or 2, wherein the culture substrate is a culture substrate having low cell adhesion.
  • Item 4. The production method according to any one of Items 1 to 3, wherein the pluripotent stem cells are iPS cells.
  • Item 5. The production method according to Item 4, wherein the iPS cells are established in a feeder-free manner, and when the iPS cells are maintained and cultured, the maintenance culture is performed in a feeder-free manner.
  • Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the cardiac troponin T positive rate in the cell group recovered from the three-dimensional suspension culture at the time point when the step (2) is performed for 12 days is 50% or more.
  • Item 7. Item 7.
  • FIG. 1 is a diagram showing a differentiation induction protocol 1 for cardiomyocytes. It is a figure which shows the cardiomyocyte differentiation induction protocol 2. It is a figure which shows the cardiomyocyte differentiation induction protocol 3. It is a figure which shows the correlation of the iPS cell seeding amount with respect to EZSPHERE (trademark), and the troponin positive rate after differentiation induction. It is a figure which shows the correlation with the troponin positive rate after differentiation induction with respect to the amount of activin A addition. It is a figure which shows the correlation of the troponin positive rate after differentiation induction with respect to the addition amount of BMP-4. It is a figure which shows the correlation with the troponin positive rate after differentiation induction with respect to bFGF addition amount. It is a figure which shows the correlation with the troponin positive rate after differentiation induction with respect to VEGF addition amount.
  • the production method of the present invention (1) A step of forming a plurality of embryoid bodies by spheroid-culturing pluripotent stem cells using a culture substrate having a plurality of compartments capable of isolating a plurality of embryoid bodies and spheroid-culturing them separately And (2) a method for producing cardiomyocytes, comprising the step of subjecting the plurality of embryoid bodies obtained in the step (1) to three-dimensional suspension culture to induce differentiation into cardiomyocytes.
  • Pluripotent stem cells are not particularly limited and can be widely selected.
  • the pluripotent stem cells are preferably iPS cells or ES cells.
  • Pluripotent stem cells may be feeder-free established. When the pluripotent stem cells are maintained in culture, they may be feeder-free and maintained.
  • the production method of the present invention is a feeder-free established pluripotent stem cell. It has the effect that cells can be induced to differentiate.
  • Step (1) a culture substrate having a plurality of compartments is used. Such a culture substrate can be used for spheroid culture while isolating a plurality of embryoid bodies.
  • a plurality of embryoid bodies can be formed by spheroid culturing pluripotent stem cells using the above culture substrate.
  • the culture substrate is preferably a culture substrate having a plurality of substantially uniform compartments.
  • a plurality of embryoid bodies having a substantially uniform size are preferably obtained.
  • the culture substrate preferably has a diameter (major axis) of each section of 400 to 800 ⁇ m. Further, from the viewpoint of the above effects, it is preferable that each section has a depth (the deepest) of 100 to 400 ⁇ m.
  • the culture substrate is preferably a culture substrate having low cell adhesion.
  • a culture substrate having low cell adhesion By spheroid-culturing pluripotent stem cells using such a culture substrate, embryoid bodies can be efficiently obtained.
  • Such low cell adhesiveness is imparted to the culture substrate by, for example, employing a culture substrate having low adhesion of protein or providing a coating layer having low adhesion of protein on the surface. it can.
  • EZSPHERE registered trademark
  • IWAKI IWAKI
  • the spheroid culture in step (1) can be usually performed for 3 to 5 days, preferably 4 days.
  • the spheroid culture in the step (1) is preferably performed at a cell seeding amount of 1 to 10 ⁇ 10 3 / mm 2 per cell culture area (mm 2 ) at the start of the culture, preferably 2 to 6 ⁇ 10 3 / mm 2. Is more preferable.
  • Step (2) the plurality of embryoid bodies obtained in step (1) are subjected to three-dimensional suspension culture to induce differentiation into cardiomyocytes.
  • a large number of cardiomyocytes can be efficiently produced by subjecting a plurality of embryoid bodies having a substantially uniform size obtained in the step (1) to three-dimensional suspension culture in the step (2).
  • the three-dimensional suspension culture is preferably a three-dimensional culture by suspension and stirring.
  • the conditions for three-dimensional culture by suspension and agitation are not particularly limited, and can be widely selected.
  • a method using a cell culture device provided with a stirring blade As such a cell culture apparatus, for example, those described in International Publication WO 2013/187359 and the like can be used.
  • a cell culture device “single use bioreactor for iPS cell culture” (Able Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the rotation speed of the stirring blade during cell culture is not particularly limited, and can be appropriately adjusted and set based on ensuring low shear stress and preventing precipitation of cell aggregates. .
