EA003923B1 - Циклопентеноны, способы их получения и применение - Google Patents

Abstract

Раскрыт способ получения 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленного следующей формулой [1], который характеризуется тем, что по крайней мере одно из веществ, выбираемых из следующих: (а), (b) и (с), нагревают;(a) - уроновая кислота или производное(производные) уроновой кислоты;(b) - сахаридное соединение, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(производные) уроновой кислоты; и(c) - вещество, содержащее сахаридное соединение, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(производные) уроновой кислоты.

Description

Настоящее изобретение относится к циклопентенонам, обладающим такой физиологической активностью, как противораковое действие, и высокой степенью безопасности, и более конкретно оно относится к способам получения указанных соединений, а также к фармацевтическим препаратам, содержащим указанные соединения в качестве эффективных компонентов. Настоящее изобретение также относится к ряду изобретений, которые могут найти применение в области пищевой промышленности, получения напитков и т.д.

Предпосылки изобретения

Фармацевтические препараты, которые используются в клинической терапии, включают многие средства, такие как противораковые средства, антибиотики, иммуностимуляторы, иммуномодуляторы и др. (такие как алкилирующие агенты, антиметаболиты и растительные алкалоиды), но трудно сказать, что такая лекарственная терапия уже совершенно установлена.

Было опубликовано, что из этих агентов среди простагландинов, полученных из природных веществ, простагландины А и 1. содержащие циклопентеноновые циклы, обладают возможностью применения в качестве высокобезопасных противораковых агентов, благодаря тому, что они ингибируют синтез ДНК, и были синтезированы различные их производные (см. выложенную заявку Японии 8ЙО-62/96438).

Проблемы, решаемые данным изобретением

Объектом настоящего изобретения является разработка высокобезопасных производных циклопентенона, обладающих таким физиологическим действием, как противораковая активность, а также к способам получения указанных соединений, к фармацевтическим препаратам, содержащим указанные соединения в качестве эффективных компонентов, и к пищевому продукту или напитку, содержащим указанные соединения. Другим объектом настоящего изобретения является способ применения указанных соединений, а также других соединений, которые связаны с указанными соединениями.

Средства решения этих проблем

Настоящее изобретение представлено далее. Так, первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения 4,5-дигидрокси2-циклопентен-1-она, представленного следующей формулой [I], который заключается в том, что по меньшей мере одно вещество, выбранное из (а), (Ь) и (с), подвергают нагреванию.

(a) уроновая кислота или производное (производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты.

Второй аспект настоящего изобретения относится к способу получения 4,5-дигидрокси2-циклопентен-1-она, который заключается в том, что по меньшей мере одно вещество, выбранное из (а), (Ь) и (с), подвергают нагреванию, и 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он, представленный формулой [1], выделяют из вышеуказанного продукта, подвергнутого термообработке.

(a) уроновая кислота или производное (производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу получения оптически активного 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, который заключается в том, что включает следующие стадии.

(A) стадия, в которой по меньшей мере одно вещество, выбранное из (а), (Ь) и (с), нагревают с получением 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она;

(a) уроновая кислота или производное (производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты;

(B) необязательная стадия, на которой 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-он выделяют из полученного теплообработанного продукта; и (C) стадия, на которой 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-он подвергают разделению на оптические изомеры.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к (-)-4,5-дигидрокси-2-циклопентен1-ону, имеющему коэффициент оптического вращения [α]_Β ²⁰ -105°С (с = 0,30, этанол).

Пятый аспект настоящего изобретения относится к (+)-4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1ону, имеющему коэффициент оптического вращения [α]_Β ²⁰ +104°С (с = 0,53, этанол).

Шестой аспект настоящего изобретения относится к противораковому средству, которое характеризуется тем, что содержит 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-он, представленный формулой [1], и/или его оптически активному производному.

Седьмой аспект настоящего изобретения относится к индуктору дифференциации раковых клеток, который характеризуется тем, что содержит 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он, представленный формулой [1], и/или его оптически активное производное.

Восьмой аспект настоящего изобретения относится к индуктору апоптоза, который характеризуется тем, что содержит 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-он, представленный формулой [1], и/или его оптически активное производное.

Девятый аспект настоящего изобретения относится к антибактериальному средству, которое характеризуется тем, что содержит 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-он, представленный формулой [1], и/или его оптически активное производное.

Десятый аспект настоящего изобретения относится к способу индукции дифференциации раковых клеток, который характеризуется применением 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленного формулой [1], и/или его оптически активного производного в качестве активного(ых) ингредиента(ов).

Одиннадцатый аспект настоящего изобретения относится к способу индукции апоптоза, который характеризуется применением 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленного формулой [1], и/или его оптически активного производного в качестве активного(ых) ингредиента(ов).

Двенадцатый аспект настоящего изобретения относится к пищевому продукту или напитку, которые характеризуются тем, что содержат разбавленный в них и/или добавленный к ним 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он, представленный формулой [1], и/или его оптически активное производное.

Тринадцатый аспект настоящего изобретения относится к веществу, которое содержит сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, которое характеризуется тем, что в указанном веществе, которое содержит сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, по меньшей мере часть реакционных групп аминов, аминокислот, пептидов или белка, обладающих способностью взаимодействовать с уроновой кислотой, производным(и) уроновой кислоты, промежуточными соединениями, приводящими к получению 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она, представленного формулой [1], или с 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1оном, представленным формулой [1], отсутствуют, и/или по меньшей мере часть упомянутых(ого) реакционноспособных(ого) веществ(а) удалена.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение, представленное формулой [1], т.е. 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он (далее указан только как циклопентенон), образуется в обработанных нагреванием продуктах по меньшей мере из одного вещества, выбранного из уроновой кислоты, производного(ых) уроновой кислоты, сахаридного производного, содержащего уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и вещества, которое содержит сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и что указанное соединение, выделенное из обработанных нагреванием продуктов, обладает различными физиологическими активностями, такими как противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие и антибактериальное действие, а также достигли успеха в получении оптически активных производных указанного соединения, результатом чего явилось настоящее изобретение.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан масс-спектр циклопентенона;

на фиг. 2 - ¹Н-ЯМР спектр циклопентенона;

на фиг. 3 - апоптоз-индуцирующее действие циклопентенона, полученного из обработанных нагреванием продуктов альгиновой кислоты;

на фиг. 4 - ИК-спектр циклопентенона; на фиг. 5 - УФ-спектр циклопентенона;

на фиг. 6 - рабочая кривая циклопентенона;

на фиг. 7 - данные газовой хроматографии обработанных нагреванием продуктов глюкуроновой кислоты;

на фиг. 8 - соотношение между временем хранения и количеством циклопентенона;

на фиг. 9 - кривая элюирования (-)-4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-она;

на фиг. 10 - кривая элюирования (+)-4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-она;

на фиг. 11 - 'Н-ЯМР спектр (-)-4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-она;

на фиг. 12 - ¹Н-ЯМР спектр (+)-4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-она;

на фиг. 13 - соотношение между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в среде;

на фиг. 14 - соотношение между временем инкубации и частью, приходящейся на зрелые костные клетки в инкубированных клетках;

на фиг. 15 - противораковое действие циклопентенона.

Предпочтительные воплощения изобретения

Настоящее изобретение более подробно иллюстрируется следующим образом.

В настоящем изобретении нет конкретного ограничения для уроновой кислоты, производного(ых) уроновой кислоты, сахаридного производного, содержащего уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и вещества, которое содержит сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, так как циклопентенон образуется в продуктах, подвергнутых тепловой обработке.

В соответствии с настоящим изобретением является возможным, что соответствующее количество физиологически активного циклопентенона и/или его оптически активного производного содержатся в пищевом продукте или напитке. Ввиду противоракового действия, антибактериального действия и т.п. этих соединений, пищевой продукт или напиток по настоящему изобретению являются достаточно полезными в качестве противоракового или бактериального пищевого продукта или противоракового или антибактериального напитка.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей циклопентенон и/или его оптически активное производное, и указанная фармацевтическая композиция может использоваться в качестве лечебного или профилактического средства при раке, а также в качестве антибактериального средства для антисептиков, антибактериальных средств для чистки зубов, антибактериальных косметических средств, антибактериальных средств для ванн и т. п.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу индукции дифференцирования раковых клеток, а также индукции апоптоза посредством применения циклопентенона и/или его оптически активного производного в качестве активного ингредиента(ов), и эти способы могут быть использованы при биохимических исследованиях и при скрининге фармацевтических препаратов, таких как средства дифференциации раковых клеток и ингибиторы индукции апоптоза.

Циклопентенон, применяемый в настоящем изобретении, может быть получен нагреванием вещества, выбранного из (а) уроновой кислоты или производного(ых) уроновой кислоты; (Ь) сахаридного производного, содержащего уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и (с) вещества, содержащего сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты. Соответственно, также является возможным получить циклопентенон по настоящему изобретению путем нагревания (а), (Ь) или (с), которые получают из материала, не содержащего ни (а), ни (Ь), ни (с) с помощью физических, химических, ферментативных или других средств.

В настоящем изобретении также возможно применять обработанные нагреванием продукты, содержащие циклопентенон, очищенный циклопентенон или частично очищенный циклопентенон, полученные из указанных выше обработанных нагреванием продуктов.

Уроновую кислоту иногда называют гликуроновой кислотой, что является общим названием для гидроксиальдегидов карбоновых ки слот, в которых альдегидная группа альдозы остается как таковая, тогда как лишь первичная спиртовая группа на другом конце окисляется до карбоксильной группы. Она существует в природе как составной компонент различных полисахаридов животного и растительного происхождения. Примерами полисахаридов, содержащих уроновую кислоту, являются пектин, пектиновая кислота, альгиновая кислота, гиалуроновая кислота, гепарин, гепарансульфат, фукоидан, хондроитинсульфат, хондроитин, дерматансульфат и т.п., и они, как известно, проявляют различное физиологическое действие.

Не существует особых ограничений для уроновой кислоты, применяемой в настоящем изобретении. Так, примерами уроновой кислоты являются галактуроновая кислота, глюкуроновая кислота, гулуроновая кислота, маннуроновая кислота и идуроновая кислота, в то время как примерами производного(ых) уроновой кислоты являются лактоны, сложные эфиры, амиды, соли и т. п. указанных выше кислот, и под производным по настоящему изобретению подразумевается любое вещество, которое дает циклопентенон при нагревании. Примерами лактона уроновой кислоты являются глюкороно-6,3-лактон (называемый здесь далее как глюкуронолактон), маннуроно-6,3-лактон и идуроно-6,3-лактон.

Примерами сложных эфиров уроновой кислоты являются метил-, этил-, пропиленгликоль- и карбоксиметилуронаты, которые могут быть получены из уроновой кислоты. Амид уроновой кислоты может быть получен путем амидирования уроновой кислоты. Их соли могут быть получены обычными методами.

В этом описании не существует особых ограничений для сахаридного производного, содержащего уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и применяемыми примерами является пектин, пектиновая кислота, альгиновая кислота, гиалуроновая кислота, гепарин, гепаринсульфат, фукоидан, хондроитинсульфат, хондроитин и дерматансульфат, включая продукты их разложения, производные продуктов их разложения, соли продуктов их разложения, которые представляют собой их химически, ферментативно или физически обработанные продукты.

При указанной выше химической обработке исходное соединение обрабатывают, например, при температуре от комнатной до 200°С в течение от нескольких секунд до нескольких часов или предпочтительно при 50-130°С в течение от нескольких секунд до 60 мин. Когда указанную обработку проводят в кислых условиях, гликозидная связь гидролизуется и, в случае пектина, получают продукт разложения, содержащий галактуроновую кислоту и/или сложный эфир галактуроновой кислоты. Или, например, при обработке при рН 6,8 при 95°С в течение от нескольких минут до нескольких десятков минут происходит бета-отщепление с образованием сахаридного производного, содержащего ненасыщенную уроновую кислоту и/или ненасыщенный сложный эфир уроновой кислоты, в которых поглощение при длине волны около 235 нм усилено. Сахаридное производное по настоящему изобретению включает сахаридное производное, содержащее ненасыщенную уроновую кислоту и/или ненасыщенный сложный эфир уроновой кислоты на нередуцирующем конце, полученном путем бетаотщепления полисахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты.

Примером указанной выше ферментативной обработки является известный метод расщепления, в котором исходное сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты, расщепляют с помощью гидролазы, такой как пектиназа и гиалуронидаза, сахарида, содержащего уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты. Другим примером является известный метод расщепления, по которому сахарид, содержащий уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты, расщепляется лиазой сахарида, содержащего уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты. Например, в случае пектина или пектиновой кислоты расщепление проводят с помощью известной лиазы пектина (ЕС 4.2.2.10), пектиатлиазы (ЕС 4.2.2.2) или лиазы экзополигалктуроновой кислоты (ЕС 4.2.2.9) с получением сахаридного соединения, содержащего уронат 4-дезокси-Ь-трео-гекс-4енопиранозила или его метиловый эфир на нередуцированном конце. В случае гиалуроновой кислоты используют гиалуронатлиазу (ЕС 4.2.2.1), в то время как в случае альгиновой кислоты применяют альгинатлиазу (ЕС 4.2.2.3). Неожиданно, в случае альгиновой кислоты получают сахаридное соединение, содержащее уронат 4 -дезокси-Ь-эритро -гекс -4-енопирано зила на его нередуцированном конце. Ферментативно расщепленные продукты, содержащие уронат 4-дезокси-Ь-трео-гекс-4-енопиранозила, уронат 4-дезокси-Е-эритро-гекс-4-енопиранозила или их метиловые эфиры на нередуцированном конце, полученные как таковые, также охватываются сахаридным соединением по настоящему изобретению.

Примерами вышеупомянутой физической обработки является обработка исходного сахаридного соединения с помощью почти инфракрасных лучей, инфракрасных лучей, микроволн, ультразвуковых волн и т.д. Так, например, пектин и/или пектиновую кислоту помещают в нейтральный (по рН) или в щелочной раствор и подвергают действию ультразвуковых волн для приложения энергии вибрации при подходящей температуре не ниже комнатной при подходящем режиме редукции, например, в присутствии аскорбиновой кислоты в течение не менее од ной секунды или предпочтительно от 5 с до 1 ч. Кроме ультразвуковых волн эффективным является также облучение микроволнами в области, близкой к инфракрасной, в инфракрасной и т.д. или их сочетания. Облучение может проводиться либо непрерывно, либо прерывисто.

В настоящем изобретении отсутствует особое ограничение для вещества, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, поскольку указанное вещество содержит сахаридное соединение, содержащее указанную выше уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты. Ниже представлены примеры вещества, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту или производное(ые) уроновой кислоты. Это фрукты, овощи, листья, семена и т.д. двудольных растений, таких как яблоко, плоды цитрусовых (например, мандарин, апельсин и лимон), банан, цветная капуста, капуста, латук, перилла, тыква, сельдерей, лопух, се11а1о1с. брокколи, зеленый перец, шпинат, лук, морковь, ботва моркови, листья дайкона (японской редиски), листья чая, кунжут, бобы, картошка и т.п.; зерна однодольных растений, таких как пшеница и рис; водоросли, такие как бурые водоросли, например морская капуста и морские водоросли (закате), красные водоросли, зеленые водоросли и одноклеточные зеленые водоросли; микроорганизмы, такие как Вак1бютусе1ек (например, БуорНуНит и1тагшт, Еуорйу11ит бесайек, ΡΗοΙίοΙα патеко, СойшеНик кЫйаке, Б1атти1та уешбрек, Лдабсик окбеаШк и Рака11ю1а сатрекбгк), Лксотусе1ек (например, Согбусерк тбйапк и другие виды Согбусерк), дрожжи, гифомицеты (например, виды ЛкретдШик) и бактерии (например, ВасШик пайо и бактерии молочнокислого брожения); и животные, такие как позвоночные животные, беспозвоночные животные, включая кожу свиней, кожу коров, хрящ акулы, хрящ кита и т. д. По настоящему изобретению можно использовать вещество, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производные уроновой кислоты, полученное из указанных выше растений, микроорганизмов или животных.

Более того, по настоящему изобретению можно использовать следующие сельскохозяйственные и рыбные продукты или обработанные пищевые продукты, как таковые или после высушивания/измельчения в качестве вещества, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты. Они представляют собой кожуру фрукта, выжимку фрукта (такого как яблоко или мандарин), выжимку овоща, выжимку зерен (такую, которую получают при приготовлении саке [японского рисового вина], пива, кйосйи [японского перегнанного спирта] и виски), выжимку бобов (такую как окага [вы жимка японских створоженных бобов]) и выжимку морских водорослей и т.п.

Вещество, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты, применяемое в настоящем изобретении, может быть использовано как таковое или может быть подвергнуто любым обычным способам обработки, таким как кипячение, выпечка, запекание, поджаривание, отварирание, обработка паром, жарка, глубокое прожаривание и т.п., в качестве предварительной обработки.

Более того, в настоящем изобретении вещество, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты, может быть подвергнуто указанной выше химической, ферментативной (включая ферментацию с использованием микроорганизмов) или физической предварительной обработке, и полученное обработанное вещество как таковое или очищенное вещество, полученное из указанного полученного вещества, также может быть использовано.

Вещество, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, содержит соединение, которое обладает способностью взаимодействовать с уроновой кислотой, производным(ыми) уроновой кислоты, промежуточными продуктами для получения циклопентенона и веществами, обладающими способностью взаимодействовать с циклопентеноном, такими как амины, аминокислоты, пептиды и/или белок, и для получения циклопентенона предпочтительно проводить предварительную обработку, при которой по меньшей мере часть реакционной способности таких реакционноактивных веществ исчезает и/или по меньшей мере часть указанных реакционно-активных веществ удаляется. Не существует особых ограничений в отношении указанной предварительной обработки, хотя предпочтительно сухое нагревание. Например, из вещества, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты, удаляют воду и затем нагревают при 60-400°С в течение от нескольких секунд до нескольких дней с получением вещества, которое содержит сахарид, содержащий уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты. Для получения циклопентенона или его оптически активного соединения по настоящему изобретению пригодны белки и т. п., которые являются нерастворимыми, денатурированными или инактивированными. Примером способа обработки сухим нагреванием является обработка пропеканием/прожариванием с применением горячего воздуха, как указано в японской выложенной патентной публикации Не1-02/79965, и с помощью указанного способа может быть эффектив но получено большое количество термообработанного вещества, т.е. пропеченного/прожаренного вещества. Не существует особых ограничений в отношении пропеченного/прожаренного вещества и его примерами являются пропеченные/прожаренные растения, животные и микроорганизмы, такие как пропеченные/прожаренные овощи, фрукты, зерна, грибы, морские водоросли, кора, хрящ. Другим примером является фракция, которую получают путем обработки указанного сахаридсодержащего вещества протеазой с последующим удалением из него разрушенных белков. Другими примерами являются фракция, полученная путем размельчения указанного сахаридсодержащего вещества с последующим промыванием водой, фракция, полученная путем подвергания указанного сахаридсодержащего вещества предварительной обработке кислотой, и фракция, полученная путем подвергания указанного сахаридсодержащего вещества щелочами. Все предварительно обработанные вещества, богатые циклопентеноном, как и те, которые пригодны для получения циклопентенона, охватываются веществом, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, как определено настоящим изобретением.

