ES2226096T3 - Agentes antivirales. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un agente antivírico caracterizado porque contiene al menos un compuesto seleccionado entre un grupo que consiste en 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona representado por la fórmula (I) y una sustancia ópticamente activa y su sal como componente activo.
Description
Agentes antivirales.
La siguiente invención se refiere a productos
farmacéuticos y preparados comestibles y bebibles que son útiles
contra organismos patógenos debido a su acción antiviral.
La acción antiviral comprende la acción de
inducir la capacidad de resistencia a los virus, tal como la
inhibición de la infección de los virus a las células, la inhibición
de la multiplicación de los virus en las células infectadas, etc.;
la acción de destruir selectivamente las células infectadas por
virus y la acción de inactivar el virus mismo (es decir, eliminar su
capacidad de infectar).
Existe un anticuerpo neutralizante en forma de
sustancia que ejerce la acción de inactivar al virus mismo, mientras
que existe una vacuna como medio de inducir a tal anticuerpo. Sin
embargo, aunque la inducción del anticuerpo mediante la
administración de la vacuna es efectiva en la prevención de la
infección por el virus, los métodos terapéuticos eficaces en los que
se usan anticuerpos se encuentran en la actualidad raramente
disponibles. Además, no existe un método terapéutico eficaz en el
que el virus sea inactivado directamente por un producto
farma-
céutico.
céutico.
Con respecto a la acción de inducir capacidad de
resistencia a los virus, se tiene inhibición de la replicación del
genoma del virus, inhibición de la transcripción del gen del virus,
inhibición de la síntesis de proteína del virus, inhibición del
desdoblamiento de la proteína del virus, etc. Al inducir tales
acciones, se da la supresión de la actividad o de la expresión del
factor de transcripción en la célula, supresión de la actividad o de
la expresión del factor de transcripción derivado del virus,
inducción de proteínas de choque térmico, etc. Un ejemplo de
sustancia que es capaz de inducir tal acción es la
prostaglandina.
Ejemplos de agentes que eliminan selectivamente
las células infectadas por virus son aciclovir, ganciclovir,
sorivudine, etc., que se han usado como medicamentos contra el virus
del herpes.
Es más eficaz luchar contra los virus por medio
de una acción sinérgica que por medio de una acción simple. Por
ejemplo, incluso cuando se administra una sustancia que elimina
selectivamente las células infectadas por virus, es muy difícil
eliminar el virus completamente, ya que hasta que se eliminan las
células infectadas se generan nuevos virus y otras células son
infectadas por ellos. Por otra parte, incluso cuando se administra
una sustancia que posee la acción de inducir capacidad de
resistencia a los virus, no es posible eliminar las células
infectadas.
Un objetivo de la presente invención es
desarrollar compuestos que tienen la función de inducir resistencia
a los virus en las células y la función de destruir selectivamente
las células infectadas por virus, así como ofrecer productos
farmacéuticos, tales como agentes antivirales, agentes para mejorar
las funciones hepáticas, agentes para inducir proteínas de choque
térmico, agentes para impedir carcinogénesis mediante oncogenes,
agentes para impedir carcinogénesis química, etc., y preparados
comestibles y bebibles antivirales en los que están contenidos los
compuestos anteriormente mencionados.
Los autores de la presente invención han dirigido
un estudio intensivo para alcanzar tal objetivo y han encontrado
que, cuando las células se tratan con un compuesto que posee la
función de inducir resistencia a los virus y de destruir
selectivamente las células infectadas por virus, dichas células
infectadas por virus resultan dañadas selectivamente y, por tanto,
disminuye la cantidad de virus que se genera hasta la muerte de
dichas células y que, dado que las células que todavía no han sido
infectadas por virus adquieren resistencia a los virus debido a la
administración del compuesto, se suprime el crecimiento de los virus
incluso si la célula es infectada nuevamente. En otras palabras, han
descubierto que el compuesto que posee la función de inducir
resistencia a los virus en las células y de destruir selectivamente
las células infectadas por virus es extremadamente eficaz para
eliminar virus, tales como el virus del SIDA humano o el virus de la
hepatitis C.
