WO2017038562A1 - 多能性幹細胞を減少させる方法、多能性幹細胞を減少させた細胞集団の製造方法 - Google Patents

多能性幹細胞を減少させる方法、多能性幹細胞を減少させた細胞集団の製造方法 Download PDF

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勝久 松浦
清水　達也
博允 瀬田
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学校法人東京女子医科大学
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
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    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Definitions

  • the present invention relates to a method for reducing pluripotent stem cells.
  • the present invention also relates to a method for producing a cell population in which pluripotent stem cells are reduced.
  • cells autologous cells isolated from tissues or blood collected from the patient's own body, cells (autologous cells) isolated from tissue or blood collected from the body of another person, and stocking Cells are used for treatment.
  • the cell type is appropriately selected according to the disease site and disease state.
  • the problem with cell transplantation is immune rejection.
  • MHC major histocompatibility gene complex
  • autologous cells since they are originally their own cells, the MHC types match and no rejection occurs. Therefore, from the viewpoint of immune rejection, regenerative medicine using autologous cells is preferable.
  • Cardiomyocytes and nerve cells are examples of such cells, and it has been difficult to use these cells for regenerative medicine.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) have been discovered, even cells that do not divide and proliferate can be differentiated from pluripotent stem cells. It was possible to induce cardiomyocytes and nerve cells, and even these cells could be supplied.
  • Pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells have the property of being able to differentiate into almost all cells constituting a living body.
  • ES cells and iPS cells that have maintained the undifferentiated ability before differentiation have a self-replicating ability, and can basically be proliferated indefinitely. Therefore, even when a large amount of cells are required, pluripotent stem cells can theoretically be expanded to the required number of cells. It was possible to secure the necessary number of cells by inducing differentiation of the pluripotent stem cells thus obtained into arbitrary somatic cells.
  • ES cells and iPS cells can be proliferated indefinitely and can be induced to differentiate into arbitrary somatic cells.
  • cells that have not yet differentiated are transplanted into a living body, their multi-differentiation Because of the ability, there is a risk of forming a teratomas, a kind of tumor. If there are no undifferentiated ES cells or iPS cells remaining in the somatic cell population induced to differentiate from ES cells or iPS cells, there is no problem, but ES cells and iPS cells that remain undifferentiated remain somatic cell populations.
  • Non-patent Document 1 a technique for reducing undifferentiated pluripotent stem cells from a cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells has been demanded.
  • Non-patent Document 2 a method for removing or reducing undifferentiated pluripotent stem cells from a cell population subjected to differentiation induction treatment.
  • Methods Non-Patent Document 3
  • chemical inhibitors Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5
  • the method using a cell sorter a large amount of antibody for recognizing an antigen on the cell surface has to be used, which entails problems such as enormous costs and a long processing time.
  • the method of incorporating a suicide gene has a problem in clinical application because the safety of the cell into which the gene has been incorporated is unknown even after transplantation.
  • the method using a chemical inhibitor has a subject about the efficiency and safety which remove or reduce a pluripotent stem cell.
  • an object of the present invention is to provide a method for removing or reducing pluripotent stem cells and a method for producing a cell population from which pluripotent stem cells have been removed or reduced.
  • pluripotent stem cells have been found to induce apoptosis and die by a very simple and inexpensive method of raising the culture temperature for a certain period of time, while being induced to differentiate from somatic cells.
  • the resulting pluripotent stem cells were found to be resistant to high temperatures.
  • TRPV-1 transient receptor potential vanilloid 1
  • it induces apoptosis in pluripotent stem cells, as in the case of high-temperature culture. It has been found that undifferentiated pluripotent stem cells remaining upon differentiation induction can be reduced. That is, the present invention is as follows.
  • [1] A method for reducing the pluripotent stem cells contained in the cell population by culturing a cell population containing pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells at a temperature of 40.5 ° C. or higher.
  • the pluripotent stem cell is an induced pluripotent stem cell and / or an embryonic stem cell.
  • the differentiated cells include cardiomyocytes, cardiac myoblasts, fibroblasts, mural cells and / or vascular endothelial cells.
  • [6] A cell population obtained by reducing the pluripotent stem cells obtained by the method according to any one of [1] to [5].
  • Activating TRPV-1 A method comprising the steps of: [8] The method according to [7], wherein the step of activating TRPV-1 is a step of activating TRPV-1 by culturing at a temperature of 40.5 ° C. or higher. [9] The method according to [8], wherein the temperature is 40.5 ° C to 45 ° C. [10] The method according to [8] or [9], wherein the temperature is 41 ° C to 43 ° C.
  • the method according to [7], wherein the step of activating TRPV-1 is a step of adding an agonist for TRPV-1.
  • the agonist is one or more selected from the group consisting of capsaicin, N-oleoyldopamine (OLDA), albanyl, olbanil, AM404 (anandamide), 2-APB, NADA, PPAHV, anti-TRPV-1 antibody.
  • the method according to [12] which is an agonist.
  • the pluripotent stem cell is an induced pluripotent stem cell and / or an embryonic stem cell.
  • the differentiated cells include cardiomyocytes, cardiac myoblasts, fibroblasts, mural cells and / or vascular endothelial cells.
  • a cell population containing pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells is cultured in a medium supplemented with an agonist for TRPV-1 to reduce the pluripotent stem cells contained in the cell population Method.
  • the agonist is one or more selected from the group consisting of capsaicin, N-oleoyldopamine (OLDA), albanyl, olbanil, AM404 (anandamide), 2-APB, NADA, PPAHV, and anti-TRPV-1 antibody.
  • LALA N-oleoyldopamine
  • AM404 anandamide
  • 2-APB 2-APB
  • NADA PPAHV
  • anti-TRPV-1 antibody anti-TRPV-1 antibody
  • [20] A method for producing a second cell population in which the pluripotent stem cells are reduced from a first cell population containing pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells, Activating TRPV-1 expressed in the pluripotent stem cells contained in the cell population.
  • the step of activating TRPV-1 is a step of activating TRPV-1 by culturing at a temperature of 40.5 ° C. or higher.
  • the temperature is 41 ° C to 43 ° C.
  • the method according to [20], wherein the step of activating TRPV-1 is a step of adding an agonist for TRPV-1.
  • the agonist is one or more selected from the group consisting of capsaicin, N-oleoyldopamine (OLDA), albanyl, olbanil, AM404 (anandamide), 2-APB, NADA, PPAHV, anti-TRPV-1 antibody.
  • LALA N-oleoyldopamine
  • AM404 anandamide
  • 2-APB 2-APB
  • NADA PPAHV
  • anti-TRPV-1 antibody anti-TRPV-1 antibody
  • an undifferentiated pluripotent stem cell obtained by inducing differentiation of a pluripotent stem cell and an undifferentiated pluripotent stem cell remaining without being induced to differentiate from a cell population.
  • Differentiated pluripotent stem cells can be easily removed or reduced.
  • the cell population obtained thereby has a reduced proportion of undifferentiated pluripotent stem cells, and when used as a transplant, the probability of forming a tumor is low.
  • (C) It is a figure which shows a TUNEL positive cell (green). Cell nuclei are shown in Hoechst (blue).
  • the lower row shows a 36 field (6 ⁇ 6) montage image of Oct4 staining.
  • A The upper row is a diagram showing a phase difference image, and the bar indicates 100 ⁇ m.
  • the middle row is a diagram showing Hoechst staining (blue), and the bar represents 200 ⁇ m.
  • the lower row is a diagram showing 36 fields of view (6 ⁇ 6) montage images of Hoechst-stained images.
  • (B) It is a figure which shows the change of the cell number with respect to each temperature condition. The total number of cells in 36 fields is shown. It is a figure which shows the influence of 42 degreeC culture
  • the upper row is a diagram showing a phase difference image, and the bar indicates 100 ⁇ m.
  • the middle row is a diagram showing Oct4 (green) and Hoechst staining (blue), and the bar shows 200 ⁇ m.
  • the lower row is a diagram showing an 81 view (9 ⁇ 9) montage image of an Oct4 stained image.
  • C It is a figure which shows the result of the coculture experiment of an iPS cell and an iPS cell origin cardiomyocyte. The cell aggregates of iPS cells and iPS cell-derived cells were cultured at 37 ° C. or 42 ° C. in AK03 medium or DMEM containing 10% FBS two days after the start of co-culture. The top row shows a phase difference image, and the bar shows 100 ⁇ m.
  • the third row is a diagram showing a fluorescent image of Oct4 (green).
  • the fourth row shows a fluorescent image of cTnT (red).
  • the bottom row shows cell nuclei stained with Hoechst (blue).
  • the bar represents 200 ⁇ m.
  • the second column is a merged image of Oct4 fluorescence image, cTnT fluorescence image, and Hoechst fluorescence image.
  • D It is a figure which shows the change of the number of Oct4 positive cells in 36 visual fields. It is the figure which confirmed the influence of the temperature with respect to an iPS cell origin cardiomyocyte and a fibroblast.
  • A It is a figure which shows a myocardial cell.
  • the first column is a merged image of fluorescent images of Nkx2.5 (red), cTnT (green), and Hoechst (blue).
  • the second row is a montage image of 36 views (6 ⁇ 6) of the cTnT stained image.
  • the third row is an Nkx2.5 stained image.
  • the 4th column name is a 36 field (6 ⁇ 6) montage image of Nkx2.5 stained image.
  • the bar represents 200 ⁇ m.
  • C It is a figure which shows a fibroblast.
  • the first column shows a phase difference image, and the bar indicates 100 ⁇ m.
  • the second row shows vimentin (green) and Hoechst staining (blue).
  • the three column names are 36 fields (6 ⁇ 6) montage images of vimentin stained images.
  • the names of the four columns are diagrams showing SM22 (red) and Hoechst staining (blue).
  • the fifth row is a 36 field (6 ⁇ 6) montage image of the SM22 stained image.
  • A It is a figure which shows the expression level of the human iPS cell origin cardiomyocyte mRNA after myocardial differentiation induction in each time of 42 degreeC culture
  • cultivation (n 3).
  • Y axis is compared with the expression level of GAPDH mRNA.
  • Y axis is compared with the expression level of GAPDH mRNA.
  • FIG. 3 shows that culture at 42 ° C. decreases iPS cells via TRPV-1.
  • the Y-axis shows the relative TRPV-1 gene expression level corrected with ⁇ -actin. * P ⁇ 0.05 vs. pre. ** p ⁇ 0.01 vs. Pre.
  • D shows the results of culturing iPS cells transfected with TRPV-1 siRNA or siRNA at 37 ° C. or 42 ° C. for 1 day.
  • the upper row shows the phase difference image, and the bar shows 100 ⁇ m.
  • the middle row shows an image of Hoechst staining, and the bar shows 200 ⁇ m.
  • the lower row is a 36 field (6 ⁇ 6) montage image of Hoechst stained image.
  • A, B The results of culturing iPS cells cultured on laminin E8 fragment with the addition of capsaicin are shown. Vehicle-1 was a control in an experiment with 2 ⁇ 10 ⁇ 4 M capsaicin added, Vehicle-2 was a control in an experiment with 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M capsaicin added, and Vehicle-3 was added with 1 ⁇ 10 ⁇ 5 M capsaicin. Represents the control in the experiment.
  • the middle row shows a Hoechst-stained image, and the bar shows 200 ⁇ m.
  • the lower row shows a 36 field (6 ⁇ 6) montage image of a Hoechst-stained image.
  • Vehicle-1 represents a control in an experiment to which 2 ⁇ 10 ⁇ 4 M capsaicin was added
  • Vehicle-2 represents a control in an experiment to which 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M capsaicin was added.
  • (C) The upper part shows a phase difference image, and the bar shows 100 ⁇ m.
  • the lower row shows a merged image of Hoechst staining (blue) and Hkx2.5 staining (green), and the bar indicates 200 ⁇ m.
  • (D) It is the figure which showed the cell number for 36 visual fields in each conditions. It is a figure which shows about the removal effect of the iPS cell using a TRPV-1 agonist.
  • (A, B) The result of culturing iPS cells cultured on laminin E8 fragment with addition of OLDA is shown.
  • (A) The upper part shows a phase difference image, and the bar shows 100 ⁇ m.
  • the middle row shows Hoechst staining (blue) image, and the bar shows 200 ⁇ m.
  • the lower row shows a 36 field (6 ⁇ 6) montage image of a Hoechst-stained image.
  • C, D shows the results of culturing iPS cell-derived cardiomyocytes with addition of OLDA.
  • C The upper row shows a merged image of cTnT staining (green), Nkx2.5 staining (red), and Hoechst staining (blue), and the bar shows 200 ⁇ m.
  • the middle row shows a 36 view (6 ⁇ 6) montage image of the cTnT stained image.
  • the lower row shows a 36 field (6 ⁇ 6) montage image of an Hkx2.5 stained image.
  • D It is a figure which shows the number of cells (for 36 visual fields) of cTnT positive and Nkx2.5 positive cells after adding OLDA to iPS cell-derived cardiomyocytes and culturing.
  • E It is a figure which shows the expression level of Lin28 mRNA after culture
  • cultivating an iPS cell origin cardiomyocyte for 2 days at 42 degreeC or OLDA (5 micromol) 37 degreeC (n 3).
  • the Y axis shows the relative expression level of Lin28 in iPS cell-derived cardiomyocytes relative to undifferentiated iPS cells cultured on MEF.
  • FIG. 1 It is a figure which shows about the removal effect of the iPS cell using a TRPV-1 agonist.
  • A, B The result of adding Albanil to iPS cells cultured on laminin E8 fragment and culturing for 1 day is shown.
  • A The upper part shows a phase difference image, and the bar shows 100 ⁇ m.
  • the middle row shows Hoechst staining (blue) image, and the bar shows 200 ⁇ m.
  • the lower row shows a 36 field (6 ⁇ 6) montage image of a Hoechst-stained image.
  • B It is the figure which showed the cell number for 36 visual fields in the conditions culture
  • cultivated by adding Albanil (n 3).
  • the present invention relates to a method for removing or reducing pluripotent stem cells and a method for producing a cell population from which pluripotent stem cells have been removed or reduced.
  • the pluripotent stem cell is a cell having self-replicating ability and pluripotency, and means a cell having the ability to form all cells constituting the body (pluripotent).
  • Self-replicating ability refers to the ability to make two undifferentiated cells from one cell.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention include embryonic stem cells (embryonic stem cells: ES cells), embryonic carcinoma cells (embrionic carcinoma cells: EC cells), trophoblast stem cells (TS cells), shrimp.
  • Blast stem cell epiblast stem cell: EpiS cell
  • embryonic germ cell embrionic germ cell: EG cell
  • pluripotent germ cell multipotent stem cell: mGS cell
  • induced pluripotent stem cell induced rupted cell
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are (1) alkaline phosphatase activity in an undifferentiated state, and / or (2) Oct3 / 4 (also referred to as Oct3, Oct4), Nanog or Sox2 which are transcription factors And / or (3) Stage Specific Embrionic Antigen (SSEA) -3, SSEA-4, Tra-1 60, Tra-1 81 or Lin28 protein (these antigens are pluripotent stem cells) And (4) cells having the ability to differentiate into three germ layers derived from endoderm, mesoderm, and ectoderm. Whether or not it has the ability to differentiate into a tissue derived from the three germ layers can be evaluated by whether or not it has the ability to transplant a target cell subcutaneously into a mouse or the like and form a teratoma (deformed species).