Промежуточное соединение для получения циклопентенона означает вещество, которое образуется во время термической обработки уроновой кислоты, производного(ых) уроновой кислоты, сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и вещество, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и которое превращается в циклопентенон в результате последующей реакции. Примерами промежуточного соединения для получения циклопентенона служат декарбоксилированные продукты уроновой кислоты, дегидратированные продукты уроновой кислоты и декарбоксилированные/дегидратированные продукты уроновой кислоты.

Полисахариды, которые являются сахаридными соединениями, содержащими уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, могут быть произведены известными химическими, ферментативными или физическими методами. В случае пектина, например, может быть получен высокомолекулярный полисахарид, экстрагированный, например, из кожуры цитрусовых фруктов или яблок. Сырьем для получения в промышленном масштабе являются фрукты, и в дополнение к выжимке (в основном включающей внутриплодник) после получения сока цитрусовых фруктов, таких как лимон и лайм, также используются выжимки после получения яблочного сока. Такие выжимки преимущественно содержат нерастворимый протопектин и их солюбилизируют (экстраги руют) в процессе производства для получения пектина. Солюбилизацию можно проводить путем экстракции подкисленной водой, от теплой до горячей, когда условия, такие как температура, рН и время экстракции должным образом контролируются в зависимости от типа исходного материала, возможно получать пектин, обладающий заданным заранее молекулярным весом и степенью этерификации с высоким выходом. Экстракт очищают с помощью центрифугирования или фильтрации и концентрируют и туда добавляют спирт, с помощью которого пектин может быть осажден и извлечен. Извлеченный осадок высушивают и измельчают для получения сухого пектина.

Основой структуры пектина служит частично метилированный полимер галактуроновой кислоты. Карбоксильная группа либо этерифицирована метилом, либо остается свободной кислотой, либо превращается в соль, такую как соль аммония, соль калия или соль натрия. В зависимости от степени этерификации метилом (ЭМ; отношение метоксильных групп к общему количеству карбоксильных групп), пектин подразделяют на НМ пектин, имеющий высокий ΌΜ, и ЬМ пектин, имеющий низкий ΌΜ [НапбЬоок о£ Ма!ейак £ог Эсус1ор1пд Νον Рооб Ргобисб, под редакцией §а!о§Ы Уо^Ыхит! с1 а1., публикация К.К. Копи, стр. 114-119 (1991)], и в настоящем изобретении можно применять пектин, который коммерчески доступен как пищевая добавка [НапбЬоок о£ Ыа!ига1 Ргобисб, под редакцией Акю Тоуата с1 а1., издательство ЗкокиЫп То Кадакизка, 12-е издание, стр. 138 (1993)], коммерчески доступный НМ пектин и ЬМ пектин и т.д. [см. вышеуказанный НапбЬоок о£ Ма1спа15 £ог Эсус1ор1пд Νον Рооб Ргобисб].

Уроновая кислота, производные уроновой кислоты, олигосахариды и т.д., которые получают синтетическим путем, также могут быть использованы по настоящему изобретению.

Термообработанное вещество, применяемое в настоящем изобретении, может быть получено с использованием вещества, выбранного из (а) уроновой кислоты или производного(ых) уроновой кислоты, (Ь) сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и (с) вещества, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное (ые) уроновой кислоты, в качестве исходного материала.

Нет особых ограничений для способа термообработки при получении термообработанного вещества, используемого в настоящем изобретении, в той мере, в которой может быть получен циклопентенон по настоящему изобретению. Так, например, уроновую кислоту, производное(ые) уроновой кислоты, сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, или веще ство, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты нагревают при 60350°С в течение от нескольких секунд до нескольких дней или предпочтительно при 80150°С в течение от нескольких минут до нескольких дней. В случае пектина термообработанное вещество, содержащее циклопентенон, может быть получено нагреванием, например, при 80-150°С в течение от нескольких минут до нескольких дней. В противоположном варианте, когда нагревают уроновую кислоту, лактон уроновой кислоты или эфир уроновой кислоты при 60-150°С в течение от нескольких минут до нескольких дней, может быть получено желаемое термообработанное вещество, содержащее циклопентенон. Такое термообработанное вещество содержит транс-циклопентенон и небольшое количестве цис-циклопентенона, в которых гидроксильные группы в положениях 4 и 5 находятся в транс- и цис-конфигурациях соответственно. Подтверждено, что транс-циклопентенон и небольшое количество цис-пентенона содержатся в этом термообработанном веществе, при введении циклопентенона, очищенного из этого термообработанного вещества, в реакцию с уксусным ангидридом в безводном пиридине, и отделении образующегося 4,5-диацетилциклопентенона колоночной хроматографией на силикагеле с последующим структурным анализом каждой из фракций с помощью ядерного магнитного резонанса.

Нет особых ограничений для величины рН при температурной обработке, и ее предпочтительно проводить в условиях от нейтральной до кислой среды. В процессе нагревания рН можно устанавливать в зависимости от вида используемых продуктов, но обычно образованию циклопентенона способствует нагревание в кислой среде.

Нет особых ограничений в отношении концентрации продуктов при термообработке в той мере, насколько концентрация находится в таком диапазоне, что образуется циклопентенон, и они могут быть установлены с учетом технологичности процесса, выхода и т.д.

Термообработка по настоящему изобретению может представлять собой либо влажное нагревание, либо сухое нагревание, хотя в отношении эффективности получения циклопентенона настоящего изобретения предпочтительно влажное нагревание. В случае влажного нагревания может быть применен любой из способов влажного нагревания, такой как нагревание паром, нагревание с паром при высоком давлении, нагревание при высоком давлении и т.д., в то время как в случае сухого нагревания может быть применен любой из способов сухого нагревания, такой как прямое нагревание сухим и горячим воздухом и непрямое нагревание горячим источником через перегородки. Примерами сухого нагревания является сухое нагревание воздушной струёй и сухое нагревание разбрызгиванием, а примерами непрямого нагревания служит сухое нагревание в барабане и т.д.

Циклопентенон в термообработанном продукте, применяемом в настоящем изобретении, может быть выделен при использовании в качестве показателя противоракового действия, антибактериального действия, индуцирующего апоптоз действия и т.д. В отношении способов выделения может быть использован любой из известных способов очистки и выделения, таких как химические методы и физические методы. Так, могут быть совместно применены методы очистки, которые уже известны, такие как гельфильтрация, фракционирование с помощью мембраны, фракционирующей по молекулярному весу, экстракция растворителем, фракционная перегонка, различные хроматографические методы, использующие ионообменную смолу или прямую или обращенную фазу и т.д., с помощью которых циклопентенон, образовавшийся в термообработанном веществе, может быть выделен.

Например, когда в качестве уроновой кислоты применяют Ό-глюкуроновую кислоту, и ее 1% раствор нагревают при 121°С в течение 4 ч, в термообработанном веществе образуется циклопентенон. Циклопентенон из этого термообработанного вещества экстрагируют растворигелем и экстракт концентрируют. Затем этот концентрированный экстракт разделяют с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, фракцию элюированного циклопентенона концентрируют и циклопентенон экстрагируют хлороформом из концентрата, в результате чего выделяют циклопентенон из термообработанного вещества.

В противоположном варианте указанную выше термообработанную глюкуроновую кислоту помещают на колонку с ионообменной смолой, предпочтительно анионообменной смолой, и неадсорбированную фракцию собирают, в результате чего счищают циклопентенон. В другом противоположном варианте указанную выше термообработанную глюкуроновую кислоту помещают на колонку с активированным углем, неадсорбированную фракцию удаляют и колонку промывают и элюируют гидрофильным органическим растворителем, таким как водный раствор этанола (предпочтительно водный раствор этанола с концентрацией 40% или выше), благодаря чему получают очищенный циклопентенон. При объединении этих методов может быть получен циклопентенон высокой степени чистоты.

Когда выделенный циклопентенон подвергают оптическому разделению, можно получить (-)-4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он и (+)4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он по настоящему изобретению. Само собой разумеется, что циклопентенон, полученный синтетическим способом, также может быть подвергнут опти ческому разделению по способу настоящего изобретения.

Разделение оптически активных веществ можно проводить путем механического разделения рацемической смеси, предпочтительно кристаллизации, разделения с помощью кристаллизации в виде солей диастереомеров или в виде присоединяемых соединений, динамического разделения с применением ферментов или микроорганизмов, разделения с помощью хроматографии и т.п.

В случае разделения с помощью хроматографии может быть использована газовая хроматография, жидкостная хроматография, тонкослойная хроматография и т.п., и может быть использована хиральная стационарная фаза, которая подходит для каждой из них.

Способ с применением хиральной стационарной фазы, способ с применением хирального элюата, разделение в виде диастереомеров и т.д. могут быть использованы для оптического разделения с помощью жидкостной хроматографии.

В качестве хиральной стационарной фазы может быть применена стационарная фаза амидного типа, она же мочевинного типа, она же лиганд-обменного типа, стационарная фаза полисахарид-производное полисахарида, белковая стационарная фаза, стационарная фаза эфира полиметакриловой кислоты, стационарная фаза полиметакриламида и т.п.

В отношении элюирующей жидкости, жидкости типа гексана, типа спирта, типа воды (буфера) и т.д. могут быть подходящим образом использованы, принимая во внимание сочетание с вышеупомянутой стационарной фазой.

В качестве способа получения циклопентенона, применяемого в настоящем изобретении, может применяться любой способ. Так, циклопентенон можно получать способом, описанным в настоящем изобретении, или химическим синтезом [СагЬоиуйга!е Рс5сагс11. том 247, стр. 217-222 (1993); НекеОса СЫшюа Ас!а, том 55, стр. 2838-2844 (1972)], и в настоящем изобретении применяются транс- и цис-соединения циклопентенона. Нет необходимости отмечать, что оптически активные производные циклопентенона, полученные химическим синтезом, входят в оптически активное вещество по настоящему изобретению. Далее может быть также использован циклопентенон, который получают из термообработанного вещества, по меньшей мере одного, выбранного из уроновой кислоты, производного уроновой кислоты, сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту и/или производное уроновой кислоты, и вещества, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, а также очищенного продукта и оптически активного его вещества.

Циклопентенон и его оптически активное вещество проявляют ингибирующее действие на рост клетки и противораковое действие по отношению к раковым клеткам, таким как клетки НЬ-60 промиелоицитной лейкемии человека, клетки МОЬТ-3 острой лимфобластной лейкемии человека, клетки А-549 рака легких, 8У40трансформированные клетки ХУ1-38УА13 рака легких, клетки Нер 02 гепатомы, клетки ХУЮг рака ободочной кишки человека, клетки АО8 рака желудка и клетки миеломы. Таким образом, циклопентенон и его оптически активное производное могут быть использованы в качестве действующих компонентов противоракового средства. Они также обладают апоптозиндуцирующим действием на эти раковые клетки. Механизм действия в плане ингибирования роста раковой клетки циклопентеноном настоящего изобретения и его оптически активного производного совершенно не ограничивает объем изобретения и, например, апоптозиндуцирующее действие на раковые клетки охватывается настоящим изобретением.

Когда в качестве активного ингредиента используют циклопентенон и/или его оптически активное производное, обладающее противораковым действием, и фармацевтический препарат получают путем смешивания с известными фармацевтическими носителями, то можно получить противораковое средство. Обычно, циклопентенон и/или его оптически активное вещество смешивают с фармацевтически приемлемым жидким или твердым носителем и, если необходимо, добавляют растворитель, диспергирующий агент, эмульгатор, буфер, стабилизатор, наполнитель, связующее средство, разрыхляющий агент, смазывающий агент и т.д., с получением противоракового средства, которое может быть в твердом виде, таком как таблетки, гранулы, разбавленные порошки, порошки, капсулы и т. д., или в жидком виде, таком как растворы, суспензии, эмульсии и т.п. Далее он может быть в виде сухого препарата, который может быть преобразован в жидкий путем добавления перед употреблением соответствующего носителя.

Фармацевтический носитель может быть выбран в зависимости от указанного выше способа введения и формы приготовления. В случае приготовления для перорального введения могут применяться крахмал, лактоза, сахар, маннитол, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, неорганические соли и т.п. При получении пероральных препаратов дополнительно с ними могут смешиваться связующие агенты, разрыхляющие агенты, поверхностно-активные агенты, смазывающие агенты, стимуляторы разжижения, средства, корректирующие вкус, окрашивающие агенты, отдушки и т.п.

С другой стороны, в случае препаратов для парентерального введения, они могут быть приготовлены с помощью обычных методов, в них циклопентенон и/или его оптически активное соединение, которые являются действующим ингредиентом по настоящему изобретению, растворяют или суспендируют в растворителе, таком как дистиллированная вода для инъекций, физиологический солевой раствор, водный раствор глюкозы, растительное масло для инъекций, кунжутное масло, арахисовое масло, соевое масло, кукурузное масло, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.д., с последующим добавлением к ним, если необходимо, бактерицидных агентов, стабилизаторов, изотонических агентов, анальгетиков и т. д.

Противоопухолевый агент по настоящему изобретению вводят по соответствующей схеме, зависящей от вида препарата. Не существует особого ограничения метода введения как такового, и он может быть введен путем перорального употребления, наружного употребления и инъекции. Инъекцию делают, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно и т.п., в то время как препараты для наружного применения включают суппозитории и т. п.

Доза противоопухолевого агента соответствующим образом определяется видом его препарата, методом введения, целью применения и возрастом, массой тела и симптомами больного, подвергаемого лечению, и не всегда, но обычно количество циклопентенона и/или его оптически активного вещества, содержащееся в препарате, составляет от 0,1 мкг до 200 мг/кг в день (для взрослых). Конечно, доза может изменяться в зависимости от различных условий и, следовательно, в некоторых случаях может быть достаточной меньшая доза, чем указанные выше, в то время как в других случаях может быть необходима доза, большая, чем указанные выше. Фармацевтический агент по настоящему изобретению может быть введен непосредственно перорально, и дополнительно он может быть добавлен к любой пище и напитку, так что агент может быть употреблен обычным путем.

Циклопентенон и/или его оптически активное производное обладают противораковым действием и в низких концентрациях они проявляют способность индуцировать дифференцирование раковых клеток, благодаря чему они пригодны в качестве индуктора дифференцирования (демаглигнизирующего агента) для раковых клеток. Индуктор дифференцирования раковых клеток, содержащий циклопентенон и/или его оптически активное производное в качестве активного ингредиента, может быть включен в фармацевтические препараты в соответствии с указанным выше методом для противоопухолевых агентов и может быть введен методом, подобным применяемому для противоопухолевых агентов.

Доза индуктора дифференцирования раковых клеток соответствующим образом опреде ляется видом препарата, методом введения, целью применения и возрастом, массой тела и симптомами больного, подвергаемого лечению, и не всегда, но обычно количество циклопентенона и/или его оптически активного вещества, содержащееся в препарате, составляет от 0,1 мкг до 100 мг/кг в день (для взрослых). Конечно, доза может изменяться в зависимости от различных условий и, следовательно, в некоторых случаях может быть достаточной меньшая доза, чем указанные выше, в то время как в других случаях может быть необходима доза, большая, чем указанные выше. Фармацевтическое средство по настоящему изобретению может быть введено непосредственно перорально, и дополнительно оно может быть добавлено в любой пищевой продукт и напиток, так что агент может быть употреблен обычным путем.

Индуктор дифференцирования раковых клеток по настоящему изобретению может быть применен в методе индукции дифференцирования раковых клеток. Так, при применении циклопентенона и/или его оптически активного вещества в качестве действующего ингредиента можно вызвать дифференцирование раковых клеток, и такой метод выгоден для выяснения механизма индукции дифференцирования раковых клеток, для скрининга индукторов дифференцирования и т.д.

Когда циклопентенон и/или его оптически активное производное используются в качестве активного ингредиента и вводятся в состав фармацевтического препарата путем объединения с известными фармацевтическими носителями, может быть получено антибактериальное средство.

Обычно циклопентенон и/или его оптически активное вещество смешивают с фармацевтически приемлемым жидким или твердым носителем и, если необходимо, добавляют растворитель, диспергирующий агент, эмульгатор, буфер, стабилизатор, наполнитель, связующее средство, разрыхляющий агент, смазывающее средство и т.д., что дает препарат в твердом виде, такой как таблетки, гранулы, разбавленные порошки, порошки, капсулы и т.д., или в жидком виде, таком как растворы, суспензии, эмульсии и т.п. Далее он может быть в виде сухого препарата, который может переходить в жидкий при добавлении перед употреблением соответствующего носителя.

Фармацевтический носитель может быть выбран в зависимости от указанного выше способа введения и формы приготовления. В случае приготовления для перорального введения могут применяться крахмал, лактоза, сахар, маннитол, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, неорганические соли и т.п. При получении пероральных препаратов дополнительно с ними могут смешиваться связующие агенты, разрыхляющие агенты, поверхностно-активные агенты, смазывающие агенты, стимуляторы разжижения, средства, корректирующие вкус, окрашивающие агенты, отдушки и т. п.

С другой стороны, в случае препаратов для парентерального введения, они могут быть получены обычными способами, в них циклопентенон и/или его оптически активное вещество, которые являются действующим ингредиентом по настоящему изобретению, растворяют или суспендируют в растворителе, таком как дистиллированная вода для инъекций, физиологический солевой раствор, водный раствор глюкозы, растительное масло для инъекций, кунжутное масло, арахисовое масло, соевое масло, кукурузное масло, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.д., с последующим добавлением к ним, если необходимо, бактерицидных агентов, стабилизаторов, изотонических агентов, анальгетиков и т.д.

Антибактериальный агент по настоящему изобретению вводят по соответствующей схеме, зависящей от вида препарата. Не существует особого ограничения метода введения как такового, и он может быть введен путем перорального употребления, наружного употребления и инъекции. Инъекцию делают, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно и т.п., в то время как препараты для наружного применения включают суппозитории и т. п.