La función del compuesto usado en la presente
invención para inducir resistencia a los virus en las células puede
medirse mediante el tratamiento de las células con el compuesto
antes de la infección del virus seguido del uso de inhibición o
infección del virus a las células, inhibición o replicación del
genoma del virus, inhibición o transcripción del gen del virus,
inhibición de síntesis de la proteína del virus, inhibición del
desdoblamiento de la proteína del virus, etc., como indicadores o
patrones de medida.
Adicionalmente, la función de destruir
selectivamente las células que están infectadas por virus se puede
medir mediante comparación del índice de supervivencia de las
células infectadas por virus con el de las células no
infectadas.
No existe absolutamente ninguna limitación para
el compuesto que posee la función de inducir resistencia a los virus
en las células y también de destruir selectivamente las células
infectadas por virus, siempre que dicho compuesto posea ambas
funciones.
Actualmente, los autores de la presente invención
han descubierto que la
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
(representada a continuación por la fórmula [I] y denominada de aquí
en adelante como "ciclopentenona"), o un compuesto o sal de
ella ópticamente activos, es un compuesto que posee la función de
inducir resistencia a los virus en las células y también de destruir
selectivamente las células infectadas por virus y, en consecuencia,
la presente invención se ha concluido con éxito.
Haciendo un compendio de la presente invención,
la primera característica se refiere al uso de al menos un compuesto
seleccionado entre cis-, trans- o una mezcla de isómeros de la
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
representada a continuación por la fórmula [I], y sus
correspondientes formas ópticamente activas o una sal de ella, en la
fabricación de un agente para el tratamiento o prevención de
enfermedades virales.
La segunda característica de la presente
invención se refiere al uso de al menos un compuesto seleccionado
entre cis-, trans- o una mezcla de isómeros de la
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
representada por la fórmula [I], sus correspondientes formas
ópticamente activas o una sal de ella, en la fabricación de bebidas
alimenticias para el tratamiento o la prevención de enfermedades
virales.
La tercera característica de la presente
invención se refiere al uso de al menos un compuesto seleccionado
entre cis-, trans- o una mezcla de isómeros de la
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
representada por la fórmula [I] y sus formas correspondientes
ópticamente activas o una sal de dicho compuesto farmacéuticamente
aceptable, en la fabricación de un agente para inducir proteínas de
choque térmico.
En una forma de realización preferente de la
presente invención, el virus del SIDA humano y el virus de la
hepatitis C constituyen ejemplos de virus. Agente antivirales para
seres humanos, agentes antivirales para animales (tales como agentes
antivirales para animales domésticos, aves de corral, peces o
crustáceos) y agentes antivirales para plantas constituyen ejemplos
de agentes antivirales.
En la Fig. 1 se representa un gráfico que muestra
la relación entre la concentración de ciclopentenona y el índice de
supervivencia cuando se usan células CEM-SS;
En la Fig. 2 se representa un gráfico que muestra
la relación entre la concentración de ciclopentenona y el índice de
supervivencia cuando se usan células H9;
En la Fig. 3 se representa un gráfico que muestra
la relación entre la concentración de ciclopentenona y el índice de
supervivencia cuando se usan células CEM-3B;
En la Fig. 4 se representa un gráfico que muestra
la relación entre la concentración de ciclopentenona y el índice de
supervivencia cuando se usan células H9-3B;
En la Fig. 5 se representa un gráfico que muestra
la acción inhibidora de la ciclopentenona contra la
carcinogenicidad.
En la Fig. 6 se muestra el dicroísmo circular
(DC) del p-dimetilaminobencil derivado de la
(-)-ciclopentenona y la
estéreo-estructura de la
(-)-ciclopentenona.
En la Fig. 7 se muestra el DC del
p-dimetilaminobencil derivado de la
(+)-ciclopentenona y la
estéreo-estructura de la
(+)-ciclopentenona.
La ciclopentenona representada por la fórmula [I]
usada en la presente invención comprende ambos isómeros en los que
las configuraciones de los grupos hidroxilo en las posiciones 4- y
5- son cis y trans. En la presente invención, puede usarse
cualquiera entre la cis-ciclopentenona,
trans-ciclopentenona y una mezcla de cis- y
trans-ciclopentenona. También es posible utilizar
sustancias ópticamente activas derivadas de las anteriores.
