JP5688970B2 - 多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、種々の細胞への分化能力を保持した多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の製造方法に関する。

生物体のすべての細胞系列に分化可能な多能性幹細胞は、任意のタイプの細胞に分化し、また、任意のタイプの組織又は器官等を生みだす潜在的能力を有している。そのため、当該細胞を使用して、生物体において失われた細胞を再生し補うという新しい治療法（再生医療）に応用することが期待されている。更に、発生学、分子生物学、薬学分野における研究ツールとしても利用可能性を有している。

多能性幹細胞として、胚盤胞と呼ばれる段階の初期胚のうちの内部細胞塊から樹立される細胞株である胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）が知られている。しかしながら、ヒト胚を破壊して作製されるヒトＥＳ細胞は倫理的観点からの反対も多く、その研究が制限されるケースも少なくない。

これらＥＳ細胞の問題点を解消するため、胚を使用することなく体細胞に人為的に遺伝子を導入して誘導される細胞株である多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞：例えば非特許文献１）が開発された。当該細胞は細胞の全能性の獲得や維持に関与する遺伝子を人為的に体細胞に導入することにより作製される。現在、その作製手法、利用方法に関して、盛んに研究が進められている。

前記の非特許文献１にはＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ及びＫＬＦ４の４種のポリペプチドをコードする遺伝子を導入してヒトｉＰＳ細胞を作製する方法が開示されている。また、他の研究者からはＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の４種のポリペプチドをコードする遺伝子の導入によってヒトｉＰＳ細胞を作製したとの報告がなされている（非特許文献２）。しかしこれらの遺伝子を導入されたすべての体細胞がｉＰＳ細胞に誘導されることはなく、実際にはその一部のみ（総細胞数の０．０２％以下）がｉＰＳ細胞へと誘導されるに過ぎない。この効率を向上させるため、ＤＮＡのメチル化を阻害する薬剤を培地に添加することが試みられている（非特許文献３）。また、ｃ−ＭＹＣはがん遺伝子であり、医療への応用を行う際には、導入された細胞のがん化のリスクが不可避なため、ｃ−ＭＹＣを除いてｉＰＳ細胞を誘導する試みがなされているが、その場合、更に誘導効率は低下する（総細胞数の０．００１％以下）。このように、未だｉＰＳ細胞作製技術は確立したとは言えない状況にある。

セル（Ｃｅｌｌ）、第１３１巻、８６１−８７２頁、２００７年 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３１８巻、１９１７−１９２０頁、２００７年 ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７０５６、２００８年

多能性幹細胞の利用を図るためには、当該細胞を効率よく作製する手法の開発が急務である。本発明の目的は、多能性幹細胞の誘導効率を向上させ、当該細胞の研究ならびに利用を促進することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、核の初期化に関与する因子（本明細書中、核初期化因子とも言う）と接触させた体細胞を培養する際、当該細胞を栄養飢餓条件で処理した場合にＥＳ細胞様の細胞、すなわち多能性を保持した幹細胞が高頻度で誘導され、多能性幹細胞が高効率で安定して製造できることを見出し、本発明を完成させた。また、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下に核初期化因子をコードする遺伝子を保持するレトロウイルスベクターを体細胞に導入した場合、従来のポリブレンを使用する方法に比べ、多能性幹細胞の誘導効率が向上し、高頻度で多能性幹細胞を取得できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造方法に関し、核初期化因子と接触させた体細胞を栄養飢餓条件で処理する工程及び／又は細胞周期を停止させる薬剤で処理する工程を包含することを特徴とする。第１の発明の態様としては、栄養飢餓条件で処理する工程が、タンパク質飢餓条件で処理する工程である製造方法が提供され、該タンパク質飢餓条件で処理する工程が、低タンパク質濃度である培地、例えばタンパク質濃度が０〜０．５％である培地を用いて核初期化因子と接触させた体細胞を培養する工程である製造方法が提供される。また、核初期化因子と接触させた体細胞が、核初期化因子を添加された培養培地で培養された体細胞、核初期化因子を導入された体細胞、核初期化因子をコードする遺伝子が導入された体細胞及び薬剤により核初期化因子の発現を誘導させた体細胞、からなる群より選択される体細胞である製造方法が提供される。更に、核初期化因子がＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８からなる群より選択される核初期化因子である製造方法も提供される。

本発明の第２の発明は、下記工程を包含することを特徴とする多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造方法に関する：
（１）核初期化因子を体細胞と接触させる工程、及び
（２）上記（１）で得られる体細胞を栄養飢餓条件で処理する工程及び／又は細胞周期を停止させる薬剤で処理する工程。

第２の発明の態様としては、上記工程（１）が、核初期化因子の培養培地への添加、核初期化因子又は当該因子をコードする遺伝子の体細胞への導入及び薬剤による体細胞における当該因子の発現誘導、からなる群から選択される操作により実施される製造方法が提供される。また、工程（２）の栄養飢餓条件で処理する工程がタンパク質飢餓条件で処理する工程である製造方法が提供され、該タンパク質飢餓条件で処理する工程が、低タンパク質濃度である培地、例えばタンパク質濃度が０〜０．５％（ｗ／ｖ）である培地を用いた培養により実施される製造方法が提供される。また、該タンパク質飢餓条件で処理する工程において、用いる培地に細胞死抑制剤を含有せしめることを特徴とする製造方法も提供される。更に、核初期化因子がＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８からなる群より選択される核初期化因子である製造方法も提供される。

本発明の第３の発明は、第１又は第２の発明により多能性幹細胞を含有する細胞集団を製造する工程、及び得られた細胞集団より多能性幹細胞を単離する工程を包含する多能性幹細胞の製造方法が提供される。

本発明の第４の発明は、多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造方法に関し、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下に核初期化因子をコードする遺伝子を保持するレトロウイルスベクターを体細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする。第４の発明の態様としては、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質が、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、前記のポリペプチドのフラグメント、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン及び前記物質由来のレトロウイルスに結合部位を有する機能性物質からなる群より選択される機能性物質である製造方法が提供される。また、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質がフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域を有するポリペプチドである製造方法も提供される。更に、核初期化因子をコードする遺伝子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８からなる群より選択される核初期化因子をコードする遺伝子である製造方法も提供される。

本発明の第５の発明は、第４の発明により多能性幹細胞を含有する細胞集団を製造する工程、及び得られた細胞集団より多能性幹細胞を単離する工程を包含する多能性幹細胞の製造方法が提供される。

本発明により得られた多能性幹細胞は、所望の細胞への分化能を有しており、また、前記多能性幹細胞を分化させて得られる分化細胞は生体内で高い生着性を示すことから、本発明の方法は、基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。

本発明により樹立されたｉＰＳ細胞クローンであるクローン＃１及びクローン＃３、ならびにポジティブコントロールの２５３Ｇ１及びネガティブコントロールのヒト成人皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）のＥＳ細胞のマーカー遺伝子発現パターンを示す電気泳動写真である。 樹立されたｉＰＳ細胞クローンのテラトーマ形成能を示す三胚葉由来の細胞写真である。 樹立されたｉＰＳ細胞クローンのＥＢを介した分化誘導による多分化能を示す写真である。

以下に本発明について詳細に説明する。

本発明の方法において、体細胞とは、生物を構成する細胞のうち、生殖細胞以外の細胞のことを示す。これら体細胞は、核初期化因子を接触させる事により、リプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）が起こり、全能性を獲得することができる。

体細胞に核初期化因子を接触させる工程とは、例えば、当該因子のポリペプチドを体細胞と接触している培養培地に添加する方法（例えば、セル ステム セル（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ），第４巻、４７２−４７６頁、２００９年）、当該因子のポリペプチドを体細胞に導入する方法、当該因子をコードする遺伝子を体細胞に導入する方法、もしくは化学物質等（例えば、５−アザ−２’デオキシシチジン、ＢＩＸ−０１２９４、ＰＤ０３２５９０１、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、バルプロ酸等）の薬剤により体細胞において内在性の当該因子の発現を誘導する方法、又は前記のいずれかの方法の組み合わせ等により実施することができる。

前記の核初期化因子をコードする遺伝子を体細胞に導入する方法としては、例えば核初期化因子をコードする遺伝子を組み込んだベクターを体細胞に導入する方法が例示される。当該ベクターには特に限定はなく、公知のベクターより適切なものを選択して使用することができる。例えば、ウイルスベクターを使用する方法、又は非ウイルスベクターを使用する方法のいずれもが本発明に使用できる。これらのベクターの詳細についてはすでに多くの文献が公表されており、これら多くの文献より適宜選択して使用すればよい。

上記で使用するウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用できる。特に好適には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際に、遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。遺伝子導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えばフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えばレトロネクチン（登録商標、ＣＨ−２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。更に、本発明を特に限定するものではないが、前記の物質は特にレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを使用する遺伝子導入に好適である。核初期化因子をコードする遺伝子は１種類又は複数種類のウイルスベクターに組み込んで使用することができる。２種類以上のレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを用いる場合、特に複数回のウイルス感染を行う場合には、前記の遺伝子導入効率を向上させる物質、特にフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントを使用することが好適である。

従来、多能性幹細胞の誘導を目的としたレトロウイルスベクターによる遺伝子導入では、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレンが使用されてきた。本発明者らは、ポリブレンを使用せず、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下に、レトロウイルスベクターを使用して核初期化因子をコードする遺伝子を体細胞に導入した場合には、ポリブレンを使用した場合に比較して多能性幹細胞の誘導効率が向上する結果、高頻度で多能性幹細胞を取得できることを初めて見出した。すなわち、本発明の他の態様として、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下に核初期化因子をコードする遺伝子を保持するレトロウイルスベクターを体細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造方法が提供される。
上記のとおり、本態様ではレンチウイルスベクター又はシュードタイプベクターを包含するレトロウイルスベクターを使用することができる。

また、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質としては、当該活性を有する物質であれば特に問題はないが、例えば、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、前記のポリペプチドのフラグメント、ポリリジン又はＤＥＡＥ−デキストラン等がある。更に、前記物質由来のレトロウイルスに結合部位を有する機能性物質を本発明に使用することができる。フィブロネクチンのフラグメントとしては分子内にヘパリン−ＩＩ結合領域を有するものが好適であり、そのようなフラグメントは例えば国際公開第９７／１８３１８号パンフレットにも記載されている。ヘパリン−ＩＩ結合領域を有するフィブロネクチンのフラグメントとしてはレトロネクチン（登録商標、ＣＨ−２９６、タカラバイオ社製）が例示される。またこれらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、又は該機能性物質の誘導体等を使用することができる。

更に、レトロウイルスに結合する活性とともに標的細胞、すなわち遺伝子導入しようとする体細胞への結合活性を有する機能性物質を併用してもよく、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質及び標的細胞結合活性を有する機能性物質を併用してもよい。標的細胞結合活性を有する機能性物質にも、特に限定はないが、例えば、標的細胞に結合するリガンドを有する物質が挙げられる。該リガンドとしては細胞接着性のタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等）もしくはそのフラグメント、ホルモン、サイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、糖タンパク質もしくは糖脂質由来の糖鎖、あるいは標的細胞の代謝物などが挙げられる。

本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコもしくはバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用される。

本発明の方法によれば、低濃度のウイルスを使用しても従来法より高効率で多能性幹細胞を取得できることから、使用ウイルス量を大幅に削減することが可能である。

また、下記実施例に示される通り、本発明の方法によれば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４の３種類の遺伝子のみを体細胞に導入した場合でも従来法より高効率で多能性幹細胞を取得することができる。

上記で使用する非ウイルスベクターとしては特に限定はないが、例えば、プラスミドベクターが挙げられ、これをリポソーム、もしくはリガンド−ポリリジンなどの担体を使用して導入する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はパーティクルガン法などで導入することができる。