Доза антибактериального агента соответствующим образом определяется видом его препарата, методом введения, целью применения и возрастом, массой тела и симптомами больного, подвергаемого лечению, и не всегда, но обычно количество циклопентенона и/или его оптически активного вещества, содержащееся в препарате, составляет от 10 мкг до 20 мг/кг в день (для взрослых). Конечно, доза может изменяться в зависимости от различных условий, и, следовательно, в некоторых случаях может быть достаточной меньшая доза, чем указанные выше, в то время как в других случаях может быть необходима доза, большая, чем указанные выше. Фармацевтический агент по настоящему изобретению может быть введен непосредственно перорально, и дополнительно он может быть добавлен к любому пищевому продукту и напитку, так что агент может быть употреблен обычным путем. Кроме того, вещество, которое содержит циклопентенон и/или его оптически активное вещество, может применяться в качестве сырья для антибактериального пищевого продукта и напитка. Далее, оно может применяться вместе с этанолом, глицином, ацетатом натрия, аскорбиновой кислотой, эфирами глицерина с жирными кислотами, солью, ЭДТА и другими веществами с активностью антибиотиков.

Антибактериальный агент по настоящему изобретению, содержащий циклопентенон и/или его оптически активное вещество в качестве действующего ингредиента, может быть ис пользован в качестве антисептического агента для улучшения сохранности пищи или напитка. Кроме того, циклопентенон и/или его оптически активное производное добавляют в пищевой продукт или напиток, с которыми он/они могут быть использованы при применении способа создания антисептических пищевого продукта или напитка.

Форма добавляемого в пищевой продукт или напиток антибактериального агента, содержащего циклопентенон и/или его оптически активное вещество, может быть любой: жидкой, пастообразной, в виде порошка, хлопьеобразной, гранулированной и т.д. Если учитывать применение простого способа обработки или смешивания с другими аддитивными компонентами, предпочтительно создавать агент в порошкообразной, хлопьевидной или гранулированной форме путем высушивания. Что касается способа высушивания, может применяться один из обычно используемых способов, таких как высушивание распылением, высушивание в барабане, ламинарная сушка, вакуумная сушка, лиофильная сушка и т.д.

Количество циклопентенона и/или его оптически активного производного, добавляемого в пищевой продукт или напиток, может применяться в зависимости от вида пищевого продукта или напитка, и количество их приемов может быть увеличено.

Один из способов применения антибактериального агента настоящего изобретения заключается в том, что агент добавляют в пищевой продукт или напиток подходящим способом. Нет специального ограничения для способа добавления, но в конце концов циклопентенон и/или его оптически активное вещество содержится(атся) в пище или напитке, поступая любым способом. Соответственно, при применении антибактериального агента настоящего изобретения термин добавление охватывает все способы, с помощью которых циклопентенон и/или его оптически активное вещество оказываются в пище или напитке. Хотя общим способом является его/их добавление на этапах производства пищевого продукта или напитка, может быть также применен способ, при котором пищевой продукт погружают в раствор, содержащий циклопентенон и/или его оптически активное вещество. Возможно также применять способ его добавления в пищевой продукт одновременно со способом погружения пищевого продукта в раствор. Примерами пищевого продукта, который подходит для способа погружения, является пищевой продукт, который не теряет своей формы даже в воде перед замораживанием, такой как рыба или отбивная из мяса домашнего скота (например, катайоко [вареная рыбная отбивная] и венская колбаска), лапша (например, отварная лапша) и мороженный продукт из рыбы, моллюсков, крабов и других морских животных, имеющих панцирь, креветок.

При применении антибактериального агента по настоящему изобретению в качестве антисептического агента сохранность пищи или напитка может быть дополнительно улучшена. В случае замороженной пищи или замороженного десерта рост сопутствующих микроорганизмов на стадии обработки перед замораживанием может быть подавлен, благодаря чему может быть получен очень благоприятный результат в плане гигиены. Антибактериальный агент по настоящему изобретению эффективен в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, и очень эффективен, например, в отношении резистентных к лекарствам бактериям, таким как метициллинрезистентному 8сарйу1ососсик аиге1ик и бактериям, которые вызывают пищевое отравление, таким как 8а1тоие11а, энтеротоксинпродуцирующие 8!арйу1ососсик аиге1ик, Вассйик сегеик рвотного типа, Вассйик сегеик диарейного типа и энтероррагических ЕксйепсЫа сой 0-157. Он также эффективен в отношении бактерий ЫосЫ. Далее, он проявляет антибактериальное действие по отношению к микроорганизмам, вызывающим заболевания, которые вызываются микроорганизмами, такими как ЬедюиеПа риеиторййа (микроорганизм, вызывающий болезнь легионеров), У1Ьпо рагайаето1уйсик (микроорганизм, вызывающий пищевое отравление), НейсоЬас!ег рПоп (микроорганизм, вызывающий язву), Сатру1оЬас!ег _)е.)иш (микроорганизм, вызывающий энтерогастрит) и т.д., включая ЬедюиеПа риеиторййа (АТСС 33153), У1Ьпо рагайаето1уйсик (АТСС 17802), НейсоЬас!ег рПоп (ЫСТС 11637), Сатру1оЬас!ег _)е.)ип1 (АТСС 29428) и т.д. Он также эффективен в отношении таких микроорганизмов, как дрожжи и грибы. Антисептический агент, содержащий циклопентенон и/или его оптически активное вещество, полученный из натуральной пищи, особенно полезен в качестве натурального предохраняющего от пищевого отравления агента и в качестве стерилизующего агента. В данном случае стерилизация одежды, постельного белья и т. д. может проводиться с применением антибактериального агента по настоящему изобретению, и когда проводят разбрызгивание антибактериального агента по настоящему изобретению или пропитывание антибактериальным агентом по настоящему изобретению, возможно стерилизовать (как для удаления, так и для уничтожения бактерий) объект, подлежащий стерилизации. Например, когда его добавляют в воду для воздушного кондиционирования офисных зданий, это может предотвратить болезнь легионеров.

Антибактериальный агент по настоящему изобретению проявляет антибактериальное действие по отношению к бактериям, вызывающим кариес зубов и вызывающим периодонтальное заболевание, и могут быть предложены пероральные препараты, содержащие антибактери альный агент по настоящему изобретению. Форма перорального препарата может быть известной, такой как жидкость или паста. Примером перорального препарата служит средство для чистки зубов. Средство для чистки зубов может быть в известной форме, такой как жидкость, паста или порошок. Нет особого ограничения в отношении количества циклопентенона и/или его оптически активного производного в средстве для чистки зубов, и если в нем содержится эффективная концентрация в отношении бактерий, вызывающих кариес зубов и периодонтальное заболевание, этого будет достаточно. К средству для чистки зубов могут быть добавлены известные добавки, такие как увлажняющие агенты, поверхностно-активные агенты, связующие агенты, отдушки, подсластители и т.д. В качестве активного ингредиента средства для чистки зубов по настоящему изобретению могут быть использованы циклопентенонсодержащие вещества, такие как термообработанные овощи, фрукты и т.д., пероральный препарат, содержащий такой термообработанный продукт, который содержит циклопентенон, такой как средство для чистки зубов, может быть также включен в объем настоящего изобретения.

Можно предложить антибактериальные косметические средства с применением антибактериального агента по настоящему изобретению. Примерами косметических средств по настоящему изобретению являются основные косметические средства, содержащие эффективное количество циклопентенона и/или его оптически активного вещества в таких формах, как крем, очищающее молочко, лосьон, материал и тампон для умывания; декоративная косметика, такая как помада и основа под макияж; мыло для тела и мыло. Оно также применимо для волос и может быть введено в продукты по уходу за волосами, включая такие продукты для волос, как средство для укрепления волос, жидкость для волос, лосьон для укладки волос, средство для придания объема волосам, крем для волос и лак для волос; туалетные средства для волос, такие как шампунь, ополаскиватель и средство для обработки волос. Обычно его количество в косметических средствах составляет от 10^-3 до 10 частей (по массе, применяемое здесь далее в том же смысле) или предпочтительно от 10^-2 до 1 части циклопентенона и/или его оптически активного производного на 100 частей косметического препарата. Что касается других ингредиентов, могут быть применены те, которые предварительно смешаны с косметическими средствами. Косметический продукт по настоящему изобретению эффективно действует на микроорганизмы, вызывающие атопический дерматит и оказывает значительное облегчающее и профилактическое действие в отношении атонического дерматита.

Можно также предложить средство для ванн с применением антибактериального агента настоящего изобретения. Средство для ванн по настоящему изобретению может быть выполнено в виде порошка, гранул, твердого вещества, жидкости и т.д., содержащих эффективное количество циклопентенона и/или его оптически активного вещества. Смешиваемое количество в отношении агента для ванн составляет обычно около 10-100 частей (по массе, применяемое здесь далее в том же смысле) или предпочтительно 20-90 частей циклопентенона и/или его оптически активного вещества на 100 частей агента для ванны. Обычно на 200 л горячей воды добавляют около 5-25 г средства для ванн, приготовленного таким образом. Что касается других ингредиентов средства для ванн, могут использоваться те, которые обычно смешиваются с ним. Средство для ванн по настоящему изобретению эффективно действует на микроорганизмы, вызывающие атопический дерматит, а также оказывает значительное облегчающее и профилактическое действие при атопическом дерматите. Он эффективен для уничтожения вызывающих его микроорганизмов в ванной комнате.

Как таковое настоящее изобретение относится к антибактериальному средству, которое может использоваться в качестве фармацевтического, косметического агентов и средства для ванн. Кроме того, пищевой продукт или напиток, содержащие циклопентенон и т.д., очень полезны для облегчения и/или предотвращения пищевого отравления, энтерогастрита и т.д.

Индуктор апоптоза по настоящему изобретению содержит апоптоз-индуцирующий циклопентенон и/или его оптически активное производное в качестве активного ингредиента(ов). Он может быть введен в фармацевтические препараты тем же способом, что и в вышеуказанном случае противораковых средств, и его вводят таким же образом, как и для противораковых средств.

Доза индуктора апоптоза не является специально определенной, но может соответствующим образом определяться в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели применения и возраста, массы тела, состояния и т. д. больного, которому вводят индуктор апоптоза. Обычно, однако, количество циклопентенона и/или его оптически активного производного, содержащееся в препарате, для взрослых составляет от 0,1 мкг до 100 мг/кг в день. Само собой разумеется, конечно, доза может изменяться в зависимости от различных факторов и, следовательно, в некоторых случаях может быть достаточной меньшая доза, чем указанные выше, в то время как в других случаях может быть необходима доза, большая, чем указанные выше. Агент по настоящему изобретению может быть введен перорально как таковой, и, кроме того, агент можно также принимать, ежедневно добавляя его в обычный пищевой продукт и/или напиток.

В отличие от некроза, представляющего собой патогенетическую смерть клеток, апоптоз, как полагают, является смертью, самой по себе изначально интегрированной в ген клетки. Таким образом, ген, который программирует апоптоз, активируется определенными внешними или внутренними причинами, благодаря чему на основе указанного гена происходит биосинтез белка, программируемого геном смерти, и затем сама клетка разрушается и умирает в результате действия образованного белка с запрограммированной гибелью.

Индуктор апоптоза по настоящему изобретению достаточно полезен, поскольку он способен вызывать такой апоптоз в желаемых тканях и клетках, и может или способен удалять ненужные или патогенные клетки из живых организмов в естественных условиях.

Индуктор апоптоза по настоящему изобретению может быть применен в способе индукции апоптоза. Так, когда в качестве активного ингредиента применяют циклопентенон и/или его оптически активное производное, можно индуцировать апоптоз, и указанный способ может использоваться, например, для определения механизма индукции апоптоза и для скрининга индукторов апоптоза и ингибиторов индукции апоптоза.

Нет особого ограничения на антибактериальный пищевой продукт или напиток по настоящему изобретению, и их примерами являются обработанные сельскохозяйственные и лесные продукты, обработанные мясные продукты, обработанные рыбные продукты и т.д., а также обработанные зерна (например, обработанная пшеничная мука, обработанный крахмал, обработанный премикс, лапша, макароны, хлеб, бобовая паста, зоЬа [гречишная лапша], Ги [хлеб из пшеничной клейковины], ЬйГип [китайская лапша, сделанная из рисовой муки], кагизате [плитки бобового желе] и упакованный рисовый кекс), обработанный жир/масло (например, пластичные жир/масло, масло для глубокого прожаривания, прованское масло, майонез и приправа), обработанная соя (например, 1оГн [створоженная соя], очко [соевая паста] и иайо [ферментированная соя]), обработанные мясные продукты (например, ветчина, бекон, прессованная ветчина и колбаса), рыбные продукты (замороженная рыбная паста, катаЬоко [вареная рыбная паста], сЫки^а [вид продукта из рыбной пасты], катрен [пирог из растолченной рыбы], за!знта-аде [обжаренные рыбные шарики], 1знт1ге [рыбные шарики, приготовленные на пару], 8ир [паста из недоваренной рыбы], ветчина из мяса рыбы, колбаса, высушенный тунец, обработанные продукты из икры рыб, консервированные рыбные продукты и 1знкнйап1 [пища, приготовленная кипячением в соевом соусе]), молочный продукт (например, простокваша, сливки, йогурт, масло, сыр, концентрированное молоко, сухое молоко и мороженое), обрабо танные овощные и фруктовые продукты (например, пюре, джемы, соления, фруктовые напитки, напитки из овощей и смешанные напитки), кондитерские продукты (например, шоколад, бисквит, сдобные булочки с изюмом, кекс, тосЫдазЫ [круглый рисовый пирог] и рисовые крекеры), алкогольные напитки (например, сакэ [японское рисовое вино], китайские вина, вино, виски, зкоски [японский перегнанный ликер], водка, бренди, джин, гат, пиво, охлажденные алкогольные напитки, фруктовое вино и ликеры), напитки к столу (например, зеленый чай, чай, черный китайский чай, кофе, освежающий напиток и напиток с молочной кислотой), приправы (например, соевый соус, ^оозкег соус, уксус и тти (подслащенное японское вино), консервированная, бутилированная и упакованная в мешки пища (например, вареный рис с мясом и приправой, кататезЫ [вареный рис, помещенный в маленький горшочек], зек ί кап [праздничный красный рис], рис с кэрри и другие полностью приготовленные пищевые продукты), полусухая или концентрированная пища (например, печеночный паштет и другие пасты, суп для зоЬа и ийоп [оба являются типичными видами японской лапши] и концентрированный суп), сухая пища (например, лапша быстрого приготовления, кэрри быстрого приготовления, кофе быстрого приготовления, сок в порошке, суп в порошке, суп из соевой пасты быстрого приготовления, сублимированная пища, сублимированный напиток и сублимированный суп), замороженная пища (например, замороженный зик1уак1, ска\\'аппшс1и [рагу из мяса и овощей, приготовленное в горшочке на пару], гамбургер, китайский зкао-та1, дуоха [зажаренная клецка, фаршированная измельченной свининой], различные плитки и фруктовые коктейли), твердые пищевые продукты, жидкие пищевые продукты (например, суп) и специи.

Не существует особых ограничений в отношении метода производства пищевого продукта и напитка по настоящему изобретению, но могут применяться приготовление, обработка и обычно применяемые способы производства пищевого продукта и напитка, обеспечивающие наличие в полученной пище или напитке циклопентенона и/или его оптически активного вещества.

Приготовление и обработка пищи должны проводиться таким образом, чтобы циклопентенон и/или его оптически активное производное содержались в термообработанном продукте из материала, выбранном из (а) уроновой кислоты или производного(ых) уроновой кислоты, (Ь) сахаридного производного, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и (с) вещества, содержащего сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты.

Таким образом, перед, в течение или после приготовления/обработки термообработанный продукт из материала, выбранного из (а) уроновой кислоты или производного (ых) уроновой кислоты, (Ь) сахаридного производного, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и (с) вещества, содержащего сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, которые содержат циклопентенон и/или его оптически активное вещество, можно добавлять или, в противном случае, приготавливаемый/обрабатываемый продукт или его исходный материал добавляют к термообработанному продукту из материала, выбранного из (а) уроновой кислоты или производного(ых) уроновой кислоты, (Ь) сахаридного производного, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и (с) вещества, содержащего сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, которые содержат циклопентенон и/или его оптически активное производное, тем самым циклопентенон и/или его оптически активное производное в указанном термообработанном веществе можно разбавить.

Далее, при производстве пищевого продукта или напитка термообработка может проводиться на любой стадии, благодаря чему циклопентенон и/или его оптически активное производное могут оказаться в термообработанном веществе, или, в противном случае, термообработанное вещество, которое содержит циклопентенон и/или его оптически активное вещество, может быть добавлено туда. Возможно также, чтобы пищевой продукт, напиток или их сырье добавляли к термообработанному веществу, которое содержит циклопентенон и/или его оптически активное производное, таким образом, что циклопентенон и/или его оптически активное производное в указанном термообработанном веществе может быть разбавлено. Добавление может проводиться либо однократно, либо в несколько этапов. Так, пищевой продукт и напиток, проявляющие новое физиологическое действие, могут производиться просто и удобно. В данном случае пищевой продукт или напиток, которые содержат циклопентенон и/или его оптически активное производное в термообработанном веществе, образующемся при производстве в виде составных компонентов после добавления (а) уроновой кислоты или производного(ых) уроновой кислоты, (Ь) сахаридного производного, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, и (с) вещества, содержащего сахаридное соединение, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты также охватываются настоящим изобретением. В случае, когда применяется любая из стадий, пищевой продукт или напиток, в кото рых содержатся циклопентенон и/или его оптически активное производное, добавленные и/или разбавленные, определяются как пищевой продукт или напиток по настоящему изобретению.

Нет особого ограничения на содержание циклопентенона и/или его оптически активного производного, обладающих физиологическим действием, в пищевом продукте, но содержание может быть соответствующим образом подобрано в свете органолептических свойств и физиологической активности, такой как противораковое и антибактериальное действие. Тем не менее, например, содержание циклопентенона и/или его оптически активного вещества в 100 частях пищевого продукта составляет 5 х 10^-6 частей или более, и в свете органолептических свойств и физиологического действия в качестве пищевого продукта предпочтительно от 10^-5 до 5 частей или более предпочтительно от 10^-4 до 2 частей.

Нет особого ограничения на содержание циклопентенона, обладающего физиологическим действием, в напитке, но содержание может быть соответствующим образом подобрано в свете органолептических свойств и физиологической активности, такой как противораковое и антибактериальное действие. Тем не менее, например, содержание циклопентенона в 100 частях напитка составляет 5 х 10^-6 частей или более, в свете органолептических свойств и физиологического действия напитка предпочтительно от 10^-5 до 5 частей или более предпочтительно от 10^-4 до 2 частей.

Нет конкретных ограничений для формы пищевого продукта или напитка по настоящему изобретению, в той мере, как циклопентенон и/или его оптически активное производное, обладающие физиологическим действием, таким как противораковое и антибактериальное действие, добавляется в них и/или разбавляется ими. Таким образом, форма включает потребляемые перорально формы, такие как таблетки, гранулы, капсулы, гель и золь.