  • a preferred example of the rotation speed is in the range of 10 to 80 rpm.
  • the cardiac troponin T positive rate in the cell group recovered from the three-dimensional suspension culture at the time point when the step (2) is performed for 12 days is preferably 50% or more, more preferably 60% or more.
  • the differentiated cardiomyocytes become cardiac troponin T positive.
  • the cardiac troponin T positive rate is an indicator of the degree of differentiation into cardiomyocytes.
  • the cardiac troponin T positive rate is measured by FACS analysis. Specifically, analysis by flow cytometry is performed using a fluorescently labeled antibody against cardiac troponin T.
  • the three-dimensional suspension culture in the step (2) can be usually performed for 9 to 15 days, preferably 10 to 14 days, more preferably 11 to 13 days, and further preferably 12 days.
  • the capacity of the culture tank is not particularly limited, and can be set as appropriate. For example, it can be 20 ml to 100 ml.
  • ⁇ Induction of differentiation into cardiomyocytes can be performed by a known method.
  • a method of culturing under the following conditions may be mentioned.
  • Example 1 Comparison between low-adhesion culture dish and EZSPHERE (registered trademark) in embryoid body formation In embryoid body (EB) formation, which is an early step of induction of cardiomyocyte differentiation, low-adhesion culture dish and cell culture container ( EZSPHERE (registered trademark) (IWAKI)).
  • EB embryoid body
  • EZSPHERE registered trademark
  • the cells were cultured for 16 days in accordance with Protocol 1 (FIG. 1) using a low-adhesion culture dish and Protocol 3 (FIG. 3) using EZSPHERE (registered trademark). Culture conditions are common as shown in the protocol, Day 0 BMP-4 final concentration 2ng / ml, Day 1 Activin A final concentration 12ng / ml, BMP-4 final concentration 10ng / ml, bFGF final concentration 10ng / ml, On Day 4, the final concentration of VEGF was 10 ng / ml, the final concentration of IWP-3 1 ⁇ M, the final concentration of SB431542 5.4 ⁇ M, the final concentration of Dorsomorphin 3 ⁇ M, and on Day 8, the final concentration was adjusted to 10 ng / ml for VEGF and 5 ng / ml for bFGF.
  • iPS cells Ff-I14s04 strain were each cultured for 4 days to obtain EBs, and then transferred to a three-dimensional suspension / agitation culture device for 12 days according to the protocol. The cells were cultured to differentiate into cardiomyocytes.
  • Example 2 Comparison of culture method after EB formation
  • a two-dimensional culture using a low-adhesion culture dish and a suspension culture apparatus manufactured by Able Co., Ltd.
  • Three-dimensional culture methods were compared.
  • the conditions for culturing the cytokines are the same as in Example 1.
  • Example 3 Based on the results of Examples 1 and 2, EZSPHERE (registered trademark) was used up to EB formation, and the subsequent culture on the myocardium was performed using a suspension culture device. Culture conditions were determined based on the results, and the cardiomyocyte differentiation induction protocol 3 (FIG. 3) of the present invention was determined.
  • EZSPHERE registered trademark
  • culture from Day0 to Day4 is performed using a cell culture vessel (EZSPHERE (registered trademark)), and culture from Day4 to Day17 is performed using a suspension culture device (manufactured by Able Co., Ltd.)
  • the culture solution Stem-Fit-AK03N (Ajinomoto Co.) was used as a medium.
  • the embryoid bodies of the iPS cells (Ff-I14s04 strain) prepared in the above test example were treated with a mixed solution (1: 1) of TrypLE Select (Thermo) solution and 0.5 mM EDTA / PBS solution for 4 minutes. The solvent was removed and the iPS cells were detached using a cell scraper to dissociate into single cells.
  • the single cell was added to 10 mL of medium (Stem Fit AK03N) supplemented with a final concentration of 10 ⁇ M Rock inhibitor (Y-27632 (Wako)) and 2 ng / mL BMP4 (R & D) to form a suspension, and EZSPHERE (registered) (Trademark) 2 to 5 ⁇ 10 6 iPS cells were seeded per plate, and cultured at 37 ° C. under 5% oxygen for 1 day to prepare EB. Further, the medium was replaced with a medium added to a final concentration of 12 ng / mL activin A (R & D), 10 ng / mL BMP4, and 10 ng / mL bFGF (R & D). The cells were cultured for one day to induce myocardial differentiation. The prepared EB used EZSPHERE (registered trademark) for 5 plates in the next step.