  • the pluripotent stem cell used in the present invention is a cell that has been confirmed and stocked in advance as a cell (cell population) that satisfies the above definition, such as a public institution (for example, Kyoto University iPS Cell Laboratory, RIKEN, etc.) ) Or a cell (cell population) distributed from a cell bank or the like possessed by a private organization (iPS Academia Japan Co., Ltd.).
  • a public institution for example, Kyoto University iPS Cell Laboratory, RIKEN, etc.
  • a cell (cell population) distributed from a cell bank or the like possessed by a private organization iPS Academia Japan Co., Ltd.
  • the pluripotency markers such as TRA-1, 81, SSEA-3, SSEA-4, and Lin28
  • at least one pluripotency marker gene expression level and / or protein expression level is non-pluripotent.
  • a method for measuring a pluripotent marker of pluripotent stem cells may be in accordance with a conventional method.
  • RT-PCR method measurement method using a flow cytometer
  • measurement method using Western blot measurement method using immunohistochemical staining
  • a technique such as a microarray method can be used.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention may be differentiated non-pluripotent stem cells, for example, pluripotent stem cells obtained by reprogramming somatic cells.
  • pluripotent stem cells obtained by reprogramming somatic cells.
  • a method of removing a nucleus of an unfertilized egg and transplanting a somatic cell nucleus, a method of performing cell fusion between a somatic cell and an ES cell, a specific reprogramming (initialization) factor (Oct3 / 4, (Nanog, Sox2, c-Myc, L-Myc, Lin28, Klf4, etc.) are introduced and initialized, but are not limited thereto.
  • the method for introducing the reprogramming factor into the cell is not particularly limited, and a method using a viral vector, a method using a plasmid vector, a method of introducing as mRNA, a method of introducing the reprogramming factor as a protein, etc. may be used. .
  • a non-pluripotent stem cell refers to a cell that does not satisfy the above definition of a pluripotent stem cell, specifically, a somatic cell that constitutes a living tissue, and an endoderm, A differentiated cell that has lost the ability to differentiate into either the mesoderm or ectoderm.
  • cardiomyocytes myoblasts, mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow derived cells, adipose derived cells, hepatocytes, sinusoidal endothelial cells, Kupffer cells, stellate cells, Pit cells, bile duct epithelial cells, kidney cells, granule cells, collecting duct epithelial cells, mural epithelial cells, podocytes, mesangial cells, smooth muscle cells, tubular cells, interstitial cells, glomerular cells, adrenal medullary cells, adrenal glands Cortical cells, spherical layer cells, bundled layer cells, reticulolayer cells, epidermal keratinocytes, melanocytes, napped muscle cells, hair follicle cells, buccal mucosa cells, gastric mucosal cells, intestinal mucosal cells, olfactory epithelial cells
  • the origin of the animal species of the cells used in the present invention is not particularly limited, but for example, human, rat, mouse, guinea pig, marmoset, rabbit, dog, cat, sheep, pig, goat, monkey, chimpanzee or Examples thereof include mammal animals such as immunodeficient animals, birds, reptiles, amphibians, amphibians, fish, and insects.
  • human cells pigs when used for pig treatment, monkeys when used for monkey treatment, and chimpanzee-derived cells when used for chimpanzee treatment. desirable.
  • cells collected from the patient himself autologous cells
  • cells collected from other people's cells transgenic cells
  • commercially available cell lines may be used. It may be.
  • non-pluripotent stem cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells are not particularly limited.
  • cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells include cardiomyocytes, myocardial blasts, myoblasts, mesenchymal stem cells, Examples include vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow-derived cells, fat-derived cells, or a mixture of two or more cells.
  • liver parenchyma Any one of cells, sinusoidal endothelial cells, Kupffer cells, stellate cells, pit cells, bile duct epithelial cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow-derived cells, adipose-derived cells, and mesenchymal stem cells Or a mixture of two or more types of cells.
  • cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells include kidney cells, granule cells Collecting duct epithelial cells, mural epithelial cells, podocytes, mesangial cells, smooth muscle cells, tubular cells, interstitial cells, glomerular cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow derived cells, Examples include any one of adipose-derived cells and mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more cells.
  • the cells used include adrenal medullary cells, adrenal cortical cells, spherical layer cells, bundled layers Examples include cells, upper layer cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow-derived cells, adipose-derived cells, mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more cells. It is done.
  • cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells include epidermal keratinocytes, melanocytes, napped muscle cells, hair follicle cells, blood vessels
  • pluripotent stem cells include epidermal keratinocytes, melanocytes, napped muscle cells, hair follicle cells, blood vessels
  • endothelial cells include endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow-derived cells, adipose-derived cells, mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more cells.
  • cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells include buccal mucosa, gastric mucosa, intestinal mucosa, olfactory epithelium, Among the cells of the oral mucosa and uterine mucosa, one or a mixture of two or more types of cells can be used.
  • cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells include midbrain dopamine neurons, cerebral neurons, retinal cells, cerebellum Among cells and hypothalamic endocrine cells, any one or a mixture of two or more types of cells may be used, but the invention is not particularly limited.
  • cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells include T cells, B cells, neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, Any one of platelets and erythrocytes, or a mixture of two or more cells may be used, but the invention is not particularly limited.
  • medium refers to a cell culture medium for culturing cells, particularly animal cells.
  • the medium is used as the same meaning as the cell culture solution. Therefore, the medium used in the present invention refers to a liquid medium.
  • the type of the medium can be a commonly used medium and is appropriately determined depending on the type of cells to be cultured.
  • the culture method for maintaining the undifferentiation of pluripotent stem cells before differentiation induction may be in accordance with a conventional method, and is not particularly limited.
  • a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells a differentiation induction method optimized for obtaining a target cell may be used, and it is not particularly limited.
  • the culture method for maintaining the undifferentiated nature of pluripotent stem cells and the culture for inducing differentiation may be performed in a flat cell culture dish, or may be performed in a suspension-stirring three-dimensional culture, and are not particularly limited. .
  • pluripotent stem cells means a cell population containing pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells (also referred to herein as “first cell population”). Pluripotency in a cell population by removing all or part of the target pluripotent stem cell from the target, or annihilating or killing part of the target pluripotent stem cell, or stopping or delaying cell proliferation of the target pluripotent stem cell Refers to reducing the relative number of sex stem cells.
  • the decrease in pluripotent stem cells in the present invention is caused by a decrease in the relative number of pluripotent stem cells in a cell population due to induction of apoptosis or necrosis, or by arresting or delaying only the cell cycle of pluripotent stem cells. It is.
  • “decreasing” pluripotent stem cells means, for example, 5% compared to the case where a cell population containing pluripotent stem cells is cultured by a conventional culture method not using the method of the present invention.
  • pluripotent stem cells are reduced.
  • a cell population obtained by reducing pluripotent stem cells from a cell population (first cell population) containing pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells by the method of the present invention is also referred to as “second cell population”.
  • pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells are cultured at a temperature of about 37 ° C., which is the body temperature of a thermostat animal.
  • pluripotent stem cells can be removed or reduced by culturing at a temperature higher than the body temperature.
  • the culture temperature for removing or reducing pluripotent stem cells may be 40.5 ° C. or higher, for example, 40.5 ° C., 40.6 ° C., 40.7 ° C., 40.
  • the culture temperature for removing or reducing the pluripotent stem cells may be 40.5 ° C to 45.0 ° C, 40.7 ° C to 43.7 ° C, or 40.8 ° C to It may be 43.5 ° C, 40.9 ° C to 43.3 ° C, or 41.0 ° C to 43.0 ° C. In particular, when cultured in the range of 41.0 ° C.
  • the step of culturing a cell population containing pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells at a temperature of 40.5 ° C. or higher comprises activating pluripotent stem cells by activating TRPV-1 described later It may also be one that reduces pluripotent stem cells by an action other than activating TRPV-1.
  • the time for culturing under conditions higher than the body temperature may be appropriately selected according to the culturing temperature, for example, 6 hours, 7 hours, 8 hours, 9 hours, 10 hours, 11 hours, 12 hours, 13 hours, 14 hours, 15 hours, 16 hours, 17 hours, 18 hours, 19 hours, 20 hours, 21 hours, 22 hours, 23 hours, 24 hours 25 hours, 26 hours, 27 hours, 28 hours, 29 hours, 30 hours, 31 hours, 32 hours, 33 hours, 34 hours, 35 hours, 36 hours, 37 hours, 38 hours, 39 hours, 40 hours, 41 Time, 42 hours, 43 hours, 44 hours, 45 hours, 46 hours, 47 hours, 48 hours, 49 hours, 50 hours, 51 hours, 52 hours, 53 hours, 54 hours, 55 hours, 56 hours, 57 hours, 5 Time, 59 hours, 60 hours, 61 hours, 62 hours, 63 hours, 64 hours, 65 hours, 66 hours, 67 hours, 68 hours, 69 hours, 70 hours, 71 hours,
  • it may be 6 to 80 hours, 9 to 75 hours, 10 to 72 hours, 11 to 70 hours, or 12 to 68 hours. It may be time. For example, when culturing at 41.0 ° C. to 43.0 ° C., culturing in the range of 10 hours to 72 hours reduces cell proliferation of pluripotent stem cells and induces differentiation of pluripotent stem cells. Thereafter, the cytotoxic activity of differentiated cells is suppressed, which is preferable.
  • a conventional method may be used as a method for evaluating the remaining pluripotent stem cells after induction of differentiation.
  • Oct4 also referred to as Oct3 or Oct3 / 4
  • Lin28 SSEA-3
  • SSEA-4 Tra-1 60
  • the evaluation method include, but are not limited to, confirmation by a flow cytometer, confirmation of protein expression by Western blotting, confirmation of mRNA expression using a real-time PCR method, and the like.
  • a conventional method may be followed as a method for evaluating the ratio of somatic cells after differentiation induction.
  • the ratio of cells expressing proteins and genes expressed in cells constituting the heart such as cardiac troponin T (cTnT) and Nkx2.5 may be evaluated.
  • cardiac troponin T (cTnT) and Nkx2.5 may be evaluated.
  • the ratio of cells expressing proteins and genes expressed in fibroblasts such as vimentin and SM22 may be evaluated.
  • the ratio of other somatic cells the ratio of cells expressing a protein or gene that is specifically expressed by the target cell may be evaluated, and is not particularly limited.
  • TRPV-1 transient receptor potential channel subfamily V member 1 refers to a membrane protein cloned as a capsaicin receptor. It is known as a non-selective cation channel that is activated against a wide range of endogenous and exogenous physical and chemical stimuli. It is activated at a temperature higher than 43 ° C., or activated against capsaicin or allyl isothiocyanate. When TRPV-1 is activated, cations flow into the cell and depolarize neurons, resulting in action potential generation from activation of voltage-gated Na + channels, causing pain. It is also activated by low pH. TRPV-1 is expressed mainly in the sensory nervous system, but is also expressed in the central nervous system and other tissues, and is considered to be a molecule mainly involved in the regulation and transmission of pain stimuli It is.
  • the present invention has found that TRPV-1 of pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells after induction of differentiation have a difference in sensitivity to temperature and chemical substances, and by activating TRPV-1
  • the present invention relates to a method for removing or reducing pluripotent stem cells from a cell population containing pluripotent stem cells and differentiated cells derived from pluripotent stem cells.
  • Examples of agonists (agonists) of TRPV-1 include capsaicin, N-oleoyldopamine (OLDA), alvanyl, olbanil, AM404 (anandamide), 2-APB, NADA, PPAHV, anti-TRPV-1 antibody and the like.
  • the present invention is not limited as long as it binds to TRPV-1 and exhibits agonist activity.
  • the concentration of capsaicin may be 20 ⁇ M to 100 mM, 30 ⁇ M to 50 mM, 40 ⁇ M to 20 mM, or 50 ⁇ M to 10 mM.
  • the concentration of OLDA may be 600 nM to 100 mM, 750 nM to 10 mM, 1 ⁇ M to 1 mM, or 2 ⁇ M to 750 ⁇ M.
  • the concentration of albanyl may be 7 ⁇ g / mL (0.016 mM) to 10 mg / mL (22.746 mM), or 10 ⁇ g / mL (0.023 mM) to 5 mg / mL (11.373 mM). It may be 15 ⁇ g / mL (0.034 mM) to 3 mg / mL (6.824 mM).
  • a method for removing or reducing pluripotent stem cells from a cell population containing pluripotent stem cells and differentiated cells derived from differentiation-induced pluripotent stem cells is obtained by applying a cell population obtained after differentiation induction treatment to the cell population obtained after differentiation induction treatment.
  • the treatment may be performed, or may be performed on a cell tissue after being processed by tissue engineering such as a cell sheet, and may be appropriately selected according to the purpose.
  • tissue engineering such as a cell sheet
  • it may be used in combination with a conventional method for removing or reducing pluripotent stem cells, and is not limited.
  • a method of using the above-described method of causing the agonist of TRPV-1 to be treated at a temperature at which pluripotent stem cells die and at which the differentiated cells derived from pluripotent stem cells do not die may be used.
  • the cell population includes those other than cells and is not particularly limited.
  • it may be a cell population in which collagen, proteoglycan, laminin, laminin 5, fibronectin, hyaluronic acid, entactin, tenascin, elastin, etc. constituting cells and extracellular matrix are mixed, and cells and cells produced by the cells
  • It may be a composition comprising an outer matrix.
  • the protein constituting the extracellular matrix may be a gene recombinant protein, or a protein produced from a cell into which a gene encoding it is incorporated or introduced by a vector or the like.
  • the cell population may be in a form in which a plurality of layered cells (for example, cell sheets) are laminated, and the cells are suspended in a gel containing an extracellular matrix and poured into a mold. It may also be a
  • the cell sheet in the present invention refers to a cell group composed of a single layer or a plurality of sheet-like cell layers obtained by culturing on a cell culture device and peeling from the cell device.
  • the method for obtaining the cell sheet is not particularly limited.
  • the cells are cultured on a cell culture device coated with a polymer whose molecular structure is changed by stimulation of temperature, pH, light, etc.
  • the method of peeling the cells from the surface of the cell culture equipment while maintaining the adhesion state between cells with any cell culture equipment Examples thereof include a method of culturing cells and physically detaching them from the edge of cell culture equipment using tweezers.
  • cells are cultured in a temperature range where the hydration power of the polymer is weak on a cell culture support coated with a polymer whose hydration power changes in the temperature range of 0 to 80 ° C. Is cultured by changing the temperature to a temperature at which the hydration power of the polymer is strong, and the cells are detached in a sheet form. At that time, the cells are cultured in a temperature range where the hydration power of the polymer is weak on a cell culture support having a surface coated with a polymer whose hydration power changes in the temperature range of 0 to 80 ° C. Usually, the temperature is preferably 37 ° C., which is a temperature for culturing cells.
  • the temperature-responsive polymer used in the present invention may be either a homopolymer or a copolymer. Examples of such a polymer include polymers described in JP-A-2-21865.