Как указано выше, циклопентенон и/или его оптически активное производное, применяемые по настоящему изобретению, могут быть получены с небольшими затратами и, благодаря их различным физиологическим функциям, он/они могут быть применены в качестве добавки (добавок) к пище или напитку, благодаря чему теперь возможно легко снабдить различными физиологическими функциями, антибактериальной активностью, апоптоз-индуцирующим действием, противораковым действием и т. д. пищевой продукт или напиток. Таким образом, циклопентенон и/или его оптически активное вещество по настоящему изобретению являются достаточно полезными в качестве добавки (добавок) к пищевому продукту или напитку.

Циклопентенон и/или его оптически активное производное, применяемое по настоя щему изобретению, могут быть получены любым способом. Так, они могут быть получены способом, описанным в настоящем изобретении, или химическим синтезом. Таким образом, все: пищевой продукт, напиток, антибактериальные агенты, противораковые агенты, индукторы дифференцирования раковой клетки и индукторы апоптоза, содержащие циклопентенон и/или его оптически активное вещество, охватываются настоящим изобретением. Далее, все способы индукции дифференцирования раковой клетки и индукции апоптоза с применением циклопентенона и/или его оптически активного производного в качестве действующего(их) ингредиента(ов), также охватываются настоящим изобретением.

Циклопентенон и/или его оптически активное производное не проявляет(ют) токсичность на мышах при пероральном введении 100 мкг/кг.

Как указано здесь выше в совокупности, циклопентенон и/или его оптически активное производное могут быть легко получены с низкими затратами и, благодаря их различным физиологическим функциям, являются достаточно полезными в широкой области, включая фармацевтические препараты и пищевой продукт.

Примеры

Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано с помощью следующих примеров, которые, однако, не ограничивают объем настоящего изобретения. В данном случае термины % и часть(и), используемые в примерах, являются массовыми, если специально не оговорено иного.

Пример 1.

(1) Коммерчески доступный пектин, полученный из яблок, растворяли в воде в концентрации 1% и этот раствор помещали в яйцевидную колбу, снабженную дефлегматором, и нагревали на масляной бане при 110-120°С в течение 18, 42 и 66 ч. Температура раствора пектина во время нагревания была 100-102°С.

Раствор пектина центрифугировали для удаления преципитатами, надосадочную жидкость разбавляли 3- и 10-кратно водой для получения образцов. рН продукта после термообработки доводили до 7,0 с помощью ΝαΟΗ и измеряли его ингибирующее действие на рост промиелогенных лейкемических клеток человека (НЬ-60 клетки) (АТСС ССЬ-240) с помощью МТТ метода, который будет описан ниже.

То есть 10 мкл разбавленного образца и 100 мкл среды ΚΡΜΙ 1640 (производство Νίδδΐιί). содержащей 5000 НЬ-60 клеток, инкубировали при 37°С в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% плодной телячьей сыворотки (производство 61Ьсо), обработанной при 56°С в течение 30 мин, добавляли в ячейки 96-луночного планшета для микротитрования, инкубировали в присутствии 5% газообразного диоксида углерода при 37°С в течение 48 ч, добавляли 10 мкл забуференного фосфатом физраствора, содержащего 5 мг/мл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолия бромида (МТТ; производство 81дта), смесь дополнительно инкубировали в течение 4 ч и степень роста клеток исследовали под микроскопом. В данном случае добавляли 100 мкл 2-пропанола, содержащего 0,04н. НС1, смесь хорошо перемешивали и измеряли поглощение при 590 нм и использовали в качестве показателя клеточного роста.

В результате не наблюдали жизнеспособных клеток во фракции, к которой добавляли разбавленный в 3 раза раствор пектина, нагреваемого в течение 18 ч, и во фракциях, к которым добавляли 3- и 10-кратно разбавленный раствор пектина, нагреваемого в течение 42 и 66 часов, и при таких разведениях пектин, который нагревали при 100°С, проявлял ингибирующую активность в отношении клеточного роста.

С другой стороны, во фракции, к которой добавляли 10-кратно разбавленный раствор пектина, прогретого в течение 18 ч, почти все клетки были живыми, хотя по сравнению с фракцией, к которой добавляли воду, служившей контролем, поглощение при 590 нм было низким.

(2) К 200 мкл пектина, прогретого при 100°С в течение 18-66 ч, добавляли метанол (200 мкл) и перемешивали, смесь центрифугировали и 200 мкл надосадочной жидкости, концентрировали досуха под вакуумом. Его растворяли в 10 мкл 50% водного раствора метанола, 1 мкл этого раствора наносили на пластинку Е₂₅₄ силикагеля 60 (производство Мегск) и разгоняли разгоняющим растворителем (подвижная фаза, состоящая из смеси 3:1:1 бутилацетата, уксусной кислоты и дистиллированной воды). После разгонки тонкий слой силикагеля сушили, опрыскивали раствором АдООз-ЯНз (в равном объеме смеси 0,1 М ΛβΝΟνΝΗ;, и 5н. ΝΗ₃) и прогревали для выявления пятна.

В результате этого появлялось пятно с Κί (относительная подвижность) около 0,3 после прогревания пектина в течение 18 ч, его увеличение наблюдалось после прогревания пектина в течение 42 ч по сравнению с пектином, прогретым в течение 18 ч, и после прогревания пектина в течение 66 ч пятно было таким же, как после прогревания пектина в течение 42 ч.

(3) К 1 мл пектина, прогретого при 100°С в течение 66 ч, упомянутого в примере 1(1), добавляли метанол (1 мл) с последующим перемешиванием и центрифугированием для получения надосадочной жидкости. Последнюю концентрировали досуха под вакуумом и остаток суспендировали в 100 мкл метанола. Эту суспензию центрифугировали для удаления нерастворимых компонентов и надосадочную жидкость наносили на пластинку Е₂₅₄ силикагеля 60 и проводили разделение, используя растворитель, упомянутый в примере 1(2). Часть тонкослойной пластинки вырезали и окрашива29 ли в соответствии с методом примера 1(2) для подтверждения появления пятна в области Κί около 0,3, а часть силикагеля, соответствующую этой величине Κί, соскребали с неокрашенного тонкого слоя.

Силикагель после соскребания экстрагировали три раза по 1 мл метанола и экстракт концентрировали досуха под вакуумом для выделения пятна с величиной Κί около 0,3. Это высушенное вещество растворяли в 250 мкл воды, далее раствор разводили в 10 раз и 10 мкл разведенного раствора использовали в качестве образца для измерения ингибирующей клеточный рост активности в клетках НЬ-60 с помощью метода МТТ, описанного в примере 1(1).

В результате в лунках, в которые добавляли воду, большинство клеток продолжало расти, тогда как в лунках, в которые добавляли этот разведенный раствор, не обнаруживали жизнеспособных клеток. Таким образом, было подтверждено ингибирующее действие фракции, полученной после соскребания, в отношении роста раковых клеток.

(4) Масс-спектрометрический анализ вещества в области Κί 0,3, выделенного в примере 1(3), ингибирующего рост раковых клеток, проводили с помощью ΌΧ302 масс-спектрометра (производство Νίρροη ЭеикЫ). Дополнительно проводили структурный анализ с помощью метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР), используя дейтерированный хлороформ в качестве растворителя. Для ЯМР использовали аппарат 1ΝΜ-Ά500 (производство Νίρροη ЭегМи). Получены следующие результаты.

ΓΑΒ-Μ8 т/ζ 115 [М+Н]⁺

В качестве матрикса применяли глицерин.

Ή-ЯМР (СЭС1₃): δ 4,20 (1Н, д, 1=2,4 Гц, 5Н), 4,83 (1Н, м, 4-Н), 6,30 (1Н, дд, 1 = 1,2; 6,1 Гц, 2-Н), 7,48 (1Н, дд, 1 = 2,1, 6,1 Гц, 3-Н).

В данном случае величина химического сдвига ¹Н-ЯМР была представлена таким образом, чтобы величина химического сдвига СНС1₃ составляла 7,26 м.д.

Эти величины совпадали с данными для транс-4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленными АНтаб, е! а1. в СагЬойубга!е Кекеагей, уо1ите 247, цадек 217-222 (1993).

На фиг. 1 показан масс-спектр, на котором ордината представляет относительную интенсивность (%), а абсцисса представляет величины т/ζ.

На фиг.2 показан спектр Ή-ЯМР, где ордината представляет интенсивность сигнала, а абсцисса представляет величину химического сдвига (м.д.).

Пример 2.

Альгиновую кислоту (ненабухающую, производство \Уако Риге СНепйеак) (25 г) суспендировали в 475 мл воды, нагревали при 121°С в течение 2 ч и центрифугировали, полученную надосадочную жидкость фильтровали через мембранный фильтр 0,22 мкм и фильтрат концентрировали в вакууме до 20 мл. Концентрат смешивали с 180 мл этанола, давали постоять в течение 1 ч при 20°С и центрифугировали для получения надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость концентрировали в вакууме до 20 мл, добавляли 180 мл ацетонитрила, смесь центрифугировали, полученный супернатант концентрировали в вакууме до 20 мл, концентрат опять центрифугировали после добавления 180 мл ацетонитрила и надосадочную жидкость концентрировали до 15 мл в вакууме. Концентрированный раствор (4 мл) упаривали в вакууме до приблизительно 400 мкл и перемешивали с равным объемом верхнего слоя смеси 3:2:2 бутилацетата, уксусной кислоты и воды и собирали надосадочную жидкость после центрифугирования. Эту процедуру повторяли с получением 8 мл экстракта.

Экстракт (4 мл) наносили на силикагель (Βν-3008Ρ, 2 х 28 см; производство Гир 811ус1а) для колоночной хроматографии и разделяли с применением верхнего слоя смеси 3:2:2 бутилацетата, уксусной кислоты и воды в качестве элюента при скорости потока приблизительно 5 мл/мин при давлении 0,18 кг/см², с использованием компрессора. Фракционирование проводили, устанавливая объем одной фракции 6-7 мл, и часть каждой фракции анализировали с помощью тонкослойной хроматографии, что показало, что циклопентенон высокой чистоты содержался во фракциях с 31-й до 35-й, с получением 35 мг циклопентенона.

Фракцию отделяли с помощью НРЬС с прямой фазой, используя колонку РАЬРАСК тип 8, и при проведении измерения в ультрафиолетовой области спектра при 215 нм найдено, что чистота составляла 95,8%.

(2) Циклопентенон, полученный в примере 2(1), применяли для получения водных растворов циклопентенона в концентрациях 2,86 мМ, 955 мкМ, 318 мкМ, 106 мкМ, 35 мкМ, 12 мкМ и 0,18 мкМ. Затем рН указанного обработанного термически вещества доводили до 7,0 с помощью №1ОН и измеряли апоптоз-индуцирующую активность в отношении НЬ-60 следующим образом.

НЬ-60 клетки, которые инкубировали при 37°С в среде КРМ1 1640, содержащей 10% сыворотку плодов телят, обработанную при 56°С в течение 30 мин, суспендировали в среде КРМ1 1640, содержащей 10% сыворотку плодов телят, для достижения концентрации 5,8 х 10⁴ клеток/ 1,35 мл.

К 1,35 мл этой суспензии добавляли 0,15 мл указанного выше раствора циклопентенона, и смесь инкубировали при 37°С в течение 20 ч в присутствии 5% газообразной двуокиси углерода.

В результате было обнаружено, что во фракциях (конечная концентрация; 10,6 мкМ), к которым был добавлен циклопентенон в кон центрации 106 мкМ или выше, после инкубации в течение 20 ч число жизнеспособных клеток и жизнеспособность клеток снижались, и что во фракции (конечная концентрация: 3,5 мкМ), к которой был добавлен циклопентенон в концентрации 35 мкМ, молекулярный вес ДНК становился небольшим, и изменялась форма клеток (т.е. наблюдалась конденсация ядер, сморщивание клеток и продукция телец апоптоза), что являлось результатом индукции апоптоза.

Результаты представлены на фиг. 3. Таким образом, на фиг. 3 показано соотношение между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток при добавлении различных концентраций циклопентенона в культуру клеток НЬ-60, где абсцисса представляет собой время инкубации (часы), в то время как ордината отражает число жизнеспособных клеток (х 10⁴/1,5 мл) в культуре.

На фиг. 3 пустой квадрат представляет фракцию, в которую не добавляли образец (контроль); пустой ромб представляет фракцию, в которую добавляли 2,86 мМ циклопентенона; пустой кружочек представляет фракцию, в которую добавляли 955 мкМ циклопентенона; пустой треугольник представляет фракцию, в которую добавляли 318 мкМ циклопентенона; черный квадрат представляет фракцию, в которую добавляли 106 мкМ циклопентенона; черный ромб представляет фракцию, в которую добавляли 35 мкМ циклопентенона; черный кружочек представляет фракцию, в которую добавляли 12 мкМ циклопентенона.

Пример 3.

(1) Ό-Глюкуроновую кислоту (С 5269; производство 81дша) (10 г) растворяли в 1 л воды, нагревали при 121°С в течение 4 ч и концентрировали в вакууме до приблизительно 10 мл. Продукт смешивали с 40 мл верхнего слоя 3:2:2 бутилацетата, уксусной кислоты и воды и центрифугировали, полученную надосадочную жидкость концентрировали в вакууме до приблизительно 10 мл.

Этот экстракт наносили на силикагель (ВХ-3008Р; 2 х 28 см; производство Риц 811уе1а) для колоночной хроматографии и проводили разделение с помощью верхнего слоя смеси 3:2:2 бутилацетата, уксусной кислоты и воды в качестве элюента при скорости потока около 5 мл в минуту под давлением 0,2 кг/см², создаваемом компрессором. Фракционирование проводили так, чтобы объем одной фракции составлял 10 мл, и часть каждой фракции анализировали тонкослойной хроматографией, при этом циклопентенон высокой частоты был обнаружен во фракциях с 61-й по 80-ю. Эти фракции объединяли, концентрировали в вакууме, экстрагировали 40 мл хлороформа и экстракт концентрировали в вакууме с получением 100 мг циклопентенона.

Фракцию выделяли с помощью ВЭЖХ с прямой фазой с использованием РЛЬРЛСК тип колонки, при этом определение проводили по поглощению в ультрафиолете при 215 нм, чистота составила 98%.

(2) Масс-спектрометрический анализ указанного выше циклопентенона проводили с помощью масс-спектрометра ΌΧ302. Кроме того, структурный анализ проводили с помощью ЯМР, используя в качестве растворителя дейтерированный хлороформ. Прибором для ядерного магнитного резонанса являлся 1ΝΜ-Ά-500. Специфическое вращение измеряли ΌΙΡ-370 поляриметром (производство Νίρροη Випко), ультрафиолетовый спектр поглощения снимали на спектрофотометре ИУ-2500 (производство 81ιίιη;·ιάζιι); а инфракрасный спектр поглощения записывали на инфракрасном спектрофотометре ΡΤΙΒ-8000 (производство 81ιίιη;·ιάζιι). Результаты масс-спектрофотометрического анализа и ЯМР были теми же, что и в примере 1- (4).

Результаты других анализов были следующими.

Оптическое вращение: [α]_ο ²⁰ 0° (с = 1,3, вода).

ИК (КВг метод): поглощение отмечено при 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 см^-1.

УФ: λ^χ 215 нм (вода).

На фиг. 4 показан ИК-спектр, где абсцисса представляет волновое число (см^-1), а ордината представляет пропускание.

На фиг. 5 показан УФ-спектр поглощения, где абсцисса представляет длину волны (нм), а ордината представляет поглощение.

Пример 4.

1% водный раствор Ό-глюкуроновой кислоты (С 5269; производство 81дта) нагревали при 121°С в течение 4 ч и рН доводили до 7 с помощью 1н. №1ОН. Образец наносили на колонку Н1Тгар О (5 мл; производство Рйагтае1а), уравновешенную водой, и колонку промывали 25 мл воды. Фракцию (5 мл), которую элюировали с колонки первой, называли Р0 фракцией, вторую фракцию (5 мл) называли Р1 фракцией; третью (10 мл) называли Р2 фракцией и последнюю (10 мл) называли Р3 фракцией. После этого колонку уравновешивали 25 мл 0,5М уксусной кислоты. Фракцию (5 мл), которую элюировали с колонки первой, называли Е0 фракцией; вторую фракцию (5 мл) называли Е1 фракцией, третью (5 мл) называли Е2 фракцией и последнюю (10 мл) называли Е3 фракцией.

Часть каждой фракции анализировали с помощью тонкослойной хроматографии и обнаружили, что циклопентенон содержался во фракции Р1 и был количественно выделен из этой фракции. В Р1 фракции не было ни непрореагировавшей глюкуроновой кислоты, ни восстановленной кислоты, которая была тем продуктом реакции, который содержался до очистки на колонке НГТгар О.

Пример 5.

(1) Очищенный образец циклопентенона, указанный в примере 3(1), растворяли в воде до концентрации 0,67 мг/мл. Одновременно ноктакозан (производство Ыаса1а1 Те5С.|ие) растворяли в н-гексане (производство Ыаса1а1 Те5С.|ие) до концентрации 1 мг/мл. В каждую из пяти пробирок помещали по 100 мкл (100 мкг) раствора н-октакозана и добавляли 15 мкл (10 мкг), 45 мкл (30 мкг), 90 мкл (60 мкг), 135 мкл (90 мкг) и 180 мкл (120 мкг) водного раствора циклопентенона. Пробирки высушивали в вакуумом и к каждой добавляли 100 мкл раствора для триметилсилилирования [раствор смеси 4:1:1 Ы,О-бис(триметилсилил)ацетамида (производство Ыаса1а1 Техцие), триметилхлоросилана (производство О.Ь. 8с1епсе) и пиридина (производство йегсе)] до полного растворения содержимого.

Стеклянную колонку длиной 2,1 м и диаметром 3,2 мм (производство 81ιίιη;·ιάζι.ι) заполняли 2% ОУ17 Итрой НР 60/80 меш (производство О.Ь. 8с1епсе) и пропускали газ-носитель (Ν₂) со скоростью 20 мл в минуту в течение 15 ч, используя аппарат для газовой хроматографии ОС-7АО (производство δΐιίιικιάζιι).

Каждый из вышеуказанных триметилсилилированных образцов (1 мкл) вносили в эту газохроматографическую систему. Условия анализа приведены ниже.

Газ-носитель: Ν₂

Скорость потока: 50 мл в минуту Температура на входе: 280°С Исходная температура: 80°С, 4 мин Скорость повышения температуры: 8°С в минуту

Конечная температура: 270°С

Определение: с помощью детектора пламенной ионизации водорода.

В результате был определен единственный пик циклопентенона с временем удерживания 9,7 мин, а н-октакозан был определен при времени удерживания 26,7 мин. Площади пиков, полученных в это время, даны ниже.