  • a suspension culture device (capacity 100 mL) was used to add a final concentration of 10 ng / mL VEGF (R & D), 5.4 ⁇ M SB431542 (Sigma), 2 ⁇ M Dorsomorphin (Sigma), and 1 ⁇ M IWP-3 (Stemolecule) to the device. 100 mL of the medium was added, and then the EB prepared in the previous step was added, followed by culturing at 37 ° C. and 5% oxygen for 4 days. On Day 6, the medium was replaced with a medium having the same composition.
  • the medium was removed, and 100 mL of medium supplemented with a new final concentration of 10 ng / mLGFVEGF and 5 ng / mL bFGF was added, and cultured at 37 ° C. and 5% oxygen for 7 to 9 days.
  • the cardiomyocytes differentiated from the iPS cells were collected. During this time, the medium was replaced with a medium having the same composition every two days.
  • EZSPHERE with (R) and suspension culture system the method for inducing differentiation from iPS cells into cardiomyocytes, it can be recovered 2.6x10 8 ⁇ 5.5x10 8 pieces of large quantities of cardiomyocytes in one lot, also, the cardiomyocytes Had a high cardiomyocyte content of 74-84%. This has made it possible to produce cardiomyocytes that can be used clinically.
  • Example 4 Examination of seeding amount in embryoid body formation using EZSPHERE (registered trademark) According to cardiomyocyte differentiation induction protocol 3 (FIG. 3), the seeding amount of iPS cells (single cells) was determined by EZSPHERE (registered trademark) 1 The number was changed to 2.5 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 6 per plate, and the troponin positive rate of cardiomyocytes obtained by inducing differentiation was examined.
  • EZSPHERE registered trademark
  • the amount of cytokines added to the culture medium was 12 ng / mL for Activin A, 10 ng / mL for BMP-4, 10 ng / ml for bFGF (differentiation phase) and 5 ng / mL for maturation phase, and VEGF 10 ng / mL, IWP-3 was adjusted to 1 ⁇ M, SB431542 to 5.4 ⁇ M, and Dorsomorphin to 0.6 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG.
  • the troponin positive rate was 47.1%, 51.3%, and 40.6%, respectively, for the seeding amounts of 3 x 10 6 , 3.5 x 10 6 , and 4 x 10 6 per EZSPHERE (registered trademark).
  • the optimal seeding volume of 3-4 ⁇ 10 6 iPS cells per plate was optimal.
  • Example 5 Examination of Amount of Cytokines Added to Medium According to the cardiomyocyte differentiation induction protocol 3 (FIG. 3), the troponin positive rate of cardiomyocytes obtained by inducing differentiation was used as an index, and The amount of each cytokine added was optimized.
  • the troponin positive rate of cardiomyocytes obtained by inducing differentiation was examined with respect to the amount of activin A added to the medium (20 to 100 ng / mL).
  • the amounts of cytokines other than Activin A added to the culture medium were 10 ng / mL for BMP-4, 10 ng / ml for bFGF (differentiation phase) and 5 ng / mL (maturation phase), and 10 ng / mL for VEGF.
  • mL, IWP-3 was adjusted to 1 ⁇ M, SB431542 to 5.4 ⁇ M, and Dorsomorphin to 0.6 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG.
  • the cTNT-positive cell content was 81.0%, 74.9%, 71.5%, and 66.5%, respectively, with respect to the amount of activin A added 20, 30, 50, and 100 mg / ml. High amounts of troponin gave a positive rate.
  • the troponin positive rate of cardiomyocytes obtained by inducing differentiation was examined with respect to the amount of BMP-4 added to the medium (200 to 1000 ng / mL).
  • the amount of cytokines other than BMP-4 added to the culture medium was 6 ng / mL for Activin A, 10 ng / mL for bFGF (differentiation induction phase) and 5 ng / mL (maturation phase), and 10 ng for VEGF.
  • IWP-3 was adjusted to 1 ⁇ M, SB431542 to 5.4 ⁇ M, and Dorsomorphin to 0.6 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG.
  • the troponin positivity was 2.1%, 12.6%, 58.7%, and 58.2%, respectively, for 200, 300, 500, and 1000 ng / ml of BMP-4. It gave a high troponin positive rate.
  • the troponin positive rate of cardiomyocytes obtained by inducing differentiation was examined with respect to the amount of bFGF added to the medium (10 to 20 ng / mL).
  • the amount of cytokines other than bFGF was 6 ng / mL for Activin A, 10 ng / mL for BMP-4, 10 ng / mL for VEGF, 1 ⁇ M for IWP-3, 5.4 ⁇ M for SB431542, and 5.4 ⁇ M for Dorsomorphin. Adjusted to 0.6 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG.
  • the troponin positive rates were 40.5% and 58.6%, respectively, with respect to the addition amounts of bFGF of 10 and 20 ng / ml, and the addition of 20 ng / ml of bFGF gave a high troponin positive rate.