  • Some cell types are difficult to adhere on the cell culture equipment.
  • collagen, laminin, laminin 5, fibronectin, matrigel, etc. alone or a mixture of two or more kinds on the cell culture equipment. It may be coated and cultured.
  • These cell adhesion protein coating methods may be in accordance with conventional methods. Usually, an aqueous solution of cell adhesion protein is applied to the surface of the equipment, and then the aqueous solution is removed and rinsed.
  • the number of cells to be seeded to produce a cell sheet varies depending on the animal species and cell type of the cells used, but generally 0.3 ⁇ 10 4 to 10 ⁇ 10 6 cells / cm 2 is good. Preferably, 0.5 ⁇ 10 4 to 8 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , more preferably 0.7 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 .
  • the temperature of the culture equipment to which the cultured cells are attached is set to be equal to or higher than the upper critical solution temperature or lower than the lower critical solution temperature. Can be peeled off.
  • the culture conditions other than the temperature may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited.
  • the medium to be used may be a medium to which serum such as known fetal bovine serum (FBS) is added, or a serum-free medium to which such serum is not added.
  • FBS fetal bovine serum
  • Cardiomyocyte sheets using cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells used in the present invention are non-cardiomyocytes such as fibroblasts, wall cells, and vascular endothelial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells in addition to cardiomyocytes May be included. Depending on the purpose, cells can be removed using a cell sorter or an antibody, or the necessary cells can be added.
  • the “cardiomyocyte sheet” in the examples in this specification includes cells derived from pluripotent stem cells such as fibroblasts, mural cells, vascular endothelial cells, and non-cardiomyocytes, in addition to cardiomyocytes.
  • poly (N-isopropylacrylamide) is known as a polymer having a lower critical solution temperature at 31 ° C. In the free state, dehydration occurs in water at a temperature of 31 ° C. or more, and polymer chains aggregate and become cloudy. Conversely, at a temperature of 31 ° C. or lower, the polymer chain is hydrated and dissolved in water. In the present invention, this polymer is coated and fixed on the surface of a device such as a petri dish. Therefore, if the temperature is 31 ° C.
  • the polymer on the surface of the culture equipment is similarly dehydrated, but the polymer chain is coated and fixed on the surface of the culture equipment so that the surface of the culture equipment is hydrophobic.
  • the polymer on the surface of the culture equipment hydrates, but since the polymer chain is coated and fixed on the surface of the culture equipment, the culture equipment surface becomes hydrophilic.
  • the hydrophobic surface is an appropriate surface on which cells can attach and proliferate, and the hydrophilic surface becomes a surface on which cells cannot attach, and the cells or cell sheet in culture are peeled off only by cooling. Will be allowed to.
  • the shape of the cell culture device for cell sheet preparation used in the present invention is not particularly limited.
  • the shape of a cell insert cultivated on a dish, a multiplate, a flask, a porous membrane, or a flat plate is used.
  • a film-like thing etc. are mentioned.
  • cells to be cultured are epithelial cells
  • the cell culture equipment to be coated include substances that can generally be given form, such as glass, modified glass, polystyrene, polymethyl methacrylate, and the like, which are usually used for cell culture, Examples thereof include molecular compounds and ceramics.
  • the cell sheet in the present invention is not damaged by proteolytic enzymes represented by dispase, trypsin and the like during culture. Therefore, the cell sheet peeled from the cell culture equipment has an adhesive protein, and when the cells are peeled into a sheet shape, the cell-cell desmosome structure is maintained. As a result, when the cell sheet is affixed to the affected part of the living body or when the cell sheets are laminated, the cell sheets can be adhered and can be efficiently engrafted.
  • dispases which are proteolytic enzymes, are known to be capable of peeling with 10 to 40% of the cell-cell desmosome structure. Since the cell sheet is almost destroyed, the resulting cell sheet is weak.
  • the cell sheet of the present invention has a desmosome structure and a basement membrane-like protein remaining in 60% or more, and can obtain various effects as described above.
  • the method for producing a cell composition having a plurality of cell layers in the present invention is not particularly limited.
  • a cell is seeded on a cell culture device and a protein constituting an extracellular matrix protein thereon.
  • a gel containing laminin, collagen, gelatin, cadherin, hyaluronic acid, fibronectin, fibrin, elastin, chitin, chitosan, vitronectin, etc. cells are seeded and stacked to obtain a cell composition having a cell layer It can be obtained by a method, a method in which cultured cells are peeled in a sheet shape, and if necessary, a cultured cell moving jig is used to laminate the cultured cell sheets.
  • the temperature of the culture medium is not particularly limited if the polymer coated on the surface of the culture equipment has an upper critical solution temperature or lower, and if the polymer has a lower critical solution temperature or higher, the temperature is particularly limited.
  • culturing in a low temperature range for example, 10 ° C. or lower
  • a high temperature range for example, 50 ° C. or higher
  • the culture conditions other than the temperature may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited.
  • the medium to be used may be a medium to which serum such as known fetal bovine serum (FBS) is added, or a serum-free medium to which such serum is not added.
  • FBS fetal bovine serum
  • these materials are usually polyvinylidene difluoride (PVDF), silicon.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • Polyvinyl alcohol, urethane, cellulose and derivatives thereof, chitin, chitosan, collagen, gelatin, fibrin glue, etc. are used in contact with the cell sheet in the form of a membrane, porous membrane, nonwoven fabric or woven fabric.
  • the antibodies used in the immunocytochemistry and flow cytometry in this example are as follows. Anti-cardiac troponin T (cTnT, Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA) Anti-Tra-1 60 mouse monoclonal antibody (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) Anti-SM22 rabbit polyclonal antibody (Abercam, Cambridge, UK) Anti-myocardial troponin T rabbit polyclonal antibody (Abercam, Cambridge, UK) Anti-Nkx2.5 goat polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ⁇ Anti-Oct4 goat polyclonal antibody (R & D Systems) Secondary antibodies were purchased from Jackson ImmunoResearch Laboratory (West Grove, Pennsylvania, USA). Unless otherwise specified, reagents purchased from Life Technologies (California, USA) were used.
  • Human iPS cells 253G1 and 2017 were purchased from RIKEN (Tsukuba, Japan). Human iPS cell 1231A3 strain was transferred from Kyoto University. In experiments using feeder cells, iPS cells were placed on mouse fibroblasts (MEF) (Reprocell, Tokyo) treated with mitomycin C, and 5 ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF, Reprocell, Japan). ) -Containing primate ES / iPS cell culture medium (Reprocell, Japan), and maintained in a humidified atmosphere of 5% CO 2 and 37 ° C.
  • MEF mouse fibroblasts
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • iPS cells were subcultured as small cell clusters using an ES / iPS cell detachment solution (CTK solution) (Reprocell, Japan) every 3 to 4 days.
  • CTK solution ES / iPS cell detachment solution
  • StemFit AK03 Alignment AK03
  • iPS cells were cultured and adapted on iMatrix 511 (Nippi Co., Tokyo, Japan), followed by maintenance culture.
  • iPS cells were passaged every 7-8 days as single cells using TryPLE Select (Life Technologies, CA, USA) (reference: Nakagawa M., et al. A novel efficient feeder-free culture). system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep.
  • iPS cells were cultured in a humidified atmosphere of 40 ° C., 41 ° C., 42 ° C., and 5% CO 2 . Sample photographs were taken and analyzed with an inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan) and NIS-Elements software (Nikon, Tokyo, Japan).
  • a lentiviral vector ( ⁇ -MHC-puro rex-1-neo) containing both a mouse ⁇ -myosin heavy chain ( ⁇ -MHC) promoter-controlled puromycin resistance gene and a rex-1 promoter-controlled neomycin resistance gene is available from Adgene (Cambridge). , Massachusetts, USA).
  • Adgene CD34+ ⁇ -MHC-puro rex-1-neo
  • the medium containing the vector was removed, and a fresh medium was added for further cultivation.
  • the culture supernatant containing the recombinant lentivirus was collected. Centrifuge the culture supernatant at 1700 ⁇ g for 5 minutes to remove large cell debris, and place the supernatant on a 0.45 ⁇ m filter (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) to remove fine debris. I passed. Subsequently, the supernatant was subjected to ultracentrifugation in an ultracentrifuge (CP80 ⁇ , Hitachi Koki Co., Tokyo, Japan) for 1.5 hours under conditions of 87,000 ⁇ g and 4 ° C., and concentrated 100 times. The concentrated virus used to infect human iPS cells was obtained.
  • Small cell aggregates were resuspended in 1 mL medium (primate ES / iPS cell medium), transferred to a 15 mL centrifuge tube (Becton Dickinson and Company), and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After removing 500 ⁇ L of the supernatant, 400 ⁇ L of fresh medium containing 8 ⁇ g polybrene (Sigma Aldrich) was added. 100 ⁇ L of concentrated virus supernatant was added, mixed with the cells, and incubated at 37 ° C. for 6 hours. During the 6-hour incubation, the cell and virus suspensions were occasionally agitated.
  • neomycin-resistant feeder cells SL10 Reprocell
  • SL10 neomycin-resistant feeder cells
  • 1 mL of medium was added to the cells, and the virus particles were washed away by changing the medium 36 hours after infection.
  • the cells were treated with G418 sulfate (400 ⁇ g / mL) (Invitrogen) for 36 hours. Then, in order to wash away G418 sulfate, it rinsed twice with the phosphate buffered saline (PBS), and also culture
  • phosphate buffered saline PBS
  • iPS cells After inducing differentiation of iPS cells into cardiomyocytes, they were detached using 0.05% trypsin / EDTA, and cell aggregates were made into single cells using a strainer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) Using DMEM (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) containing 10% FBS, 2.1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 of cells were seeded on the culture dish, and maintained at 37 ° C., 5% CO 2 , humidified. Cultured under atmosphere.
  • cardiomyocytes derived from iPS cells were purified by treatment with puromycin (Sigma Aldrich, 1.5 ⁇ g / mL) for 1 day.
  • IPS cell-derived fibroblasts were obtained by a technique (pre-plating method) of seeding in a culture dish in advance. That is, after inducing differentiation from iPS cells to myocardium, the cells were seeded and cultured on a non-coated culture dish using 10% FBS-containing DMEM. Thereafter, the cells that did not adhere to the culture dish were discarded, and the adherent cells were washed thoroughly three times with PBS ( ⁇ ) and cultured using DMEM containing 10% FBS. More than 99% of the cells were SM22 positive, and the percentage of cTnT positive was less than 1%. IPS cell-derived fibroblasts that were passaged 2-3 times were used in the experiments.
  • iPS cell aggregates and iPS cell-derived cardiomyocytes were co-cultured for 1 day using AK03 medium on a 24-well plate. Subsequently, the cells were cultured for 2 days at 37 ° C. (AK03 medium), 42 ° C. (AK03 medium), 37 ° C. (10% FBS-containing DMEM), or 42 ° C. (10% FBS-containing DMEM).
  • IPS cells cultured on MEF were detached as single cells using Accumax (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA, USA).
  • mTeSR1 Stem Cell Technology, Canada
  • Y27632 Stem Cell Technology, Canada
  • 2 ⁇ 10 7 iPS cells including MEF
  • myocardium 12 days after induction of myocardial differentiation Cells were co-cultured (Day 0).
  • the medium was replaced with mTeSR1 medium not containing Y27632.
  • the cells were cultured in mTeSR1 medium at 37 ° C. for 48 hours, or at 42 ° C.
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and analyzed by the method of Matsuura et al. (Matsuura K., et al. Creation of human cardiac cells using pluripotent stem cells. 1 Biochem Biophys Res Commun. 24:25; .) Immunostaining was performed. To perform TUNEL analysis, staining was performed using the Click-iT TUNEL Alexa Fluor 488 Imaging Kit (Life Technologies, CA, USA) according to the instructions. Cell nuclei were stained with Hoechst 33258 (Sigma Aldrich). Stained samples were photographed using ImageXpress (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA) and Metaxpress and AcuityXpress software (Molecular Devices).
  • RNA extraction and quantitative RT-PCR Total RNA extraction and RT-PCR were performed by Matsuura K. et al. Kodama F .; Luo method (Matsuura K, Kodama F.et al., Elimination of remaining undifferentiated iPS cells in the process of human cardiac cell sheet fabrication using a methionine-free culture condition.Tissue Eng Part C Methods.2014 Sep 23.) performed according to It was.
  • the primer pair and Taqman MGB probe used were the above-mentioned Matsuura K, Kodama F. et al. The same method was used. Specific primer information is shown in Table 1. All primers purchased from Life Technologies were used. Quantitative PCR was analyzed using a 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems). Relative mRNA expression levels were calculated using a standard curve of GAPDH or ⁇ -actin mRNA expression levels.
  • TRPV-1 knockdown iPS cells cultured on iMatrix511 were treated with TRPV-1 siRNA (Life Technologies, catalog number: 4392240) and negative control (Life Technologies) using Lipofectamine® RNAi Max Transfection Reagent (Life Technologies) according to the instructions. Technologies, Silencer (registered trademark) Select Negative Control No. 1 siRNA, product number: 4390843).
  • TRPV-1 agonist The following reagents were used as agonists of TRPV-1. ⁇ Capsaicin (Sigma Aldrich) ⁇ Albanil (Wako Pure Chemical Industries) ⁇ OLDA (Tocris) -Solvent (vehicle): ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Example 1 In order to confirm whether high culture temperature damages iPS cells, first, iPS cells cultured on laminin E8 fragment were cultured at 37 ° C, 40 ° C, 41 ° C, or 42 ° C for 1 day or IPS cells cultured at 37 ° C. and 40 ° C. for 2 days (FIG. 1A, B) had a significant increase in cell number depending on the culture time (37 ° C .; Day 0; 10311 ⁇ 1395, Day 1; 23748 ⁇ 1611, Day2; 41563 ⁇ 760, 40 ° C .; Day1; 21758 ⁇ 3219, Day2; 40706 ⁇ 591). Interestingly, iPS cells cultured at 41 ° C.
  • TUNEL positive cells increased significantly in a culture time-dependent manner (Day 0; 3.4 ⁇ 0.2, Day 1; 9.4 ⁇ 4.1, Day 2; 33. 0 ⁇ 5.6) (FIGS. 1C, D).
  • a temperature of 42 ° C. is an important temperature at which human iPS cells cause apoptosis. Similar results were observed for these cytotoxic effects at 42 ° C. in different iPS cell lines (1231A3 line) cultured without feeder cells.
  • iPS cells were cultured at 42 ° C. for 1 hour or 3 hours, and then cultured at 37 ° C. until 24 hours from the start of the culture.
  • the number of cells increased significantly compared to the number of cells of Day 0 at any culture time (before the start of culture; 11897 ⁇ 207, 37 ° C. for 24 hours; 25721 ⁇ 3477, 42 ° C. 1 hour + 37 ° C. 23 hours; 23391 ⁇ 842, 42 ° C. 3 hours + 37 ° C. 21 hours; 20834 ⁇ 1942) (FIG. 3A, B).
  • a culture temperature of 42 ° C. is effective for iPS cells cultured on MEF in order to confirm the effect. I checked if there was.