Количество циклопентенона	Площадь пика циклопентенона (а)	Площадь пика н-октакозана (Ь)	Отношение (а)/(Ь)
10 мкг	19,981	285,798	0,06991
30 мкг	90,980	285,398	0,3188
60 мкг	174,284	251,439	0,6931
90 мкг	272,524	256,356	1,063
120 мкг	368,573	255,545	1,442

Когда полученное таким образом соотношение между количеством циклопентенона и отношением [площадь пика (а) циклопентенона]/[площадь пика (Ь) н-октакозана] выражали графически, то получали результат, представленный на фиг. 6. Таким образом, фиг. 6 представляет собой график, демонстрирующий рабочую кривую циклопентенона, на котором ордината представляет отношение области пика циклопентенона к таковой н-октакозана, а абсцисса представляет собой количество циклопентенона в мкг.

Таким образом, количество циклопентенона может быть измерено при добавлении 100 мкг н-октакозана к образцу с неизвестным количеством циклопентенона, который высушивали в вакууме, триметилсилилировали и анализировали с помощью газовой хроматографии, согласно описанному выше методу, и определяли отношение (у) область пика циклопентенона к области пика н-октакозана.

(2) Водный раствор глюкуроновой кислоты (производство Ν;·κ;·ι1;·ιί Те^сще) в концентрации 1% (по весу) нагревали при 120°С в течение 4 ч под давлением в автоклаве. Содержимое (100 мкл) (что соответствует 1 мг глюкуроновой кислоты) помещали в пробирку, туда же добавляли 100 мкг н-октакозана и смесь высушивали в вакууме и триметилсилилировали. Содержимое подвергали газохроматографическому анализу тем же методом, который представлен выше, с получением спектра, показанного на фиг. 7. Итак, на фиг. 7 показан результат газовой хроматографии термообработанной глюкуроновой кислоты, где ордината представляет собой измеренное напряжение, а абсцисса представляет собой время удерживания (минуты). Каждый одиночный пик тестировали на циклопентенон при времени удерживания приблизительно 10,2 мин [пик (а)] и на н-октакозан при времени удерживания приблизительно 27,8 мин [пик (Ь)].

Результаты показаны ниже, степень превращения глюкуроновой кислоты в циклопентенон под действием термообработки составляла около 15% при молярном выражении.

Площадь пика (а) циклопентенона: 203,794 Площадь пика (Ь) н-октакозана: 305,444 (а)/(Ь): 0,6672

Количество циклопентенона (мкг): 88,4. Пример 6.

Коммерчески доступный глюкуронолактон (производство Мегск; каталожный № 100282) растворяли в воде до концентрации 1% и нагревали при 121°С в течение 0,5, 1, 2, 4 или 16 ч. Термообработанный раствор триметилсилилировали в соответствии с методом, указанном в примере 5(1), и подвергали газохроматографическому анализу.

Ниже представлены результаты анализа.

Время нагревания, ч	Количество циклопентенона (мкг/100мкл)	Степень превращения (%; в моль)
0,5	9,28	1,43
1	21,0	3,26
2	52,8	8,15
4	119	18,3
16	132	20,4

В результате степень превращения глюкуронолактона в циклопентенон при термообработке составляла 20% в молярном выражении.

Кроме того, из раствора глюкуронолактона, нагреваемого в течение 16 ч, был выделен чистый циклопентенон с помощью метода, описанного в примере 3(1).

Пример 7.

К 100 г продающейся капусты добавляли воду (100 мл) и затем измельчали миксером. Подвергали взаимодействию с 5 мл протеиназы. К (20 мг/мл; # 9033 производство Такага 81ιιιζο) при 50°С в течение 1 ч, после чего фильтровали и осадок промывали 1,5 л воды. К промытому осадку добавляли воду (100 мл) и полученную суспензию с рН 6,5 прогревали при 121°С в течение 2 ч с последующей фильтрацией и получением фильтрата с рН 4,7. Фильтрат концентрировали в вакууме до 14 мл, смешивали с 36 мл метанола и центрифугировали при 4000 х д в течение 10 мин и полученную надосадочную жидкость концентрировали в вакууме с получением 3,5 мл концентрированной жидкости.

Количество циклопентенона, содержащегося в этой концентрированной жидкости, измеряли с помощью метода, описанного в примере 5(1), и оно оказалось равным 24,9 мкг. Когда после измельчения миксером не проводили обработку протеиназой К и удаление белка промыванием водой, а только нагревали, циклопентенон не образовывался. Из этого результата ясно, что 0,87 мг циклопентенона были получены при обработке 100 г капусты протеиназой К, промывке водой для удаления белка и нагревании при указанных условиях.

После этого циклопентенон был получен в чистой форме из этой концентрированной жидкости в соответствии с методом примера 3(1).

Пример 8.

(1) К 8 мл 1% водного раствора пектина (из яблок; производство \Уако Риге Скеш1са18) добавляли пектиназу (8,1 единицы на мг белка; Р9932 производство 81дта) в количестве 1,36, 0,68 или 0,14 единиц и оставляли при 25°С на ночь. НС1 добавляли к (1) продукту ферментативной реакции и (2) надосадочной жидкости продукта ферментативной реакции после центрифугирования для установления рН 3 с последующим нагреванием при 120°С в течение 4 ч с получением термообработанных продуктов. Циклопентенон, содержащийся в термообработанном продукте, триметилсилилировали по методу примера 5(1) и количество циклопентенона в термообработанном продукте определяли методом газовой хроматографии.

Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Количество добавленной пектиназы (единицы/ 80 мг пектина)	Степень превращения (% в мас. выражении)
(1)	(2)
1,36	4,46	4,75
0,68	4,52	4,62
0,14	3,39	3,43
0	2,71	2,73

Результат показывает, что, когда пектин гидролизовали пектиназой и затем нагревали, образование циклопентенона повышалось на 2575% по сравнению со случаем, когда проводили только нагревание.

(2) Альгиновую кислоту (ненабухающую; производство \Уако Риге СкеткаН) (1 г) суспендировали или растворяли в 100 мл или (1) 0,1н. НС1 или (2) 0,1 М Ыа₂СО₃ нагревали при 95°С в течение 15 ч и доводили рН до 2,7 путем добавления порошкообразного Ыа₂СО₃ к (1) или 6н. НС1 к (2). Параллельно 1 г альгиновой кислоты суспендировали в (3) 100 мл воды (конечный рН 2,7) или в (4) 100 мл 0,1 М Ыа₂СО₃ с последующим доведением рН до 2,7 6н. НС1. Количество циклопентенона, содержащегося в (1)-(4), нагретого при 121°С в течение 4 ч (называемых здесь далее образцами с (1) по (4)), определяли следующим методом. Нерастворимые вещества, содержащиеся в образцах (1)-(4), удаляли с помощью центрифугирования, и 10 мкл надосадочной жидкости анализировали с помощью гель-фильтрации ВЭЖХ, используя Т8К гелевую колонку 6 2000 Р\У (7,5 мм х 30 см; производство Τοδοίι). В качестве подвижной фазы применяли воду, скорость протекания и температура колонки составляли 1 мл в минуту и 40°С соответственно, и определение проводили по поглощению при 215 нм. Чистый циклопентенон, описанный в примере 3(1), использовали в качестве стандартного соединения, и 2циклопентен-1-он (производство Л1йпс11) применяли в качестве внутреннего стандарта.

В результате было обнаружено, что образцы (1), (2), (3) и (4) содержали 414, 279, 289 и 296 мкг/мл циклопентенона соответственно. Таким образом, по сравнению с образцом (3), нагретым при 121°С в течение 4 ч, в случае нагревания в 0,1н. НС1 при 95°С в течение 15 ч, проведенном перед нагреванием при 121°С в течение 4 ч, (выход) циклопентенона увеличивался в 1,43 раза.

Чистый циклопентенон получали из каждого из этих образцов с помощью метода, указанного в примере 3(1).

К 50 г коммерчески доступного окага (осадок створоженных бобов) добавляли воду (120 мл) и встряхивали при комнатной температуре и твердую фазу удаляли центрифугированием и фильтрацией. К 50 мл фильтрата добавляли 1н. Н₂8О₄ до достижения рН 2, затем нагревали до 121°С в течение 4 ч для получения образца (5).

К 100 г окага добавляли ацетон (300 мл), перемешивали и фильтровали с получением 55 г осадка. Осадок (27,5 г) промывали 1 л воды, добавляли воду до 150 мл, рН доводили до 2 с помощью 1н. Н₂8О₄ и смесь нагревали при 121°С в течение 4 ч для получения образца (6).

Оставшийся осадок (27,5 г) после обработки ацетоном суспендировали в 200 мл воды и подвергали взаимодействию с 500 мкл протеиназы К (20 мг/мл; производство Такага 81ιιιζο) при 50°С в течение 2 ч. Продукт реакции промывали 1 л воды, доводили до 180 мл добавлением к нему воды, устанавливали рН до 2 с помощью 1н. Н₂8О₄ и нагревали при 121°С в течение 4 ч для получения образца (7).

Каждый из образцов (5)-(7) фильтровали, фильтрат концентрировали в вакууме до 10 мл, добавляли 4-кратный объем ацетона и смесь центрифугировали с получением надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость затем концентрировали в вакууме с получением 5,5, 3,8 и 3,0 мл концентрированных жидкостей из образцов (5), (6) и (7) соответственно. Количество циклопентенона, содержащегося в концентрированных жидкостях, определяли с помощью метода, который далее описан в примере 8(2).

Получены следующие результаты: исходя из 50 г окага, было получено 0,54, 2,79 и 3,98 мг циклопентенона из образцов (5), (6) и (7) соответственно. В данном случае в любом из образцов во время получения образцов (5)-(7) перед нагреванием при 121°С в течение 4 ч циклопентенон не содержался. Соответственно, в результате удаления белка обработкой протеиназой образование циклопентенона увеличивалось на приблизительно 40%.

Чистый циклопентенон получали из каждого образца (5)-(7) методом, описанным в примере 3(1).

Окага (50 г) суспендировали в 200 мл воды, доводили рН до 1,5 с помощью 6н. НС1 и нагревали при 50°С в течение 3 ч. рН доводили до 5,0 с помощью №ОН и фильтровали с получением фильтрата. рН фильтрата доводили до 2,05 с помощью 6н. НС1 и нагревали при 121°С в течение 4 ч с получением образца (8). Количество циклопентенона, содержащегося в образце (8), определяли по методу, описанному в примере 8(2).

В результате из 50 г окага получено 5,0 мг циклопентенона. В данном случае в фильтрате перед нагреванием при 121°С в течение 4 ч циклопентенон не содержался.

(4) Коммерчески доступную клетчатку яблок (сухой порошок; производство ΝίοΙιίΐΌ) обрабатывали следующим образом.

Клетчатку яблок (0,5 г) суспендировали в 50 мл воды, нагревали при 121°С в течение 4 ч и центрифугировали с получения 37 мл надосадочной жидкости, которая будет называться образцом (9).

Клетчатку яблок (5 г) суспендировали в 50 мл воды, нагревали при 121°С в течение 4 ч и центрифугировали с получением 20 мл надосадочной жидкости, которая будет называться образцом (10).

Клетчатку яблок (5 г) суспендировали в 50 мл воды, встряхивали при комнатной температуре в течение 2 ч, центрифугировали и надосадочную жидкость нагревали при 121°С в течение 4 ч и центрифугировали с получением 25 мл надосадочной жидкости, которая будет называться образцом (11).

Преципитат, полученный с помощью центрифугирования, после встряхивания при комнатной температуре в течение 2 ч при получении образца (11) суспендировали в 50 мл воды, нагревали при 121°С в течение 4 ч и центрифугировали с получением 31 мл надосадочной жидкости, которая будет называться образцом (12).

Количество циклопентенона, содержащегося в образцах (9)-(12), определяли методом, указанным в примере 8(2).

В результате образцы (9), (10), (11) и (12) содержали 14,8, 76,3, 54,0 и 34,2 мкл/мл циклопентенона соответственно. Образец перед нагреванием при 121°С в течение 4 ч для получения образца (9) не содержал циклопентенон. Соответственно, 1 г клетчатки яблок давал 1,09, 0,305, 0,270 и 0,212 мг циклопентенона с помощью способов получения образцов (9), (10), (11) и (12) соответственно.

Чистый циклопентенон получали из каждого образца (9)-(12) по методу, описанному в примере 3(1).

Пример 9.

Коммерчески доступные листья (2 г) 5спска (зеленого чая среднего сорта), НорсНа (поджаренного чая), черного китайского чая или чая измельчали с помощью миксера со 100 мл воды, доводили до рН 3 с помощью 1н. серной кислоты и нагревали при 121°С в течение 16 ч. Количество циклопентенона, содержащегося в термообработанных продуктах, определяли с помощью гель-фильтрационной ВЭЖХ, описанной в примере 8(2). В результате из 5СпеНа. 1оце11а. черного китайского чая и чая получено 0,19, 0,28, 0,34 и 0,12 мМ циклопентенона соответственно. Эти продукты подвергали сушке с температурной обработкой на стадии получения с эффективным образованием циклопентенона.

Пример 10.

Пектин (производство \Уако Риге СНсииса1§; каталожный № 167-00542), альгиновую кислоту (ненабухающую; производство \Уако Риге Сйеш1са18; каталожный № 011-13341), Ό-αгалактуроновую кислоту (производство №1са1а1 Те5С.|ие; каталожный № 165-18) или Όглюкуроновую кислоту (производство №1са1а1 Теэдие; каталожный № 169-28) растворяли в дистиллированной воде с получением 1% раствора. В случае пектина готовили также раствор в 1н. водном растворе уксусной кислоты.

рН 1% водного раствора пектина равнялся 3,4; рН 1 % раствора пектина в уксусной кислоте равнялся 2,6; рН водного раствора галактуроновой кислоты перед нагреванием равнялся 2,5; рН водного раствора глюкуроновой кислоты перед нагреванием равнялся 2,4; и рН водного раствора альгиновой кислоты перед нагреванием равнялся 3,3.

Эти 1% растворы нагревали при 121°С в течение 2,4 или 16 ч. рН каждого из термообработанных растворов доводили до 7 с помощью ΝαΟΗ и стерилизовали с помощью фильтра 0,22 мкм для получения образца для измерения количества образовавшегося циклопентенона.

Циклопентенон наносили в виде капли на пластинку 60 Р₂₅₄ силикагеля (производство Мегск) и разгоняли с помощью подвижной фазы (верхний слой смеси 3:1:1 бутилацетата, уксусной кислоты и дистиллированной воды) и после завершения разгонки тонкослойный силикагель высушивали, опрыскивали АдЦО₃-ХН₃ раствором (смесь одинаковых количеств 0,1 М АдЦО₃ и 5н. ΝΜ₃) и нагревали до проявления циклопентенона в виде пятна в области Κί = 0,3. Полученный таким образом образец для определения полученного количества циклопентенона разбавляли 2-, 5-, 10-, 20-, 50- и 100-кратно и полученные разбавленные растворы подвергали ТСХ, как описано выше. В данном случае полученное количество циклопентенона из 2-кратно разбавленного раствора термообработанного продукта 1% водного раствора пектина в течение двух часов было принято за одну единицу, и было определено количество циклопентенона в каждом из термообработанных продуктов.

Результаты показаны в табл. 2.

В каждом из образцов образование циклопентенона увеличивалось с увеличением времени прогревания, и в термообработанных продуктах водного раствора галактуроновой кислоты 1 единица и 5 единиц циклопентенона образовывались через 30 мин и 1 ч соответственно, тогда как в термообработанных продуктах водного раствора глюкуроновой кислоты через 30 мин и 1 ч образовывалось, соответственно, 5 единиц и 10 единиц циклопентенона.

Таблица 2

Образец для нагревания	Время нагревания, ч	рН перед нагреванием	рН после нагревания	рН после установления	Образованный циклопентенон, единицы
	2	3,4	3,3	7,0	1
1% водн. р-р пектина	4	3,4	3,2	7,2	5
	16	3,4	3,5	7,0	10
1% р-р в уксусной	2	2,6	2,7	7,0	1
4	2,6	2,6	7,2	2
кислоте	16	2,6	2,8	7,1	10
1% водн. р-р галактуро-	2	2,5	2,4	6,9	10
4	2,5	2,4	6,8	25
новой кислоты	16	2,5	2,6	6,9	50
% водн. р-р глюкуроно-	2	2,4	2,7	6,9	25
4	2,4	2,6	7,0	50
вой кислоты	16	2,4	2,8	7,0	50
1% водн. р-р альгиновой	2	3,3	2,5	6,9	5
4	3,3	2,7	7,0	5
кислоты	16	3,3	2,9	7,3	10

Пример 11.

(1) Коммерчески доступный глюкуронолактон (производство Мегск; кат. № 100282) растворяли в воде с получением 1% раствора и нагревали при 121°С в течение 0,5, 1, 2, 4 или 16 ч. Термообработанные растворы триметилсилилировали по методу примера 5(1) и количество полученного циклопентенона анализировали с помощью газовой хроматографии.

Результаты измерений представлены в табл. 3.

Таблица 3

Время нагревания, ч	Количество циклопентенона, мкг/100 мкл	Степень превращения, % (рассчитано в молях)
0,5	9,28	1,43
1	21,0	3,26
2	52,8	8,15
4	119	18,3
16	132	20,4

Данные показывают, что степень превращения глюкуронолактона в циклопентенон при прогревании в течение 16 ч была около 20% в расчете на моли.

Циклопентенон был очищен/выделен из указанного выше раствора, полученного путем нагревания глюкуронолактона в течение 16 ч, с помощью метода, указанного в примере 3(1).

(2) Указанный выше глюкуронолактон растворяли в воде с получением 1, 2, 5, 10 или 20% раствора с последующим нагреванием при 121°С в течение 4 ч. Этот термообработанный раствор триметилсилилировали по методу, указанному в примере 5(1), и количество полученного циклопентенона определяли с помощью газовой хроматографии.

Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Концентрация глюкуронолактона, %	Количество циклопентенона, мкг/100 мкл	Степень превращения, % (рассчитано в молях)
0,1	15,1	23,2
1	99,2	15,3
3	229	11,8
5	365	11,3
10	455	7,03
20	592	4,58

В результате при использовании 0,1% водного раствора глюкуронолактона степень превращения глюкуронолактона в циклопентенон при прогревании была около 23% в расчете на моли.

(3) рН указанного выше 1% водного раствора глюкуронолактона доводили до 1, 2, 3 или 4,5 с помощью НС1 или ΝαΟΗ с последующим нагреванием при 121°С в течение 4 ч. Этот термообработанный раствор триметилсилилировали по методу, указанному в примере 5(1), и количество полученного циклопентенона определяли с помощью газовой хроматографии. Результаты представлены в табл. 5

Таблица 5

рН	Количество циклопентенона, мкг/100 мкл	Степень превращения, % (рассчитано в молях)
1	7,85	1,21
2	15,9	2,46
3	108	16,7
4,5	125	19,3

В результате, когда рН равнялся 4,5, степень превращения глюкуронолактона в циклопентенон при прогревании была около 19% в расчете на моли.