核初期化因子をコードする遺伝子は、通常、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにウイルスベクター又は非ウイルスベクター等に挿入して使用することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、核初期化因子のうち、１種類の因子をコードする遺伝子のみを１つのベクターに組み込んでもよいが、１つのベクターに複数の因子をコードする遺伝子を組み込んで使用してもよい。更に、当該因子をコードする遺伝子に加えて、当該遺伝子の導入を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。

本発明に使用される、核初期化因子としては、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、又はＬＩＮ２８等が知られており、通常、これらの複数、好ましくは２〜３種以上を体細胞に接触させる。各種の生物（例えばヒト、マウス）由来の因子のアミノ酸配列情報、当該因子をコードする遺伝子の塩基配列情報はデータベース上に公開されている。前記の因子をコードする遺伝子はデータベースより入手できる配列情報をもとに単離し、もしくは人工的に合成し、取得することができる。更にこれらの遺伝子を導入した形質転換体を培養して得られる培養物より前記の因子（ポリペプチド）を取得することもできる。

以下、核初期化因子をコードする遺伝子を使用して多能性幹細胞を作製する方法について説明する。

（１）核初期化因子を体細胞と接触させる工程
本発明に使用される体細胞に特に限定はなく、任意の体細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、又は神経幹細胞等の体細胞を使用することができる。前記の体細胞は生体より採取されたもの、又は細胞株として樹立されたもののどちらでもよい。作製された多能性幹細胞もしくは当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身から採取された体細胞より多能性幹細胞を誘導することが好ましい。

核初期化因子をコードする遺伝子は、前記のとおり公知のベクターを使用して体細胞へ導入され、導入された遺伝子より前記の因子が発現される。こうして核初期化因子と体細胞との接触が達成される。

核初期化因子をコードする遺伝子を組み込んだベクターを複数使用して遺伝子導入を実施する場合、各ベクターを順次体細胞に導入してもよく、又はベクターの混合物を作製して同時に体細胞に導入してもよい。

（２）核初期化因子と接触させた体細胞を栄養飢餓条件で処理する工程
核初期化因子を接触させた体細胞、例えば、上記（１）に記載の工程において得られた体細胞を栄養飢餓条件にさらすことにより、多能性幹細胞が誘導・成育される頻度又は収量を向上させることができ、多能性幹細胞を高効率で製造することができる。ここで、栄養飢餓条件にさらすとは、培地中の細胞の栄養源となる成分のうち特定の成分、例えばアミノ酸、タンパク質、糖質、脂質、有機酸、又はビタミン類等を含まないか又はその濃度が低減された培地（以下、栄養飢餓培地と記載することがある）中で細胞を培養することを意味する。特に本発明を限定するものではないが、本発明ではタンパク質を含まないか又はその濃度が低減された培地、例えばタンパク質濃度が０〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲にある培地（以下、タンパク質飢餓培地と記載することがある）、好適には０〜０．３％（ｗ／ｖ）の範囲にある培地、更に好適には０〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲にある培地中で細胞を培養する操作が例示される。タンパク質飢餓培地中のタンパク質濃度は公知の方法、例えばローリー法、ブラッドフォード法又はビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により、標準タンパク質（例えばウシ血清アルブミン）換算値として測定することができる。

タンパク質飢餓培地の調製に使用される基本培地は、アミノ酸、糖類もしくは有機酸のようなエネルギー源、ビタミン類、ｐＨ調整のための緩衝成分又は無機塩類等を含有するものであり、例えばＤＭＥＭのような公知の培地もしくはその改変物、又はその他の市販の培地を使用することもできる。ＥＳ細胞もしくはｉＰＳ細胞用培地に通常添加されている多能性を維持させるための成分、例えば白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１：ＴＧＦ−β１）、もしくは繊毛様神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ：ＣＮＴＦ）等の増殖因子類又はその他のサイトカイン類を添加してもよい。更に、血清又は血漿を添加することもできる。なお、前記の各種成分は培地の最終タンパク質の総量が０〜０．５％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度の範囲、好適には０〜０．３％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度の範囲、更に好適には０〜０．１％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度の範囲となるよう培地に添加される。

タンパク質以外の成分のうち特定の成分を含まないか又はその濃度が低減された栄養飢餓培地を使用する場合、上記のタンパク質飢餓培地の場合と同様に、当該成分を含まないか又はその濃度を通常の培地よりも低減させるほか、公知の培地作製方法に従って培地を調製し、核初期化因子と接触させた体細胞の培養に供すればよい。なお、当該成分は単一の成分でもよく、複数の成分でもよい。また、タンパク質飢餓培地において他の成分を除くか又は低減させてもよい。

栄養飢餓条件での処理は、核初期化因子を接触させた体細胞、例えば、上記（１）に記載の工程において得られた体細胞を、通常のフィーダー細胞との共培養に供した後、培地を栄養飢餓培地に交換して培養を継続することによって実施することができる。この培地交換は一度の操作で行ってもよく、数回に分けて栄養成分の含有濃度を段階的に低減させて栄養飢餓培地への置換を実施してもよい。その後、またフィーダー細胞との共培養を行う培地に交換して培養を継続してもよい。また、上記（１）に記載の工程において得られた体細胞を、初めから栄養飢餓培地を用いて培養を行い、その後フィーダー細胞との共培養を行う培地に交換して培養を継続してもよい。栄養飢餓培地での処理は前記の培地交換により実施する処理に限定されるものではなく、実質的に同等の条件で処理可能な他の方法であってもよい、例えば、タンパク質分解酵素を培地に添加してタンパク質濃度を低減させる方法、又はリパーゼを添加して脂質濃度を低減させる方法、等の操作により栄養飢餓状態を達成してもよい。

なお、ここで言うフィーダー細胞とは、誘導される多能性幹細胞の生育に有効な成分を供給しうるものであれば特に限定はないが、線維芽細胞（例えば胚線維芽細胞）等の細胞が好適に使用される。

上記（１）に記載の工程において得られた体細胞をフィーダー細胞上に播種する細胞数（本明細書において播種数ともいう）は、多能性幹細胞が効率よく誘導される細胞数であれば、特に限定はなく、通常ｃ−ＭＹＣ遺伝子を導入しない場合は、約９，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の細胞数が播種される。本発明においては、当該体細胞の播種する細胞数を少なくすることにより、更に多能性幹細胞を効率よく誘導することが可能である。例えば、１００〜５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の細胞数がよく、好適には２５０〜５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の細胞数である。

上記フィーダー細胞に代えて細胞外マトリックスタンパク質又はその断片等を使用することもできる。該タンパク質又はその断片は、例えば培養用容器等、適切な固相に固定化した状態で使用されることが好ましい。

すなわち、本発明の多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造方法は、核初期化因子と接触させた体細胞の培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において細胞を栄養飢餓条件で処理する工程を包含することを特徴とする。核初期化因子と接触させた体細胞の培養の一部工程において、栄養飢餓条件での培養を含むものであれば本発明に包含される。本発明の好適な態様においては、核初期化因子と接触させた体細胞の培養工程の期間において少なくとも１２時間以上、好ましくは１８時間以上、体細胞が栄養飢餓条件にさらされる。当該処理の時間に特に上限はないが、細胞の生存性の観点からは、８日以内、好ましくは６日以内の期間処理される。

また、本発明において、上記栄養飢餓条件で処理する工程の代わりに、細胞周期を停止させる薬剤で処理する工程を用いてもよい。使用する細胞周期を停止させる薬剤は特に限定はないが、ブチロラクトンＩ、オロモウシン、ロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ、ＤＲＢ（５，６−ジクロロベンゾイミダゾール １−β−Ｄ−リボフラノシド）、ＳＵ９５１６、ＮＵ６１０２、ＮＵ６１４０、ＪＮＪ−７７０６６２１、ＣＤＫ１／２阻害剤ＩＩ、フラボピリドール、ＰＤ０３３２９９１、ＣＤＫ２阻害ペプチド（ＴＡＴ−ＬＦＧ及びＴＡＴ−ＬＤＬ）などのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、マイトマイシン、シスプラチン、メソトレキセート、５−フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、塩酸イリノテカン、アドリアマイシン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、パクリタキセル、ブレオマイシンなどの抗がん剤、ＤＨＣＰ（４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン）もしくはその誘導体、又はラパマイシンなどを用いることができる。細胞周期を停止させる薬剤の使用量は、使用する薬剤により適宜決定すればよい。

更に、本発明において、上記栄養飢餓条件で処理する工程及び細胞周期を停止させる薬剤で処理する工程の両方を行ってもよい。

また、培養期間の一部において、細胞死抑制剤を使用してもよい。細胞死抑制剤としては、特に限定はないが、Ｙ−２７６３２［（Ｒ）（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキシアミドジヒドロクロリド］などを用いることができる。

栄養飢餓条件、細胞周期を停止される薬剤での処理条件、又は通常の条件を問わず、核初期化因子と接触させた体細胞の培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養条件を採用できる。例えば、湿度９０〜９８％、ＣＯ_２濃度３〜７％、３０〜４０℃での培養が例示される。適切な時間間隔で新鮮な培地への交換が行われてもよいことは言うまでもない。

上記記載の方法により得られた多能性幹細胞は、その形態上の特徴に基づいてそれ以外の細胞と区別することが可能である。また、アルカリフォスファターゼ、段階特異的胎児抗原（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＳＳＥＡ、例えばＳＳＥＡ−４等）、腫瘍拒絶抗原（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ：ＴＲＡ）−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＯＣＴ４又はＮＡＮＯＧ等の未分化状態の指標となるマーカー分子の発現に基づいて確認することもできる。前記の分子の発現は、例えば前記の分子を認識する抗体を用いて確認することができる。アルカリフォスファターゼに関してはその酵素活性に基づいて発現を確認することもできる。

更に、上記の操作により得られる細胞集団より多能性幹細胞を単離し、他の細胞と分離された多能性幹細胞を取得することができる。こうして単離された多能性幹細胞は、公知の方法により細胞株として樹立することができる。すなわち、本発明の態様の一つとして、本発明の多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造方法の工程及び得られた細胞集団より多能性幹細胞を単離する工程を包含する多能性幹細胞の製造方法が挙げられる。

以上、本発明により従来の多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）の製造方法と比較して、高い頻度で多能性幹細胞を誘導、成育させることができ、多能性幹細胞の収量を向上させた製造が可能となる。

以下に実施例をもって本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。

調製例１ 核初期化因子遺伝子のクローニング
（１）ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＳＯＸ２及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＫＬＦ４プラスミドの構築
ＮＣＢＩデータベース登録番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）ＮＭ＿００３１０６．２の配列情報より、配列表の配列番号１及び２に記載の塩基配列を有するＳＯＸ２遺伝子増幅用合成プライマーｈＳＯＸ２−Ｆ及びｈＳＯＸ２−Ｒをそれぞれ合成した。また、ＮＣＢＩデータベース登録番号ＮＭ＿００４２３５．３の配列情報より、配列表の配列番号３及び４に記載の塩基配列を有するＫＬＦ４遺伝子増幅用合成プライマーｈＫＬＦ４−Ｆ及びｈＫＬＦ４−Ｒをそれぞれ合成した。

ＨｕｍａｎＢｒａｉｎＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社製）より合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ｈＳＯＸ２−Ｆ及びｈＳＯＸ２−Ｒのプライマー対、ｈＫＬＦ４−Ｆ及びｈＫＬＦ４−Ｒのプライマー対のそれぞれとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＭＡＸ ＰｒｅＭｉｘ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲを行なった。反応終了後、反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＯＸ２遺伝子については約１ｋｂｐ、ＫＬＦ４遺伝子については約１．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを抽出、精製した。次に、得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）及びＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で消化し、精製することによりＳＯＸ２フラグメント及びＫＬＦ４フラグメントを得た。

ＳＯＸ２フラグメント及びＫＬＦ４フラグメントは、同じくＮｏｔＩ−ＳａｌＩで消化したｐＤＯＮ−ＡＩ−２ Ｎｅｏ ＤＮＡ（タカラバイオ社製）とそれぞれ混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。この反応産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）を形質転換し、形質転換体を得た。