  • iPS cells cultured on MEF were cultured at 42 ° C., many cells that formed colonies died by Day 2, but cells around the colonies remained (FIG. 4A). From the results of confocal high content image analysis (Confocal high content image analysis), the number of Oct4-positive cells was significantly decreased depending on the culture time (Day 0; 9931 ⁇ 250, Day 1; 5250 ⁇ 1866, Day 2; 767 ⁇ ).
  • iPS cells When iPS cell aggregates were co-cultured with iPS cell-derived cardiomyocytes for 1 day, iPS cells were engrafted with cardiomyocytes (Day 0; 7531 ⁇ 1229) (FIGS. 4C and D).
  • iPS cell culture medium AK03
  • cardiomyocyte culture medium 10% FBS-containing DMEM
  • the cells proliferate remarkably under either condition.
  • the size of the colony increased and cardiomyocytes were arranged around the colony (Day2 (AK03); 15065 ⁇ 2166, Day2 (DMEM); 16984 ⁇ 3520) (FIG. 4C, D).
  • Example 2 In order to apply the method for reducing iPS cells of the present invention in regenerative medicine applications, what kind of influence the culture conditions at 42 ° C. have on the differentiated cells used in biotechnologically produced tissues It is necessary to confirm. Since human iPS cell-derived cardiomyocyte sheets are mainly composed of cardiomyocytes, fibroblasts, etc., how the 42 ° C culture condition affects iPS cell-derived cardiomyocytes and fibroblasts confirmed.
  • iPS cell-derived cardiomyocytes When iPS cell-derived cardiomyocytes were cultured under conditions of 37 ° C. or 42 ° C., the myocardial cells showed self-sustaining pulsation, and many cells remained alive under both conditions cultured at 37 ° C. and 42 ° C. for 2 days. It was. When cultured at 37 ° C. and 42 ° C. for 1 day (Day 1) or 2 days (Day 2), the number of cTnT positive and Nkx2.5 positive cardiomyocytes was almost unchanged (cTnT positive cells: 37 ° C. (Day 1); 11084 ⁇ 1810, 37 ° C. (Day 2); 12625 ⁇ 768, 42 ° C. (Day 1); 12343 ⁇ 105, 42 ° C.
  • vimentin-positive or SM22-positive iPS cell-derived fibroblasts significantly increased compared to Day0 (vimentin-positive: Day0; 10451 ⁇ 835, Day1; 12686 ⁇ 593, Day2; 16353 ⁇ 868, SM22 positive: Day0; 10553 ⁇ 876, Day1; 12777 ⁇ 615, Day2; 16752 ⁇ 940) (FIG. 5C, D).
  • mRNA expression analysis of myocardial and extracellular matrix genes was performed, and it was examined how the temperature of 42 ° C. affects the gene expression of iPS cell-derived cardiomyocytes and fibroblasts.
  • iPS cells including myocardium and fibroblasts were cultured at 42 ° C.
  • MYL2, MYL7, Col1A, Col3A, NPPA and NPPB mRNA expression did not change until 48 hours, but the expression level of TNNT2 was significant at 48 hours (Fig. 6A). This suggested that transcriptional activity was maintained even under 42 ° C. culture conditions.
  • iPS cell-derived cardiomyocytes Cultivation of iPS cell-derived cardiomyocytes at 42 ° C. has little effect, but to clarify how the 42 ° C. culture method affects the construction of biotechnological tissue used for regenerative medicine is important.
  • the iPS cell-derived cardiomyocytes after induction of myocardial differentiation were confirmed to be autonomously pulsating when cultured on a temperature-responsive culture dish at 37 ° C. for 4 days, and when the culture temperature was lowered, a monolayer cell sheet was produced ( FIG. 6D).
  • iPS cell-derived cardiomyocytes were cultured at 42 ° C. for 2 days (Day 1 to Day 3) or 3 days (Day 1 to Day 4), and a cell sheet was obtained even when the culture temperature was lowered (FIG.
  • TRPV-1 transient receptor potential vanilloid 1
  • TRPV-1 was significantly higher in iPS cell-derived cardiomyocytes than in baseline (before 42 ° C. culture) iPS cell-derived cardiomyocytes and iPS cell-derived cardiomyocytes cultured at 42 ° C. for 24 hours. It was high (FIG. 7B).
  • iPS cells were transfected with siRNA against TRPV-1. It was confirmed that the increase in the expression level of TRPV-1 accompanying the culture at 42 ° C. was inhibited by TRPV-1 knockdown (FIG. 7C), and in agreement with this, iPS cells after the culture at 42 ° C. The decrease in the number of cells was also inhibited by TRPV-1 siRNA transfection (FIG. 7D, E). These results suggested that TRPV-1 plays an important role in the removal of iPS cells in culture at 42 ° C.
  • TRPV-1 pharmacological activity
  • TRPV-1 agonists including capsaicin
  • OLDA FIG. 9
  • albanyl FIG. 10
  • the number of cells depended on the concentration when capsaicin was used.
  • treatment with other TRPV-1 agonists also showed cytotoxic activity against iPS cells (FIGS. 9 and 10).
  • the method shown in the present invention can reduce undifferentiated pluripotent stem cells from a cell population obtained by inducing differentiation of a cell population containing pluripotent stem cells.
  • a cell population can reduce the risk of forming a tumor when used as a transplant material for regenerative medicine, and is industrially useful.
  • it is useful because it enables simple and inexpensive removal of undifferentiated pluripotent stem cells from a differentiated cell population derived from pluripotent stem cells used in applications such as experiments.

Abstract

本発明は、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、４０．５℃以上の温度で培養し、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞を減少させる方法に関する。また、本発明は、多能性幹細胞と、多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団から、多能性幹細胞を減少させる方法であって、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞に発現するＴＲＰＶ－１を活性化する工程、を含む方法に関する。本発明により、多能性幹細胞集団を分化誘導した際に残存する未分化状態の多能性幹細胞を減少させることが可能となる。

Description

多能性幹細胞を減少させる方法、多能性幹細胞を減少させた細胞集団の製造方法
　本発明は、多能性幹細胞を減少させる方法に関する。また、多能性幹細胞を減少させた細胞集団の製造方法に関する。
　近年、細胞を用いた治療技術の開発が活発化しており、国内外の多くの機関において臨床応用が試みられている。患者の生体から採取した細胞を生体外において培養し、再び患者本人に細胞を移植する方法、採取した細胞にある特定の遺伝子を導入して生体に戻す方法や、細胞をスキャフォールドと呼ばれる足場に播種し、三次元的に組織を構築して移植する方法など、様々な方法が開発されている。これらは再生医療分野の医療技術として用いられるものであり、従来の治療では根治が困難であった疾患に対しても治療できる可能性を秘めている。そのため、数多くの疾患に適用できる細胞を用いた根治治療技術の早期実用化が待ち望まれているところである。
　再生医療では、患者本人の生体から採取した組織や血液等より単離された細胞（自家細胞）、他人の生体から採取した組織や血液等より単離された細胞（他家細胞）、株化された細胞などが治療に用いられる。疾患部位や病態に応じて細胞種は適宜選択される。細胞移植を行う場合に問題となるのが免疫による拒絶反応である。自己の細胞とは異なる細胞（他家細胞）が移植される場合、通常、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の型が一致せず、拒絶反応が起こり生着しない。一方、自家細胞を用いる場合、元々自分の細胞であるためＭＨＣの型が一致し拒絶反応は起こらない。そのため、免疫拒絶の観点から考えると自家細胞を用いた再生医療の方が好ましいが、自家細胞を用いた場合は患者ごとに細胞又は組織を採取し、オーダーメードで培養等の処理を行わなければならず、莫大なコストを要する。一方で他家細胞を用いた治療であれば、あらかじめ必要とする細胞や組織を確保することが可能であり、移植が必要となった時に、保管しておいた他家細胞を用いることが出来、コストを低減させる観点からは他家細胞を用いた方が好ましい。この場合、移植した他家細胞が非移植者の体内で免疫拒絶を受けないようにするために、免疫抑制剤を用いることで免疫拒絶を回避することができる。
　再生医療に用いられる細胞種の中には、生体外の培養環境において、分裂・増殖しない、又はほとんど増殖しない細胞が存在する。心筋細胞や神経細胞などがそれにあたり、こうした細胞を再生医療に用いることは困難であった。しかし、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞が発見されたことにより、分裂・増殖しないような細胞であっても、多能性幹細胞から分化誘導し、心筋細胞や神経細胞を作ることができるようになり、こうした細胞であっても供給可能となった。
　ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、生体を構成するほぼ全ての細胞へと分化できる性質を有している。また、分化前の未分化能を維持したＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、自己複製能を有していることから、基本的には無限に増殖させることが出来る。そのため、大量の細胞が必要とされる場合であっても、理論的には要求される細胞数まで多能性幹細胞を増殖させることができる。こうして得られた多能性幹細胞を任意の体細胞へと分化誘導させることで必要な細胞数を確保することが可能となった。
　ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、無限に増殖させることが出来、任意の体細胞へと分化誘導することが可能である一方、未分化能を維持したままの細胞を生体内へ移植すると、その多分化能のために、腫瘍の一種である奇形種（テラトーマ）を形成してしまう恐れがある。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導した体細胞集団に、未分化状態のＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が残存していなければ問題無いが、未分化性を維持したままのＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が体細胞集団に残ったまま生体内へ移植されてしまうとテラトーマを形成してしまう危険性があり、安全性の面から課題を抱えていた（非特許文献１）。そのため、多能性幹細胞から分化誘導した細胞集団から、未分化状態の多能性幹細胞を減少させる技術が求められていた。
　こうした課題を解決するために、分化誘導処理を行った細胞集団から未分化な多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法として、セルソーターを用いた方法（非特許文献２）や、自殺遺伝子を組み込む方法（非特許文献３）、化学阻害剤（非特許文献４、非特許文献５）などが開発されている。しかし、セルソーターを用いる方法の場合、細胞表面の抗原を認識するための抗体を大量に用いなければならず、膨大なコストを要し、また、処理に時間がかかるなどの課題を抱えていた。また、自殺遺伝子を組み込む方法は、移植後においても遺伝子を組み込んだ細胞の安全性が不明であり、臨床応用については課題があった。また、化学阻害剤を用いる方法は、多能性幹細胞を除去する又は減少させる効率や安全性について課題があった。
国際公開第１３／１８７３５９号
Ｇｒｏｐｐ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．（２０１２）．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｅｒａｔｏｍａ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＥＳ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｂｉｏｓａｆｅｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｐｒｏｇｅｎｙ．ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　７，ｅ４５５３２． Ｂｅｎ－Ｄａｖｉｄ，Ｕ．，ｅｔ　ａｌ．（２０１３）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｉｇｈｔ－ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｌａｕｄｉｎ－６　ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，１９９２． Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．（２００３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ａｂｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａ‘‘ｓｕｉｃｉｄｅ’’ｇｅｎｅ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２１，２５７-２６５． Ｂｅｎ－Ｄａｖｉｄ，Ｕ．，ｅｔ　ａｌ．（２０１３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ａｎ　ｏｌｅａｔｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ　ｉｎ　ａ　ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎ．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　１２，１６７-１７９． Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．（２０１４）．Ａ　ｎｅｗ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　９，ｅ８５０３９．
　本発明は、上述のような多能性幹細胞集団を分化誘導した際に残存する多能性幹細胞を除去する又は減少させるための問題点を解決することを課題としてなされたものである。すなわち、本発明は、多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法、多能性幹細胞を除去した又は減少させた細胞集団の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、驚くべきことに、多能性幹細胞は、培養温度を一定時間上昇させるという極めて簡単、かつ安価な方法によりアポトーシスが誘導され、死滅することを見いだし、一方で分化誘導されて体細胞となった多能性幹細胞は、高温に対して耐性であることを見いだした。また、高温感受性のＴＲＰチャンネルであるａｃｔｉｖａｔｅｓ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｖａｎｉｌｌｏｉｄ　１（ＴＲＰＶ－１）のアゴニストを用いたときも高温での培養と同様、多能性幹細胞にアポトーシスを誘導し、多能性幹細胞集団を分化誘導した際に残存する未分化状態の多能性幹細胞を減少させることができることを見出した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