  • the troponin positive rate of cardiomyocytes obtained by inducing differentiation was examined with respect to the amount of VEGF added to the medium (5 to 20 ng / mL).
  • the amount of cytokines other than VEGF added to the culture medium was 6 ng / mL for Activin A, 10 ng / mL for BMP-4, 10 ng / ml for bFGF (differentiation induction phase), and 5 ng / mL for mature Period), IWP-3 was adjusted to 1 ⁇ M, SB431542 to 5.4 ⁇ M, and Dorsomorphin to 0.6 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG.
  • the troponin positive rates were 84.3%, 82.6%, 80.8%, and 81.8%, respectively, with respect to 5, 10, 15, and 20 ng / ml of VEGF added, and no significant difference was observed in the VEGF added amounts examined. All gave high troponin positive rates.

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Abstract

大量の心筋細胞を効率的に産生することを課題とする。（１）複数の胚様体をそれぞれ隔離してスフェロイド培養しうる、複数の区画を有する培養基材を用いて、ｉＰＳ細胞をスフェロイド培養することにより、複数の胚様体を形成する工程；及び（２）前記工程（１）において得られた複数の胚様体を、三次元浮遊培養に供して心筋細胞へと分化誘導する工程を含む、心筋細胞の製造方法を提供する。

Description

心筋細胞の製造方法
　本発明は心筋細胞の製造方法に関する。
　胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞は（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法が報告されている。多能性幹細胞を分化誘導するには、まず多能性幹細胞を培養して胚様体を形成させ、それから分化誘導を行う必要がある。
　胚様体の形成から心筋への分化誘導までを、低接着性の培養基材を用いて培養しつつ行う方法（非特許文献１）が報告されている。
三輪達明、他１名、Ｂｉｏ　Ｃｌｉｎｉｃａ、　Ｖｏｌ．　３１、Ｎｏ．３、ｐｐ．２５７～２６０、２０１６年
　本発明者らは、胚様体の形成から心筋への分化誘導までを、低接着性の培養基材を用いて培養しつつ行う方法においては、大量の心筋細胞を効率的に産生することができないという課題を見出した。
　本発明者らは、複数の胚様体をそれぞれ隔離してスフェロイド培養しうる、複数の区画を有する培養基材を用いて、多能性幹細胞をスフェロイド培養することにより、複数の胚様体を形成し、これらの胚様体を、三次元浮遊培養に供して心筋細胞へと分化誘導することにより上記課題を解決できることを見出した。本発明はかかる知見に基づいてさらに検討を加えることにより完成したものであり、以下の態様を含む。
項１．
（１）複数の胚様体をそれぞれ隔離してスフェロイド培養しうる、複数の区画を有する培養基材を用いて、多能性幹細胞をスフェロイド培養することにより、複数の胚様体を形成する工程；及び
（２）前記工程（１）において得られた複数の胚様体を、三次元浮遊培養に供して心筋細胞へと分化誘導する工程
を含む、心筋細胞の製造方法。
項２．
前記培養基材が、複数の概ね均一の区画を有する培養基材である、項１に記載の製造方法。
項３．
前記培養基材が、低細胞接着性の培養基材である、項１又は２に記載の製造方法。
項４．
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
項５．
前記ｉＰＳ細胞が、フィーダーフリーで樹立されたものであり、かつ維持培養されている場合は当該維持培養がフィーダーフリーで行われたものである、項４に記載の製造方法。
項６．
前記工程（２）を１２日間行った時点において三次元浮遊培養から回収される細胞群における心筋トロポニンＴ陽性率が５０％以上である、項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
項７．
前記三次元浮遊培養が、浮遊攪拌による三次元培養である、項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
項８．
浮遊攪拌による前記三次元培養が、