形質転換体より調製したプラスミドの中から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを選択し、組換えプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＳＯＸ２及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ｎｅｏ−ＫＬＦ４を得た。このｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＳＯＸ２は、ＮＭ＿００３１０６．２に含まれるＳＯＸ２ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミドである。またｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＫＬＦ４はＮＭ＿００４２３５．３に含まれるＫＬＦ４ポリペプチドをコードする配列を含むプラスミドである。

（２）ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＯＣＴ４、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＬＩＮ２８及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＮＡＮＯＧプラスミドの構築
ＮＣＢＩデータベース登録番号ＮＭ＿００２７０１．４、ＮＭ＿０２４６７４．４、ＮＭ＿０２４８６５．２の配列情報をもとに、それぞれＯＣＴ４、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧの各ポリペプチドをコードする人工合成遺伝子を合成した。前記の人工合成遺伝子は、各ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの塩基配列に加え、５’末端にＣＤＳの直前の３塩基の配列及び制限酵素ＮｏｔＩの認識配列、３’末端に制限酵素ＳａｌＩの認識配列をそれぞれ有している。３種の人工合成遺伝子は、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩの認識配列を利用して、調製例１−（１）と同様にｐＤＯＮ−ＡＩ−２ Ｎｅｏに連結し、各遺伝子が挿入された組換えプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＯＣＴ４、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＬＩＮ２８及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＮＡＮＯＧを得た。

調製例２ レトロウイルスベクターの調製
（１）ｐＤＯＮ−ＡＩ−２、ｐＤＯＮ−５プラスミドベクターへの移し替え
調製例１により調製したｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＯＣＴ４、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＳＯＸ２、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＫＬＦ４、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＬＩＮ２８、及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ＮＡＮＯＧをそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｌＩにより処理後、１．０％アガロース電気泳動に供して生じたフラグメントをゲル上で分離した。ゲルより各ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むフラグメントを抽出・精製後、このフラグメントのそれぞれを同じくＮｏｔＩ−ＳａｌＩで消化したｐＤＯＮ−５ ＤＮＡ（タカラバイオ社製）と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。こうして作製された組換えプラスミドより各遺伝子が正しく挿入されたものを選択し、それぞれｐＤＯＮ−５−ＯＣＴ４、ｐＤＯＮ−５−ＳＯＸ２、ｐＤＯＮ−５−ＫＬＦ４、ｐＤＯＮ−５−ＬＩＮ２８、及びｐＤＯＮ−５−ＮＡＮＯＧと命名した。

ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＬＩＮ２８の３遺伝子については同様の操作でこれらをｐＤＯＮ−ＡＩ−２ ＤＮＡ（タカラバイオ社製）にそれぞれ挿入した組換えプラスミドを作成し、それぞれｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＯＣＴ４、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＫＬＦ４、及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＬＩＮ２８と命名した。

（２）ＩＲＥＳフラグメントの調製
配列番号５及び６で示すＩＲＥＳ配列増幅用合成プライマーＩＲＥＳ−Ｆ−ＳａｌＩ及びＩＲＥＳ−Ｒ−ＮｏｔＩを合成した。ＩＲＥＳ配列を増幅するために、鋳型ＤＮＡとしてｐＩＲＥＳ２−ＺｓＧｒｅｅｎ１（クロンテック社製）、プライマーとしてＩＲＥＳ−Ｆ−ＳａｌＩ及びＩＲＥＳ−Ｒ−ＮｏｔＩを用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲを行なった。反応終了後、反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、約０．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを抽出、精製した。次に、このＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化し、精製することによりＩＲＥＳフラグメントを得た。

（３）ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、及びＮＡＮＯＧフラグメントの調製
上記調製例２−（１）で調製したｐＤＯＮ−５−ＳＯＸ２、ｐＤＯＮ−５−ＬＩＮ２８、及びｐＤＯＮ−５−ＮＡＮＯＧプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｐａＩにより処理後、１．０％アガロース電気泳動に供して生じたフラグメントをゲル上で分離した。ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、又はＮＡＮＯＧの各遺伝子を含むフラグメント（それぞれＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、及びＮＡＮＯＧフラグメントと記載する）をゲルより抽出・精製した。

（４）ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧ、ｐＤＯＮ−５−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２、ｐＤＯＮ−５−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧ、及びｐＤＯＮ−５−ＮＡＮＯＧ−ＩＲ−ＬＩＮ２８プラスミドの構築
上記調製例２−（１）で調製したｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＯＣＴ４、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＬＩＮ２８、ｐＤＯＮ−５−ＯＣＴ４、ｐＤＯＮ−５−ＬＩＮ２８、及びｐＤＯＮ−５−ＮＡＮＯＧを制限酵素ＳａｌＩ及びＨｐａＩで消化したもの、（２）で調製したＩＲＥＳフラグメント及び（３）で調製したＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧフラグメントを表１の組み合わせで混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。

こうして作製された組換えプラスミドより各遺伝子が正しく挿入されたものを選択し、それぞれｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧ、ｐＤＯＮ−５−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２、ｐＤＯＮ−５−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧ又はｐＤＯＮ−５−ＮＡＮＯＧ−ＩＲ−ＬＩＮ２８と命名した。ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２はｐＤＯＮ−ＡＩ−２に、その５’端側から順にＯＣＴ４遺伝子、ＩＲＥＳ、ＳＯＸ２遺伝子が挿入されたプラスミドである。ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧはｐＤＯＮ−ＡＩ−２に、その５’端側から順に、ＬＩＮ２８遺伝子、ＩＲＥＳ及びＮＡＮＯＧ遺伝子が挿入されたプラスミドである。ｐＤＯＮ−５−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２はｐＤＯＮ−５に、その５’端側から順にＯＣＴ４遺伝子、ＩＲＥＳ及びＳＯＸ２遺伝子が挿入されたプラスミドである。ｐＤＯＮ−５−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧはｐＤＯＮ−５に、その５’端側から順にＬＩＮ２８遺伝子、ＩＲＥＳ及びＮＡＮＯＧ遺伝子が挿入されたプラスミドである。ｐＤＯＮ−５−ＮＡＮＯＧ−ＩＲ−ＬＩＮ２８はｐＤＯＮ−５に、その５’端側から順にＮＡＮＯＧ遺伝子、ＩＲＥＳ及びＬＩＮ２８遺伝子が挿入されたプラスミドである。

（５）レトロウイルスベクターの産生
Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭ［１０％牛胎児血清（インビトロジェン社製）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）含有Ｄ−ＭＥＭ（シグマ社製）］に懸濁し、その４ｍＬを６ｃｍコラーゲンコートディッシュ（イワキ社製）に播種して３７℃のＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。

５００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）に１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３（タカラバイオ社製）を混合し、室温で５分放置後、２μｇのｐＧＰプラスミド（タカラバイオ社製）、１μｇのｐＥ−Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ社製）及び２μｇの調製例２−（１）及び（４）で調製した各組換えプラスミドをそれぞれ加えて混合し、更に１５分間室温で放置した。この混合液を上記のＧ３Ｔ−ｈｉ細胞に添加して培養を継続し、２４時間後に４ｍＬの１０Ｆ−ＤＭＥＭに交換した。更に２４時間培養を継続した後、ウイルスを含む培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過してレトロウイルスベクターを含むウイルス液を調製した。また、更に１０Ｆ−ＤＭＥＭを添加して培養を継続し、２４時間後にウイルスを含む培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過して調製したウイルス液も実験に使用した。ウイルス液は調製後すぐに使用しない場合は−８０℃で凍結保存して、使用時に解凍して用いた。表２にそれぞれの組換えプラスミドから得たレトロウイルスベクターの名称を示す。

調製例３ 蛍光タンパク質発現レトロウイルスベクターの調製
（１）プラスミドベクターの調製
ｐＡｃＧＦＰ1（クロンテック社製）よりＡｃＧＦＰ1遺伝子をｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ（タカラバイオ社製）に移し替え、ｐＤＯＮ−ＡＩ−ＡｃＧＦＰ１を調製した。同様に、ｐｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）よりｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ遺伝子をｐＤＯＮ−ＡＩ−２ Ｎｅｏ ＤＮＡに移し替え、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを調製した。

（２）レトロウイルスベクターの産生
調製例２−（５）と同様の方法により、ｐＤＯＮ−ＡＩ−ＡｃＧＦＰ１からはレトロウイルスベクターＤＯＮ−ａｍ−ＡｃＧＦＰ１を、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２−Ｎｅｏ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙからはレトロウイルスベクターＤＯＮＡＩ２−ａｍ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを調製した。

調製例４ マウスＥＳ細胞用培地の調製
（１）１００×ＬＩＦの調製
１０^６ｕｎｉｔ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ；ＥＳＧＲＯ、インビトロジェン社製）０．５ｍＬに対して、ノックアウトＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、インビトロジェン社製）８．５ｍＬ、ノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製）１．５ｍＬを添加して１００×ＬＩＦを調製した。

（２）マウスＥＳ細胞用培地の調製
ノックアウトＤＭＥＭ ４２５ｍＬに対して、ノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製）７５ｍｌ、１００×非必須アミノ酸混合物（ＮＥＡＡ ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｌｏｎｚａ社製）５ｍＬ、１００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｌｏｎｚａ社製）５ｍＬ、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ社製）５ｍＬ、５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社製）０．９１ｍＬ、及び（１）で調製した１００×ＬＩＦ ５ｍＬを添加することによりマウスＥＳ細胞用培地を調製した。

実施例１ 多能性幹細胞の誘導
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
ノントリートメント６穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）の各ウェルに２０〜２５μｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）で希釈したレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）溶液を２ｍＬずつ添加し、４℃で一晩もしくは室温で２時間固定化を行った。その後、各ウェルより溶液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄の後、各実験に供するまで４℃で保存した。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
調製例２で調製したウイルス液７００μＬずつを表３の組み合わせで（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウェルにそれぞれ添加し、３２℃、２，０００×ｇで２時間遠心した。

その後、各ウェルより上清を除去してＰＢＳで１回洗浄後、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト成人皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を２ｍＬずつ各ウェルに播種した。３２℃、５００×ｇで１０分間遠心した後、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入は培養１日目に行った。調製例２により調製したウイルス液各７００μＬずつを表３の組み合わせで混合し、終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレン（ヘキサジメトリン・ブロミド；アルドリッチ社製）を添加してレトロウイルスベクター混合液を調製した。（２）で培養していた培養プレートより上清を除去し、このレトロウイルスベクター混合液を添加した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで４時間培養後、１０Ｆ−ＤＭＥＭを２ｍＬ添加した。更に２日間培養後、上清を除去し１０Ｆ−ＤＭＥＭを２ｍＬ添加して培養を継続した。

（４）フィーダー細胞上への播種
１０ｃｍシャーレ（イワキ社製）に終濃度１ｍｇ／ｍＬのゼラチン（シグマ社製）水溶液を添加し室温１時間あるいは４℃で一晩固定化後、洗浄してゼラチン固定化シャーレを作製した。ここに終濃度１２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク社製）で処理したＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）を１×１０^６ｃｅｌｌｓずつ播種し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで終夜培養することによりフィーダー細胞を調製した。

（３）で作製した培養７日目の遺伝子導入細胞を回収し、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭに懸濁した。この懸濁液１０ｍＬを前記のフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。

（５）タンパク質飢餓あるいはメチル化阻害剤処理
培養８日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）上清を除去し、タンパク質飢餓処理条件では、血清が含まれていないＤＭＥＭ（０Ｆ−ＤＭＥＭ：１０Ｆ−ＤＭＥＭより牛胎児血清を除去したもの）を１０ｍＬ添加した。一方、メチル化阻害剤処理条件では、ＥＳ細胞用培地［１％ペニシリン／ストレプトマイシン、４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含む霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社製）］を１０ｍＬ添加し、更に終濃度１μＭとなるように５−アザ−２’−デオキシシチジン（シグマ社製）を添加した。なお、実施例１−（２）に記載の条件Ａ、Ｂ、Ｃにそれぞれの処理を行った。