[１]　多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、４０．５℃以上の温度で培養し、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞を減少させる方法。
[２]　前記温度が、４１℃～４３℃である、[１]に記載の方法。
[３]　前記温度で培養する時間が、１０時間～７２時間の範囲である、[１]又は[２]に記載の方法。
[４]　前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞である、[１]～[３]のいずれか１項に記載の方法。
[５]　前記分化細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、壁細胞及び／又は血管内皮細胞を含む、[１]～[４]のいずれか１項に記載の方法。
[６]　[１]～[５]のいずれか１項に記載の方法によって得られた、前記多能性幹細胞を減少させた細胞集団。
[７]　多能性幹細胞と、多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団から、多能性幹細胞を減少させる方法であって、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞に発現するＴＲＰＶ－１を活性化する工程、を含むことを特徴とする方法。
[８]　前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程が、４０．５℃以上の温度で培養して前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程である[７]に記載の方法。
[９]　前記温度が、４０．５℃～４５℃である[８]に記載の方法。
[１０]　前記温度が、４１℃～４３℃である[８]又は[９]に記載の方法。
[１１]　前記温度で培養して前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程の時間が、１０時間～７２時間の範囲である[８]～[１０]に記載の方法。
[１２]　前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程が、ＴＲＰＶ－１に対するアゴニストを添加する工程である[７]に記載の方法。
[１３]　前記アゴニストが、カプサイシン、Ｎ－ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２－ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ－１抗体からなる群から選択された１又は２以上のアゴニストである[１２]に記載の方法。
[１４]　前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞である[７]～[１３]に記載の方法。
[１５]　前記分化細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、壁細胞及び／又は血管内皮細胞を含む[７]～[１４]に記載の方法。
[１６]　[７]～[１５]のいずれか１項に記載の方法によって得られた、前記多能性幹細胞を減少させた細胞集団。
[１７]　多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、ＴＲＰＶ－１に対するアゴニストを添加した培地で培養し、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞を減少させる方法。
[１８]　前記アゴニストが、カプサイシン、Ｎ－ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２－ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ－１抗体からなる群から選択された１又は２以上のアゴニストである[１７]に記載の方法。
[１９]　[１７]又は[１８]に記載の方法によって得られた、前記多能性幹細胞を減少させた細胞集団。
[２０]　多能性幹細胞と、多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む第一細胞集団から、前記多能性幹細胞を減少させた第二細胞集団を製造する方法であって、前記第一細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞に発現するＴＲＰＶ－１を活性化する工程、を含むことを特徴とする方法。
[２１]　前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程が、４０．５℃以上の温度で培養してＴＲＰＶ－１を活性化する工程である[２０]に記載の方法。
[２２]　前記温度が、４１℃～４３℃である[２０]又は[２１]に記載の方法。
[２３]　前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程が、ＴＲＰＶ－１に対するアゴニストを添加する工程である[２０]に記載の方法。
[２４]　前記アゴニストが、カプサイシン、Ｎ－ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２－ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ－１抗体からなる群から選択された１又は２以上のアゴニストである[２３]に記載の方法。
　本発明によれば、多能性幹細胞を分化誘導して得られた分化誘導された多能性幹細胞と、分化誘導されずに残存した未分化な多能性幹細胞とを含む細胞集団から、未分化な多能性幹細胞を、簡便に除去する又は減少させることが可能となる。また、これにより得られた細胞集団は、未分化な多能性幹細胞の割合が減少しており、移植物として使用した際、腫瘍を形成する確率が低くなる。
フィーダーレスで培養したヒトｉＰＳ細胞に対する培養温度の影響を示す図である。（Ａ）ラミニンＥ８フラググメント上で培養したヒトｉＰＳ細胞を３７℃、４０℃、４１℃、４２℃にて１日間又は２日間培養した。上段列は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。中段列はヘキスト染色（青）を示す図であり、バーは２００μｍを示す。下段列はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す図である。（Ｂ）それぞれの温度条件に対する細胞数の変化を示す図である（ｎ＝３）。（Ｃ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑）を示す図である。細胞核はヘキスト（青）で示す。（Ｄ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を示す図である（ｎ＝３）。 ４２℃で培養したフィーダーフリーｉＰＳ細胞の細胞数を示す図である。（Ａ）ラミニンＥ８フラグメントで培養したヒトｉＰＳ細胞を３７℃又は４２℃において、１日及び２日間培養した。上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す。中段はＯｃｔ４（緑）及びヘキスト（青）染色の画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はＯｃｔ４染色の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｂ）３６視野（６×６）におけるＯｃｔ４陽性細胞の数を示す（ｎ＝３）。 フィーダーレスで培養したヒトｉＰＳ細胞に対する培養温度の影響を示す図である。ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞を１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間４２℃で培養し、続いて培養開始から２４時間まで３７℃で培養した。（Ａ）上段列は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。中段列はヘキスト染色（青）を示す図であり、バーは２００μｍを示す。下段列はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す図である。（Ｂ）それぞれの温度条件に対する細胞数の変化を示す図である。３６視野の合計の細胞数を示している。 ｉＰＳ細胞と他の細胞との共培養における４２℃培養の影響を示す図である。（Ａ）ＭＥＦ上で培養したヒトｉＰＳ細胞を４２℃で１日間及び２日間培養した。上段列は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。中段列はＯｃｔ４（緑）及びヘキスト染色（青）を示す図であり、バーは２００μｍを示す。下段列はＯｃｔ４染色画像の８１視野（９×９）モンタージュ画像を示す図である。（Ｂ）それぞれの時間における８１視野中のＯｃｔ４陽性細胞の数を示す図である（ｎ＝３）。（Ｃ）ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞由来心筋細胞の共培養実験の結果を示す図である。ｉＰＳ細胞の細胞凝集塊とｉＰＳ細胞由来細胞とを共培養開始２日後、ＡＫ０３培地又は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにて３７℃又は４２℃で培養した。最上段列は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。３段目列はＯｃｔ４（緑）の蛍光画像を示す図である。４段目列はｃＴｎＴ（赤）の蛍光画像を示す図である。最下段はヘキスト（青）で染色した細胞核を示す図である。バーは２００μｍを表す。２列目はＯｃｔ４蛍光画像、ｃＴｎＴ蛍光画像、ヘキスト蛍光画像のマージ画像である。（Ｄ）３６視野中のＯｃｔ４陽性細胞の数の変化を示す図である。 ｉＰＳ細胞由来心筋細胞と線維芽細胞に対する温度の影響を確認した図である。（Ａ）心筋細胞を示す図である。１列目はＮｋｘ２．５（赤）、ｃＴｎＴ（緑）、ヘキスト（青）の蛍光画像のマージ画像である。２列目はｃＴｎＴ染色画像の３６視野（６×６）のモンタージュ画像である。３列目はＮｋｘ２．５染色像である。４列名はＮｋｘ２．５染色像の３６視野（６×６）モンタージュ画像である。バーは２００μｍを示す。（Ｂ）ｃＴｎＴ陽性細胞、及びＮｋｘ２．５陽性細胞の数を示す図である（ｎ＝２）。（Ｃ）線維芽細胞を示す図である。１列目は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。２列目はビメンチン（緑）及びヘキスト染色（青）を示す図である。３列名はビメンチン染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像である。４列名はＳＭ２２（赤）及びヘキスト染色（青）を示す図である。５列目はＳＭ２２染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像である。（Ｄ）ビメンチン陽性細胞及びＳＭ２２陽性細胞の数の変化を示す図である（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５　ｖｓ．　Ｄａｙ０．　＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ．　Ｄａｙ０． 心筋細胞シート作製におけるｉＰＳ細胞の除去効果を示す図である。（Ａ）４２℃培養の各時間における心筋分化誘導後のヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞ｍＲＮＡの発現量を示す図である（ｎ＝３）。Ｙ軸はＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡの発現量で比較している。＊ｐ＜０．０５　ｖｓ．　ｐｒｅ．（Ｂ）４２℃培養の各時間における心筋分化誘導後のヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＬｉｎ２８及びＯｃｔ４　ｍＲＮＡの発現量を示す図である（ｎ＝３）。Ｙ軸はＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡの発現量で比較している。＊ｐ＜０．０５　ｖｓ．　ｐｒｅ．（Ｃ）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＬｉｎ２８及びＯｃｔ４　ｍＲＮＡの相対的発現量を示す図である（ｎ＝３）。ｉＰＳ細胞の発現量を１００％としたときの相対値である。（Ｄ）４２℃培養が細胞シート作製に与える効果を示す図である。左図は培養スケジュールを示す。右図は、細胞シートの状態を示す図である。 ４２℃培養がＴＲＰＶ－１を介してｉＰＳ細胞を減少させることを示す図である。（Ａ）フィーダーレスｉＰＳ細胞（左、ｎ＝３）及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞（右、ｎ＝３）のＴＲＰＶ－１　ｍＲＮＡの発現量を示す。Ｙ軸はβーアクチンで補正した相対的なＴＲＰＶ－１遺伝子発現量を示す。＊ｐ＜０．０５　ｖｓ．ｐｒｅ．　＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ．　ｐｒｅ．（Ｂ）培養開始前及び４２℃培養２４時間後におけるフィーダーレスｉＰＳ細胞及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＴＲＰＶ－１　ｍＲＮＡ発現量の比較を示す図である（ｎ＝３）。（Ｃ）ＴＲＰＶ－１　ｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳ細胞のＴＲＰＶ－１　ｍＲＮＡ発現量を示す図である（ｎ＝４）。（Ｄ）ＴＲＰＶ－１　ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳ細胞を３７℃又は４２℃で１日間培養した結果を示す図である。上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す。中段はヘキスト染色の画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像である。（Ｅ）それぞれの培養条件における細胞数を示した図である（ｎ＝３）。 ＴＲＰＶ－１アゴニストを使用したｉＰＳ細胞の除去効果について示す図である。（Ａ、Ｂ）ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞をカプサイシンを添加して培養した結果を示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ－１は２×１０-4Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロール、Ｖｅｈｉｃｌｅ－２は１×１０-4Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロール、Ｖｅｈｉｃｌｅ－３は１×１０-5Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロールを表す。（Ａ）上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す図である。中段はヘキスト染色画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｂ）それぞれの条件における３６視野分の細胞数を示した図である。（Ｃ、Ｄ）ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞にカプサイシンを添加して培養したＮｋｘ２．５陽性細胞を示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ－１は２×１０-4Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロール、Ｖｅｈｉｃｌｅ－２は１×１０-4Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロールを表す。（Ｃ）上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す図である。下段はヘキスト染色（青）及びＨｋｘ２．５染色（緑）のマージ画像を示し、バーは２００μｍを示す。（Ｄ）それぞれの条件における３６視野分の細胞数を示した図である。 ＴＲＰＶ－１アゴニストを使用したｉＰＳ細胞の除去効果について示す図である。（Ａ、Ｂ）ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞をＯＬＤＡを添加して培養した結果を示す。（Ａ）上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す。中段はヘキスト染色（青）画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｂ）ＯＬＤＡを添加して培養した条件における３６視野分の細胞数を示した図である（ｎ＝３)。（Ｃ、Ｄ）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞をＯＬＤＡを添加して培養した結果を示す。（Ｃ）上段はｃＴｎＴ染色（緑）、Ｎｋｘ２．５染色（赤）、ヘキスト染色（青）のマージ画像を示し、バーは２００μｍを示す図である。中段はｃＴｎＴ染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。下段はＨｋｘ２．５染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｄ）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞にＯＬＤＡを添加して培養した後のｃＴｎＴ陽性及びＮｋｘ２．５陽性細胞の細胞数（３６視野分）を示す図である。（Ｅ）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を４２℃、又はＯＬＤＡ（５μＭ）３７℃で２日間培養した後のＬｉｎ２８　ｍＲＮＡの発現量を示す図である（ｎ＝３）。Ｙ軸は、ＭＥＦ上で培養した未分化ｉＰＳ細胞に対するｉＰＳ細胞由来心筋細胞の相対的なＬｉｎ２８の遺伝子発現量を示す。 ＴＲＰＶ－１アゴニストを使用したｉＰＳ細胞の除去効果について示す図である。（Ａ、Ｂ）ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞にアルバニルを添加して１日間培養した結果を示す。（Ａ）上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す。中段はヘキスト染色（青）画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｂ）アルバニルを添加して培養した条件における３６視野分の細胞数を示した図である（ｎ＝３）。
　本発明は、多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法、多能性幹細胞を除去した又は減少させた細胞集団の製造方法に関するものである。本発明において、多能性幹細胞とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、体を構成するあらゆる細胞を形成する能力（ｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｔ）を備える細胞をいう。自己複製能とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を２つ作る能力のことをいう。本発明で用いられる多能性幹細胞には、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エビブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）などが含まれる。
　本発明に用いられる多能性幹細胞とは、（１）未分化状態でアルカリフォスファターゼ活性を有し、及び／又は（２）転写因子であるＯｃｔ３／４（Ｏｃｔ３、Ｏｃｔ４ともいう）、Ｎａｎｏｇ若しくはＳｏｘ２を発現し、及び／又は（３）Ｓｔａｇｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＳＳＥＡ）－３、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１　６０、Ｔｒａ－１　８１若しくはＬｉｎ２８のタンパク質を発現し（これらの抗原は、多能性幹細胞のステージによって発現量に若干の違いがある）、並びに（４）内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉由来の組織へと分化する能力を有する細胞と定義することができる。三胚葉由来の組織へと分化する能力があるかどうかは、対象となる細胞をマウスなどの皮下に移植し、テラトーマ（奇形種）を形成する能力を有するかどうかで評価できる。
　本発明に用いられる多能性幹細胞は、上記の定義を満たす細胞（細胞集団）として予め確認されてストックされている細胞、例えば公的機関（例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究所、理化学研究所等）又は民間機関（ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社等）が有する細胞バンク等から配布される細胞（細胞集団）であることが好ましく、この場合、アルカリフォスファターゼ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＴＲＡ－１　６０、ＴＲＡ－１　８１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｌｉｎ２８などの多能性マーカーのうち、少なくとも１つ以上の多能性マーカーの遺伝子発現量及び／又はタンパク質の発現量が、非多能性幹細胞と比較して高いかどうかを確認するだけで、細胞集団における多能性幹細胞が含まれる割合を簡便に確認することができる。本発明において、多能性幹細胞の多能性マーカーを測定する方法は定法に従えばよく、例えばＲＴ－ＰＣＲ法、フローサイトメーターによる測定法、ウエスタンブロットによる測定法、免疫組織化学染色による測定法、マイクロアレイ法などの手法を用いることができる。