La cis-ciclopentenona se puede
preparar mediante síntesis química [Helvetica Chimica Acta, volumen
55, pp. 2838-2844 (1972)]. La
trans-ciclopentenona se puede preparar, bien
mediante síntesis química [Carbohydrate Res., volumen 247, pp.
217-222 (1993)], bien mediante calentamiento de un
ácido urónico, tal como ácido glucurónico, de un derivado de ácido
urónico, tal como glucuronolactona o una sustancia que contenga el
mismo (véase el documento WO-A-9 813
328), o bien mediante reacción de
4-acetoxi-5-alcoxi-pentadienal
en anhídrido acético en presencia de un catalizador ácido (véase
JP-A-01 233255). En la presente
invención, es también posible usar dicho producto de calentamiento,
el producto parcialmente purificado o el producto del mismo
purificado.
Por ejemplo, cuando se usa ácido
D-glucurónico como ácido urónico y se calienta su
disolución al 1% a 12ºC durante cuatro horas, se produce
ciclopentenona en la sustancia tratada mediante calor. La
ciclopentenona contenida en esta sustancia tratada mediante calor se
extrae con un disolvente y se concentra el extracto. A continuación,
este extracto concentrado se separa por medio de una cromatografía
en columna de gel de sílice, se concentra la fracción eluida de
ciclopentenona, se extrae con cloroformo la ciclopentenona del
concentrado y el extracto del concentrado se somete a una
cromatografía en columna de fase normal, después de lo cual se aísla
la ciclopentenona contenida en la sustancia tratada con calor.
Las propiedades físicas de la ciclopentenona se
darán más adelante. Complementariamente, se efectuó un análisis de
la ciclopentenona por espectrometría de masas, mediante un
espectrómetro de masas DX302 (fabricado por Nippon Denshi).
Adicionalmente, el registro del espectro de RMN, en cloroformo
deuterado como disolvente, se efectuó en un JNM-A
500 (fabricado por Nippon Denshi). La rotación específica se midió
mediante un polarímetro DIP-370 (fabricado por
Nippon Bunko). El espectro de absorción ultravioleta se registró en
un espectrofotómetro UV-2500 (fabricado por
Shimadzu) y el espectro de absorción infrarroja (IR) se registró en
un espectrofotómetro de infrarrojo FTIR-8000
(fabricado por Shimadzu).
EM m/z 115 [M+H]^{+}
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 4,20 (1H, d, J = 2,4 Hz, 5-H), 4,83 (1H, m,
4-H), 6,30 (1H, dd, J = 1,2; 6,1 Hz,
2-H), 7,48 (1H, dd, J = 2,1; 6,1 Hz,
3-H).
Como información complementaria, los valores de
desplazamiento químico del espectro de RMN-^{1}H
se dan tomando como base el valor del desplazamiento químico del
CHCl_{3}, que es 7,26 ppm.
Rotación óptica: [\alpha]_{D}^{20}
0ºC (c 1,3, agua)
UV: \lambda_{max} 215 nm (agua)
IR (método con KBr): absorciones observadas a
3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm^{-1}.
Cuando la ciclopentenona aislada se somete a
resolución óptica, se obtienen
(-)-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
y
(+)-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Ni que decir tiene que la ciclopentenona obtenida por el método
sintético puede someterse también a resolución óptica.
Por ejemplo, se disuelve la ciclopentenona en
etanol. Se añade adicionalmente a esta disolución etanólica una
mezcla de hexano/etanol (94/6) para preparar una disolución de
ciclopentenona. La ciclopentenona se puede resolver ópticamente
cuando esta muestra en disolución se somete a HPLC (cromatografía de
líquidos de alta eficacia) utilizando, por ejemplo, un Chiral Pack
AS (fabricado por Dalcel Chemical Industries) bajo condiciones tales
que la temperatura de la columna es 40ºC y la fase móvil
hexano/etanol (94/6).