タンパク質飢餓処理あるいはメチル化阻害処理開始から２日後（培養開始から１０日目）に上清を除去し、ＥＳ細胞用培地を各シャーレに１０ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間、１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に条件Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれのタンパク質飢餓処理あるいはメチル化阻害剤処理の各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表４に示す。

表４に示すように、いずれのレトロウイルスベクターの組み合わせにおいても、メチル化阻害剤処理した群よりタンパク質飢餓処理した群の方が多能性幹細胞コロニーがはるかに多かった。すなわち、多能性幹細胞誘導の過程において、タンパク質飢餓処理を行うことで、飛躍的に多能性幹細胞の誘導効率が高まることが明らかとなった。

また、タンパク質飢餓処理した群では、いずれの条件においても培養１６日目より多能性幹細胞コロニーが確認できたのに対し、メチル化阻害剤処理した群では、培養２６日目に多能性幹細胞コロニーが確認できた。すなわち、タンパク質飢餓処理することで、多能性幹細胞の誘導期間も大幅に短縮できることが明らかとなった。

（７）培地に含有されるタンパク質の濃度の測定
上記の実施例において使用された１０Ｆ−ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ及びＥＳ細胞用培地について、それぞれに含有されるタンパク質の濃度をブラッドフォード法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ；ピアス社製）を使用して測定した。この結果、１０Ｆ−ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ及びＥＳ細胞用培地にはそれぞれ５．５ｍｇ／ｍＬ、０．６３３ｍｇ／ｍＬ、２４．１ｍｇ／ｍＬ（すべてウシ血清アルブミン相当）のタンパク質が含有されていることが確認された。

実施例２ タンパク質飢餓条件の検討
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例１−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。ただし、細胞播種後の遠心は行っていない。なお、レトロウイルスベクターはＤＯＮ５−ａｍ−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２、ＤＯＮ５−ａｍ−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧ及びＤＯＮＡＩ２−ａｍ−ＫＬＦ４の組み合わせでそれぞれ行った

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入は培養１日目に、実施例２−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例１−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。ただし、フィーダー細胞（マイトマイシンＣ処理したＳＮＬ７６／７細胞もしくはＳＴＯ細胞（大日本製薬社製））は、１．５×１０^６ｃｅｌｌｓずつ播種した。また、遺伝子導入細胞は２．５×１０^５ｃｅｌｌｓずつ播種した。

（５）タンパク質飢餓処理
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）にシャーレから上清を除去し、表５に示す条件により細胞を処理した。表中、０．５Ｆ−ＤＭＥＭは０．５％血清を含むＤＭＥＭを示す。なお、ＥＳ細胞用培地に交換後は、各条件とも培養２８日目まで培養を継続し、この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表６に示す。

表６に示すように、コントロール（無処理）よりもタンパク質飢餓処理した群の方が多能性幹細胞コロニーがはるかに多かった。すなわち、多能性幹細胞誘導の過程において、タンパク質飢餓処理を行うことで、飛躍的に多能性幹細胞の誘導効率が高まることが明らかとなった。また、タンパク質飢餓処理期間中に細胞死を抑制する物質の１つであるＹ２７６３２［（Ｒ）（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキシアミドジヒドロクロリド］を添加することで、安定して多能性幹細胞コロニーが得られることが明らかとなった。

実施例３ 細胞周期停止剤の検討
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例１−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。ただし、プレートの洗浄は１．５％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳで行い、細胞播種後の遠心は行わなかった。なお、レトロウイルスベクターはＤＯＮ５−ａｍ−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２、ＤＯＮ５−ａｍ−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧ、又はＤＯＮ５−ａｍ−ＫＬＦ４の組み合わせで行った。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入は培養１日目に、実施例３−（２）と同様の方法により行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養７日目に実施例１−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。

（５）細胞周期停止剤処理
培養８日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）にシャーレから上清を除去し、ＥＳ細胞用培地に交換後、それぞれ終濃度０．１μＭ、０．５μＭ、又は２μＭとなるようにプルバラノールＡ（シグマ社製）を添加した群、終濃度１０μＭ、１００μＭとなるようにヒドロキシウレア（シグマ社製）を添加した群を設定した。なお、コントロールには薬剤を添加しなかった。２日間培養後、ＥＳ細胞用培地に交換し、培養２２日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２２日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表７に示す。

表７に示すように、コントロール（無処理）よりも細胞周期停止剤処理した群の方が多能性幹細胞コロニーがはるかに多かった。すなわち、多能性幹細胞誘導の過程において、細胞周期を停止させる処理を行うことで、飛躍的に多能性幹細胞の誘導効率が高まることが明らかとなった。

実施例４ 遺伝子導入細胞の播種数の検討
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例２−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。なお、レトロウイルスベクターはＤＯＮ５−ａｍ−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２、ＤＯＮ５−ａｍ−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧ、又はＤＯＮ５−ａｍ−ＫＬＦ４の組み合わせで行った

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入では、培養１日目に、ウイルス液７００μＬずつを実施例４−（２）の組み合わせで混合し、終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレンを添加してレトロウイルスベクター混合液を調製後、細胞を培養していたプレートより上清を除去し、このレトロウイルスベクター混合液を添加した。1日培養後、上清を除去し１０Ｆ−ＤＭＥＭを２ｍＬ添加して培養を継続した。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例２−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。ただし、遺伝子導入細胞は０．６２×１０^５、１．２５×１０^５、２．５×１０^５、又は５×１０^５ｃｅｌｌｓずつ播種する群を設定した。

（５）タンパク質飢餓処理
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）にシャーレより上清を除去し、０Ｆ−ＤＭＥＭを１０ｍＬ添加した。２日間培養後、上清を除去してＥＳ細胞用培地を各シャーレに９ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。また、ｉＰＳ細胞誘導効率（％）を、（ｉＰＳ細胞コロニー数÷遺伝子導入細胞播種数）×１００として算出した。その結果を表８に示す。

表８に示すように、遺伝子導入細胞の播種数が少ないほど多能性幹細胞コロニーの誘導効率が高かった。すなわち、多能性幹細胞誘導の過程において、遺伝子導入細胞の播種数を減少させることで多能性幹細胞の誘導効率が高まることが明らかとなった。

実施例５ タンパク質飢餓条件の検討−２
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例４−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入は培養１日目に、実施例５−（２）と同様の方法により行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例２−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。ただし、培養容器は６穴培養プレート（コーニング社製）を使用し、フィーダー細胞は、２．５×１０^５ｃｅｌｌｓずつ播種した。また、遺伝子導入細胞は２×１０^４ｃｅｌｌｓずつ播種した。

（５）タンパク質飢餓処理
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に６穴培養プレートから上清を除去し、表９に示す条件により細胞を処理した。なお、ＥＳ細胞用培地に交換後は、各条件とも培養２８日目まで培養を継続し、この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表１０に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表１０に示すように、コントロール（無処理）よりもタンパク質飢餓処理した群の方が多能性幹細胞コロニーがはるかに多かった。すなわち、多能性幹細胞誘導の過程において、タンパク質飢餓処理を行うことで、飛躍的に多能性幹細胞の誘導効率が高まることが明らかとなった。また、タンパク質飢餓処理期間中に細胞死を抑制する物質の１つであるＹ２７６３２［（Ｒ）（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキシアミドジヒドロクロリド］を添加することで、安定して多能性幹細胞コロニーが得られることが明らかとなった。

実施例６ 遺伝子導入細胞の播種数の検討−２
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例４−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入は培養１日目に、実施例６−（２）と同様の方法により行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。ただし、遺伝子導入細胞は２．５×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、４×１０^４、又は８×１０^４ｃｅｌｌｓずつ播種する群を設定した。

（５）タンパク質飢餓処理
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に６穴培養プレートから上清を除去し、０Ｆ−ＤＭＥＭあるいはＥＳ細胞用培地（コントロール）を２ｍＬ添加した。２日間培養後、上清を除去してＥＳ細胞用培地を各ウェルに２ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。また、ｉＰＳ細胞誘導効率（％）を、（ｉＰＳ細胞コロニー数÷遺伝子導入細胞播種数）×１００として算出した。その結果を表１１及び表１２に示す。なお、表１１はコントロール群の結果、表１２はタンパク質飢餓群の結果を示す。

表１１及び１２に示すように、コントロール（無処理）よりもタンパク質飢餓処理した群の方が、また遺伝子導入細胞の播種数が少ないほど多能性幹細胞コロニーの誘導効率が高かった。すなわち、多能性幹細胞誘導の過程において、タンパク質飢餓処理を行い、遺伝子導入細胞の播種数を減少させることで多能性幹細胞の誘導効率が高まることが明らかとなった。

実施例７ 遺伝子導入方法の検討
レトロウイルスベクターによる遺伝子導入に関して、レトロネクチンあるいはポリブレンを用いて１回あるいは２回導入を行い、多能性幹細胞の誘導を行い比較した。設定した条件を表１３に示す。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
レトロネクチンによる遺伝子導入に関しては実施例４−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。ポリブレンによる遺伝子導入に関しては、以下の方法で行った。すなわち、１日前に６穴培養プレートに、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト皮膚線維芽細胞を２ｍＬずつ各ウェルに播種し１日培養した。調製例２により調製したウイルス液７００μＬずつを表３の条件Ｃの組み合わせで混合し、終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレンを添加してレトロウイルスベクター混合液を調製後、細胞を培養していたプレートより上清を除去し、このレトロウイルスベクター混合液を添加し、培養を開始した（培養０日目）。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入を行う群に関しては培養１日目に、レトロネクチンによる遺伝子導入は実施例４−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。ポリブレンによる遺伝子導入に関しては、実施例７−（２）のポリブレンによる遺伝子導入と同様の方法で行った。すなわち、細胞を培養していたプレートより上清を除去し、同様に調製したレトロウイルスベクター混合液を添加し培養を継続した。1日培養後、上清を除去し１０Ｆ−ＤＭＥＭを２ｍＬ添加して培養を継続した。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。ただし、遺伝子導入細胞は１．７５×１０^４ｃｅｌｌｓずつ播種した。

（５）タンパク質飢餓処理
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に６穴培養プレートから上清を除去し、０Ｆ−ＤＭＥＭあるいはＥＳ細胞用培地（タンパク質飢餓処理なし群）を２ｍＬ添加した。２日間培養後、上清を除去してＥＳ細胞用培地を各ウェルに２ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表１４に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表１４に示すように、レトロネクチンによる遺伝子導入を行うことで、ポリブレンによる遺伝子導入を行うより、はるかに多能性幹細胞の誘導効率が高かった。また、タンパク質飢餓処理を行うことで、更に誘導効率を高めることが明らかとなった。

実施例８ 多重遺伝子導入時における遺伝子導入方法の比較
多能性幹細胞誘導時には、複数のレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行うことがある。そこで、複数のレトロウイルスベクターによる遺伝子導入を行う際の方法としてレトロネクチンあるいはポリブレンによる遺伝子導入効率を比較した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。ただし、ノントリートメント２４穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）を用い、レトロネクチン溶液は各ウェルに５００μＬずつ添加した。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
レトロネクチンによる遺伝子導入に関しては実施例３−（２）と同様の方法により行った。ただし、レトロウイルスベクターはＤＯＮ−ａｍ−ＡｃＧＦＰ１とＤＯＮＡＩ２−ａｍ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの組み合わせで、ウイルス液２５０μＬずつを混合して行った。更に、１０Ｆ−ＤＭＥＭで５０倍希釈したウイルス液２５０μＬを混合する群も設定した。また、細胞は４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培地に懸濁し、５００μＬずつ各ウェルに添加した。

同じレトロウイルスベクターの組み合わせにより、ポリブレンによる遺伝子導入は、実施例７−（２）のポリブレンによる遺伝子導入と同様の方法で行った。ただし、細胞は４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培地に懸濁し、５００μＬずつ２４穴培養プレート（コーニング社製）の各ウェルに添加した。また、ウイルス液は２５０μＬずつ混合し、終濃度４μｇ／ｍＬとなるようにポリブレンを添加してレトロウイルスベクター混合液を調製した。１日培養後に、上清を除去し１０Ｆ−ＤＭＥＭを５００μＬ添加して培養を継続した。