培養液を収納する円筒形状の培養槽と、
該円筒形状の中心軸を回転中心として回転可能に取り付けられ、かつ培養槽底部側に向かって裾広がり形状を有する攪拌翼と
を備える、細胞培養装置を用いて行われるものである、項７に記載の製造方法。
　本発明によれば、大量の心筋細胞を効率的に産生することができる。
心筋細胞の分化誘導プロトコール１を示す図である。 心筋細胞の分化誘導プロトコール２を示す図である。 心筋細胞の分化誘導プロトコール３を示す図である。 EZSPHERE（登録商標）に対するiPS細胞播種量と分化誘導後のトロポニン陽性率との相関を示す図である。 アクチビンA添加量に対する分化誘導後のトロポニン陽性率との相関を示す図である。 BMP-4添加量に対する分化誘導後のトロポニン陽性率の相関を示す図である。 bFGF添加量に対する分化誘導後のトロポニン陽性率との相関を示す図である。 VEGF添加量に対する分化誘導後のトロポニン陽性率との相関を示す図である。
　本発明の製造方法は、
（１）複数の胚様体をそれぞれ隔離してスフェロイド培養しうる、複数の区画を有する培養基材を用いて、多能性幹細胞をスフェロイド培養することにより、複数の胚様体を形成する工程；及び
（２）前記工程（１）において得られた複数の胚様体を、三次元浮遊培養に供して心筋細胞へと分化誘導する工程
を含む、心筋細胞の製造方法である。
　１．多能性幹細胞
　多能性幹細胞は、特に限定されず、幅広く選択できる。多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である。多能性幹細胞は、フィーダーフリーで樹立されたものであってもよい。多能性幹細胞は、維持培養されている場合はフィーダーフリーで維持培養が行われたものであってもよい。本発明の製造方法は、フィーダーフリーで樹立された多能性幹細胞であって、維持培養されている場合はフィーダーフリーで維持培養が行われた多能性幹細胞を用いても、効率的に心筋細胞を分化誘導することができるという効果を有する。
　２．工程（１）
　工程（１）では、複数の区画を有する培養基材を用いる。かかる培養基材は、複数の胚様体をそれぞれ隔離してスフェロイド培養しうる。
　上記培養基材を用いて、多能性幹細胞をスフェロイド培養することにより、複数の胚様体を形成することができる。
　上記培養基材は、複数の概ね均一の区画を有する培養基材であることが好ましい。そのような培養基材を用いて、多能性幹細胞をスフェロイド培養することにより、サイズが概ね均一な複数の胚様体が得られるため好ましい。この効果の点で、上記培養基材は、各区画の口径（長径）が、４００～８００μｍであれば好ましい。また、上記の効果の点で、各区画は、深さ（最深）が、１００～４００μｍであれば好ましい。
　上記培養基材は、低細胞接着性の培養基材であることが好ましい。そのような培養基材を用いて、多能性幹細胞をスフェロイド培養することにより、胚様体を効率的に得ることができる。そのような低細胞接着性は、例えば、タンパク質が低い接着性を示す培養基材を採用したり、あるいはタンパク質が低い接着性を示すコーティング層を表面に設けたりすること等によって培養基材に付与できる。
　特に限定されないが、上記培養基材として、例えば、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（ＩＷＡＫＩ）を使用することができる。
　工程（１）のスフェロイド培養は、通常、３～５日間、好ましくは４日間行うことができる。
　工程（１）のスフェロイド培養は、培養開始時の細胞播種量が、細胞培養面積（ｍｍ２）当り、１～１０×１０３／ｍｍ２であれば好ましく、２～６×１０３／ｍｍ２であればより好ましい。
　３．工程（２）
　工程（２）では、工程（１）において得られた複数の胚様体を、三次元浮遊培養に供して心筋細胞へと分化誘導する。工程（１）で得られる、サイズが概ね均一な複数の胚様体を、工程（２）において三次元浮遊培養に供することにより、大量の心筋細胞を効率的に産生することができる。
　上記三次元浮遊培養は、好ましくは浮遊攪拌による三次元培養である。浮遊攪拌による三次元培養の条件は、特に限定されず、幅広く選択できる。浮遊攪拌による三次元培養の一例として、培養液を収納する円筒形状の培養槽と、該円筒形状の中心軸を回転中心として回転可能に取り付けられ、かつ培養槽底部側に向かって裾広がり形状を有する攪拌翼とを備える、細胞培養装置を用いる方法を挙げることができる。そのような細胞培養装置については、例えば、国際公開２０１３／１８７３５９号等に記載されるものを使用できる。
　例えば、細胞培養装置として、「ｉＰＳ細胞培養用　シングルユースバイオリアクター」（エイブル株式会社）等を使用することができる。
　細胞培養時における攪拌翼の回転数は、特に限定されず、低シェアストレスが確保されることと、細胞凝集塊の沈殿が防止されることとを基準として、適宜調整して設定することができる。回転数の好ましい一例としては１０～８０ｒｐｍの範囲等が挙げられる。