　本発明で用いられる多能性幹細胞は、分化した非多能性幹細胞、例えば、体細胞を初期化（リプログラミング）することにより得られる多能性幹細胞であってもよい。例えば、未受精卵の核を除去して体細胞の核を移植する方法、体細胞とＥＳ細胞との細胞融合を行う方法、体細胞へ特定のリプログラム（初期化）因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４など）を導入して初期化する方法などが挙げられるが限定されない。リプログラム因子を細胞へ導入する方法も特に限定されず、ウイルスベクターを用いた方法、プラスミドベクターを用いた方法、ｍＲＮＡとして導入する方法、リプログラム因子をタンパク質として導入する方法などを用いてもよい。
　本発明の実施形態において、非多能性幹細胞とは、上記の多能性幹細胞の定義を満たさない細胞をいうが、具体的には、生体組織を構成する体細胞であって、内胚葉、中胚葉、外胚葉のいずれかの胚葉へと分化する能力を失った分化細胞をいう。例えば、心筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、頬側粘膜細胞、胃粘膜細胞、腸管粘膜細胞、嗅上皮細胞、口腔粘膜細胞、子宮粘膜細胞、中脳ドーパミン神経細胞、大脳神経細胞、網膜細胞、小脳細胞、視床下部内分泌細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球等の生体を構成する細胞、又は、一系統の細胞型を形成し得る能力（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有する体性幹細胞が含まれる。体細胞には、生殖細胞は含まれない。
　本発明に用いられる細胞の動物種の由来は、特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物などの哺乳類動物、鳥類、爬虫類、両生類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。本発明により得られる細胞集団をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタの治療に用いる場合はブタ、サルの治療に用いる場合はサル、チンパンジーの治療に用いる場合はチンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。また、治療を行うのがヒトである場合、患者本人から採取した細胞であってもよく（自家細胞）、他人の細胞から採取した細胞を用いてもよく（他家細胞）、市販の細胞株であってもよい。
　本発明において、多能性幹細胞から分化誘導して得られる非多能性幹細胞は特に限定されるものではない。例えば、心筋組織の再生、或いは心筋機能を評価する方法を目的とした場合、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。肝組織の再生、肝組織を模擬した人工肝臓の作製、或いは肝組織の機能を評価する方法等を目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。腎組織の再生、腎組織を模擬した人工腎臓の作製、或いは腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。副腎組織の再生、副腎を模擬した人工副腎の作製、或いは副腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。皮膚の再生、或いは皮膚機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。粘膜組織の再生、或いは粘膜組織の機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜の細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。神経系の再生、あるいは神経の機能を評価する細胞を得る目的として場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、中脳ドーパミン神経細胞、大脳神経細胞、網膜細胞、小脳細胞、視床下部内分泌細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられるが特に限定されない。血液を構成する細胞を得る目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球、血小板、赤血球、のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられるが特に限定されない。
　本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。
　本発明において、分化誘導前の多能性幹細胞の未分化性を維持する培養方法については定法に従えばよく、特に限定されない。また、多能性幹細胞を分化誘導する方法としては目的とする細胞を得るために最適化された分化誘導法を用いればよく、特に限定されない。多能性幹細胞の未分化性を維持するための培養方法や、分化誘導を行うための培養は、平面の細胞培養皿で行ってもよく、浮遊撹拌三次元培養で行ってもよく特に限定されない。
　本発明において、多能性幹細胞を「減少させる」とは、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団（本明細書において、「第一細胞集団」ともいう。）から目的とする多能性幹細胞の全て若しくは一部を除去、又は、全滅若しくは一部を死滅、又は、目的とする多能性幹細胞の細胞増殖を停止若しくは遅延させることにより、細胞集団における多能性幹細胞の相対的な数を減少させることをいう。本発明における多能性幹細胞の減少は、アポトーシス又はネクローシスの誘導、又は、多能性幹細胞の細胞周期のみ停止若しくは遅延により、細胞集団における多能性幹細胞の相対的な数が減少することで引き起こされる。本発明において、多能性幹細胞を「減少させる」とは、本発明の方法を用いない従来の培養方法により、多能性幹細胞を含む細胞集団を培養した場合と比較して、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％の多能性幹細胞が減少することを意味する。本明細書において、本発明の方法によって、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団（第一細胞集団）から、多能性幹細胞を減少させて得られる細胞集団を「第二細胞集団」ともいう。
　従来、多能性幹細胞や、多能性幹細胞から分化誘導された分化細胞は、恒温動物の体温である３７℃前後の温度にて培養される。本発明では、体温よりも高温で培養することで多能性幹細胞を除去する又は減少させることが可能である。本発明において、多能性幹細胞を除去する又は減少させるための培養温度としては、４０．５℃以上であればよく、例えば、４０．５℃、４０．６℃、４０．７℃、４０．８℃、４０．９℃、４１．０℃、４１．１℃、４１．２℃、４１．３℃、４１．４℃、４１．５℃、４１．６℃、４１．７℃、４１．８℃、４１．９℃、４２．０℃、４２．１℃、４２．２℃、４２．３℃、４２．４℃、４２．５℃、４２．６℃、４２．７℃、４２．８℃、４２．９℃、４３．０℃、４３．１℃、４３．２℃、４３．３℃、４３．４℃、４３．５℃、４３．６℃、４３．７℃、４３．８℃、４３．９℃、４４．０℃、４４．１℃、４４．２℃、４４．３℃、４４．４℃、４４．５℃、４４．６℃、４４．７℃、４４．８℃、４４．９℃、４５．０℃であってもよい。また、多能性幹細胞を除去する又は減少させるための培養温度としては４０．５℃～４５．０℃であってもよく、４０．７℃～４３．７℃でもよく、４０．８℃～４３．５℃でもよく、４０．９℃～４３．３℃でもよく、４１．０℃～４３．０℃でもよい。特に、４１．０℃～４３．０℃の範囲での培養は、多能性幹細胞の細胞増殖が停止し、また、多能性幹細胞が分化誘導された後の分化細胞は傷害をほとんど受けないため、好ましい。本発明において、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、４０．５℃以上の温度で培養する工程は、後述のＴＲＰＶ－１を活性化して多能性幹細胞を減少させるものであってもよく、また、ＴＲＰＶ－１を活性化する以外の作用によって多能性幹細胞を減少させるものであってもよい。
　本発明において、多能性幹細胞を除去する又は減少させるために、体温より高温の条件にて培養する時間としては、培養温度に応じて適宜選択すればよいが、例えば、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、５０時間、５１時間、５２時間、５３時間、５４時間、５５時間、５６時間、５７時間、５８時間、５９時間、６０時間、６１時間、６２時間、６３時間、６４時間、６５時間、６６時間、６７時間、６８時間、６９時間、７０時間、７１時間、７２時間、７３時間、７４時間、７５時間、７６時間、７７時間、７８時間、７９時間、８０時間であってもよい。また、６時間～８０時間であってもよく、９時間～７５時間であってもよく、１０時間～７２時間であってもよく、１１時間～７０時間であってもよく、１２時間～６８時間であってもよい。例えば、４１．０℃～４３．０℃で培養した場合は、１０時間～７２時間の範囲で培養すれば、多能性幹細胞の細胞増殖が減少し、また、多能性幹細胞が分化誘導された後の分化細胞の傷害活性が抑えられ、好ましい。
　本発明おいて、分化誘導後の残存した多能性幹細胞を評価する方法としては定法に従えばよいが、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３又はＯｃｔ３／４ともいう）、Ｌｉｎ２８、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１　６０、Ｔｒａ－１　８１などの発現を指標として評価すれば良く、特に限定されない。評価する方法としては、フローサイトメーターによる確認、ウエスタンブロット法によるタンパク発現の確認、リアルタイムＰＣＲ法をもちいたｍＲＮＡの発現量を確認する方法などが挙げられるが特に限定されない。また、分化誘導した後の体細胞が含まれる割合を評価する方法としても定法に従えばよい。例えば心筋細胞の割合を評価する場合は、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）やＮｋｘ２．５など心臓を構成する細胞に発現しているタンパク質や遺伝子を発現する細胞の割合を評価すればよい。例えば、線維芽細胞の割合を評価する場合は、ビメンチンやＳＭ２２など、繊維芽細胞に発現しているタンパク質や遺伝子を発現する細胞の割合を評価すれば良い。その他の体細胞が含まれる割合を評価する場合は、目的とする細胞が特異的に発現するタンパク質や遺伝子を発現する細胞の割合を評価すればよく、特に限定されない。
　本発明において、ＴＲＰＶ－１（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃａｔｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｖ　ｍｅｍｂｅｒ　１）とは、カプサイシン受容体としてクローニングされた膜タンパク質のことをいう。内因性及び外因性の物理的及び化学的刺激の幅広い刺激に対して活性化される非選択性陽イオンチャネルとして知られている。４３℃より高い温度で活性化したり、カプサイシンやアリルイソチアネートなどに対しても活性化する。ＴＲＰＶ－１が活性化すると、陽イオンが細胞内に流入し、神経細胞を脱分極させて電位作動性Ｎａ+チャネルの活性化から活動電位の発生をもたらし、痛みが引き起こされる。また、低ｐＨによっても活性化される。ＴＲＰＶ－１は主に感覚神経系に発現しているが、中枢神経系や他の組織においても発現しており、主に痛み刺激の調節や伝達に関与する分子であると考えられている分子である。
　本発明は、多能性幹細胞と、分化誘導後の多能性幹細胞由来分化細胞のＴＲＰＶ－１は、温度及び化学物質に感受性の違いがあることを見出し、ＴＲＰＶ－１を活性化することにより、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来分化細胞を含む細胞集団から多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法に関する。ＴＲＰＶ－１のアゴニスト（作動薬）としては、カプサイシンの他、Ｎ－ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２－ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ－１抗体などが挙げられるが、本発明ではＴＲＰＶ－１に結合し、アゴニスト活性を示すものであればよく、限定されない。本発明において、カプサイシンの濃度は２０μＭ～１００ｍＭであってもよく、３０μＭ～５０ｍＭであってもよく、４０μＭ～２０ｍＭであってもよく、５０μＭ～１０ｍＭであってもよい。本発明において、ＯＬＤＡの濃度は６００ｎＭ～１００ｍＭであってもよく、７５０ｎＭ～１０ｍＭであってもよく、１μＭ～１ｍＭであってもよく、２μＭ～７５０μＭであってもよい。本発明において、アルバニルの濃度は７μｇ／ｍＬ（０．０１６ｍＭ）～１０ｍｇ／ｍＬ（２２．７４６ｍＭ）であってもよく、１０μｇ／ｍＬ（０．０２３ｍＭ）～５ｍｇ／ｍＬ（１１．３７３ｍＭ）であってもよく、１５μｇ／ｍＬ（０．０３４ｍＭ）～３ｍｇ／ｍＬ（６．８２４ｍＭ）であってもよい。
　本発明において、多能性幹細胞と分化誘導後の多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞集団から、多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法は、分化誘導処理後に得られた細胞集団に上記処理を行ってもよく、細胞シートなどのティッシュエンジニアリングによる加工を行った後の細胞組織に対して行ってもよく、適宜目的に応じて選択すればよい。また、従来の多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法と組み合わせて利用してもよく限定されない。また、多能性幹細胞が死滅する温度であり、多能性幹細胞由来の分化細胞が死滅しない温度で処理しつつ、上記ＴＲＰＶ－１のアゴニストを作用させる方法を用いる方法であってもよい。
　本発明において、細胞集団とは、細胞以外のものも含み、特に限定されない。例えば、細胞と細胞外マトリックスを構成するコラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、エンタクチン、テネイシン、エラスチン等が混合された細胞集団であってもよく、細胞とその細胞が産生する細胞外マトリックスを含む組成物であってもよい。また、細胞外マトリックスを構成するタンパク質は、遺伝子組み換えタンパク質であってもよく、それをコードする遺伝子が組み込まれた、又はベクター等により遺伝子導入された細胞から産生されるタンパク質であってもよい。また、細胞集団の形態は、層状の細胞（例えば、細胞シート）が複数積層された形態であってもよく、細胞を細胞外マトリックスを含むゲルに懸濁して、型（モールド）に流し込んで得られた物であってもよい。
　本発明における細胞シートは、細胞培養器材上で培養し、細胞器材上から剥離させて得られる１層、または複数層のシート状の細胞層からなる細胞群をいう。細胞シートを得る方法としては特に限定されるものではないが、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した細胞培養器材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の条件を変えて、細胞培養器材表面を変化させることで、細胞間の接着状態は維持しつつ、細胞培養器材表面から細胞をシート状に剥離する方法、任意の細胞培養器材にて細胞を培養し、細胞培養器材の端部から、物理的にピンセット等により剥離する方法等が挙げられる。特に好ましいのが、０～８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培地をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養し、細胞をシート状に剥離させる方法である。その際、細胞は０～８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２－２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。
　細胞種によっては、細胞培養器材上に接着しにくいものがあり、そのような場合は、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物を細胞培養器材上に被覆して培養してもよい。これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を器材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法が挙げられる。
　本発明の方法において、細胞シートを作製するために播種する細胞数は使用細胞の動物種や細胞種によって異なるが、一般的に０．３×１０4～１０×１０6個／ｃｍ2が良く、好ましくは０．５×１０4～８×１０6個／ｃｍ2が良く、さらに好ましくは０．７×１０4～５×１０6個／ｃｍ2が良い。本発明においては、培養した細胞シートを温度応答性培養器材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養器材の温度を被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培地中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、培養器材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法、ピンセットを用いる方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。
　本発明において用いられる多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いた心筋細胞シートは、心筋細胞以外にも多能性幹細胞から分化誘導される線維芽細胞、壁細胞、血管内皮細胞などの非心筋細胞が含まれてもよい。目的に応じて細胞をセルソーターや抗体を用いて不要な細胞を除いたり、逆に必要な細胞を加えることができる。本明細書における実施例中の「心筋細胞シート」は、心筋細胞以外に、線維芽細胞、壁細胞、血管内皮細胞、非心筋細胞などの多能性幹細胞から分化誘導された細胞が含まれる。
　以上のことを、温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの器材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、培養器材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養器材表面に被覆、固定されているため、培養器材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、培養器材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養器材表面に被覆、固定されているため、培養器材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。
　本発明に用いられる細胞シート作製用の細胞培養器材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、多孔膜上で培養するセルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。培養する細胞が上皮系の細胞である場合、セルインサートを用いると、細胞の上下に培地が触れさせることができ、細胞が重層化し、好ましい。被覆を施される細胞培養器材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。
　本発明における細胞シートは、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、細胞培養器材から剥離された細胞シートは接着性蛋白質を有し、細胞をシート状に剥離させた際には細胞－細胞間のデスモソーム構造が保持されている。このことにより、細胞シートを生体患部に貼付したり、細胞シートを積層する場合、接着することができ、効率良く生着できるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞－細胞間のデスモソーム構造については１０～４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞－器材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。