（３）遺伝子導入効率の測定
遺伝子導入操作から３日後、細胞を回収し、フローサイトメーター（ＣｙｔｏｍｉｃｓＦＣ５００、ベックマン・コールター社製）により、ＡｃＧＦＰ１陽性及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ陽性細胞を測定した。その結果を表１５に示す。表１５はそれぞれの遺伝子導入方法における両陽性細胞の割合を示す。

表１５に示すように、２種類のレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行う際に、レトロネクチンにより遺伝子導入を行うことで、ポリブレンにより遺伝子導入を行う場合と比べて、両方の遺伝子が導入された細胞の割合がはるかに多かった。すなわち、多能性幹細胞を誘導する際には、２種類以上のレトロウイルスベクターを使用する場合が多いため、レトロネクチンを用いる事で、複数の遺伝子が導入される割合が高くなり、結果として多能性幹細胞の誘導効率を高めるものと考えられた。また、レトロネクチンによる遺伝子導入を行う際、ウイルス液を希釈して使用することにより、更に遺伝子導入効率を向上させ、その結果、更に多能性幹細胞の誘導効率を高めることが可能であると考えられた。

実施例９ 多重遺伝子導入時における遺伝子導入方法の比較−２
レトロネクチンあるいはポリブレンによる複数のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入効率を更に比較した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例８−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
実施例８−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。ただし、ウイルス液の希釈は１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈、又は１００倍希釈する群を設定した。

（３）遺伝子導入効率の測定
実施例８−（３）と同様の方法により遺伝子導入効率を測定した。ただし、フローサイトメーターによる測定は遺伝子導入操作から５日後に行った。結果を表１６に示す。表１６はそれぞれの遺伝子導入方法における両陽性細胞の割合を示す。

表１６に示すように、２種類のレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行う際に、レトロネクチンの存在下で遺伝子導入を行うことで、ポリブレンにより遺伝子導入を行う場合と比べて、両方の遺伝子が導入された細胞の割合がはるかに多かった。すなわち、多能性幹細胞を誘導する際には、２種類以上のレトロウイルスベクターを使用する場合が多いため、レトロネクチンを用いる事で、複数の遺伝子が導入される割合が高くなり、結果として多能性幹細胞の誘導効率を高めるものと考えられた。また、レトロネクチンによる遺伝子導入を行う際、ウイルス液を希釈して使用することにより、更に遺伝子導入効率を向上させ、その結果、更に多能性幹細胞の誘導効率を高めることが可能であると考えられた。

実施例１０ 遺伝子導入方法の検討−２
レトロウイルスベクターによる遺伝子導入に関して、レトロネクチンあるいはポリブレンのそれぞれを使用する条件で、更にレトロウイルスの量を変化させて多能性幹細胞の誘導を行い比較した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例７−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。ただし、ウイルス液は１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈、又は１００倍希釈する群を設定した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例７−（３）と同様の方法により２回目の遺伝子導入を行った。ただしウイルス希釈群については実施例１０−（２）と同様に希釈したウイルス液を用いた。

（４）フィーダー細胞上への播種
実施例７−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し、培養を継続した。ただし、遺伝子導入細胞は２×１０^４ｃｅｌｌｓずつ播種した。

（５）培養
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に６穴培養プレートから上清を除去し、ＥＳ細胞用培地を２ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表１７に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表１７に示すように、レトロネクチンによる遺伝子導入を行うことで、ポリブレンによる遺伝子導入を行うより、はるかに多能性幹細胞の誘導効率が高かった。また、レトロネクチンによる遺伝子導入を行う際、ウイルス液を希釈して使用することにより、更に遺伝子導入効率を向上させ、その結果、更に多能性幹細胞の誘導効率を高めることが明らかとなった。

実施例１１ 遺伝子導入方法の検討−３
導入する遺伝子をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４の３種類のみとして、実施例１０と同様の試験を行った。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例１０−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。ただし、レトロウイルスベクターは、調製例２で調製したレトロウイルスベクターＤＯＮ５−ａｍ−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２及びＤＯＮ５−ａｍ−ＫＬＦ４を使用した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例１０−（３）と同様の方法により２回目の遺伝子導入を行った。ただし使用したレトロウイルスベクターは実施例１１−（２）と同様である。

（４）フィーダー細胞上への播種
実施例１０−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し、培養を継続した。

（５）培養
実施例１０−（５）と同様の方法により行った。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表１８に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表１８に示すように、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４の３種類の遺伝子のみを導入した場合でも、レトロネクチンによる遺伝子導入を行うことで、ポリブレンによる遺伝子導入を行うより、はるかに多能性幹細胞の誘導効率が高かった。また、レトロネクチンによる遺伝子導入を行う際、ウイルス液を希釈して使用することにより、更に遺伝子導入効率を向上させ、その結果、更に多能性幹細胞の誘導効率が高くなることは、３遺伝子のみを導入した場合でも同様であった。

実施例１２ 多重遺伝子導入時における遺伝子導入方法の比較−３
レトロネクチンあるいはポリブレンによる複数のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入効率を更に比較した。４名の異なるドナーに由来するヒト成人皮膚線維芽細胞を標的とし、多能性幹細胞誘導実験と同様に遺伝子導入を２回実施する方法を用いて蛍光タンパク質遺伝子の導入を行った。本実施例中、細胞Ａは２８歳白人女性由来、細胞Ｂは４２歳白人女性由来、細胞Ｃは５１歳白人女性由来、細胞Ｄは４８歳黒人女性由来（いずれもＬｏｎｚａ社製）を示す。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例８−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例８−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。ただし、ウイルス液の希釈は１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈、１００倍希釈、又は１０００倍希釈する群を設定した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入は培養１日目に、実施例１２−（２）と同様の方法により行った。ただし、ポリブレンによる遺伝子導入において、培養２日目に上清を除去し、１０Ｆ−ＤＭＥＭを５００μＬ添加して培養を継続した。

（４）遺伝子導入効率の測定
実施例８−（３）と同様の方法により、培養６日目に遺伝子導入効率を測定した。結果を表１９に示す。表１９はそれぞれの遺伝子導入方法における各細胞での両陽性細胞の割合を示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表１９に示すように、レトロネクチンを用いた遺伝子導入において、ヒト成人皮膚線維芽細胞のドナーによる導入効率への影響はほとんど見られないことが初めて明らかとなった。すなわち、レトロネクチンを用いて多能性幹細胞を誘導する際にも、ドナーの由来に関わらず安定した遺伝子導入が可能であると考えられる。

２種類のレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行う際に、レトロネクチン存在下で遺伝子導入を行うことで、ポリブレンによる遺伝子導入を行う場合と比べて、両方の遺伝子が導入された細胞の割合が多かった。すなわち、多能性幹細胞を誘導する際には、２種類以上のレトロウイルスベクターを使用する場合が多いことから、当該誘導の際にレトロネクチンを用いる事で、複数の遺伝子が導入される割合が高くなり、結果として多能性幹細胞の誘導効率を高めることが可能であると考えられた。

また、表１９に示すように、レトロネクチンによる遺伝子導入を行う際、ウイルス液を１００倍あるいは１０００倍希釈して使用しても、高い効率での遺伝子導入が可能となる。すなわち、多能性幹細胞を誘導する際にレトロネクチンを用いる事で、低力価あるいは少量のウイルスでも高い誘導効率で多能性幹細胞を誘導することが可能であることが示唆された。

実施例１３ ドナー差の検討
レトロウイルスベクターによる遺伝子導入に関して、実施例１２と同じ４種のヒト成人皮膚線維芽細胞を標的とし、レトロネクチンあるいはポリブレンを用いて多能性幹細胞の誘導を行い比較した。設定した条件を表２０に示す。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。ただしノントリートメント１２穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）を使用し、レトロネクチン溶液を各ウェルに１ｍＬずつ添加した。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例７−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。ただし、ポリブレンによる遺伝子導入では細胞培養用１２穴プレート（コーニング社製）を使用した。ウイルス液は、３種のベクターを等量ずつ混合した溶液を１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈し、各ウェルに１ｍＬずつ添加した。５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト成人皮膚線維芽細胞についても１ｍＬずつ各ウェルに播種した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例１３−（２）と同様の方法により、培養１日目に２回目の遺伝子導入を行った。ただし、ポリブレンによる遺伝子導入において、培養２日目に上清を除去し、１０Ｆ−ＤＭＥＭを１ｍＬずつ添加して培養を継続した。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法により、遺伝子導入された細胞をフィーダー細胞上に播種し培養を継続した。

（５）培養
実施例１０−（５）と同様の方法により、フィーダー細胞上での培養を培養２５日目まで行った。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２５日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表２１に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表２１に示すように、全ての条件において多能性幹細胞の形成が認められ、いずれのドナー由来の細胞においても、レトロネクチンによる遺伝子導入を行うことで、ポリブレンによる遺伝子導入を行うよりも、はるかに多能性幹細胞の誘導効率が高かった。

実施例１４ 導入遺伝子の検討
レトロウイルスベクターによる遺伝子導入に関して、レトロネクチンを使用し、導入する遺伝子の組み合わせを変化させて、多能性幹細胞の誘導を行い比較した。設定した組み合わせを表２２に示す。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１３−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例４−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。ウイルス液は、表２２にある組み合わせでそれぞれの溶液を等量ずつ混合し、１０Ｆ−ＤＭＥＭで１００倍希釈し、各ウェルに１ｍＬずつ添加した。５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト成人皮膚線維芽細胞についても１ｍＬずつ各ウェルに播種した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例１４−（２）と同様の方法により、培養１日目に２回目の遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法により、遺伝子導入された細胞をフィーダー細胞上に播種し培養を継続した。

（５）培養
実施例１０−（５）と同様の方法により、フィーダー細胞上での培養を培養２５日目まで行った。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２５日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表２３に示す。なお、表中の数字はＮ＝４の平均値を示す。

表２３に示すように、種々の遺伝子の組み合わせにおいても、レトロネクチンを使用することで多能性幹細胞の形成が認められた。

実施例１５ 多能性幹細胞クローンの樹立
レトロネクチンを用いた遺伝子導入により誘導した多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニーをピックアップし、各種アッセイに用いるためのｉＰＳ細胞クローンを樹立した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例２−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例２−（３）と同様の方法により２回目の遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
実施例２−（４）と同様の方法により、遺伝子導入された細胞のフィーダー細胞上への播種を行った。ただし、遺伝子導入細胞は４×１０^５ｃｅｌｌｓずつ播種した。

（５）培養
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）にシャーレから上清を除去し、コントロール条件（ＥＳ細胞用培地）又はタンパク質飢餓処理条件（０Ｆ−ＤＭＥＭで２日間培養後ＥＳ細胞用培地に交換）で以降の培養を行った。培地の交換後は、各条件とも培養２９日目まで培養を継続し、この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）ピックアップ
培養２９日目の各条件の１０ｃｍシャーレ上に形成された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニーを実体顕微鏡（ＳＺ６１；ＯＬＹＭＰＵＳ社製）下でピックアップした。ピックアップしたｉＰＳ細胞コロニーをあらかじめＥＳ細胞用培地を１００μＬ添加した９６穴培養プレートのウェルに移し、数回ピペッティングを行った後、フィーダー細胞を１ウェル当たり５．４×１０^４ｃｅｌｌｓずつ播種した２４穴培養プレートに継代した。継代後は毎日培地交換を行い、十分な大きさになったｉＰＳ細胞コロニーを随時継代していき、ｉＰＳ細胞クローンの樹立を行った。なお、タンパク質飢餓処理を行い得られたｉＰＳ細胞クローンとしてクローン＃１、＃４、＃５、＃６、＃１０を樹立し、コントロール条件でのｉＰＳ細胞クローンとしてクローン＃３を樹立した。