La rotación óptica de la
(-)-trans-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
ópticamente resuelta [de aquí en adelante denominada como
(-)-ciclopentenona] es
[\alpha]_{D}^{20} -105º (c 0,30, etanol),
mientras que la de la
(+)-trans-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
ópticamente resuelta [de aquí en adelante denominada como
(+)-ciclopentenona] es
[\alpha]_{D}^{20} +104º (c 0,53, etanol). Como
información complementaria, la rotación óptica se midió mediante el
polarímetro anteriormente mencionado, del tipo
DIP-370 (fabricado por Nippon Bunko).
Después de esto, tanto la
(-)-ciclopentenona como la
(+)-ciclopentenona se sometieron a análisis
estructural, por medio de análisis de masas y de resonancia
magnética nuclear (RMN), medida del espectro de absorción UV y
medida del espectro de absorción infrarroja, según los métodos ya
mencionados. El resultado fue que ambas sustancias ópticamente
activas presentaron los mismos resultados que la ciclopentenona
antes de la resolución óptica.
Cada una de las
(-)-ciclopentenona y
(+)-ciclopentenona ópticamente resueltas se
convirtieron en el p-dimetilaminobencil derivado y
se midió el espectro de dicroísmo circular (DC) mediante un
dispersímetro de dicroísmo circular del tipo J-720
(fabricado por Nippon Bunko), aplicándose al resultado la regla de
quiralidad del dibenzoato [J. Am. Chem. Soc., volumen 91, pp.
3989-3991 (1969)] para determinar la
configuración.
El DC del p-dimetilaminobencil
derivado de la (-)-ciclopentenona y la
estéreo-estructura de la
(-)-ciclopentenona se muestran en la Fig. 6. En el
gráfico, se indica en el eje de ordenadas el dicroísmo circular
molar, mientras que la longitud de onda (nm) se indica en el eje de
abscisas. Complementariamente, se da a continuación la
estéreo-estructura anteriormente mencionada como
fórmula [II].
El DC del p-dimetilaminobencil
derivado de la (+)-ciclopentenona y la
estéreo-estructura de la
(+)-ciclopentenona se muestran en la Fig. 7. En el
gráfico, se indica en el eje de ordenadas el dicroísmo circular
molar, mientras que la longitud de onda (nm) se indica en el eje de
abscisas. Complementariamente, se da a continuación la
estéreo-estructura anteriormente mencionada como
fórmula [III].
Como se muestra en la Fig. 6 y en la Fig. 7, y en
las fórmulas [II] y [III], la (-)-ciclopentenona es
(-)-(4R,5S)-trans-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
mientras que la (+)-ciclopentenona es
(+)-(4S,5R)-trans-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Las ciclopentenonas anteriormente mencionadas o
una sustancia ópticamente activa de ellas pueden fabricarse mediante
cualquier método, es decir, pueden fabricarse mediante un método
descrito en esta especificación o mediante síntesis química; y
pueden usarse también en esta invención trans- y
cis-ciclopentenona o una mezcla de ambas.
Naturalmente, se incluye también como sustancia ópticamente activa
descrita en la presente invención, cualquier sustancia de
ciclopentenonas ópticamente activa obtenida mediante un método de
síntesis química.
Ejemplos de sal de ciclopentenona o de una
sustancia de ella ópticamente activa constituyen sales
farmacéuticamente aceptables y pueden prepararse mediante métodos de
transformación conocidos.
El compuesto que se usa en la presente invención,
que posee la función de inducir resistencia a los virus en las
células y además posee la función de destruir selectivamente las
células infectadas por virus, tal como, por ejemplo, la
ciclopentenona, o una sustancia o una sal de ella ópticamente
activas, posee acción antiviral y, actualmente, es posible preparar
un agente antiviral mediante el uso de al menos un compuesto
seleccionado entre los anteriores como componente efectivo.
Es decir, el compuesto que tiene la función de
inducir resistencia a los virus en las células y además tiene la
función de destruir selectivamente las células infectadas por virus,
se usa como componente efectivo y se fabrica como preparación
farmacéutica mediante composición con vehículos farmacéuticos
conocidos, siendo actualmente posible preparar un agente antiviral.