(4) рН 1% водного раствора галактуроновой кислоты доводили до 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 с помощью НС1 или №1ОН с последующим нагреванием при 121°С в течение 4 ч. Этот термообработанный раствор триметилсилилировали по методу, указанному в примере 5(1), и количество полученного циклопентенона определяли с помощью газовой хроматографии.

Результаты представлены в табл. 6.

Таблица 6

рН	Количество циклопентенона, мкг/100 мкл	Степень превращения, % (рассчитано в молях)
1	16,6	2,83
2	66,6	11,3
3	42,7	7,27
4	7,36	1,25
5	5,47	0,931
6	5,45	0,927
7	0	0

В результате, когда рН равнялся 2, степень превращения глюкуроновой кислоты в циклопентенон при прогревании была около 11% в расчете на моли.

(5) рН 1 % водной суспензии альгиновой кислоты (ненабухающей) доводили до 1, 2, 3 или 4 с помощью НС1 или ΝαΟΗ. В другом варианте альгиновую кислоту (ненабухающую) растворяли для получения 1% раствора в 0,1 М ацетатном буфере с последующим доведением рН до 5 или в 0,1 М фосфатном буфере с последующим доведением рН до 6 или 7. Растворы нагревали при 121°С в течение 4 ч. Количество циклопентенона, содержащегося в нагретых растворах, определяли с помощью гельфильтрационной ВЭЖХ в следующих условиях.

Колонка: Т8К гель α-2500 (7,8 х 800 мм; производство Тозой)

Температура колонки: 40°С

Подвижная фаза: 0,01% водный раствор трифторуксусной кислоты

Скорость протекания: 1 мл в минуту Определение: по поглощению при 215 нм Чистый циклопентенон, полученный в примере 3(1), использовали в качестве стандартного соединения и определяли область пика циклопентенона, элюированного (со временем удерживания) около 10 мин, на основе измерения концентрации циклопентенона.

Результаты представлены в табл. 7.

Таблица 7

рН	рН после прогревания	Концентрация циклопентенона, мкг/ 100 мкл	Степень превращения, % (рассчитано в молях)
1	1,07	0	0
2	1,98	0,536	0,611
3	2,76	2,00	2,28
4	4,01	1,05	1,20
5	5,02	0,167	0,190
6	5,95	0	0
7	6,90	0	0

В результате, когда рН равнялся 3, степень превращения альгиновой кислоты в циклопентенон при прогревании была около 2,3% в расчете на моли.

Пример 12.

Помозин-пектин типа ЬМ-13СО (производство Негеи1е8), альгиновую кислоту ΗΕΌ (производство Όαίηίρροη Рйагтасеи!1са1), Όглюкуроновую кислоту (производство №1са1а1 Те8С|ие) или глюкуронолактон (производство Мегск) растворяли или суспендировали в воде с получением концентрации 1% и последующим прогреванием при 30, 60, 95, 121 или 132°С в течение 16 ч. Циклопентенон в термообработанном веществе триметилсилилировали по методу, описанному в примере 5(1), и определяли количество циклопентенона, образованного в термообработанном веществе, с помощью газовой хроматографии. Результаты представлены в табл. 8.

Таблица 8

Производное уроновой кислоты	Температура нагревания, °С	Количество образованного циклопентенона, мгк/мл
Пектин	121	176
132	128
Альгиновая	121	466
кислота	132	75
	95	302
Глюкуроновая кислота	121	718
132	132
	95	274
Глюкуронолактон	121	781
	132	161

Пример 13.

(1) Хондроитин сульфат А (производство 8е1кадаки), хондроитин (натриевая соль; производство 8е1кадаки), дерматансульфат (натриевая соль; производство 8егЫо), гепарин (натриевая соль; производство \Уако Риге СйеткаН) или гиалуроновую кислоту (производство 8е1ка даки) растворяли в воде с получением 1% раствора с последующим доведением рН до 3 с помощью 1н. НС1. Их нагревали при 121°С в течение 4 или 16 ч для получения термообработанного раствора.

(2) Термообработанный раствор (100 мкл) хондроитинсульфата А, хондроитина, дерматансульфата или гепарина, полученный в примере 13(1), смешивали с раствором (1 мг/мл; 100 мкл) н-октакозана (производство Ν;·κα1αί Теэдие) в нгексане (производство Ν;·κα1αί Теэдие) с последующим высушиванием под вакуумом. К содержимому добавляли 100 мкл указанного раствора для триметилсилилирования до полного растворения, и определяли количество циклопентенона в термообработанном веществе с помощью метода, указанного в примере 5(1).

Результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9

	Количество циклопентенона (мкг/100 мкл) в растворе, нагреваемом в течение
	4 ч	16 ч
Хондроитинсульфат А	9,26	15,71
Хондроитин	7,47	9,11
Дерматансульфат	32,81	47,60
Гепарин	5,09	15,12

(3) Нагреваемый раствор (100 мкл) гиалуроновой кислоты высушивали в вакууме, суспендировали в 10 мкл метанола, и нерастворенный материал удаляли центрифугированием. Надосадочную жидкость (1 мкл) после центрифугирования наносили в виде пятна на пластинку силикагеля 60 Р₂₅₄ (производство Мегск) и подвергали тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя верхний слой смеси 3:2:2 бутилацетата, уксусной кислоты и воды в качестве подвижной фазы. После разделения проводили окрашивание с помощью орцинолсульфатного метода и сравнивали с пятном стандарта циклопентенона. В результате образование циклопентенона было отмечено в продукте гиалуроновой кислоты, нагреваемой в течение 4 ч, и отмечено увеличение его количества после нагревания в течение 16 ч.

Пример 14.

Дерматансульфат (1 г) растворяли в 100 мл воды и рН раствора доводили до 3 с помощью 1н. НС1 и нагревали при 121°С в течение 16 ч с получением термообработанного раствора. Затем из термообработанного вещества выделяли циклопентенон в соответствии с методом примера 3(1) с получением 30 мг чистого циклопентенона.

Пример 15.

(1) Очищенный/выделенный циклопентенон, описанный в примере 3(1), растворяли в воде, 10 мМ трис-НС1 (рН 7) или 10 мМ трис (рН 10) с получением концентрации 25 мМ, оставляли при комнатной температуре или при 4°С и анализировали с помощью ТСХ, описанной в примере 13(3). В результате в обоих рас творах - в воде и в 10 мМ трис-НС1 (рН 7), хранившихся при комнатной температуре и при 4°С в течение одного месяца, обнаруживали некие продукты распада, хотя основная часть оставалась нераспавшейся. В случае раствора в 10 мМ трис (рН 10) при комнатной температуре наблюдался быстрый распад, и когда анализ с помощью ТСХ проводили сразу после растворения, пятна циклопентенона не обнаруживали.

Когда растворенный в воде циклопентенон нагревали при 121°С в течение 30 мин и анализировали с помощью ТСХ, обнаруживали некие продукты распада, хотя основная часть циклопентенона оставалась нераспавшейся.

(2) 1 % водный раствор Ό-глюкуроновой кислоты нагревали при 121°С в течение 4 ч и разделяли на два образца, рН одного из которых не меняли, а рН другого доводили до 6,6 с помощью ΝαΟΗ. По 1 мл из каждого образца делили на порции и хранили при -20, 4 или 37°С с последующим триметилсилилированием по методу примера 5(1). После этого измеряли количество циклопентенона с помощью газовой хроматографии.

При хранении в течение 25 дней в случае хранения при 37°С в количестве циклопентенона отмечено некоторое снижение, в то время как при хранении при 4 и при -20°С состояние было полностью стабильным. Указанный результат представлен на фиг. 8. Таким образом, на фиг. 8 представлен график, показывающий соотношение между временем хранения и количеством циклопентенона, на котором абсцисса представляет время хранения (дни), а ордината показывает концентрацию циклопентенона (мг/мл). На фиг. 8 пустой квадрат показывает случай, когда рН не меняли и хранили при -20°С; черный квадрат показывает случай, когда рН равнялся 6,66 и хранили при -20°С; пустой кружок показывает случай, когда рН не меняли и хранили при 4°С; черный кружок показывает случай, когда рН равнялся 6,66 и хранили при 4°С; пустой треугольник показывает случай, когда рН не меняли и хранили при 37°С, и черный треугольник показывает случай, когда рН равнялся 6,66 и хранили при 37°С.

Пример 16.

(1) Очищенный/выделенный циклопентенон (113,9 мг), описанный в примере 3(1), растворяли в 2,85 мл этанола. К этому этанольному раствору добавляли 3,85 мл (смеси) гексана/этанола (94/6) для получения раствора циклопентенона (17 мг/мл). Раствор фильтровали через фильтр 0,5 мкм для получения раствора образца для ВЭЖХ с оптическим разделением.

Этот раствор образца подвергали ВЭЖХ с оптическим разделением, каждую фракцию циклопентенона в наиболее раннем пике и в более позднем пике собирали и упаривали досуха в вакууме с получением 43,2 мг циклопентенона наиболее раннего пика и 43,0 мг циклопентенона более позднего пика.

Условия ВЭЖХ с оптическим разделением.

Колонки: Хиральный Раск А8 (производство Эа1се1) 2,0 см х 25,0 см

Температура колонки: 40°С

Скорость протекания: 14,0 мл в минуту Определение: УФ 210 нм

Количество заряженного образца: 150 мкл (2,55 мг)

Каждый из циклопентенонов как в более раннем, так и в более позднем пиках содержит около 1% энантиомера и, следовательно, их опять подвергали оптическому разделению в описанных выше условиях. В результате было получено 19,7 мг циклопентенона, не содержащего энантиомер, из 30,0 мг его, содержащегося в более раннем пике, в то время как из 37,4 мг его из более позднего пика было получено 27,7 мг циклопентенона, не содержащего энантиомер. Полученное оптическое вращение циклопентенонов из более раннего и более позднего пиков составляло [α]_Β ²⁰ -105° (с = 0,30, этанол) и |α|ι/⁰ +104° (с = 0,53, этанол) соответственно. Таким образом, более ранний пик вещества соответствовал (-)-транс-4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-ону [обозначаемому здесь далее как (-)-циклопентенон], и более поздний пик вещества соответствовал (+)-транс-4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-ону [обозначаемому здесь далее как (+)-циклопентенон]. В данном случае оптическое вращение измеряли с помощью поляриметра типа ΌΙΡ-370 (производство №рроп Випко), который уже упоминался.

Кривые элюции ВЭЖХ с оптическим разделением (-)-циклопентенона и (+)-циклопентенона представлены на фиг. 9 и 10 соответственно. Таким образом, фиг. 9 представляет собой кривую элюции (-)-циклопентенона, где ордината показывает поглощение, а абсцисса время элюции (минуты). Фиг. 10 представляет собой кривую элюции (+)-циклопентенона, где ордината показывает поглощение, а абсцисса время элюции (минуты).

Затем каждый из (-)- и (+)-циклопентенонов подвергали масс-спектрофотометрическому анализу, структурному анализу с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР), измерению поглощения в УФ спектре и измерению поглощения при анализе в инфракрасном спектре в соответствии с методом, представленным в примере 3(2). В результате показано, что оба оптически активных соединения давали те же результаты, что и циклопентенон перед оптическим разделением.

На фиг. 11 показан ¹Н-ЯМР (-)-циклопентенона, где ордината показывает интенсивность сигнала, а абсцисса - величины химического смещения (м.д.).

На фиг. 12 показан ¹Н-ЯМР (+)-циклопентенона, где ордината показывает интенсив ность сигнала, а абсцисса - величины химического смещения (м.д.).

(2) Транс-циклопентенон синтезировали с помощью метода, который упоминается в уже цитированном СагЬойубга!е Кезеагсй. Далее, цис-циклопентенон синтезировали с помощью метода, который упоминается в уже цитированном Некейса СЫтка Ас!а. Каждое из их оптически активных соединений получали с помощью оптического разделения.

Каждый из полученных (+)-трансциклопентенона, (-)-транс-циклопентенона, (+)цис-циклопентенона и (-)-цис-циклопентенона подвергали исследованию в отношении торможения клеточного роста, апоптоз-индуцирующей активности, активности, индуцирующей дифференцирование раковых клеток, и антибактериальной активности с помощью методов соответствующих примеров, в которых каждый из (+)-транс-циклопентенона, (-)-транс-циклопентенона, (+)-цис-циклопентенона и (-)-цисциклопентенона показали ингибиторную активность в отношении торможения клеточного роста, апоптоз-индуцирующую активность, активность, индуцирующую дифференцирование раковых клеток, и антибактериальную активность.

Пример 17.

Этанольный раствор (1 мг/мл) каждого из (-)- и (+)-циклопентенонов, полученных в примере 16, разбавляли 75% водным раствором этанола в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 и 2048 раз, и каждые 5 мкл из них помещали в лунки 96-луночного планшета для микротитрования с последующим высушиванием воздухом. К каждой лунке добавляли среду ΚΡΜΙ 1640 (100 мкл), содержащую 10% сыворотку плодов телят, содержащую 5000 клеток НЬ-60 промиелоцитной лейкемии человека (АТСС ССЬ-240), и инкубировали при 37°С в течение 48 ч в присутствии 5% газообразной двуокиси углерода. После исследования морфологии клеток на оптическом микроскопе туда (добавляли) 10 мкл солевого раствора, забуференного фосфатом, содержащего 5 мг/мл бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ, производство 81дта), инкубацию проводили в течение дополнительных 4 ч, и состояние клеточного роста исследовали под микроскопом. Далее, туда добавляли 100 мкл 2-пропанола, содержащего 0,04н. НС1 с последующим перемешиванием лунок и измеряли поглощение при 590 нм и ее рассматривали как степень клеточного роста.

В результате показано, что даже во фракции, к которой добавляли раствор каждого из оптически активных соединений циклопентенона, разбавленный в 128 раз (конечная концентрация: 0,39 мкг/мл) была отмечена активность, ингибирующая клеточный рост. Кроме того, также была отмечена апоптоз-индуцирующая активность.

4Ί

Пример 18.

(1) К среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% сыворотку плодов телят и содержащей НЬ-60 клетки 1 х 10⁵/мл, добавляли 10, 1, 0,1 или 0,01 мкг/мл циклопентенона, затем проводили инкубацию при 37°С в присутствии 5% газообразной двуокиси углерода в течение 3 или 6 дней и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Результатом шестидневной инкубации было то, что по сравнению с контролем, к которому не добавляли циклопентенон, жизнеспособные клетки не были обнаружены во фракции, к которой добавляли 10 мкг/мл циклопентенона, в то время как во фракциях, к которым добавляли 1, 0,1 и 0,01 мкг/мл, было отмечено торможение клеточного роста приблизительно на 90%, приблизительно на 55% и приблизительно на 45% соответственно.

Результат показан на фиг. 13. Таким образом, на фиг. 13 показано соотношение между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной жидкости при добавлении различных концентраций циклопентенона к инкубационной жидкости НЬ-60 клеток, где абсцисса показывает время инкубации (дни), а ордината показывает количество жизнеспособных клеток (х 10⁴ /мл) в инкубационной жидкости. На кривой пустой квадрат показывает случаи, когда никакого образца не добавляли (контроль); пустой ромб показывает случай, когда добавляли 10 мкг/мл циклопентенона; пустой кружок показывает случай, когда добавляли 1 мкг/мл; пустой треугольник показывает случай, когда добавляли 0,1 мкг/мл; и черный квадрат показывает случай, когда добавляли 0,01 мкг/мл.

(2) К НЬ-60 клеткам добавляли 10^-4 мкг/мл циклопентенона и проводили инкубацию в течение 3 дней тем же способом, что и в примере 15(1). Часть клеток отбирали, делали мазок на предметном стекле, окрашивали по методу ^г1дЫ-С1етка, описанному в Тесшциек о£ Т1ккие СиЙиге (под редакцией Японского общества тканевой культуры; издание Лкакша 81ю1еп; 1982), стр. 191, и проводили исследование на оптическом микроскопе. Данные показывают, что в контроле, в который не добавляли циклопентенон, было около 10% дифференцированных клеток, в то время как во фракциях, к которым добавляли циклопентенон, 50% или более клеток дифференцировалось в моноцит- или макрофагподобные клетки.

(3) К НЬ-60 клеткам добавляли 0,5 или 0,005 мкг/мл циклопентенона, и инкубацию проводили тем же способом, что и в примере 18(1) в течение 3 или 6 дней. Часть клеток отбирали, делали мазок на предметном стекле, окрашивали по методу ^пдШ-61етка, и проводили исследование на оптическом микроскопе. В результате показано, что в контроле, в который не добавляли циклопентенон, дифференцированные клетки составляли около 10%, в то вре мя как во фракции, к которой добавляли 0,005 мкг/мл циклопентенона, 25% или более клеток дифференцировалось в зрелые клетки костного мозга. Результаты показаны на фиг. 14. Таким образом, на фиг. 14 показано соотношение между временем инкубации и долей зрелых клеток костного мозга среди инкубируемых клеток, где абсцисса показывает время инкубации (дни), а ордината показывает долю (%) зрелых клеток костного мозга среди инкубируемых клеток. На фиг. 14 пустой квадрат показывает случай, когда никакого образца не добавляли (контроль); пустой кружок показывает случай, когда добавляли 0,5 мкг/мл циклопентенона; и пустой треугольник показывает случай, когда добавляли 0,005 мкг/мл.

Пример 19.

(1) Антибактериальное действие очищенного/выделенного циклопентенона, описанного в примере 3(1), измеряли с использованием следующих штаммов. Итак, для измерения использовали следующие штаммы. Итак, тестируемый микроорганизм (I): 8а1топе11а еп1егШб1к (штамм, вызывающий пищевое отравление), тестируемый микроорганизм (2): 8а1топе11а 1ур1итипит (штамм, вызывающий пищевое отравление); тестируемый микроорганизм (3): §1арйу1ососсик аигеик ΡΡΙ 722 (штамм, продуцирующий энтеротоксин типа А); тестируемый микроорганизм (4): 81ар11у1ососсик аигеик (устойчивый к метициллину); тестируемый микроорганизм (5): ВасШик сегеик (штамм, вызывающий пищевое отравление рвотного типа); и тестируемый микроорганизм (6): ВасШик сегеик (штамм, вызывающий пищевое отравление диарейного типа). Все эти штаммы хранились в Департаменте гигиены колледжа питания Кадара.

Измерения антибактериального действия проводили по эффекту торможения роста каждого из тестируемых микроорганизмов и выражали в виде индекса. Итак, определенные количества каждого из тестируемых микроорганизмов добавляли к среде, содержащей циклопентенон в определенной концентрации, и полученный раствор тестируемого микроорганизма инкубировали в течение 16 или 48 ч и после этого сравнивали количество жизнеспособных клеток.