　工程（２）を１２日間行った時点において三次元浮遊培養から回収される細胞群における心筋トロポニンＴ陽性率は、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは６０％以上である。分化した心筋細胞は心筋トロポニンＴ陽性となる。よって、心筋トロポニンＴ陽性率は、心筋細胞への分化の程度の指標である。
　本発明において、心筋トロポニンＴ陽性率は、ＦＡＣＳ解析により測定するものとする。具体的には、蛍光標識した、心筋トロポニンＴに対する抗体を用いて、フローサイトメトリーによる解析を行う。
　工程（２）の三次元浮遊培養は、通常、９～１５日間、好ましくは１０～１４日間、より好ましくは１１～１３日間、さらに好ましくは１２日間行うことができる。
　培養槽の容量は特定に限定されず、適宜設定できる。例えば、２０ｍｌ～１００ｍｌ等とすることができる。
　心筋細胞への分化誘導は、公知の方法によって行うことができる。一例として、以下の条件で培養する方法が挙げられる。
　心筋細胞への分化誘導条件：
・工程（１）胚様体形成
　Ｄａｙ　０～：ＢＭＰ－４最終濃度２ｎｇ／ｍｌ
　Ｄａｙ　１～：Ａｃｔｉｖｉ　Ａ最終濃度１２ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ－４最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ
・工程（２）三次元浮遊培養
　Ｄａｙ　４～：ＶＥＧＦ最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＷＰ－３最終濃度１μＭ、ＳＢ４３１５４２最終濃度５．４μＭ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ最終濃度３μＭ
　Ｄａｙ　８～：ＶＥＧＦ最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ最終濃度５ｎｇ／ｍｌ
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
　試験例　iPS細胞（Ff-I14s04株）の調製
　沖田らの方法（Stem Cells, 31(3):458-66m 2013）に従って、ヒトホモドナー末梢血の細胞に初期化因子を有するエピソーマルベクター（pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL）を電気穿孔法で遺伝子導入し、ラミニン511-E8でコーティングされた培養皿で培養することにより、iPS細胞（Ff-I14s04株）を調製した。
　実施例１　胚様体形成における低接着性培養皿とEZSPHERE（登録商標）との比較
　心筋細胞分化誘導の初期過程である胚様体（EB）形成において、低接着性培養皿および細胞培養容器（EZSPHERE（登録商標）（IWAKI））の効果を検討した。
　低接着性培養皿を用いたプロトコール１（図１）およびEZSPHERE（登録商標）を用いたプロトコール３（図３）に従って、それぞれ１６日間培養した。培養条件はプロトコールに示すように共通してDay 0ではBMP-4最終濃度2ng/ml、Day 1ではActivin A最終濃度 12ng/ml、BMP-4最終濃度10ng/ml、bFGF最終濃度10ng/ml、Day 4ではVEGF最終濃度10ng/ml、IWP-3最終濃度 1μM、SB431542最終濃度 5.4μM、Dorsomorphin最終濃度 3μM、Day 8ではVEGF最終濃度10ng/ml、bFGF最終濃度5ng/mlに調整した。
　プロトコール１（図１）およびプロトコール３（図３）に従って、iPS細胞（Ff-I14s04株）をそれぞれ４日間培養してEBとし、次いで、共に３次元浮遊撹拌培養装置に移し、プロトコールに従って１２日間（合計１６日間）培養して心筋細胞に分化させた。
　その結果を表１に示した。day 4までに形成されたEBを細胞画像および細胞数で比較したところ、EBの均一性は EZSPHERE（登録商標）を用いた場合が優れており、細胞数は両プロトコールで大きな差異が認められなかった。day 16までの培養によって得られた回収細胞についてトロポニン陽性率と回収細胞数で比較したところ、トロポニン陽性率は低接着性培養皿を用いた場合では14.7%であったが、EZSPHERE（登録商標）を用いた場合では65.3%であって、４．４倍ほど高い心筋細胞含有率を示した。回収細胞数はそれぞれ2.08 x 108個（低接着培養皿）、1.90 x 108個（EZSPHERE（登録商標））であり、差異が認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらの結果から、iPS細胞から心筋細胞への分化誘導工程ではEB形成おいてEZSPHERE（登録商標）を用いることにより、均一なEBが形成され、トロポニン陽性率の高い回収細胞が得られ、EZSPHERE（登録商標）の有用性が認められた。
　実施例２　EB形成後の培養方法の比較
　心筋細胞分化誘導のEB形成後の培養過程において、低接着性培養皿を用いた２次元培養および浮遊培養装置（（株）エイブル社製）を用いた３次元培養方法を比較した。サイトカイン類の培養条件は実施例１と同一である。