Generalmente, se prepara una composición de al menos uno de los
compuestos seleccionados entre los compuestos que tienen la función
de inducir resistencia a los virus en las células y además tienen la
función de destruir selectivamente las células infectadas por virus,
tales como, por ejemplo, la ciclopentenona, una sustancia o una sal
de ella ópticamente activas, con un vehículo líquido o sólido
farmacéuticamente aceptable y, si es necesario, se añade también un
disolvente, agente de dispersión, emulsificante, tampón,
estabilizante, relleno, aglutinante, agente disgregante, lubricante,
etc., para formar un agente antiviral, que puede presentarse en
forma sólida, tal como comprimidos, gránulos, polvo diluido, polvo,
cápsulas, etc., o en forma líquida, tal como disoluciones,
suspensiones, emulsiones, etc. Adicionalmente, el agente antiviral
puede presentarse como preparación seca que puede transformarse en
líquida mediante la adición del vehículo adecuado antes del uso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar en
función del modo de administración y forma de preparación
anteriormente mencionados. En el caso de preparaciones orales, puede
usarse almidón, lactosa, azúcar, manitol, carboximetil celulosa,
almidón de maíz, sales inorgánicas, etc. En la fabricación de
preparaciones orales, pueden incorporarse adicionalmente a la
composición aglutinantes, agentes disgregantes, agentes
tensioactivos, lubricantes, fluidificantes, correctores de sabor,
agentes colorantes, saborizantes, etc.
Por otra parte, en el caso de preparaciones
parenterales, éstas pueden prepararse mediante métodos comunes en
los que al menos uno de los compuestos seleccionados entre los
compuestos que tienen la función de inducir resistencia a los virus
en las células y además tienen la función de destruir selectivamente
las células infectadas por virus, tales como, por ejemplo, la
ciclopentenona, una sustancia o una sal de ella ópticamente activas,
que es un componente efectivo de la presente invención, se disuelve
o suspende en un diluyente, tal como agua destilada para inyección,
solución salina fisiológica, solución acuosa de glucosa, aceite
vegetal para inyección, aceite de sésamo, aceite de cacahuete,
aceite de soja, aceite de maíz, propilenglicol, polietilenglicol,
etc. y, seguidamente, si es necesario, se adicionan a la preparación
bactericidas, estabilizantes, agentes isotónicos, analgésicos,
etc.
El agente antiviral de la presente invención se
administra mediante la vía apropiada, dependiente de la forma de
preparación. Además, no existen limitaciones particulares del método
de administración, pudiéndose administrar por medio de uso oral, uso
externo e inyección. La preparación inyectable se administra, por
ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea,
intracutánea, etc., mientras que en las preparaciones para uso
externo se incluyen supositorios, etc.
La dosis como agente antiviral no se especifica
concretamente, aunque se puede determinar adecuadamente dependiendo
de la forma de dosificación, método de administración, propósito de
uso y edad, peso corporal, condiciones, etc. del paciente.
Normalmente, sin embargo, la cantidad de al menos uno de los
compuestos seleccionados entre los compuestos que tienen la función
de inducir resistencia a los virus en las células y además tienen la
función de destruir selectivamente las células infectadas por virus,
tales como, por ejemplo, la ciclopentenona, una sustancia o una sal
de ella ópticamente activas, contenida en la preparación para
adultos es 0,1 \mug-20 mg/kg por día. Lógicamente,
la dosis puede variar dependiendo de varios factores y, por tanto,
una dosis menor que la anteriormente mencionada puede ser suficiente
en algunos casos, mientras que, en otros casos, pueden ser
necesarias dosis mayores que las anteriormente mencionadas. El
agente de la presente invención puede administrarse oralmente tal
como es, aunque adicionalmente el agente puede también tomarse
diariamente una vez añadido a alimentos y/o bebidas comunes. Además,
el compuesto que tiene la función de inducir resistencia a los virus
en las células y además tiene la función de destruir selectivamente
las células infectadas por virus, tal como, por ejemplo, la
ciclopentenona, una sustancia o una sal de ella ópticamente activas,
puede usarse como material para componer el agente antiviral o un
preparado comestible o bebible antiviral.