Сначала определенную концентрацию циклопентенона добавляли в жидкую среду для тестирования чувствительности (производство №ккш) для проведения последовательного 2^п разведения. Затем раствор микроорганизма, подвергнутый преинкубации при 37°С в течение 16 ч в жидкой среде для тестирования чувствительности, инокулировали в количестве 10⁶ клеток/мл и инкубировали при 37°С. Измерение количества жизнеспособных клеток для каждого времени инкубации для каждого штамма проводили после разведения инкубируемого раствора до определенной степени с последующим распылением на поверхность твердой среды. При измерении количества клеток каждого из микроорганизмов использовали ЭНЬ (производство Е1кеп), Вайб Рагкег агар (производство ВВЬ) и ΝΟΚΟ агар (производство №ззш) для 8а1топе11а, 8. аигеиз и В. сегеиз соответственно. В случае лишь В. сегеиз инкубацию проводили при 32°С. Измеренные количества клеток при каждом времени инкубации выражали в виде десятичного логарифма величины КОЕ (колонии, формирующие единицы)/мл. Следующая табл. 10 показывает количество тестируемых микроорганизмов после инкубации в течение 16 ч и табл. 11 показывает эти величины после инкубации в течение 48 ч. Циклопентенон проявляет антибактериальное действие в отношении любого из тестируемых микроорганизмов. В данном случае в табл. 10-13 знак (-) в таблицах обозначает, что рост тестируемого микроорганизма не обнаружен.

Таблица 10

Концентрация добавленного образца в инкубационном растворе тестируемого микроорганизма (м.д.)	Количество тестируемого микроорганизма после инкубации в течение 16 ч (СРИ/мл) Тестируемый микроорганизм
(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)
1563	-	-	-	-	-	-
781	-	-	-	-	-	-
391	-	-	6,1	-	-	-
195	3,0	3,0>	4,9	4,3	-	-
98	5,2	5,0	4,7	5,5	5,8	3,0
49	7,0	6,7	6,9	6,1	6,9	6,8
0	8,8	8,3	8,7	8,4	8,4	7,8

Таблица 11

Концентрация добавленного образца в инкубационном растворе тестируемого микроорганизма (м.д.)	Количество тестируемого микроорганизма после инкубации в течение 48 ч (СРИ/мл) Тестируемый микроорганизм
(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)
1563					-	-
781					-	-
391					-	-
195					-	-
98					8,1	5,0
49	9,0	8,5	8,5	-	8,4	7,9

(2) Измеряли антибактериальное действие вышеуказанного циклопентенона по отношению к ЕзсйейсЫа сой и к энтерогеморрагической ЕзсйепсЫа сой. Тестировали следующие микроорганизмы.

Тестируемый микроорганизм (7): Езсйег1сй1а сой (8-0157:Н7, УТ1, 2-продуцирующий штамм); тестируемый микроорганизм (8): ЕзсйейсЫа сой (Υ.3-0157:Η7, УТ1, 2-продуцирующий штамм); тестируемый микроорганизм (9): ЕзсйепсЫа сой (Υ.1-0157:Η7, УТ1-продуцирующий штамм), тестируемый микроорганизм (10): ЕзсйейсЫа сой (8-026:ΗΝΜ, УТ1-продуцирующий штамм); тестируемый микроорганизм (11): ЕзсйейсЫа сой (8-0111:ΗΝΜ, УТ1, 2-продуцирующий штамм); и тестируемый микроорганизм (12): ЕзсйепсЫа сой (выделенный из пищи).

Все эти штаммы хранились в Департаменте гигиены колледжа питания Кадаета.

Измерение антибактериального действия проводили тем же способом, что и в примере 19(1).

Сначала определенную концентрацию циклопентенона добавляли в жидкую среду для тестирования чувствительности (производство N13341) и проводили последовательное 2^п разведение. Затем раствор микроорганизма, подвергнутый преинкубации при 37°С в течение 16 ч в жидкой среде для тестирования чувствительности, инокулировали в количестве 10⁶ клеток/мл и инкубировали при 37°С.

Измерение количества жизнеспособных клеток для каждого времени инкубации для каждого штамма проводили после разведения инкубирующего раствора до определенной степени путем нанесения на поверхность твердой среды. При измерении количества клеток штамма использовали ИНЬ (производство Е1кеп). Измеренные количества клеток при каждом времени инкубации выражали в виде величины логарифма, как описано выше. Результаты представлены в следующих табл. 12 и 13. Циклопентенон проявлял антибактериальное действие в отношении любого из тестируемых микроорганизмов.

Таблица 12

Концентрация добавленного образца в инкубационном растворе тестируемого микроорганизма (м.д.)	Количество тестируемого микроорганизма после инкубации в течение 16 ч (СЕИ/мл) Тестируемый микроорганизм
(7)	(8)	(9)	(10)	(11)	(12)
1563	-	-	-	-	-	3,0>
781	-	-	3,0>	-	-	6,4
391	3,6	2,2	3,0>	-	3,6	5,8
195	4,7	4,7	3,0>	-	6,2	6,6
98	7,0	7,0	7,1	6,1	7,4	8,3
49	6,3	6,9	7,1	7,1	8,0	8,2
0	8,5	8,0	8,6	8,5	8,5	8,5

Таблица 13

Концентрация добавленного образца в инкубационном растворе тестируемого микроорганизма (м.д.)	Количество тестируемого микроорганизма после инкубации в течение 48 ч (СЕИ/мл) Тестируемый микроорганизм
(7)	(8)	(9)	(10)	(11)	(12)
1563	-	-	-	-	-	-
781	-	-	-	-	-	-
391	-	-	-	-	-	-
195	-	-	-	-	4,1	-
98	8,9	5,3	8,6	7,4	8,5	5,0
49	8,5	9,3	8,5	9,8	8,5	10,1

(3) Следующие микроорганизмы использовали для тестирования антибактериальной активности описанного выше циклопентенона. К ним относились тестируемый микроорганизм (13): ЕксйепсЫа сой НВ101 (АТСС 33694); тестируемый микроорганизм (14): 8а1топе11а 1урЫтигшт ЬТ-2 (АТСС 27106); тестируемый микроорганизм (15): Ркеиботонак аегидшока (ΙΕΟ 3080), тестируемый микроорганизм (16): 81ар11у1ососсик аигеик 3А (ИтСт 8319); тестируемый микроорганизм (17): ВасШик киЬбйк (ΙΕΟ 3034) и тестируемый микроорганизм (18): 81гер1ососсик тШапк (655); хранившиеся в Национальном институте здоровья.

Тестируемые микроорганизмы высевали для культивирования в течение ночи в Ьбульоне (1% триптон, 0,5% экстракт дрожжей и 5% №С1; рН 7,0). Культивируемый посев (5 мкл) инокулировали в среду, в которой к 5 мл Ьбульона было добавлено 25-200 мкг/мл циклопентенона, а также в среду, к которой ничего не было добавлено, и проводили инкубацию при встряхивании при 37°С для измерения роста. В начале инкубации, а также через 8 ч после ее начала измеряли помутнение культуры, применяя Еиц И1дйа1 турбидиметр (проданный Еиц Кодио КК; производство Акуата Эепк| 8е1какикйо) при условии, что нормализованная шкала равнялась 82,3, и рост тестируемого микроорганизма измеряли от величины (помутнения при росте), полученной вычитанием помутнения в начале инкубации, и из величины, полученной после 8 ч инкубации. Здесь в случае тестирования микроорганизма (18) вместо Ь-бульона использовали вытяжку из мозга и сердца.

Результаты представлены в табл. 14, где обозначает, что не исследовали.

Таблица 14

Помутнение при росте

Тестируемый микроорганизм	Количество добавленного циклопентенона, мкг/мл среды
0	25	50	100	200
(13)	222	0	0	0	0
(14)	273	-	-	0	0
(15)	239	2	0	0	0
(16)	243	203	158	0	0
(17)	267	145	9	0	0
(18)	140	133	130	34	6

Таким образом, циклопентенон проявлял антибактериальную активность в отношении всех тестируемых микроорганизмов.

(4) Антибактериальную активность циклопентенона по отношению к бактериям ЫосЫ исследовали следующими методами. Тестируемый микроорганизм подвергали стационарной инкубации в течение 5 дней в среде 8Ι (1арап Вге^егу Аккоаайон), содержащей 10% этанол, для получения высеваемого микроорганизма. Высеваемый микроорганизм (0,1%) добавляли к 100 мл 10% этанолсодержащей среде 8Ι, к которой добавляли циклопентенон в количестве 0, 25, 50, 75 или 100 мкг/мл (в выражении на конечную концентрацию), затем проводили стационарную инкубацию в течение 5 дней и измеряли помутнение. При измерении помутнения определяли величину ΘΌ₆₀₀ с помощью абсорбциометра. Величину ΘΌ₆₀₀ среды, в которую не инокулировали тестируемый микроорганизм, вычитали из указанной выше величины, и полученную величину (помутнение при росте) использовали в качестве показателя роста тестируемого микроорганизма.

Тестировали следующие микроорганизмы. Итак, Ьас1оЬасШик ГгисРуогапк (ΙΕΟ 13118) (тестируемый микроорганизм А), Ьас1оЬасШик Ггис йуогапк (1СМ 1198) (тестируемый микроорганизм В) и Ьас!оЬасШик 1ютоЫос1Ы (ΙΕΘ 13120) (тестируемый микроорганизм С) в качестве истинных бактерий ЫосЫ, в то время, как Ьас!оЬасШик гйатиокик (ΙΕΘ 3532) (тестируемый микроорганизм Ό) применяли как ЫосЫ лактобактерии. Результаты представлены в табл. 15.

Таблица 15 Помутнение при росте

Тестируемый микроорганизм	Количество добавленного циклопентенона, мкг/мл среды
0	25	50	75
А	0,96	0,17	0,02	0
В	2,03	0,01	0	0
С	1,61	0,32	0,08	0
э	0,35	0,04	0,01	0

Рост тестируемых микроорганизмов А, С и Ό полностью ингибировался при концентрации 75 мкг/мл, в то время как рост тестируемого микроорганизма В полностью ингибировался при концентрации 50 мкг/мл.

Таким образом, циклопентенон проявляет антибактериальное действие также в отношении бактерий ЫосЫ.

Кроме того, циклопентенон проявляет антимикробную активность при высоких концентрациях также по отношению к грибкам, таким как ЗассЫотусек сегеуЩае АТСС 9763, Сапбйа а1Ысапк Т1ММ 0136 и АкрегдШик ГнтщаШк Т1ММ 1776.

Пример 20.

(1) У1Ьпо рагайаето1уйсик 4387-61 или У1Ьпо рагайаето1уйсик Т4144-1 (оба хранились в Национальном институте гигиенических наук) инокулировали в трипто-соевую бульонную среду (производство №ккш), содержащую 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,15, 3,13 или 1,56 мкг/мл циклопентенона для получения 10⁶ клеток/мл и проводили стационарную инкубацию при 37°С в течение 24 ч. В результате не обнаружено роста микроорганизмов ни одного из штаммов во фракциях, в которые добавляли 12,5 мкг/мл циклопентенона.

Культуру (50 мкл), в которой не обнаружен рост микроорганизма, распыляли на 20 мл агаровой среды с трипто-соевым бульоном, не содержащей циклопентенон, и проводили инкубацию при 37°С в течение 24 ч. В результате ни в одном из штаммов не наблюдался рост микроорганизма на агаровой среде, на которую наносили фракцию (в которую добавляли 50 мкг/мл или более циклопентенона).

Из вышеприведенного следует, что циклопентенон проявляет антибактериальное действие по отношению к У1Ьпо рагайаето1уйсик 4387-61 и У1Ьпо рагайаето1уйсик Т4144-1 при 12,5 мкг/мл и проявляет бактерицидное действие по отношению к обоим штаммам при 50 мкг/мл.

(2) Сатру1оЬас!ег )е)иЫ А3309 (хранилась в Национальном институте гигиенических наук) инокулировали в среду из вытяжки мозга и сердца (производство ЭГсо). содержащую 2% сыворотку плодов телят (производство Оап'ирроп 8е1уаки) и проинкубировали при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. Культуру (50 мкл) распыляли на 20 мл пластинку со средой Ми11егНтйп, содержащей 0,5% ЫаС1 и содержащей 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13 или 1,56 мкг/мл циклопентенона, и подвергали стационарной инкубации при 37°С в течение 48 ч.

В результате не наблюдали никакого роста микроорганизма на пластинке среды, к которой было добавлено 12,5 мкг/мл или более циклопентенона.

Таким образом, циклопентенон проявлял антибактериальную активность по отношению к Сатру1оЬас!ег.

(3) Измерение антибактериального действия циклопентенона по отношению к Ьещопе11а рпеиторЫ1а (выделенной из промывки бронхов человека; тестируемый микроорганизм (1)) и Ьещопе11а рпеиторЫ1а (выделенной из воды ванночки для горячего спринцевания; тестируемый микроорганизм (2)) (обе хранились в Департаменте гигиены Колледжа питания в Кагаве) проводили с использованием в качестве показателя эффекта торможения роста каждого из тестируемых микроорганизмов. Итак, определенное количество тестируемого микроорганизма добавляли к жидкой среде, содержащей определенную концентрацию циклопентенона, и полученную суспензию тестируемого микроорганизма инкубировали в течение 16, 48, 72 или 96 ч и проверяли количество жизнеспособных клеток после инкубации.

Первое: к бульону ВСУЕ α (производство Охой) добавляли циклопентенон в определенной концентрации и проводили последовательное 2^п разведение. Туда добавляли бактериальную суспензию, преинкубированную при 37°С в течение 16 ч в бульоне ВСУЕ α для получения количества клеток 10⁶/мл и инкубировали при 37°С. Измерение количества жизнеспособных клеток для каждого времени инкубации для каждого из микроорганизмов проводили путем соответствующего разведения культуры с последующим размазыванием по ВСУЕ α агару (производство Охой).

Измеренные количества клеток для каждого времени инкубации выражали в КОЕ (колонии образующие единицы)/мл, в виде десятичного логарифма. Результаты показаны в следующей табл. 16. Циклопентенон проявлял антибактериальное действие в отношении любого из микроорганизмов. Здесь в таблице означает, что рост тестируемого микроорганизма не наблюдался.

Таблица 16

Концентрация добавленного образца в культуре тестируемого микроорганизма (м.д.)	Количество клеток тестируемого микроорганизма после каждой инкубации, Сги/мл (16-ч инкубация) (96-ч инкубация) Тестируемый микроорганизм
(1)	(2)	(1)	(2)
24
12	5,7	6,1	8,3	8,6
0	6,9	7,4	8,7	8,6

(4) Наряду со штаммами Не11соЬас1ег ру1оп применяли стандартный штамм ΝΟΙΌ 11637 (АТСС 43504) и выделенные в клинике штаммы из желудка человека (206 и 3401; оба хранились в Департаменте бактериологии медицинского колледжа Нуодо). Каждый штамм подвергали инкубации при встряхивании при 37°С в условиях легкой аэрации, применяя Апегораск Сатрно (производство МйкиЫкЫ бак Скетка1) в Вгисе11а Вго111 Мебшт (производство ВВЬ), содержащей 7% лошадиной сыворотки (производство В1о \У1Ш1акег). Микроорганизм в фазе логарифмического роста разводили Вгисе11а ВгоШ и использовали для тестирования. Для экспериментов использовали 24-луночный планшет (производство Еа1соп). Циклопентенон вносили в количестве 0,1 мл (1,000 мкг)/лунка, после двухкратных разведении с помощью РВ8 и иммобилизовывали добавлением 0,9 мл/лунка среды [Вгисе11а агаровая среда (рН 6,0), содержащей 7% лошадиной сыворотки (производство ВВЬ)]. рН Вгисе11а агаровой среды предварительно доводили до 6,0 с помощью НС1 и использовали в экспериментах. Каждый микроорганизм инокулировали в количестве около 10⁴/50 мкл/лунка. После инокуляции микроорганизма проводили инкубацию в условиях слабой аэрации при 37°С в течение 3-4 дней для оценки антибактериальной активности. Определяли количество образца (мкг/мл), проявляющего 90% или более ингибирования, и выражали как М1С. В результате для всех тестированных штаммов М1С равнялся 32 мкг/мл, и циклопентенон проявлял антибактериальное действие в отношении штаммов НеНсоЬас1ег.

Пример 21. Антиканцерогенное действие циклопентенона по отношению к твердой опухоли.

Циклопентенон, описанный в примере 3(1), разбавляли физиологическим солевым раствором до определенных концентраций с последующим проведением тестов.

(1) Ме111 А клетки (2 х 10⁶ клетки/мышь) вводили подкожно в кожу живота самок мышей ВАЬВ/с в возрасте 8 недель (вес тела: около 20 г). После этого в ту же область в течение последующих пяти дней вводили подкожно циклопентенон (5 мг/кг/день). В другом варианте контрольной группе таким же образом подкожно вводили физиологический солевой раствор. Через две недели раковые ткани, образовавшиеся в брюшной полости мышей, извлекали и измеряли их вес. Результат представлен в табл. 17.

Итак, в контрольной группе средний вес опухоли равнялся 1,41 г, в то время как в группе, получавшей циклопентенон (5 мг/кг/день), этот вес равнялся 0,0 г, таким образом, образование раковой ткани не наблюдалось вовсе и степень ингибирования равнялась 100%.

Таблица 17

Мыши, %	(п)	Вес опухоли, г (среднее±8Э)	Степень ингибирования
Контроль	(7)	1,41±0,55	-
Получавшие циклопентенон	(8)	0,00±0,00	100,0

(2) Использовали шестнадцать самок мышей линии 1СК в возрасте шести недель (вес тела: около 26 г). Подкожно в область живота вводили саркому-180 (5,5 х 10⁶ клеток/мышь), из которых создавали контрольную группу (8 мышей) и группу, получавшую циклопентенон (8 мышей).

Циклопентенон разбавляли водопроводной водой и свободно давали группе с введением циклопентенона, применяя бутылку для снабжения водой и создавая дозу циклопентенона примерно 80 мг/кг/день. Водопроводную воду сходным образом давали контрольной группе. Обеим группам в ходе эксперимента предоставляли свободный доступ к пище.

Количество выживших мышей на 40-й день после подкожной трансплантации саркомы-180 равнялось двум из восьми в контрольной группе, а в группе получавших циклопентенон равнялось семи, таким образом отмечен значительный эффект продления жизни при введении циклопентенона.

(3) Мышиную лейкемию Р-388 (1,1 х 10⁶ клеток/мышь) вводили внутрибрюшинно самкам мышей ЭВЛ/2 в возрасте семи недель (вес тела: около 20 г). После этого внутрибрюшинно вводили циклопентенон (10 мг/кг/день) в течение 5 последующих дней. Параллельно контрольной группе тем же способом внутрибрюшинно вводили физиологический солевой раствор. В каждой группе (каждая состояла из восьми мышей) определяли количество выживших мышей, средний срок выживания и степень продления жизни. Результаты показаны на фиг. 15. Так, в контрольной группе средний срок выживания составлял 10,3 дня, в то время как в группе, получавших циклопентенон, эта величина составляла 31,4 дня, а степень продления жизни составляла 306,1%, что показывает значительный продлевающий жизнь эффект. Фиг. 15 показывает антиканцерогенный эффект циклопентенона, где ордината представляет собой количество выживших мышей, а абсцисса показывает дни выживания. На фиг. 15 сплошная линия показывает группу с введением циклопентенона, а прерывистая линия показывает контрольную группу.