　EB形成までは共にEZSPHERE（登録商標）を用いて４日間培養してEBを形成させ、EB形成後に低接着性培養皿を用いたプロトコール２（図２）および浮遊培養装置を用いたプロトコール３（図３）に従って、それぞれ１２日（合計１６日間）培養して心筋細胞に分化させた。
　その結果を表２に示した。day 16までの培養によって得られた回収細胞をトロポニン陽性率と回収細胞数で比較したところ、トロポニン陽性率は低接着性培養皿を用いた場合では27.8%であり、浮遊培養装置を用いた場合では68.9%であり、約２．５倍ほど高い心筋含有率を認めた。回収細胞数は2.26 x 108個（低接着性培養皿）、1.9 x 108個（浮遊培養装置）であり差異は認められなかった。
　これらの結果から、EB形成後の培養過程において、浮遊培養装置を用いた３次元培養方法が優れていることが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例３
　実施例１および実施例２の結果を基にEB形成までをEZSPHERE（登録商標）を用い、それ以後の心筋への培養を浮遊培養装置を用いることとし、また、実施例４および実施例５の結果を基に培養条件を定め、本発明の心筋細胞分化誘導プロトコール３（図３）を決定した。
　iPS細胞から心筋細胞の作製において、Day0からDay4の培養は細胞培養容器（EZSPHERE（登録商標））を用い、Day4からDay17の培養は浮遊培養装置（（株）エイブル社製）を用いて行い、培養液Stem Fit AK03N（味の素株式会社）を培地として用いた。
　Day0で、上記試験例で調製したiPS細胞（Ff-I14s04株）の胚様体をTrypLE Select（Thermo）溶液と0.5 mM EDTA/PBS溶液との混合溶液（１：１）で４分間処理した後に溶媒を除去し、セルスクレーパーを用いてiPS細胞を剥離して単一細胞に解離した。当該シングルセルを最終濃度が10μM Rock阻害剤（Y-27632（Wako））および2 ng/mL BMP4（R&D）を添加した10 mLの培地（Stem FitAK03N）に加えて懸濁液とし、EZSPHERE（登録商標）１プレート当たり２～５x106個のiPS細胞を播種し、37℃、5％酸素条件下で１日間培養してEBを作製した。さらに、最終濃度が12ng/ mL アクチビンＡ（R&D）、10ng/mL BMP4、および10ng/mL bFGF（R&D）になるように添加した培地に交換し、37℃、5％酸素条件下でEBを３日間培養して心筋分化誘導を行った。作製したEBは次工程においてEZSPHERE（登録商標）５プレート分を使用した。
　Day4で、浮遊培養装置（容量100mL）を用いて、装置に最終濃度が10ng/mL VEGF（R&D）、5.4μM SB431542（Sigma）、2μM Dorsomorphin（Sigma）および1μM IWP-3（Stemolecule）を添加した培地100mLを加え、次いで前工程で作製したEBを加え、37℃、5％酸素条件下で４日間培養した。Day6で同じ組成の培地に交換した。
　Day8で、培地を除去し、新たに最終濃度が10ng/mL VEGFおよび5ng/mL bFGFを添加した培地100mLを加え、37℃、5％酸素条件下で７～９日間培養して、Day15～17にiPS細胞より分化誘導した心筋細胞を回収した。この間に２日毎に同じ組成の培地に交換した。
　本実施例の分化誘導プロトコール３（図３）に従って作製した５ロットの心筋細胞をFACSで評価し、回収細胞数およびトロポニン陽性率を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　EZSPHERE（登録商標）および浮遊培養装置を用いた、iPS細胞から心筋細胞への分化誘導方法によって、１ロットで2.6x108 ～ 5.5x108個の多量の心筋細胞を回収できること、また、その心筋細胞のトロポニン陽性率は74～84%であり高い心筋細胞含有率を有することが明らかになった。これにより、臨床使用を可能とする心筋細胞の製造が可能となった。
　実施例４　EZSPHERE（登録商標）を用いた胚様体形成における播種量の検討
　心筋細胞分化誘導プロトコール３（図３）に従い、のiPS細胞（単一細胞）の播種量をEZSPHERE（登録商標）１プレートあたり2.5 x 106～5 x 106個に変化させ、分化誘導して得られる心筋細胞のトロポニン陽性率を検討した。本試験において、サイトカイン類の培地への添加量はActivin Aを12ng/mL、BMP-4を10 ng/mL、bFGFを10 ng/ml（分化期）および5ng/mL（成熟期）、VEGFを10 ng/mL、IWP-3を1μM、SB431542を5.4μM、Dorsomorphinを0.6μMに調整した。
　結果を図４に示した。EZSPHERE（登録商標）１プレートあたりの播種量3 x 106、3.5 x 106、4 x 106個に対して、トロポニン陽性率はそれぞれ47.1％、51.3％、40.6％であり、EZSPHERE（登録商標） １プレートあたり3～4 x 106個のiPS細胞播種量が最適であった。
　実施例５　培地に対するサイトカイン類の添加量の検討