実施例１６ ｉＰＳ細胞クローンのゲノムに挿入されたプロウイルスコピー数の定量
樹立した各ｉＰＳ細胞クローンのゲノムに挿入されたプロウイルスコピー数の定量を行った。なお、コントロールとして京都大学で樹立されたｉＰＳ細胞クローン「２５３Ｇ１」〔Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら、ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、第２６巻、第１号，１０１−１０６頁、２００８年〕についても同様に解析した。

（１）ゲノム抽出
６ウェルプレートの１ウェルにコンフルエントの実施例１５で樹立した各ｉＰＳ細胞クローン（クローン＃１、＃３、＃４、＃５、＃６、又は＃１０）あるいは２５３Ｇ１を、ＥＳ細胞剥離液で回収し、ＰＵＲＥＧＥＮＥ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノム抽出を行った。

（２）リアルタイムＰＣＲ
ｉＰＳ細胞クローンのゲノムに挿入されたプロウイルスコピー数は、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲにより算出した。Ｐｒｏｖｉｒｕｓ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ，Ｈｕｍａｎ（ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）（タカラバイオ社製）に付属のプライマーセット及びＤＮＡコントロール・テンプレートを用いて、実施例１６−（１）で抽出したゲノムＤＮＡ２００ｎｇあたりのプロウイルスコピー数及びヒトＩＦＮγコピー数をそれぞれ算出し、（レトロウイルスコピー数）／（ヒトＩＦＮγコピー数）×２によって１細胞あたりの挿入レトロウイルスコピー数を算出した。なお、全てＮ＝２で行い、平均を算出した。

その結果、コントロールである２５３Ｇ１は約１９．３コピーだったが、クローン＃１では約６．４コピー、クローン＃３は約１０．２コピー、クローン＃４は約７．１コピー、クローン＃５は約１１．４コピー、クローン＃６は約５．７コピー、クローン＃１０は約１３．３コピーであった。このことから、ｐＤＯＮ−５ベクターをもとに作製されたレトロウイルスを用いて、レトロネクチンによる遺伝子導入を行い、作製されたｉＰＳ細胞クローン全てにおいて、ポリブレンを用いて遺伝子導入され作製された２５３Ｇ１よりもレトロウイルスの挿入コピー数が明らかに少ないことにもかかわらず、前記の方法により効率的にｉＰＳ細胞が作製できることが確認できた。

実施例１７ ＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現確認
樹立された各ｉＰＳ細胞クローンがＥＳ細胞のマーカー遺伝子を発現しているかどうかをＲＴ−ＰＣＲにより確認した。なおクローン＃１、クローン＃３のｉＰＳ細胞クローン、及びコントロールとして２５３Ｇ１のｉＰＳ細胞クローンについて確認を行った。

（１）ＲＮＡ抽出
各ｉＰＳ細胞コロニーを数十個回収し、ＦａｓｔＰｕｒｅ（登録商標） ＲＮＡ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）によりＴｏｔａｌＲＮＡを回収した。方法はＫｉｔに添付の培養細胞からのＴｏｔａｌＲＮＡ抽出のプロトコルに従った。

（２）ｃＤＮＡ合成
実施例１７−（１）で抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡの合成を行った。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙの場合のプロトコルに従ってプレミックスを調製し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを２００ｎｇ添加した。ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いて３７℃で１５分、８５℃で５秒の反応を行い、ｃＤＮＡを得た。

（３）ＰＣＲ反応
まず、配列表の配列番号７〜１０に記載の塩基配列を有する合成プライマー及び参考文献〔Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋら、セル（Ｃｅｌｌ）、第１３１巻、８６１−８７２頁、２００７年〕に記載の塩基配列を有する合成プライマーをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。

実施例１７−（２）で得られたｃＤＮＡのうちＴｏｔａｌ ＲＮＡ量に換算して２０ｎｇ分を鋳型としてＰＣＲを行った。５μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、２μＬのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）（タカラバイオ社製）、５ｐｍｏｌのフォワードプライマー、５ｐｍｏｌのリバースプライマー及び０．５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１．２５Ｕ／μＬ）（タカラバイオ社製）を加え、滅菌蒸留水を加えて全量を２５μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔにセットし、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒、６８℃で１５秒を１サイクルとし、３０サイクルの反応を行なった。

（４）アガロースゲル電気泳動による確認
反応終了後、該反応液５μＬを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅されたＤＮＡフラグメントを確認した。結果を図１に示す。図１から明らかなように、元のヒト成人皮膚線維芽細胞（図中に示すＮＨＤＦ−Ａｄ）では確認されない各ＥＳ細胞マーカーが、クローン＃１、クローン＃３ならびに２５３Ｇ１で確認された。すなわち、樹立されたｉＰＳ細胞クローンはＥＳ細胞と同様の遺伝子発現パターンを示していることが確認された。

実施例１８ ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｉＰＳ細胞クローンの多分化能の評価
樹立されたｉＰＳ細胞クローンがヒトＥＳ細胞と同様に多分化能を持つことを確認するため、クローン＃１についてＳＣＩＤマウスの精巣に移植し、テラトーマ形成能について評価を行った。

（１）ｉＰＳ細胞懸濁液の作製
培養したｉＰＳ細胞クローン（クローン＃１）をＥＳ細胞剥離液（２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ、０．２５％トリプシン）を用いて回収し、その一部を用いてセルカウントを行った。ｉＰＳ細胞懸濁液を遠心後に上清を除去し、ＨＡＮＫＳ’ ＢＡＬＡＮＣＥＤ ＳＡＬＴ ＳＯＬＵＴＩＯＮ（Ｓｉｇｍａ社製）で５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製した。

（２）ｉＰＳ細胞懸濁液のＳＣＩＤマウスの精巣への投与
実施例１８−（１）で調製したｉＰＳ細胞懸濁液をＳＣＩＤマウスの精巣に２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／５０μＬで投与した。

（３）形成されたテラトーマの凍結切片作製
ｉＰＳ細胞を投与後、１０週目に剖検を行いＳＣＩＤマウスからテラトーマを取り出し、ＴＩＳＳＵ ＭＯＵＮＴ（千葉メディカル社製）で包埋して凍結ブロックを作成した。凍結ブロックは使用まで−８０℃に保存した。クライオスタットを用いて凍結切片を作製し、標準的な方法でＨＥ染色後、検鏡を行った。その結果を図２に示す。図２に示すように、三胚葉由来の組織が観察できたことから、レトロネクチンによる遺伝子導入で樹立したｉＰＳ細胞クローンは多分化能を持つと評価された。

実施例１９ 各遺伝子導入法における遺伝子導入効率と多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数との比較
核初期化因子（ｉＰＳ細胞誘導因子）をコードする遺伝子とともに各レトロウイルスベクターが挿入された細胞の存在率を示す指標としてＡｃＧＦＰ１遺伝子の遺伝子導入を行い、レトロネクチンによる遺伝子導入法（レトロネクチン法）とポリブレンによる遺伝子導入法（ポリブレン法）における多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）誘導効率とＡｃＧＦＰ１陽性細胞率の比較を行った。また、一部の条件については、ゲノムへのレトロウイルスベクター挿入コピー数の定量を行い、コピー数と多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）誘導効率との比較を行った。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。ただし、レトロネクチンをコートするプレートにはノントリートメント１２穴プレートを用い、各ウェルに１ｍＬずつのレトロネクチン溶液（２５μｇ／ｍＬ）を添加した。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
調製例２及び調製例３で調製したウイルス液を表２４の組み合わせで等量ずつ混合し、条件Ａについては１０Ｆ―ＤＭＥＭで１０倍希釈及び１００倍希釈、条件Ｂについては１０倍希釈にしたものを調製し、遺伝子導入に用いた。遺伝子導入は実施例７−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。ただし、レトロネクチン法におけるＰＢＳでのプレートの洗浄には１ｍＬのＰＢＳを使用し、レトロネクチン法及びポリブレン法での感染に用いる細胞数は４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、レトロウイルスベクター溶液は１ｍＬ／ｗｅｌｌとした。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例１９−（２）と同様の方法により、培養１日目に２回目の遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種及びＡｃＧＦＰ１陽性細胞率の測定
実施例１０−（４）と同様の方法により、遺伝子導入細胞のフィーダー細胞上への播種を行った。ただし、フィーダー細胞上への播種に使用しなかった残りの細胞を用いてフローサイトメーターによりＡｃＧＦＰ１陽性細胞率を測定した。

（５）培養
実施例１０−（５）と同様の方法により、フィーダー細胞上での培養を行った。ただし、培養１１日目に条件Ａの一部のウェルから細胞を回収してゲノム抽出を行い、レトロウイルスベクターの挿入数を定量した。

（６）多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。

実施例１９−（４）、（５）、及び（６）の結果を表２５に示す。

表２５に示すように、ＡｃＧＦＰ１陽性率及び挿入コピー数にほとんど差がない条件においてもｉＰＳ細胞コロニー数に差が認められた。具体的には、条件Ａのレトロウイルス１０倍希釈という条件においてはレトロネクチン法、ポリブレン法のＡｃＧＦＰ陽性率には差はなく、挿入コピー数でもレトロネクチン法が０．９コピーのみ多いという結果にも関わらず、ｉＰＳ細胞コロニー数には３倍以上の差が認められた。また、条件Ａのレトロネクチン法１００倍希釈とポリブレン法１０倍希釈を比較すると、挿入コピー数はレトロネクチン法の方が約２倍高いが、ｉＰＳ細胞コロニー数は９倍という飛躍的に高い値を示した。条件Ｂについても両方法においてＡｃＧＦＰ１陽性率に差はないにも関わらず、ｉＰＳ細胞コロニー数にはレトロネクチン法の方が２倍以上高い値となった。これらのことから、レトロネクチン法で遺伝子導入効率が向上することは確かであるが、それだけでは説明し難いほどの高い多能性幹細胞誘導効率を示しており、レトロネクチンには遺伝子導入効率を高める働き以外にも、多能性幹細胞誘導効率を高める働きがあることが初めて明らかとなった。

実施例２０ レトロウイルスベクターの調製ロット差の検討
５回の一連の調製操作によって得られた、５種の生産ロットが異なるレトロウイルスベクター（以下、それぞれウイルス１〜５と示す）を用いて、レトロネクチンによる遺伝子導入を行い、多能性幹細胞の誘導効率を比較した。ウイルス１は調製、回収直後にそのまま実験に供し、ウイルス２〜５は調製後に凍結保存しておき、解凍したものを実験に供した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例４−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。ただしウイルス液は、各ロットごとに、３種のベクターを等量ずつ混合した溶液を１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈し、各ウェルに２ｍＬずつ添加した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例２０−（２）と同様の方法により、培養１日目に行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。

（５）培養
実施例１０−（５）と同様の方法により、培養２５日目までフィーダー細胞上での培養を行った。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２５日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表２６に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表２６に示すように、レトロネクチンを用いた多能性幹細胞誘導において、ウイルスベクターの生産ロットによる影響はほとんど見られない。また凍結保存、解凍後に使用したウイルスベクターを用いた場合にも、未凍結のものと同等のコロニー数が見られた。レトロネクチンを用いて多能性幹細胞を誘導する場合、多少のウイルス溶液の力価の変動や、凍結融解の有無に関わりなく、安定して多能性幹細胞の誘導が可能であることが明らかとなった。