　本発明における複数の細胞層を有する細胞組成物を作製する方法については、特に限定されるものではないが、例えば、細胞を細胞培養器材に播種し、その上に細胞外マトリックスタンパクを構成するタンパク（ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、カドヘリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、フィブリン、エラスチン、キチン、キトサン、ビトロネクチン等）を含むゲルを塗布後、さらに細胞を播種して積層し、細胞層を有する細胞組成物を得る方法や、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させる方法などにより得られる。その際、培地の温度は、培養器材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域（例えば、１０℃以下）、あるいは培養細胞が死滅するような高温域（例えば５０℃以上）における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、必要に応じ、細胞シートを移動させるための治具を利用しても良い。そのような治具としては、剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば材質、形状は何ら限定されるものではないが、それらの材質としては、通常、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリングルー等の材料を膜状、多孔膜状、不織布状、織布状として細胞シートに接触させて使用される。
　　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
（抗体）
本実施例中の免疫細胞化学、フローサイトメトリーに用いた抗体は以下の通りである。
・抗心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ、サーモサイエンティフィック社、ロックフォード、イリノイ州、米国）
・抗Ｔｒａ－１　６０マウス単クローン抗体（ミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）
・抗ＳＭ２２　ウサギポリクローナル抗体（アバカム社、ケンブリッジ、英国）
・抗心筋トロポニンＴ　ウサギポリクローナル抗体（アバカム社、ケンブリッジ、英国）
・抗Ｎｋｘ２．５　ヤギポリクローナル抗体（サンタクルズ　バイオテクノロジー社、サンタクルズ、カリフォルニア州、米国）
・抗Ｏｃｔ４　ヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステム社）
２次抗体はジャクソン　イムノリサーチ　ラボラトリー社（ウエスト　グローブ社、ペンシルベニア州、米国）から購入した。特に明記しない限り、試薬はライフ　テクノロジーズ社（カリフォルニア州、米国）より購入したものを使用した。
（ヒトｉＰＳ細胞の培養）
　ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株及び２０１７株は、国立研究開発法人理化学研究所（筑波、日本）より購入した。ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株は京都大学より譲渡を受けた。フィーダー細胞を用いた実験は、マイトマイシンＣで処理したマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）（リプロセル社、東京）上にｉＰＳ細胞を載せ、５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、リプロセル社、日本）を含有した霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル社、日本）を用いて５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気条件にて維持培養を行った。ｉＰＳ細胞は３～４日毎にＥＳ／ｉＰＳ細胞剥離液（ＣＴＫ溶液）（リプロセル社、日本）を用い、小さな細胞塊として継代を行った。フィーダー細胞を用いない実験では、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３（味の素社、東京、日本）を培地として用い、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（ニッピ社、東京、日本）上でｉＰＳ細胞を培養して適応させ、維持培養を行った。ｉＰＳ細胞は７～８日毎に、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジー社、カリフォルニア州、米国）を使用してシングルセルとして継代を行った（参考：Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ　Ｒｅｐ．２０１４；４：３５９４．）。実験に応じて、ｉＰＳ細胞は、４０℃、４１℃、４２℃の加湿、５％ＣＯ2濃度の雰囲気にて培養を行った。試料の写真は倒立顕微鏡（ニコン社、東京、日本）及びＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウエア（ニコン社、東京、日本）にて撮影して解析した。
（α－ＭＨＣプロモーター及びｒｅｘ－１プロモーター誘導薬剤耐性遺伝子発現ヒトｉＰＳ細胞の準備）
　マウスα－ミオシン重鎖（α－ＭＨＣ）プロモーター制御ピューロマイシン耐性遺伝子及びｒｅｘ－１プロモーター制御ネオマイシン耐性遺伝子の両方を含むレンチウイルスベクター（α－ＭＨＣ－ｐｕｒｏ　ｒｅｘ－１－ｎｅｏ）はアドジーン社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）より購入した。当該レンチウイルスベクターを用いることで、ヒトｉＰＳ細胞を増殖させるときにＧ４１８によって未分化状態のｉＰＳ細胞だけを選別することができ、また、心筋へと分化誘導された後は、ピューロマイシンによって分化誘導した心筋細胞を選別することができる。遺伝子組み換えｉＰＳ細胞は以下の手順により得た。
（ｉ）組み換えレンチウイルスベクターの調整
　ベクターの遺伝子導入は、商業的販売されている遺伝子導入キットのリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）にて行い、組み換えレンチウイルスベクターの調整はＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルスパッケージングミックス（インビトロジェン社）を用いて行った。
　１００ｍｍポリスチレン培養皿（ベクトンディッキンソン　アンド　カンパニー社、フランクリンレイク、ニュージャージー州、米国）上に５×１０4細胞／ｃｍ2のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を播種した。２４時間培養後、リポフェクタミン２０００キット及びＯＰＴＩ－ＭＥＭ（インビトロジェン社）を用い、ベクター（３μｇ／培養皿）を遺伝子導入して８時間３７℃にて培養した。その後、ベクターを含む培地を除去し、新鮮な培地を加えてさらに培養した。遺伝子導入してから７２時間後、遺伝子組み換えレンチウイルスを含む培養上清を回収した。大きな細胞の破片を取り除くために１７００×ｇ、５分間、培養上清を遠心分離し、細かい破片を取り除くために上清を０．４５μｍのフィルター（メルクミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）に通した。その後、上清を８７，０００×ｇ、４℃の条件にて１．５時間、超遠心機（ＣＰ８０β、日立工機社、東京、日本）にて超遠心処理を行って１００倍濃縮を行い、ヒトｉＰＳ細胞に感染させるために用いる濃縮ウイルスを得た。
（ｉｉ）レンチウイルス感染手順
　レンチウイルスを感染させる方法についてはＮａｋａｇａｗａらの方法（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ　Ｒｅｐ．２０１４；４：３５９４．）に改変を加えた手順で行った。以下にその手順を説明する。
　ヒトｉＰＳ細胞を６ウェル培養皿（ベクトンディッキンソン　アンド　カンパニー社）の１つのウェルにてコンフルエントになるまで培養し、ＣＴＫ溶液を用いて剥離した。小さな細胞凝集塊を１ｍＬの培地（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地）にて再懸濁し、１５ｍＬの遠沈管（ベクトンディッキンソン　アンド　カンパニー社）に移して５分間室温にて静置した。５００μＬの上清を除いた後、８μｇポリブレン（シグマアルドリッチ社）を含む４００μＬの新鮮な培地を添加した。１００μＬの濃縮ウイルス上清を添加し、細胞と混ぜ、３７℃で６時間保温した。６時間の保温の間、時々細胞とウイルス懸濁液を撹拌した。６ウェル培養皿の２つのウェルに播種したネオマイシン耐性フィーダー細胞ＳＬ１０（リプロセル社）の上に、レトロウイルスを感染させた細胞を播種し、３７℃で培養した。一晩培養した後、１ｍＬの培地を細胞に加え、感染後３６時間後に培地交換を行うことでウイルス粒子を洗い流した。感染４日後、Ｇ４１８硫酸塩（４００μｇ／ｍＬ）（インビトロジェン社）にて３６時間処理した。その後、Ｇ４１８硫酸塩を洗い流すためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて２回リンスし、さらに数日間培養した。必要に応じてＧ４１８硫酸塩で再処理を行った。
（バイオリアクターを用いた心筋分化誘導及び心筋細胞シートの調整）
　ｉＰＳ細胞の心筋分化誘導は、バイオリアクターシステム（エイブル社、日本）を用いて、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（Ｍａｔｓｕｕｒａ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃａｒｄｉａｃ　ｃｅｌｌ　ｓｈｅｅｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２　Ａｕｇ　２４；４２５（２）：３２１－７．、特許文献１参照）に従って実施した。細胞を播種する前に、温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社、東京、日本）、もしくは細胞培養皿（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州、米国）の表面をウシ胎児血清（ＦＢＳ）にて２時間コーティングした。ｉＰＳ細胞を心筋細胞へ分化誘導した後、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥離し、細胞凝集塊はストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を使用してシングルセルとし、１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて２．１×１０5細胞／ｃｍ2の細胞を培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ2、加湿雰囲気下で培養した。いくつかの実験では、ピューロマイシン（シグマアルドリッチ社、１．５μｇ／ｍＬ）で１日間処理し、ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、αＭＨＣ－ｐｕｒｏ／Ｒｅｘ１－ｎｅｏ）由来の心筋細胞を純化した。
　ｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞は培養皿にあらかじめ播種する技法（プレプレーティング法）によって得た。すなわち、ｉＰＳ細胞から心筋へと分化誘導後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いてコーティングしていない培養皿上に播種し、培養した。その後、培養皿に接着しなかった細胞を捨て、接着している細胞をＰＢＳ（－）で３回しっかりと洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて培養した。９９％以上の細胞がＳＭ２２陽性であり、ｃＴｎＴ陽性の割合は１％未満であった。継代２～３回行ったｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞を実験に使用した。
（２次元共培養試験）
　ヒトｉＰＳ細胞から心筋へ分化誘導した後の細胞は、２４ウェル培養皿（コーニング社）にて２．１×１０5細胞／ｃｍ2で播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＤを用いて３７℃、５％ＣＯ2、加湿雰囲気下にて２日間培養した。共培養実験を行う１日前、ｉＭａｔｒｉｘ５１１上で培養したｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔで剥離し、細胞凝集塊を形成させるためにＹ２７６３２（化合物一般名）（１０μＭ）（和光純薬工業社、日本）を含有するＡＫ０３培地を用い、シングルセル懸濁液をＥＺ　Ｓｐｈｅｒｅ（旭硝子社、東京、日本）上で１日間培養した。次の日、２４ウェルプレート上でＡＫ０３培地を用い、ｉＰＳ細胞の凝集塊５０個とｉＰＳ細胞由来の心筋細胞とを１日間、共培養した。続いて、３７℃（ＡＫ０３培地）、４２℃（ＡＫ０３培地）、３７℃（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、又は４２℃（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）の条件にて、それぞれ２日間培養を行った。
（バイオリアクターを用いた共培養試験）
　ＭＥＦ上で培養したｉＰＳ細胞はＡｃｃｕｍａｘ（イノベーティブセルテクノロジーズ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いてシングルセルとして剥離した。１００ｍＬバイオリアクターを用い、Ｙ２７６３２（１０μＭ）を含有したｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジー社、カナダ）培地を使用して、２×１０7個のｉＰＳ細胞（ＭＥＦを含む）と心筋分化誘導後１２日目の心筋細胞を共培養した（Ｄａｙ０）。翌日、Ｙ２７６３２を含まないｍＴｅＳＲ１培地へと交換した。共培養開始２日後（Ｄａｙ２）、ｍＴｅＳＲ１培地にて３７℃４８時間、又は４２℃６時間培養後に３７℃４２時間（合計４８時間）培養した。培養開始４日後（Ｄａｙ４）、それぞれの条件の細胞をＡｃｃｕｍａｘで剥離し、ＦＢＳをあらかじめコーティングしていた２４ウェル培養皿上に２．１×１０5細胞／ｃｍ2で再播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて３７℃で培養し、ＦＡＣＳ解析用に４％パラホルムアルデヒドで固定した。培養皿上の細胞は４２℃で再び２日間培養し（Ｄａｙ５からＤａｙ７）、その後、３７℃で１日間培養した（Ｄａｙ７からＤａｙ８）。
（免疫細胞化学）
　細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（Ｍａｔｓｕｕｒａ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃａｒｄｉａｃ　ｃｅｌｌ　ｓｈｅｅｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２　Ａｕｇ　２４；４２５（２）：３２１－７．）に従い免疫染色を行った。ＴＵＮＥＬ解析を行うために、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ　ＴＵＮＥＬ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８イメージングキット（ライフテクノロジー社、カリフォルニア州、米国）を用い、説明書に従って染色を行った。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（シグマアルドリッチ社）にて染色した。染色した試料は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（モレキュラーデバイス社、サニーベール、カリフォルニア州、米国）及びＭｅｔａｘｐｒｅｓｓ　ａｎｄ　ＡｃｕｉｔｙＸｐｒｅｓｓソフトウエア（モレキュラーデバイス社）を用いて撮影した。
（ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ－ＰＣＲ）
　全量ＲＮＡ抽出及びＲＴ－ＰＣＲはＭａｔｓｕｕｒａ　Ｋ．、　Ｋｏｄａｍａ　Ｆ．らの方法（Ｍａｔｓｕｕｒａ　Ｋ，Ｋｏｄａｍａ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｍａｉｎｉｎｇ　ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｉＰＳ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃａｒｄｉａｃ　ｃｅｌｌ　ｓｈｅｅｔ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ－ｆｒｅｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ　Ｐａｒｔ　Ｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４　Ｓｅｐ　２３．）に従い行った。使用したプライマーペアとＴａｑｍａｎ　ＭＧＢプローブは上記Ｍａｔｓｕｕｒａ　Ｋ、　Ｋｏｄａｍａ　Ｆ．らの方法と同一のものを使用した。具体的なプライマーの情報は表１に示し、いずれのプライマーもライフ　テクノロジーズ社より購入したものを使用した。定量的ＰＣＲは７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析した。相対的ｍＲＮＡ発現レベルはＧＡＰＤＨ、またはβ－アクチンｍＲＮＡ発現レベルの標準曲線を用いて計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（フローサイトメトリー解析）
　それぞれの条件の細胞凝集塊は、Ａｃｃｕｍａｘを用いて１０分間３７℃で剥離し、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（Ｍａｔｓｕｕｒａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃａｒｄｉａｃ　ｃｅｌｌ　ｓｈｅｅｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２　Ａｕｇ　２４；４２５（２）：３２１－７．）らの方法に従ってＴｒａ－１　６０または心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を染色した。細胞の割合はＧａｌｌｉｏｓ（ベックマンコールター社、ブレア、カリフォルニア州、米国）及びＣｅｌｌ　Ｑｕｅｓｔ　Ｐｒｏ　ｖｅｒｓｉｏｎ５．２ソフトウエアを用いて解析した。
（ＴＲＰＶ－１ノックダウン）
　ｉＭａｔｒｉｘ５１１上で培養したｉＰＳ細胞は、説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）　ＲＮＡｉ　Ｍａｘ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ライフ　テクノロジー社）を使用してＴＲＰＶ－１　ｓｉＲＮＡ（ライフ　テクノロジーズ社、カタログ番号：４３９２２４０）、及びネガティブコントロール（ライフ　テクノロジーズ社、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｎｏ．１　ｓｉＲＮＡ、製品番号：４３９０８４３)をトランスフェクトした。
（ＴＲＰＶ－１アゴニスト）
　ＴＲＰＶ－１のアゴニストとしては以下の試薬を用いた。
・カプサイシン（シグマアルドリッチ社）
・アルバニル（和光純薬工業社）
・ＯＬＤＡ（トクリス（Ｔｏｃｒｉｓ）社）
・溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）：エタノール（和光純薬工業社）
（統計解析）
　データは平均値±標準偏差で表している。２つのグループ間を比較した統計学的解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いて行った。複数グループ間の比較統計解析は一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ）を行い、続いてＤｕｎｎｅｔｔ検定にて比較を行った。ｐ値が０．０５より小さいものを統計学的に有意であるとした。
（実施例１）
　高い培養温度がｉＰＳ細胞へ傷害を与えるかどうかを確かめるために、まず初めにラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞を３７℃、４０℃、４１℃、又は４２℃の条件にて、１日間又は２日間培養した（図１Ａ、Ｂ）３７℃及び４０℃で培養したｉＰＳ細胞は培養時間に依存して有意に細胞数が増加した（３７℃；Ｄａｙ０；１０３１１±１３９５、Ｄａｙ１；２３７４８±１６１１、Ｄａｙ２；４１５６３±７６０、４０℃；Ｄａｙ１；２１７５８±３２１９、Ｄａｙ２；４０７０６±５９１）。興味深いことに、４１℃で培養したｉＰＳ細胞はＤａｙ１で細胞増殖が停止されており（１３２２８±２０３７）、Ｄａｙ２では細胞数が減少していた（４２７８±８４８）。しかしながら、４２℃で培養したｉＰＳ細胞は培養時間依存的に細胞数が有意に減少していた（Ｄａｙ１；２４５９±９３４、Ｄａｙ２；１２１６±２２９）。それに伴い、Ｏｃｔ４を発現するｉＰＳ細胞の数は３７℃において顕著に増加し（Ｄａｙ０；８８３４±２５４５、Ｄａｙ１；１７１３４±５７３１、Ｄａｙ２；３１１００±２８９４）、一方、４２℃で培養したＯｃｔ４を発現するｉＰＳ細胞の数は有意に減少した（Ｄａｙ１；２２７１±１２０８、Ｄａｙ２；９６１±２６）（図２）。４２℃での細胞数の減少に伴い、ＴＵＮＥＬ陽性の細胞が培養時間依存的に有意に増加した（Ｄａｙ０；３．４±０．２、Ｄａｙ１；９．４±４．１、Ｄａｙ２；３３．０±５．６）（図１Ｃ、Ｄ）。これらの結果から、４２℃という温度はヒトｉＰＳ細胞がアポトーシスを引き起こす重要な温度であることを示唆している。４２℃におけるこれらの細胞傷害効果は、フィーダー細胞無しで培養した異なったｉＰＳ細胞株（１２３１Ａ３株）においても同様の結果が観察された。