　心筋細胞分化誘導プロトコール３（図３）に従い、分化誘導して得られた心筋細胞のトロポニン陽性率を指標として、胚様体形成後における、培地に対する各サイトカイン類添加量の最適化を行った。
　（１）アクチビンＡ添加量の最適化
　培地へのアクチビンＡの添加量（20～100 ng/mL）に対して、分化誘導して得られた心筋細胞のトロポニン陽性率を検討した。
本試験において、Activin A以外のサイトカイン類の培地への添加量はBMP-4を10 ng/mL、bFGFを10 ng/ml（分化期）および5ng/mL（成熟期）、VEGFを10 ng/mL、IWP-3を1μM、SB431542を5.4μM、Dorsomorphinを0.6μMに調整した。
　結果を図５に示した。アクチビンＡの添加量20、30、50、100 ng/mlに対して、cTNT陽性細胞含有率はそれぞれ81.0％、74.9％、71.5％、66.5％であり、20 および30 ng/mlのアクチビンＡ添加量が高いトロポニン陽性率を与えた。
　（２）BMP-4添加量の最適化
　培地へのBMP-4の添加量（200～1000 ng/mL）に対して、分化誘導して得られた心筋細胞のトロポニン陽性率を検討した。本試験において、BMP-4以外のサイトカイン類の培地への添加量はActivin Aを6 ng/mL、bFGFを10 ng/ml（分化誘導期）および5ng/mL（成熟期）、VEGFを10 ng/mL、IWP-3を1μM、SB431542を5.4μM、Dorsomorphinを0.6μMに調整した。
　結果を図６に示した。BMP-4の添加量200、300、500、1000 ng/mlに対して、トロポニン陽性率はそれぞれ2.1％、12.6％、58.7%、58.2%であり、500 ng/mlのBMP-4添加量が高いトロポニン陽性率を与えた。
　（３）bFGF添加量の最適化
　培地へのbFGFの培地への添加量（10～20 ng/mL）に対して、分化誘導して得られた心筋細胞のトロポニン陽性率を検討した。本試験において、bFGF以外のサイトカイン類の添加量はActivin Aを6 ng/mL、BMP-4を10 ng/mL、VEGFを10 ng/mL、IWP-3を1μM、SB431542を5.4μM、Dorsomorphinを0.6μMに調整した。
　結果を図７に示した。bFGFの添加量10、20 ng/mlに対して、トロポニン陽性率はそれぞれ40.5％、58.6％であり、20 ng/mlのbFGF添加量が高いトロポニン陽性率を与えた。
　（４）VEGF添加量の検討
　培地へのVEGFの添加量（5～20 ng/mL）に対して、分化誘導して得られた心筋細胞のトロポニン陽性率を検討した。本試験において、VEGF以外のサイトカイン類の培地への添加量はActivin Aを6 ng/mL、BMP-4を10 ng/mL、bFGFを10 ng/ml（分化誘導期）および5ng/mL（成熟期）、IWP-3を1μM、SB431542を5.4μM、Dorsomorphinを0.6μMに調整した。
　結果を図８に示した。VEGFの添加量5、10、15、20 ng/mlに対して、トロポニン陽性率はそれぞれ84.3％、82.6％、80.8％、81.8％であり、検討したVEGF添加量では顕著な差異は認められず、いずれも高いトロポニン陽性率を与えた。

Claims (8)

  1. （１）複数の胚様体をそれぞれ隔離してスフェロイド培養しうる、複数の区画を有する培養基材を用いて、多能性幹細胞をスフェロイド培養することにより、複数の胚様体を形成する工程；及び
    （２）前記工程（１）において得られた複数の胚様体を、三次元浮遊培養に供して心筋細胞へと分化誘導する工程
    を含む、心筋細胞の製造方法。
  2. 前記培養基材が、複数の概ね均一の区画を有する培養基材である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記培養基材が、低細胞接着性の培養基材である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 前記ｉＰＳ細胞が、フィーダーフリーで樹立されたものであり、かつ維持培養されている場合は当該維持培養がフィーダーフリーで行われたものである、請求項４に記載の製造方法。
  6. 前記工程（２）を１２日間行った時点において三次元浮遊培養から回収される細胞群における心筋トロポニンＴ陽性率が５０％以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 前記三次元浮遊培養が、浮遊攪拌による三次元培養である、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 浮遊攪拌による前記三次元培養が、
    培養液を収納する円筒形状の培養槽と、
    該円筒形状の中心軸を回転中心として回転可能に取り付けられ、かつ培養槽底部側に向かって裾広がり形状を有する攪拌翼と
    を備える、細胞培養装置を用いて行われるものである、請求項７に記載の製造方法。
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