実施例２１ 静置感染法による遺伝子導入におけるレトロネクチンとＮａｔｉｖｅフィブロネクチンの比較
レトロネクチンがコーティングされたプレート及びＮａｔｉｖｅフィブロネクチンがコーティングされたプレートを用いて遺伝子導入を行い、多能性幹細胞誘導を行った。尚、使用するプレートは、下記実施例２１−（１）で作成したプレート、あらかじめレトロネクチンがコーティングされた３５ｍｍシャーレ（タカラバイオ社製、Ｔ１１０Ａ）及びＮａｔｉｖｅフィブロネクチンがコーティングされた３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製、３５４４５７）の市販品を用いた。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。但し、培養容器にはノントリートメント３５ｍｍシャーレ（ＩＷＡＫＩ社製）を用いた。また市販品であるレトロネクチン及びＮａｔｉｖｅフィブロネクチンをコーティング済みのシャーレ（以下、それぞれ、レトロネクチンディッシュ、フィブロネクチンディッシュとも記載する）には、これらの固定化操作は行っていない。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
調製例２で調製したウイルス液を、表２７の組み合わせで等量ずつ混合した後、１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈し、実施例２１−（１）で調製したレトロネクチン固定化培養シャーレ、もしくはレトロネクチン、Ｎａｔｉｖｅフィブロネクチンがコーティング済みシャーレにそれぞれ２ｍＬずつ添加し、３２℃のＣＯ_２インキュベーター内に４〜６時間静置した。

その後、各シャーレより上清を除去してＰＢＳで１回洗浄後、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト成人皮膚線維芽細胞を２ｍＬずつ各シャーレに播種した後、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例２１−（２）と同様の方法により、培養１日目に行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。

（５）培養
実施例１０−（５）と同様の方法により、培養２７日目までフィーダー細胞上での培養を行った。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２７日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表２８に示す。なお、表中の数字はＮ＝３の平均値を示す。

表２８に示すように、レトロネクチンにウイルスを吸着させる際、遠心操作を行わない静置感染法においても、レトロネクチンではｉＰＳ細胞誘導が可能であった。これに対してＮａｔｉｖｅフィブロネクチンでは多能性幹細胞のコロニーが、レトロウイルスの組み合わせに関わらず、１つも得ることができなかった。ｉＰＳ細胞誘導におけるレトロネクチンのＮａｔｉｖｅフィブロネクチンに対する優位性が明らかとなった。

実施例２２ ウイルス混合比率の検討
多能性幹細胞の誘導効率の向上を目指し、最適なウイルスベクター混合比率の検討を行った。なお、誘導に用いる遺伝子としてＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４の３種類を用いた。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例１１−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った。ただし、表２９に示すようにウイルス混合比率を変更した。なお、遺伝子導入法はレトロネクチン法で、ウイルス溶液を１００倍希釈して感染に用いた。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例２２−（２）と同様の方法により、培養１日目に２回目の遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
実施例１１−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。

（５）培養
実施例１０−（５）と同様の方法によりフィーダー細胞上での培養を行った。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２７日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表３０に示す。なお、表中の数字はＮ＝３の平均値を示す。

表３０に示すように、ＤＯＮ５−ａｍ−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２をＤＯＮ５−ａｍ−ＫＬＦ４の２倍量混合したウイルス溶液を用いることで、ｉＰＳ細胞の誘導効率が飛躍的に上昇ししており、ウイルスの混合比率を最適化することで、ｉＰＳ細胞の誘導効率をさらに向上させることができることが明らかとなった。

実施例２３ マウス胎児線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）へのレトロウイルスベクター導入効率
レトロウイルスベクターを用いたＭＥＦへの遺伝子導入効率をレトロネクチン法及びポリブレン法で比較した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。ただし、レトロネクチンをコートするプレートにはノントリートメント１２穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）を用い、各ウェルに１ｍＬずつのレトロネクチン溶液（２５μｇ／ｍＬ）を添加した。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
実施例１９−（２）及び（３）と同様の方法で遺伝子導入を行った。レトロウイルスベクターは調製例３と同様の方法で調製したが、ｐＥ−Ａｍｐｈｏプラスミドの代りにｐＥ−Ｅｃｏプラスミド（タカラバイオ社製）を用いて作製したＤＯＮ−ｅｃｏ−ＡｃＧＦＰ１を用いた。調製したレトロウイルスベクターを原液から１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈ずつ１０００００倍まで希釈した溶液をそれぞれ感染に用いた。また、標的細胞にはＭＥＦ（ミリポア社製）を使用した。

（３）培地交換
遺伝子導入の翌日に培地を１０Ｆ―ＤＭＥＭに交換した。

（４）遺伝子導入効率の測定
遺伝子導入操作から４日後、細胞を回収し、フローサイトメーターにより、ＡｃＧＦＰ１陽性細胞率を測定した。その結果を表３１に示す。

表３１に示すように、レトロネクチン法による遺伝子導入効率は、ポリブレン法による遺伝子導入効率よりもはるかに高かった。これは、ヒト線維芽細胞と同様に、マウス線維芽細胞に対してもレトロネクチン法による遺伝子導入法は有用であることを示しており、効率的なｉＰＳ細胞の誘導を促進できることが示唆された。

実施例２４ ヒトｉＰＳ細胞誘導因子を用いたＭＥＦからのｉＰＳ細胞誘導
ヒトとマウスのｉＰＳ細胞誘導因子のアミノ酸配列は非常に酷似しており、機能的にも高度に保存されていることが推測される。そこで、ヒトｉＰＳ細胞誘導因子を用いてＭＥＦからマウスｉＰＳ細胞を誘導可能かどうか検討した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
実施例２３−（２）と同様のレトロネクチン法により遺伝子導入を行った。誘導に用いるレトロウイルスベクターの組み合わせは表３２に示した。また、レトロウイルスベクターは調製例２と同様の方法で調製したが、ｐＥ−Ａｍｐｈｏプラスミドの代りにｐＥ−Ｅｃｏプラスミドを用いて作製したレトロウイルスベクターを用いた。

（３）培地交換
遺伝子導入翌日及び３日目に培地を１０Ｆ―ＤＭＥＭに交換した。

（４）フィーダー細胞上への播種
実施例１０−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。ただし、継代日は遺伝子導入４日目とし、播種細胞数は２×１０^５、５×１０^４又は１×１０^４ｃｅｌｌｓずつ播種する群を設定した。

（５）培養
培養５日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に６穴培養プレートから上清を除去し、調製例４により調製したマウスＥＳ細胞用培地を２ｍＬ添加した。培養１９日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養１９日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表３３に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表３３に示すように、ヒトｉＰＳ細胞誘導因子を搭載したウイルスベクターを用いることで、ＭＥＦからもマウスｉＰＳ細胞を誘導可能であることが明らかとなった。このことから、レトロネクチンを用いたｉＰＳ細胞誘導システムはヒトだけでなく、マウスに対しても有用であることがわかった。

実施例２５ ｉＰＳ細胞のＥＢ（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を介した分化誘導による多分化能の確認
ｉＰＳ細胞の定義の一つに多分化能があげられており、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＥＢを介した分化誘導により多分化能を確認することができる。そこで、作製したｉＰＳ細胞の多分化能を評価することを目的に実験を行った。

（１）ｉＰＳ細胞の浮遊培養
実施例１５−（６）と同様の方法によりフィーダー細胞とＥＳ細胞用培地を用いて、６穴培養プレートで培養したｉＰＳ細胞クローン（クローン＃３）を、ＥＳ細胞剥離液を用いて回収し、ＥＢ形成培地（８０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ）に懸濁した後、ノントリートメント６穴培養プレートで浮遊培養を行った。なお、隔日で培地交換を行った。

（２）ゼラチンコートプレートへの接着
培養８日目に、前日ゼラチンコートしておいた２４ウェルプレートにＥＢを全量播種し、プレートに接着させてさらに８日間培養を行った。なお、隔日で培地交換を行った。

（３）免疫染色
培養１６日目に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温１０分間固定を行った後、ＰＢＳで２回洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温１時間反応することでブロッキングを行った。その後、Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−βＩＩＩ−ｔｕｂｌｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）又はＭｏｕｓｅ ａｎｔｉ−α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｃｓｌｅ ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＤＡＫＯ社製）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで５０倍希釈した溶液を添加し、４℃で一晩インキュベートを行った。翌日、ＰＢＳで３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温１時間反応することでブロッキングを行った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ Ｆ（ａｂ‘）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１０００倍希釈した溶液を添加し、４℃で一晩インキュベートを行った。翌日、ＰＢＳで３回洗浄後、蛍光顕微鏡による観察を行った。

その結果を図３に示す。図３から明らかなように、本方法で作製したｉＰＳ細胞は外胚葉系の細胞であるβＩＩＩ−ｔｕｂｌｉｎ、中胚葉系の細胞であるα−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｃｓｌｅ ａｃｔｉｎ陽性の細胞へと分化可能であり、多分化能を持つことが示された。

実施例２６ 遺伝子導入後からフィーダー細胞への継代までの培地検討
ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（仔ウシ血清）はＦＢＳ（ウシ胎児血清）よりも分化誘導因子が少ないと予想され、よりｉＰＳ細胞誘導に適している可能性が考えられた。そこで、遺伝子導入後からフィーダー細胞への継代までに使用する培地中の血清成分のｉＰＳ細胞誘導効率への影響について検討を行った。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例１１−（２）と同様に、レトロネクチン法で１００倍希釈した溶液を用いて遺伝子導入を行った。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例１１−（３）と同様の方法により２回目の遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
実施例１１−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。ただし、遺伝子導入２回目の翌日からフィーダー細胞上への播種までの培地中の血清成分を、表３４に示す組成に変更した。

（５）培養
実施例１０−（５）と同様の方法によりフィーダー細胞上での培養を行った。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２７日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表３５に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表３５に示すように、ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍの濃度依存的にｉＰＳ細胞誘導効率が増加し、５％、１０％及び２０％ではコントロール群である条件Ａよりも高い誘導効率が得られた。このことから、ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍはｉＰＳ細胞誘導時の細胞の拡大に効果的であることが示された。

実施例２７ 細胞周期停止剤の検討―２
実施例３で多能性幹細胞の誘導促進効果が確認された、細胞周期停止剤のプルバラノールＡについて、薬剤処理期間の延長と、細胞死を抑制する物質の１つであるＹ２７６３２［（Ｒ）（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキシアミドジヒドロクロリド］との併用を検討した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例３−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。ただしウイルス液は３種のベクターを等量ずつ混合した溶液を１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈し、各ウェルに２ｍＬずつ添加した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例２７−（２）と同様の方法により、培養１日目に２回目の遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。

（５）細胞周期停止剤処理と培養
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に６穴培養プレートから上清を除去し、ＥＳ細胞用培地に交換後、表３６に示すように、薬剤処理を行った。薬剤処理期間終了後、ＥＳ細胞用培地に交換し、培養２６日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。４日間ないし６日間の薬剤処理を行った条件については、薬剤処理期間中も２日おきに培地を交換し、そのたびに薬剤を同じ濃度で添加した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２６日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表３７に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表３７に示すように、プルバラノールＡによる薬剤処理期間を４日間に延長することにより、更に多能性幹細胞の誘導効率が高まることが明らかとなった。またプルバラノールＡによる薬剤処理期間を延長した場合、細胞死を抑制する物質の１つであるＹ２７６３２を添加することで、安定して多能性幹細胞コロニーが得られることが明らかとなった。

実施例２８ 細胞周期停止剤の検討―３
多能性幹細胞の誘導培養において、細胞周期停止剤の１つであるＮＵ６１４０（ＡＬＥＸＩＳ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社製）による薬剤処理を行い、誘導効率への影響を検討した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。ただし、ノントリートメント１２穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）を用い、レトロネクチン溶液は各ウェルに１ｍＬずつ添加した。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例４−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。ただしウイルス液は３種のベクターを等量ずつ混合した溶液を１０Ｆ−ＤＭＥＭで１００倍希釈し、各ウェルに１ｍＬずつ添加した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例２８−（２）と同様の方法により、培養１日目に２回目の遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し、培養を継続した。

（５）細胞周期停止剤処理と培養
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に６穴培養プレートから上清を除去し、ＥＳ細胞用培地に交換後、それぞれ終濃度０．１μＭ、１μＭとなるようにＮＵ６１４０を添加した群を設定した。なお、コントロールでは薬剤を添加しなかった。２日間培養後、ＥＳ細胞用培地に交換し、培養２８日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２８日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表３８に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表３８に示すように、コントロール（無処理）よりもＮＵ６１４０による薬剤処理を行った群にて多能性幹細胞コロニーの数が多くなった。すなわち、多能性幹細胞誘導の過程において、細胞周期を停止させることで、誘導効率が高まることが再確認された。