Сходным образом использовали 16 самок мышей линии 1СЛ в возрасте пяти недель (вес тела: около 25 г), которые получали внутрибрюшинно саркому-180 (5,5 х 106 клеток/мышь) для формирования контрольной группы (включавшей восемь мышей) и группы, получавших циклопентенон (включавшей восемь мышей).

Параллельно использовали 16 самок мышей линии СОН в возрасте семи недель (вес тела: около 20 г), которые получали внутрибрюшинно 1МС (2,0 х 10⁶ клеток/мышь) для формирования контрольной группы (включавшей восемь мышей) и группы, получавшей циклопентенон (включавшей восемь мышей).

Кроме того, использовали 16 самок мышей линии ΌΌΥ в возрасте пяти недель (вес тела: около 25 г), которые получали внутрибрюшинно ЕАС (1,2 х 10⁶ клеток/мышь) для формирования контрольной группы (включавшей восемь мышей) и группы, получавшей циклопентенон (включавшей восемь мышей).

В результате в случаях саркомы-180, 1МС и ЕАС средние сроки выживания в контрольной группе составляли 22,6 дней, 10,8 дней и 15,8 дней соответственно, в то время как аналогичные величины в группе, получавшей циклопентенон, равнялись 33,4 дня, 20,3 дня и 40,3 дня соответственно, тем самым продление жизни составляло 148, 188 и 255% соответственно, что показывает значительный эффект введения циклопентенона на продление жизни.

Пример 22. Введение.

(1) Для приготовления раствора для инъекций к физиологическому солевому раствору (1арапезе Ркагтасорое1а) добавляли циклопентенон в концентрации 1%.

(2) Для приготовления раствора для инъекций к физиологическому солевому раствору (той же фирмы, что и указанный выше) добавляли циклопентенон и глицирретиновую кислоту в концентрациях 0,5 и 0,1% соответственно.

Пример 23. Таблетки.

(1) Готовили таблетки, каждая из которых содержит 100 мг циклопентенона и определенное количество микрокристаллической целлюлозы, с последующим покрытием их оболочкой из сахара.

(2) Готовили таблетки, каждая из которых содержит 0,1 мг циклопентенона, 10 мг дикалиевой соли глицирретиновую кислоты и определенное количество микрокристаллической целлюлозы, с последующим покрытием их оболочкой из сахара.

Пример 24. Мази.

Мази готовили в соответствии со следующим составом.

Циклопентенон 1 г

Всасывающаяся мазь (1арапезе Ркагтасорое1а) 99 г

Сначала циклопентенон хорошо перемешивали с всасывающейся мазью и затем остав шуюся всасывающуюся мазь добавляли туда постепенно с последующим перемешиванием до образования гомогенного продукта, в результате чего была приготовлена мазь. Эту мазь наносят 4-5 раз в день на место повреждения.

Пример 25. Косметические средства.

Суспензию в форме антибактериального косметического материала готовили в соответствии со следующим составом.

Этанол 10 частей

Глицерол 1 часть

Лимонная кислота 0,3 части

Метил-п-гидроксибензоат 0,2 части

Циклопентенон 0,1 часть

Отдушка Немного

Чистая вода Добавляют до 100 частей

Пример 26. Средство для ванны.

Антибактериальное средство для ванны готовили в соответствии со следующим составом.

Безводная глауберова соль	20 частей
Бикарбонат натрия	40 частей
Янтарная кислота	10 частей
Циклопентенон	30 частей
Красители	По желанию
Отдушки	По желанию
(готовится в форме таблеток)
Пример 27. Препарат для чистки зубов.
Препарат для чистки зубов готовили в со-
ответствии со следующим составом.
Карбонат кальция	50,00%
Глицерол	22,00%
Каррагенан	0,50%
Карбоксиметилцеллюлоза	1,00%
Лаурилдиэтаноламид	1,00%
Монолаурат сахарозы	2,00%
Отдушки	1,00%
Сахарин	0,10%
Циклопентенон	0,10%
Вода	До 100%
Всего	100,00%
Пример 28.

74,9%

20,0%

0,2%

0,5%

4,3%

0,001%

Леденцовую таблетку готовили в соответствии со следующим составом.

Сахар

Лактоза

Монолаурат сахарозы

Отдушки

Чистая вода

Циклопентенон

Пример 29.

Антибактериальные напитки готовили в соответствии со следующими методами.

(1) Пектин (Ротозш РесИп ЬМ-13СС; производство Негси1ез) (5 кг) добавляли к 100 л водопроводной воды, и смесь нагревали от температуры жидкости 28°С до 120°С с помощью продувания паром в течение 35 мин, оставляли при 120°С в течение 5 ч при перемешивании и охлаждали для получения 135 л охлажденной смеси. Туда добавляли 1,35 кг целита #545 (производство Се1бе) и 1,35 кг кремнезема #6008 (производство Сбио 8Шса) с целью фильтрования, и фильтрование проводили, используя компактный фильтр (6-дюймовой (40,64 см) фильтровальной бумаги в 16 слоев; ΛΌνΑΝΤΕί’ #327), предварительно покрытый 0,1 кг целита #545 и 0,1 кг кремнезема #600-8. Полученный фильтрат подвергали постоянной мгновенной температурной обработке (при 98°С в течение 60 с) с помощью нагревательной пластины (производство Ы1сб1бап 8екаки5бо) с последующим охлаждением для получения 150 л раствора термообработанного пектина, содержащего циклопентенон.

Указанный раствор термообработанного пектина, содержащий циклопентенон, имел рН около 3,5, кислотность 6,2 мл и сахаристость 5,8 Впх %. В данном случае рН измеряли на рНметре, кислотность выражали в виде количества (мл) 0,1н. ΝαΟΗ, используемого для нейтрализации до рН 7,0, и сахаристость измеряли сахарометром Впх.

(2) Зеленый чай готовили обычным способом, используя 10 г листьев зеленого чая, 0,2 г витамина С и 1000 мл деионизированной воды. К 100 мл зеленого чая добавляли заранее приготовленный раствор термообработанного пектина, содержащий циклопентенон в количестве 200 мг (в расчете на твердое вещество; содержащий 1,6 мг циклопентенона) для приготовления продукта (1) изобретения. Контролем служил чай, к которому ничего не добавляли. Органолептическое исследование (по пятиточечному методу, в котором точка 5 определялась как хорошее и точка 1 представляла плохое) проводили с помощью 20 оценщиков, и среднее результатов представлено в табл. 18.

Таблица 18 Органолептическая оценка

	Продукт (1)	Контроль
Вкусовая палитра	4,3	3,2
Сбалансированность вкуса	3,9	3,4
Общий вкус	4,3	3,3

Оценка, приведенная в табл. 18, показывает, что по сравнению с контролем продукт (1) настоящего изобретения имел более широкий вкус и вкусовую палитру, а также хорошо сбалансированный вкус, при этом аромат и вкус чая были улучшены и был достигнут эффект спрятанного запаха.

Пример 30.

Напиток готовили в соответствии со следующим составом.

Фруктозо-глюкозо-жидкий сахар 5,00%

Сахар 4,00%

Закисляющий агент 1,20%

Отдушки 0,30%

Циклопентенонсодержащий материал 0,5%

Чистая вода До 100%

Всего 100,00%

Раствор термообработанного пектина, содержащий циклопентенон, описанный в примере 29(1), использовали в качестве содержащего циклопентенон материала и добавляли его в количестве, рассчитанном по твердому веществу. Этот напиток (100 мл) содержит 4 мг циклопентенона.

Пример 31.

Свежую капусту (200 г) нарезали на полоски и каждые 100 г погружали в воду (контроль) или в 0,2% раствор циклопентенона на 5 мин. Затем воду осторожно удаляли и капусту помещали в мешочек из синтетической смолы и оставляли при комнатной температуре (20°С). По наблюдениям после 24 ч капуста, погруженная в водный раствор циклопентенона, сохраняла свежесть по сравнению с той, которую погружали в воду (контроль).

Это различие становилось более четким через несколько дней, и по наблюдениям через 4 дня капуста, погруженная в водный раствор циклопентенона, не проявляла запаха испорченности, оставаясь свежей по сравнению с той, которую погружали в воду (контроль).

Преимущества изобретения

Настоящее изобретение относится к циклопентенону и его оптически активным соединениям, которые проявляют физиологические виды активности, такие как антиканцерогенное действие, ингибирующее действие по отношению к пролиферации раковых клеток, индуцирующее действие на дифференцирование раковых клеток, индуцирующее действие на апоптоз, антибактериальное действие и т.д., и обладают высокой безопасностью. Предложены также фармацевтические препараты, пищевые продукты и напитки, содержащие указанные соединения, обладающие такими физиологически активными свойствами. Теперь возможно в соответствии с настоящим изобретением легко и эффективно получать циклопентенон из природных материалов и предлагать его оптически активные соединения по низкой цене.

Благодаря своим физиологическим видам активности циклопентенон и/или его оптически активные соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть использованы в качестве фармацевтических препаратов, обладающих действием, предупреждающим канцерогенез, антиканцерогенным действием и антибактериальным действием, и указанные фармацевтические препараты могут использоваться для поддержания гомеостаза живого организма, особенно для поддержания хорошего состояния желудка и кишечника. Настоящее изобретение также относится к антисептикам, антибактериальным косметическим средствам, антибактериальным средствам для чистки зубов и антибактериальным агентам для ванны, содержащим циклопентенон и/или его оптически активные производные в качестве действующих ингредиентов.

В соответствии с настоящим изобретением теперь возможно, что подходящее количество циклопентенона и/или его оптически активных производных, обладающих физиологической активностью, включались в пищевые продукты или напитки. Благодаря различным вариантам физиологической активности циклопентенона и/или его оптически активных соединений, пищевой продукт или напиток по настоящему изобретению является здоровым пищевым продуктом или напитком, обладающим способностью поддерживать гомеостаз организма, такой как профилактика канцерогенеза, антиканцерогенное действие, антибактериальное действие и действие по индукции апоптоза, и по настоящему изобретению предлагается пищевой продукт или напиток, содержащие действующее соединение, полезное для поддержания хорошего состояния желудка и кишечника. Более того, в результате добавления циклопентенона антибактериальное действие пищевого продукта или напитка может быть легко усилено, и препарат, содержащий циклопентенон и/или его оптически активные соединения, также очень полезен в качестве антисептического агента для пищи или напитка.

Кроме того, по настоящему изобретению предлагается вещество, которое содержит сахаридный компонент, содержащий уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, где в указанном веществе, которое содержит сахаридный компонент, содержащий уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, по крайней мере часть реакционной способности аминов, аминокислот, пептидов или белка, обладающих способностью взаимодействовать с уроновой кислотой, производным(ыми) уроновой кислоты, промежуточным соединением для циклопентенона или самим циклопентеноном исчезает и/или по крайней мере часть указанного(ных) реакционноспособного(ных) вещества(в) удаляется. Когда применяется указанное вещество, которое содержит сахаридный компонент, содержащий указанную уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, циклопентенон и/или его оптически активные соединения, применяемые по настоящему изобретению, могут быть эффективно получены. Примеры вещества, которое содержит сахаридный компонент, содержащий указанную уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, представляют собой вещество, нагреваемое в сухом виде, которое содержит сахаридный компонент, содержащий уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты. В отношении обработки сухим прогреванием обработка в виде запекания/поджаривания является простой и удобной, и запекаемые/поджариваемые растения, животные и микроорганизмы, такие как запекаемые/поджари ваемые овощи, фрукты, зерна, грибы, морские водоросли, кора и хрящ являются вполне пригодными для производства циклопентенона и/или его оптически активных соединений настоящего изобретения. В данном случае продукт, обработанный сухим нагреванием, может быть эффективно получен с помощью дегидратации вещества, которое подвергается обработке, перед обработкой сухим нагреванием.

Claims (33)

1. Способ получения 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она, представленного формулой [1] заключающийся в том, что по меньшей мере одно вещество, выбранное из следующих: (а), (Ъ) и (с), подвергают нагреванию, где (a) уроновая кислота или производное(производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(производные) уроновой кислоты.

2. Способ получения 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она, заключающийся в том, что по меньшей мере одно вещество, выбранное из следующих: (а), (Ъ) и (с), подвергают нагреванию и 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он, представленный формулой [1] выделяют из вышеуказанного термообработанного продукта, где (a) уроновая кислота или производное(производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(производные) уроновой кислоты.

3. Способ получения 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она по п.1 или 2, где уроновая кислота представляет собой галактуроновую кислоту, глюкуроновую кислоту, гулуроновую кислоту, маннуроновую кислоту и/или идуроновую кислоту.

4. Способ получения 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она по п.1 или 2, где производное уроновой кислоты представляет собой соль уроновой кислоты или лактон уроновой кисло ты, эфир уроновой кислоты, амид уроновой кислоты или их соли.

5. Способ получения 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она по п.1 или 2, где сахаридное производное представляет собой сахарид, выбранный из пектина, пектиновой кислоты, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, гепарина, гепарансульфата, фукоидана, хондроитинсульфата, хондроитина, дерматансульфата и/или продукта их разложения.

6. Способ получения 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она по любому из пп.1-5, где продукт, подвергнутый термообработке, получают нагреванием при 60-350°С в течение периода времени от нескольких секунд до нескольких дней.

7. Способ получения 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она по любому из пп.1-6, где продукт, подвергнутый термообработке, получают нагреванием в условиях от кислых до нейтральных.

8. Способ получения оптически активного

4.5- дигидрокси-2-циклопентен-1-она, заключающийся в том, что включает следующие стадии:

(A) стадию, на которой по меньшей мере одно вещество, выбранное из следующих: (а), (Ъ) и (с), нагревают с получением 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-она, где (a) уроновая кислота или производное(производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(производные) уроновой кислоты;

(B) необязательную стадию, на которой

4.5- дигидрокси-2-циклопентенон-1-он выделяют из полученного термообработанного продукта; и (C) стадию, на которой 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-он подвергают разделению на оптические изомеры.

9. Способ получения оптически активного

4.5- дигидрокси-2-циклопентен-1-она по п.8, где уроновая кислота представляет собой галактуроновую кислоту, глюкуроновую кислоту, гулуроновую кислоту, маннуроновую кислоту и/или идуроновую кислоту.

10. Способ получения оптически активного 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она по п.8, где уроновая кислота представляет собой соль уроновой кислоты или лактон уроновой кислоты, сложный эфир уроновой кислоты, амид уроновой кислоты или их соль.

11. Способ получения оптически активного 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она по п.8, где производное сахарида представляет собой сахарид, выбранный из пектина, пектиновой кислоты, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, гепарина, гепарансульфата, фукоидана, хондроитинсульфата, хондроитина, дерматансульфата и/или продукта их разложения.

12. Способ получения оптически активного 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она по любому из пп.8-11, где термообработанный продукт получают путем нагревания при 60-350°С в течение от нескольких секунд до нескольких дней.

13. Способ получения оптически активного 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она по любому из пп.8-12, где термообработанный продукт получают путем нагревания в условиях от кислых до нейтральных.

14. (-)-4,5 - Дигидрокси-2-циклопентен-1он, имеющий показатель оптического вращения [а]р²⁰ -105° (с=0,30, этанол).

15. (+)-4,5-Дигидрокси-2-циклопентен-1он, имеющий показатель оптического вращения [а]_о ²⁰ +104 (с=0,53, этанол).

16. Применение 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленного формулой [1]

О

0::: ^1,1 и/или его оптически активного производного в качестве противоракового средства.

17. Применение 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленного формулой [1]

О /'Л-он па и—-1-он и/или его оптически активного производного в качестве индуктора дифференциации раковых клеток.

18. Применение 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленного формулой [1] и/или его оптически активного производного в качестве индуктора апоптоза.

19. Применение термообработанного продукта, полученного нагреванием вещества, выбранного из следующих (а), (Ъ) и (с):

(a) уроновая кислота или производное(производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(производные) уроновой кислоты, в качестве противоракового средства.

20. Применение термообработанного продукта, полученного нагреванием вещества, выбранного из следующих (а), (Ъ) и (с):

(a) уроновая кислота или производное(производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту, и/или производное(производные) уроновой кислоты, в качестве индуктора дифференциации раковых клеток.

21. Применение термообработанного продукта, полученного нагреванием вещества, выбранного из следующих (а), (Ь) и (с):

(a) уроновая кислота или производное(производные) уроновой кислоты;

(b) сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту и/или производное (производные) уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту, и/или производное(производные) уроновой ки слоты, в качестве индуктора апоптоза.

22. Способ индукции дифференциации раковых клеток, отличающийся тем, что в качест ве активного ингредиента используют 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-он, представленный формулой [1] и/или его оптически активное производное.

23. Способ индукции апоптоза, отличаю- щийся тем, что в качестве активного ингредиента используют 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1он, представленный формулой [1]

О и/или его оптически активное производное.

24. Способ по п.22 или 23, отличающийся тем, что в качестве активного ингредиента(ов) используют 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1он, полученный по способу по п.1, или его оп- тически активное производное.

25. Способ по п.22 или 23, отличающийся тем, что в качестве активного ингредиента(ов) используют термообработанный продукт по п.1.

26. Способ по п.22 или 23, отличающийся тем, что в качестве активного ингредиента(ов) используют 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1он, представленный формулой [1], полученный по способу по п.2.

27. Способ получения пищевого продукта или напитка, включающий стадию добавления к ним 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленного формулой [1]

О и/или его оптически активного производного.

28. Способ по п.27, где 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-он, представленный формулой [1], получен способом по п.1.

29. Способ по п.27, где в пищевой продукт или напиток добавляют термообработанный продукт по п.1.

30. Способ по п.27, где 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-он, представленный формулой [1], получен способом по п.2.

31. Способ по любому из пп.27-30, где количество добавленного 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-она, представленного формулой [1], и/или его оптически активного производного составляет 5х10^-6 частей или более на 100 частей продукта или напитка.

32. Способ по любому из пп.27-31, где пищевой продукт или напиток представляет собой антиканцерогенный пищевой продукт и/или антиканцерогенный напиток.

33. Промежуточный продукт для получения 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она, представленного формулой [1], на основе материала из растений, микроорганизмов или животных, содержащего сахаридное производное, которое содержит уроновую кислоту и/или производное(ые) уроновой кислоты, отличающийся тем, что его получают путем обработки указанного материала нагреванием при 60-400°С или протеазной обработкой.