　次に、ｉＰＳ細胞が死滅する４２℃の最小限の培養時間を確かめた。ｉＰＳ細胞を４２℃で１時間、又は３時間培養し、その後、それぞれ培養開始から２４時間になるまで３７℃で培養した。３７℃で２４時間培養した時と同様、いずれの培養時間においてもＤａｙ０の細胞数と比較して細胞数は有意に増加した（培養開始前；１１８９７±２０７、３７℃２４時間；２５７２１±３４７７、４２℃１時間＋３７℃２３時間；２３３９１±８４２、４２℃３時間＋３７℃２１時間；２０８３４±１９４２）（図３Ａ、Ｂ）。４２℃で６時間及び９時間培養した場合、細胞数はほとんど変化しなかった（４２℃６時間＋３７℃１８時間；９９０９±１７１４、４２℃９時間＋３７℃１５時間；１１９３４±２０３２）。しかし、４２℃で１２時間以上培養した場合は、Ｄａｙ０と比較して有意に細胞数が減少していた（４２℃１２時間＋３７℃１２時間；５１７２±１１６８、４２℃２４時間；２１６０±３３２）。これらの結果から、４２℃で１２時間以上培養することがｉＰＳ細胞を減少させることに重要である可能性が示唆された（図３Ａ、Ｂ）。
　フィーダー細胞がｉＰＳ細胞との相互作用により細胞を生存させている可能性もあるので、その影響を確認するために、ＭＥＦ上で培養したｉＰＳ細胞に対しても４２℃の培養温度が効果的であるかどうかを確かめた。ＭＥＦ上で培養されたｉＰＳ細胞を４２℃で培養すると、コロニーを形成した多くの細胞はＤａｙ２までに死滅したが、コロニーの周囲の細胞は残ったままであった（図４Ａ）。共焦点ハイコンテント画像解析（Ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ）の結果より、Ｏｃｔ４陽性細胞の数は培養時間依存的に有意に減少したが（Ｄａｙ０；９９３１±２５０、Ｄａｙ１；５２５０±１８６６、Ｄａｙ２；７６７±２１５）、Ｏｃｔ４陰性細胞の数はＤａｙ２までほとんど変化しないことが明らかとなった（Ｄａｙ０；１１３２３±１８３５、Ｄａｙ１；１１８４３±９２５、Ｄａｙ２；１２９６７±１４４０）（図４Ａ、Ｂ）。これらのことは、４２℃はｉＰＳ細胞にとって細胞傷害性を与える温度であるが、フィーダー細胞のような分化した細胞には影響がないことを示唆している。細胞種間で細胞―細胞間相互作用に違いがある可能性があり、再生医療に用いられる生物工学的に作製される組織において、残存したｉＰＳ細胞が４２℃で除去されるかどうかを明らかにすることは重要である。ｉＰＳ細胞の凝集塊をｉＰＳ細胞由来の心筋細胞と１日間共培養すると、ｉＰＳ細胞は心筋細胞と生着した（Ｄａｙ０；７５３１±１２２９）（図４Ｃ、Ｄ）。これらの共培養した細胞を、３７℃でさらに２日間、ｉＰＳ細胞用培地（ＡＫ０３）中、又は心筋細胞用培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）中で培養すると、いずれの条件においても顕著に増殖してコロニーのサイズが増大し、コロニー周辺に心筋細胞が配置するようになった（Ｄａｙ２（ＡＫ０３）；１５０６５±２１６６、Ｄａｙ２（ＤＭＥＭ）；１６９８４±３５２０）（図４Ｃ、Ｄ）。一方、前述の共培養した細胞を４２℃で２日間培養したものは、Ｏｃｔ４陽性細胞の数が減少し、コロニー中のｉＰＳ細胞は、まばらな状態で存在していた（Ｄａｙ２（ＡＫ０３）；７９０±６６、Ｄａｙ２（ＤＭＥＭ）；２７３０±４２１）（図４Ｃ、Ｄ）。これらの結果により、ｉＰＳ細胞は、様々なタイプの細胞と共培養条件しても、４２℃で培養することにより除去できることが示唆された。
（実施例２）
　本発明のｉＰＳ細胞を減少させる方法を再生医療の用途で適用するには、４２℃の培養条件が、生物工学的に作製する組織に用いる分化した細胞に対して、どのような影響を与えるかを確かめる必要がある。ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞シートは、主に心筋細胞、線維芽細胞等から構成されているので、４２℃培養条件が、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞及び線維芽細胞にどのように影響を及ぼすのかを確認した。
　ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を３７℃又は４２℃の条件で培養したところ、心筋細胞は自立拍動を示し、３７℃及び４２℃で２日間培養したいずれの条件においても多くの細胞は生き残ったままであった。３７℃及び４２℃で１日（Ｄａｙ１）又は２日（Ｄａｙ２）培養した場合において、ｃＴｎＴ陽性及びＮｋｘ２．５陽性心筋細胞の数はほとんど変わらなかった（ｃＴｎＴ陽性細胞：３７℃（Ｄａｙ１）；１１０８４±１８１０、３７℃（Ｄａｙ２）；１２６２５±７６８、４２℃（Ｄａｙ１）；１２３４３±１０５、４２℃（Ｄａｙ２）；９９１７±２５２、Ｎｋｘ２．５陽性細胞：３７℃（Ｄａｙ１）；１１２４９±１７８３、３７℃（Ｄａｙ２）；１２２７２±６０７、４２℃（Ｄａｙ１）；１３４３２±１０５、４２℃（Ｄａｙ２）；１０５８６±３０９）（図５Ａ、Ｂ）。これらの結果は、心筋細胞が４２℃の培養条件に対しても耐性であることを示唆している。
　次に、ｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞に対する４２℃培養条件の影響を調べた。ｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞を３７℃で培養すると、ビメンチン陽性又はＳＭ２２陽性ｉＰＳ細胞由来線維芽細胞は、Ｄａｙ０と比較して有意に増加した（ビメンチン陽性：Ｄａｙ０；１０４５１±８３５、Ｄａｙ１；１２６８６±５９３、Ｄａｙ２；１６３５３±８６８、ＳＭ２２陽性：Ｄａｙ０；１０５５３±８７６、Ｄａｙ１；１２７７７±６１５、Ｄａｙ２；１６７５２±９４０）（図５Ｃ、Ｄ）。一方、ｉＰＳ細胞由来線維芽細胞の数は、４２℃で培養するとＤａｙ１において有意に増加したが（ビメンチン陽性；１１８１８±６８９、ＳＭ２２陽性；１１８９５±６９３）（図５Ｃ、Ｄ）、Ｄａｙ２では有意差は生じなかった（ビメンチン陽性；１１５９２±２９３、ＳＭ２２陽性；１１７３８±２７８）（図５Ｃ、Ｄ）。これらのことより、ｉＰＳ細胞由来線維芽細胞もまた４２℃に対して耐性である可能性を示唆している。
　心筋及び細胞外マトリックス遺伝子のｍＲＮＡの発現解析を行い、４２℃という温度が、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞及び線維芽細胞の遺伝子発現においてどのような影響を与えるかを調べた。心筋や線維芽細胞を含むｉＰＳ細胞を４２℃で培養した場合、ＭＹＬ２、ＭＹＬ７、Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢのｍＲＮＡ発現は４８時間まで変化しなかったが、ＴＮＮＴ２の発現量は４８時間で有意に増加していた（図６Ａ）。このことは、４２℃培養条件においても転写活性は維持されていることを示唆していた。これらの結果とは逆に、４２℃で培養すると、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞中のＬＩＮ２８の発現量は有意に減少し（図６Ｂ）、４２℃で４８時間培養した細胞のＬＩＮ２８の発現量はｉＰＳ細胞の発現量の約０．３％であった（図６Ｃ）。これらのことから、４２℃での培養はｉＰＳ細胞由来の細胞に残存したｉＰＳ細胞を減少させるための方法として極めて有用であることを示している。
　ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞に対する４２℃での培養はほとんど影響を与えないが、４２℃培養法が再生医療に用いられる生体工学的組織の構築においてどのような影響を与えるかを明らかにすることは重要である。心筋分化誘導後のｉＰＳ細胞由来心筋細胞は、３７℃４日間温度応答性培養皿上で培養すると自立拍動することが確認され、その培養温度を低下させると単層細胞シートが作製された（図６Ｄ）。興味深いことに、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を４２℃で２日間（Ｄａｙ１からＤａｙ３）又は３日間（Ｄａｙ１からＤａｙ４）培養した後に培養温度を下げても細胞シートが得られた（図６Ｄ）。これは、細胞－細胞間ジャンクションタンパク質、基底膜タンパク質及び細胞外マトリックスを含む生物工学的に作製される組織を構築するために重要な様々な構成要素が、４２℃で培養したとしても維持されることを示唆している。しかしながら、４２℃で３日間（Ｄａｙ１からＤａｙ４）培養した場合は、心筋拍動が時々弱くなることがあった。一方、４２℃で２日間（Ｄａｙ１からＤａｙ３）培養した場合は、心筋の拍動に影響は与えなかった。これらのことから、細胞シート作製過程における４２℃２日間の培養は、残存しているｉＰＳ細胞を除去し、心筋細胞の生存率に影響しない最適な条件である可能性を示唆している。
（実施例３）
（ヒト心筋組織におけるＴＲＰＶ－１介在型残存ｉＰＳ細胞の除去）
　高温条件は、温度感受性ＴＲＰチャンネルであるａｃｔｉｖａｔｅｓ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｖａｎｉｌｌｏｉｄ　１（ＴＲＰＶ－１）を活性化することが知られている。我々は、次にｉＰＳ細胞やｉＰＳ細胞由来心筋細胞におけるＴＲＰＶ－１の発現を明らかにした。ｉＰＳ細胞のＴＲＰＶ－１　ｍＲＮＡの発現量は、４２℃で９時間培養した場合に有意に上昇し、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＴＲＰＶ－１　ｍＲＮＡの発現は４２℃で１２時間培養後に上昇した（図７Ａ）。一方、ＴＲＰＶ－１の発現量は、ベースライン（４２℃培養前）のｉＰＳ細胞由来心筋細胞及び４２℃で２４時間培養したｉＰＳ細胞由来心筋細胞よりも、ｉＰＳ細胞の発現量の方が有意に高かった（図７Ｂ）。これらの結果は、４２℃培養によるＴＲＰＶ－１の活性の違いが、４２℃培養におけるｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞由来心筋細胞に対する除去効果の違いを説明しているのかもしれない。
　ｉＰＳ細胞に対する４２℃培養の細胞傷害効果が、ＴＲＰＶ－１の相互作用によるものかを確かめるため、ｉＰＳ細胞に、ＴＲＰＶ－１に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。４２℃培養に付随して起こるＴＲＰＶ－１発現量の上昇が、ＴＲＰＶ－１ノックダウンによって阻害されたことが確認でき（図７Ｃ）、そのことと一致して、４２℃培養後のｉＰＳ細胞の細胞数の減少もＴＲＰＶ－１　ｓｉＲＮＡのトランスフェクトにより阻害されていた（図７Ｄ、Ｅ）。これらの結果から、ＴＲＰＶ－１は４２℃培養におけるｉＰＳ細胞の除去に重要な役割を果たしていることが示唆された。
　最後に、ＴＲＰＶ－１の薬理学的活性がｉＰＳ細胞には細胞傷害効果を与え、心筋細胞には効果を示さないかどうかを確かめた。フィーダーレスのｉＰＳ細胞を、カプサイシン（図８）、ＯＬＤＡ（図９）、アルバニル（図１０）、を含むＴＲＰＶ－１アゴニストと一緒に培養したところ、カプサイシンを用いた場合は細胞数が濃度依存的に有意に減少し（図８Ａ、Ｂ）、他のＴＲＰＶ－１アゴニストでの処理もまたｉＰＳ細胞に対して細胞傷害活性を示した（図９、図１０）。逆に、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を、ｉＰＳ細胞では有毒である濃度（２００μＭ及び１００μＭ）のカプサイシンを含む培地で培養したところ、心筋細胞の自立拍動は維持されたままであり、Ｎｋｘ２．５陽性細胞の数は、溶媒で培養した時と変わらなかった（図８Ｃ、Ｄ）。これらのことから、ＴＲＰＶ－１のアゴニストは心筋細胞の生存率に影響を与えることなく、ｉＰＳ細胞を減少させるのに有効であることが示唆された。
　本発明に示される方法であれば、多能性幹細胞が含まれる細胞集団を分化誘導して得られた細胞集団から、未分化の多能性幹細胞を減少させることができる。このような細胞集団は、再生医療等の移植材として使用する際の腫瘍化を形成するリスクが低くすることが可能となり、産業上有用である。また、実験等の用途で使用される多能性幹細胞由来の分化細胞集団から、未分化の多能性幹細胞を簡便かつ安価に除去することが出来きるようになり、有用である。

Claims (15)

  1. 　多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、４０．５℃以上の温度で培養し、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞を減少させる方法。
  2. 　前記温度が、４１℃～４３℃である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記温度で培養する時間が、１０時間～７２時間の範囲である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記分化細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、壁細胞及び／又は血管内皮細胞を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の方法によって得られた、前記多能性幹細胞を減少させた細胞集団。
  7. 　多能性幹細胞と、多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団から、多能性幹細胞を減少させる方法であって、
    　前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞に発現するＴＲＰＶ－１を活性化する工程、を含むことを特徴とする方法。
  8. 　前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程が、４０．５℃以上の温度で培養して前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程である請求項７に記載の方法。
  9. 　前記温度が、４１℃～４３℃である請求項８に記載の方法。
  10. 　前記温度で培養して前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程の時間が、１０時間～７２時間の範囲である請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　前記ＴＲＰＶ－１を活性化する工程が、ＴＲＰＶ－１に対するアゴニストを添加する工程である請求項７に記載の方法。
  12. 　前記アゴニストが、カプサイシン、Ｎ－ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２－ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ－１抗体のからなる群から選択された１又は２以上のアゴニストである請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞である請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記分化細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、壁細胞及び／又は血管内皮細胞を含む請求項７～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法によって得られた、前記多能性幹細胞を減少させた細胞集団。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018225705A1 (ja) 2017-06-05 2018-12-13 テルモ株式会社 細胞培養物の製造方法
WO2020027278A1 (ja) * 2018-08-01 2020-02-06 国立大学法人大阪大学 心筋細胞の製造方法
WO2020067435A1 (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞のシート化方法
WO2020067438A1 (ja) 2018-09-27 2020-04-02 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞のシート化方法
WO2020067436A1 (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞の移植片形成方法
JP2020162441A (ja) * 2019-03-28 2020-10-08 株式会社ニチレイ 保存液
US11395863B2 (en) 2016-11-01 2022-07-26 Terumo Kabushiki Kaisha Modification method for sheet-shaped cell culture

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133945A1 (ja) * 2011-03-30 2012-10-04 学校法人東京女子医科大学 胚性幹細胞から心筋シートを製造する方法
WO2013137491A1 (ja) * 2012-03-15 2013-09-19 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞から心筋および血管系混合細胞群を製造する方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6791756B2 (ja) * 2014-01-21 2020-11-25 ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インクＴｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｉｎｃ． 多能性幹細胞の選択的な阻害のための方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133945A1 (ja) * 2011-03-30 2012-10-04 学校法人東京女子医科大学 胚性幹細胞から心筋シートを製造する方法
WO2013137491A1 (ja) * 2012-03-15 2013-09-19 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞から心筋および血管系混合細胞群を製造する方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATSUURA KATSUHISA: "TRPV-1-mediated elimination of residual iPS cells in bioengineered cardiac cell sheet tissues", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 6, 18 February 2016 (2016-02-18), pages 21747, XP055367698 *
QI YAN ET AL.: "Role of TRPV1 in the differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes", PLOS ONE, vol. 10, no. 7, 24 July 2015 (2015-07-24), pages e0133211, XP055367697 *
See also references of EP3346002A4 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11395863B2 (en) 2016-11-01 2022-07-26 Terumo Kabushiki Kaisha Modification method for sheet-shaped cell culture
WO2018225705A1 (ja) 2017-06-05 2018-12-13 テルモ株式会社 細胞培養物の製造方法
WO2020027278A1 (ja) * 2018-08-01 2020-02-06 国立大学法人大阪大学 心筋細胞の製造方法
WO2020067435A1 (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞のシート化方法
WO2020067438A1 (ja) 2018-09-27 2020-04-02 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞のシート化方法
WO2020067436A1 (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞の移植片形成方法
JPWO2020067438A1 (ja) * 2018-09-27 2021-08-30 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞のシート化方法
JPWO2020067436A1 (ja) * 2018-09-27 2021-08-30 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞の移植片形成方法
JPWO2020067435A1 (ja) * 2018-09-27 2021-09-09 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞由来細胞のシート化方法
JP2020162441A (ja) * 2019-03-28 2020-10-08 株式会社ニチレイ 保存液

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