実施例２９ ＤＨＣＰの検討
多能性幹細胞の誘導培養において、動植物由来のウロン酸化合物を加熱することで生成した化合物ＤＨＣＰ（国際公開第９８／１３３２８号パンフレット）、およびＤＨＣＰにグルタチオンが付加されたＧＭ（国際公開第９８／３９２９１号パンフレット）による薬剤処理を行い、誘導効率への影響を検討した。

（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例２８−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
実施例４−（２）と同様の方法により遺伝子導入を行った（培養０日目）。ただしウイルス液は３種のベクターを等量ずつ混合した溶液を１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈し、各ウェルに１ｍＬずつ添加した。

（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例２８−（２）と同様の方法により、培養１日目に２回目の遺伝子導入を行った。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。

（５）薬剤処理と培養
培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に６穴培養プレートから上清を除去し、ＥＳ細胞用培地に交換後、それぞれ終濃度１０μＭとなるようにＤＨＣＰおよびＧＭを添加した群を設定した。なお、コントロールでは薬剤を添加しなかった。２日間培養後、ＥＳ細胞用培地に交換し、培養２６日目まで培養を継続した。この間１〜２日おきに培地を交換した。

（６）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２６日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表３９に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表３９に示すように、コントロール（無処理）よりもＤＨＣＰ及びＧＭによる薬剤処理を行った群にて多能性幹細胞コロニーの数が多くなった。すなわち、ＤＨＣＰ及びその誘導体であるＧＭに多能性幹細胞の誘導促進効果があることが明らかとなった。

実施例３０ 静置感染法による遺伝子導入におけるレトロネクチンとＮａｔｉｖｅフィブロネクチンの比較―２
実施例２１と同様に、レトロネクチンがコーティングされたプレート及びＮａｔｉｖｅフィブロネクチンがコーティングされたプレートを用いて遺伝子導入を行い、多能性幹細胞誘導を行った。同時にポリブレンによる遺伝子導入も実施し、ウイルス液の希釈倍率についても検討した。尚、使用するプレートは、あらかじめレトロネクチンがコーティングされた３５ｍｍシャーレ（タカラバイオ社製、Ｔ１１０Ａ）及びＮａｔｉｖｅフィブロネクチンがコーティングされた３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製、３５４４５７）の市販品を用いた。

（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
レトロネクチン及びＮａｔｉｖｅフィブロネクチンがコーティングされたシャーレを用いた遺伝子導入は、実施例２１−（２）と同様に行った。ポリブレンによる遺伝子導入に関しては以下の方法で行った。１日前に３５ｍｍ細胞培養用シャーレ（ＩＷＡＫＩ社製）に、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト皮膚線維芽細胞を２ｍＬずつ播種し、１日培養した。終濃度４μｇ／ｍＬとなるようにポリブレンを添加したレトロウイルスベクター混合液を調製後、細胞を培養していたシャーレより上清を除去し、このレトロウイルスベクター混合液を添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。いずれの方法においても、ウイルス液は実施例２１−（２）と同様の組み合わせで等量ずつ混合し、そのまま使用する群と、１０Ｆ−ＤＭＥＭで１０倍希釈、又は１００倍希釈する群を設定した。

（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
実施例３０−（１）と同様の方法により、培養１日目に２回目の遺伝子導入を行った。

（３）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。

（４）培養
実施例１０−（５）と同様の方法により、培養２５日目まで行った。

（５）多能性幹細胞コロニーの計測
培養２５日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表４０に示す。なお、表中の数字はＮ＝２の平均値を示す。

表４０に示すように、レトロネクチンをコートしたシャーレ（表中、レトロネクチンディッシュと記載する）を用いた静置感染法による遺伝子導入は、ポリブレンによる遺伝子導入よりも、はるかに多能性幹細胞の誘導効率が高かった。レトロネクチンをコートしたシャーレによる遺伝子導入では、ウイルス液を希釈して使用した場合にも、安定して多能性幹細胞誘導が可能であるのに対し、Ｎａｔｉｖｅフィブロネクチンをコートしたシャーレ（表中、フィブロネクチンディッシュと記載する）を用いた遺伝子導入では、多能性幹細胞のコロニーが全く形成されなかった。多能性幹細胞誘導におけるレトロネクチンのＮａｔｉｖｅフィブロネクチンに対する優位性が再確認された。

調製例５ レンチウイルスベクターの調製
（１）ｐＬｅｎｔｉ６．３プラスミドベクターへの移し替え
調製例２−（１）より調製したｐＤＯＮ-５-ＫＬＦ４を制限酵素ＮｏｔＩで消化後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ(タカラバイオ社製）を用いて平滑化し、さらに制限酵素ＸｈｏＩで消化してＫＬＦ４フラグメントを得た。調製例２−(４)で調製したｐＤＯＮ−５−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２を制限酵素ＮｏｔＩで消化後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔを用いて平滑化し、さらにＢｌｎＩで消化することによってＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２フラグメント１を得た。同じくｐＤＯＮ−５−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２を制限酵素ＢｌｎＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２フラグメント２を得た。また、調製例２−(４)で調製したｐＤＯＮ−５−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧをＮｏｔＩで消化後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔを用いて平滑化し、さらにＸｂａＩで消化することによってＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧフラグメント１を得た。同じくｐＤＯＮ−５−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧを制限酵素ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで消化することでＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧフラグメント２を得た。ｐＬｅｎｔｉ−６．３/Ｖ５−ＴＯＰＯプラスミド (インビトロジェン社製)を制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩで消化し、ｐＬｅｎｔｉ６．３フラグメントを得た。前記の各種フラグメントを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的サイズのＤＮＡフラグメントを抽出、精製した。ｐＬｅｎｔｉ６．３フラグメントを、ＫＬＦ４フラグメント、ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２フラグメント１及び２、又はＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧフラグメント１及び２とそれぞれ混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞を用いて連結した。
こうして作製された組換えプラスミドより各遺伝子が正しく挿入されたものを選択し、それぞれｐＬｅｎｔｉ６．３−ＫＬＦ４、ｐＬｅｎｔｉ６．３−ＯＣＴ４−ＩＲ−ＳＯＸ２及びｐＬｅｎｔｉ６．３−ＬＩＮ２８−ＩＲ−ＮＡＮＯＧと命名した。

（２）レンチウイルスベクターの産生
調製例２−（５）と同様に Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞を播種し、２４時間培養した。５００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭに１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３（タカラバイオ社製）を混合し、室温で５分放置後、４μｇのＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（インビトロジェン社製）及び１μｇの調製例５−（１）で調製した各組換えプラスミドをそれぞれ加えて混合し、更に１５分間室温で放置した。この混合液を上記のＧ３Ｔ−ｈｉ細胞に添加して培養を継続し、２４時間後に４ｍＬの１０Ｆ−ＤＭＥＭに交換した。更に２４時間培養を継続した後、ウイルスを含む培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過してレンチウイルスベクターを含むウイルス液を調製した。表４１にそれぞれの組換えプラスミドから得たレンチウイルスベクターの名称を示す。３種のウイルス液は等量ずつ混合し、感染に用いた。混合ウイルスの一部は、ウイルス液の三分の一量のＬｅｎｔｉ−Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（クロンテック社製）を加え混合し、４℃で１時間放置した。その後１，５００×ｇで１時間遠心後、上清を除去し、新たに１０Ｆ−ＤＭＥＭを加え、２０倍濃縮ウイルス液を調製した。濃縮前もしくは濃縮後のウイルス液は調製後すぐに使用しない場合は−８０℃で凍結保存して、使用時に解凍して用いた。

実施例３１ レンチウイルスベクターを用いた多能性幹細胞の誘導
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法によりレトロネクチンの培養プレートへの固定化を行った。ただし、レトロネクチンをコートするプレートにはノントリートメント１２穴プレートを用い、各ウェルに１ｍＬずつのレトロネクチン溶液（２５μｇ／ｍＬ）を添加した。

（２）レンチウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
調製例５で調製した各混合ウイルス液を１２穴レトロネクチン固定化培養プレート、もしくは１２穴培養プレートに５００μＬずつ添加し、さらに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト成人皮膚線維芽細胞を５００μＬずつ各ウェルに添加した。ポリブレン感染条件については終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレンを添加した。これらのプレートを３２℃、１，０００×ｇで３０分遠心後、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。設定した条件を表４２に示す。

（３）レンチウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入を培養１日目に、実施例３１−（２）と同様に行った。更に１日培養後、上清を除去し１０Ｆ−ＤＭＥＭを１ｍＬ添加して培養を継続した。

（４）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例５−（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に遺伝子導入細胞を播種し培養を継続した。培養７日目（フィーダー細胞上に播種してから１日培養後）に上清を除去し、ＥＳ細胞用培地を２ｍＬ添加し、培養３２日目まで培養を継続した。この間、２日おきに培地を交換した。

（５）多能性幹細胞コロニーの計測
培養３２日目に各条件の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数を計測した。その結果を表４３に示す。なお、条件Ａについては、１ウェルの結果のみを示す。

表４３に示すように、濃縮の有無にかかわらず、レトロネクチンを用いて感染を行った場合においてのみ、多能性幹細胞コロニーを得ることができた。すなわち、レンチウイルスベクターを用いた場合においても、レトロネクチンによる遺伝子導入を行うことで、ポリブレンによる遺伝子導入より効率よく多能性幹細胞を誘導できることが明らかになった。

本発明により、従来の製造方法と比べ、高い頻度で多能性幹細胞を製造する方法が提供される。本発明により得られた細胞集団に含有される多能性幹細胞は、公知の手段により所望の細胞へ分化させることができることから、生体移植用細胞の作製あるいは基礎研究への使用に非常に有用である。

SEQ ID NO:1；Primer hSOX2-F to amplify the SOX2 gene.
SEQ ID NO:2；Primer hSOX2-R to amplify the SOX2 gene.
SEQ ID NO:3；Primer hKLF4-F to amplify the KLF4 gene.
SEQ ID NO:4；Primer hKLF4-R to amplify the KLF4 gene.
SEQ ID NO:5；Primer IRES-F-SalI to amplify the IRES sequence.
SEQ ID NO:6；Primer IRES-R-NotI to amplify the IRES sequence.
SEQ ID NO:7；Primer OCT4EndoqP-F1 to amplify the endogenous OCT4 gene.
SEQ ID NO:8；Primer OCT4EndoP-R1 to amplify the endogenous OCT4 gene.
SEQ ID NO:9；Primer SOX2EndoP-F2 to amplify the endogenous SOX2 gene.
SEQ ID NO:10；Primer SOX2EndoP-R2 to amplify the endogenous SOX2 gene.

Claims (6)

1. ヘパリンＩＩ−結合領域を有するフィブロネクチンフラグメントの存在下にＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される３種以上の核初期化因子をコードする遺伝子を保持するレトロウイルスベクターを体細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、該核初期化因子がＯＣＴ４及びＳＯＸ２を含み、かつ、ＫＬＦ４及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される１種以上を含む、方法。
2. 核初期化因子がさらにＬＩＮ２８を含む、請求項１記載の方法。
3. 請求項１記載の方法により多能性幹細胞を含有する細胞集団を製造する工程、及び得られた細胞集団より多能性幹細胞を単離する工程を包含する、多能性幹細胞の製造方法。
4. さらに、核初期化因子と接触させた体細胞を栄養飢餓条件で処理する工程及び／又は細胞周期を停止させる薬剤で処理する工程を包含することを特徴とする、請求項１記載の方法。
5. 栄養飢餓条件で処理する工程が、タンパク質飢餓条件で処理する工程である請求項４記載の方法。
6. タンパク質飢餓条件で処理する工程が、タンパク質濃度が０〜０．５％（ｗ／ｖ）である培地を用いて核初期化因子と接触させた体細胞を培養する工程である請求項５記載の方法。

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