El compuesto usado en la presente invención que
tiene la función de inducir resistencia a los virus en las células y
además tiene la función de destruir selectivamente las células
infectadas por virus, tal como, por ejemplo, la ciclopentenona, una
sustancia o una sal de ella ópticamente activas, posee actividad
antiviral contra ADN-virus,
ARN-virus, retrovirus y viroides.
Consecuentemente, puede usarse para fabricar
agentes antivirales para seres humanos, agentes antivirales para
animales, tales como los efectivos contra enfermedades virales (por
ejemplo, para animales domésticos, aves de corral y animales de
criadero, tales como peces o crustáceos), agentes antivirales para
plantas, tales como los de enfermedades de productos agrícolas y
hortícolas (por ejemplo, flores y verduras) y agentes antivirales
para seres vivos beneficiosos.
Ejemplos de ADN-virus que
infectan a animales son pox-virus, virus del herpes,
adenovirus, virus de la hepatitis B, virus del papiloma, virus del
polioma, virus de Epstein-Barr y baculovirus,
mientras que el virus del mosaico de la coliflor es un ejemplo de
ADN-virus que infecta a las plantas. Ejemplos de
ARN-virus que infectan a animales son rotavirus,
virus de la rubéola, virus de la encefalitis japonesa, virus del
dengue, virus de la enfermedad de Newcastle, virus del sarampión,
virus de las paperas, virus del distemper, virus de la gripe, virus
de la estomatitis vesicular, virus de la poliomielitis humana, virus
de la hepatitis A y virus de la hepatitis C, mientras que virus del
mosaico del tabaco, virus del trigo enano, virus del arroz rayado y
virus de las manchas anulares del tabaco, son ejemplos de
ARN-virus que infectan a las plantas. Ejemplos de
retrovirus son el virus de la leucemia de las células T adultas y el
virus del síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida, y un
ejemplo de viroide es el viroide del tubérculo fusiforme de la
patata.
La ciclopentenona, o una sustancia de ella
ópticamente activa o una sal de ella, es eficaz para su uso en la
fabricación de medicamentos para la terapia y prevención de
enfermedades virales de mamíferos no humanos y aves, tales como
pollos y pavos, así como de animales de sangre fría, tales como
peces, presentando tal compuesto actividad antiviral hacia los
siguientes virus no humanos: virus del herpes escirroso de tipo 1,
virus del herpes del roedor cerdo de Guinea de tipo 1, virus del
herpes de lagomorfos de tipo 1, virus del herpes de faisánidos de
tipo 1, virus del herpes de faisánidos de tipo 2, virus del herpes
de pavo de tipo 1, virus del herpes de ánades de tipo 1, virus del
herpes de lamprea de tipo 1, virus del herpes de équidos de tipo 3,
virus del herpes de bóvidos de tipo 1, virus del herpes de bóvidos
de tipo 3, virus del herpes de bóvidos de tipo 4, virus del herpes
de porcinos de tipo 1, virus del herpes de porcinos de tipo 2, virus
del herpes de múridos de tipo 1, virus del herpes de cébidos de tipo
1, virus del herpes de cébidos de tipo 2, virus del herpes de
tupayas de tipo 1, virus del herpes canino de tipo 1, virus del
herpes felino de tipo 1, virus del herpes de équidos de tipo 1 y
virus del herpes de équidos de tipo 2.
Las enfermedades virales de aves, tales como la
enfermedad de Marek, se pueden prevenir y/o curar con el compuesto
usado en la presente invención, mediante métodos conocidos en
veterinaria o cría de ganado, tales como los de inyectar el agente
antiviral de la presente invención o añadirlo al alimento o agua de
bebida. Adicionalmente, cuando el compuesto usado en la presente
invención se añade directamente a un depósito, tanque de agua,
tanque de una granja, o agua, agua de mar, etc., que se encuentran
en una zona de cría de animales, o se mezcla con el alimento, se
pueden prevenir y/o curar de manera similar las siguientes
enfermedades. Existen enfermedades virales de peces que viven en
áreas reducidas, tales como depósitos, tanques de agua, tanques de
granja o zonas de cría, infectados por virus de herpes, tal como
virus de larvas de lamprea, virus herpes de salmón y virus de nerka,
siendo ejemplos la enfermedad necrotizante infecciosa de órganos
hematopoiéticos, enfermedades infecciosas de virus de herpes o
enfermedad necrotizante infecciosa del páncreas de peces de la
familia del salmón, septicemia viral hemorrágica de la trucha arco
iris, viremia primaveral de la carpa, linfoquistes de varios peces,
enfermedad necrotizante viral de eritrocitos de peces marinos y
peces anádromos, enfermedad rabdoviral de lenguados y análogos,
enfermedad necrotizante viral de páncreas e hígado de crías de
seriola y análogos, úlcera nasal de torafugu (tipo de pez globo),
etc. Como información complementaria, la regulación precisa de la
administración del compuesto usado en la presente invención y del
agente antiviral de la presente invención depende, naturalmente, de
las necesidades de cada animal a ser tratado, del tipo de
tratamiento y del buen juicio del productor.
Los animales a quienes se administra el agente
antiviral de la presente invención quedan capacitados para mantener
su buen estado de salud, con lo que la mejora en el índice de
supervivencia, índice de crecimiento, índice de desovación, etc., es
significativa.
El compuesto usado en la presente invención que
tiene la función de inducir resistencia a los virus en las células y
además tiene la función de destruir selectivamente las células
infectadas por virus, tal como, por ejemplo, la ciclopentenona, una
sustancia o una sal de ella ópticamente activas, inhibe la síntesis
de las proteínas virales e inhibe además la síntesis del genoma del
virus y, consecuentemente, presenta una potente acción antiviral.
Además, destruye selectivamente las células infectadas por dichos
virus.
Por ejemplo, incluso en pacientes que padecen
infección por el virus de inmunodeficiencia humana (de aquí en
adelante abreviado como VIH), no todas las células
CD4-positivas están infectadas por VIH, sino que
sólo una parte de ellas están infectadas por el virus. El agente
antiviral de la presente invención inhibe la producción de VIH en
las células infectadas, al mismo tiempo que destruye selectivamente
las células infectadas e induce la capacidad de resistencia al virus
de las células no infectadas, lo que hace posible eliminar el VIH de
las células.
La ciclopentenona, o una sustancia o una sal de
ella ópticamente activas, posee la capacidad de mejorar la función
hepática y la acción de inducir proteínas de choque térmico, además
de la actividad antiviral anteriormente mencionada. Un agente para
mejorar la función hepática y un agente para inducir proteínas de
choque térmico, que contiene al menos un compuesto seleccionado
entre ciclopentenona y una sustancia o una sal de ella ópticamente
activas, puede fabricarse en forma de preparación farmacéutica de la
misma manera que en el caso del agente antiviral anteriormente
mencionado y puede administrase de la misma manera que en el caso
del agente antiviral.
La dosis como agente para mejorar la función
hepática y para inducir proteínas de choque térmico no se especifica
concretamente, aunque se puede determinar adecuadamente dependiendo
de la forma de dosificación, método de administración, propósito de
uso y edad, peso corporal, condiciones, etc. del paciente.
Normalmente, sin embargo, la cantidad de al menos uno de los
compuestos seleccionados entre ciclopentenona y una sustancia o una
sal de ella ópticamente activas, contenida en la preparación para
adultos es 0,1 \mug-20 mg/kg por día. Lógicamente,
la dosis puede variar dependiendo de varios factores y, por tanto,
una dosis menor que la anteriormente mencionada puede ser suficiente
en algunos casos, mientras que, en otros casos, pueden ser
necesarias dosis mayores que las anteriormente mencionadas. El
agente de la presente invención puede administrarse oralmente tal
como es, aunque adicionalmente el agente puede también tomarse
diariamente una vez añadido a alimentos y/o bebidas comunes.
Adicionalmente, al menos uno de los compuestos seleccionados entre
ciclopentenona y una sustancia o una sal de ella ópticamente
activas, puede usarse como material para preparar un alimento o
bebida para mejorar la función hepática o para inducir proteínas de
choque térmico.
Cuando se administra ciclopentenona o una
sustancia o una sal de ella ópticamente activas, mejoran los
desórdenes de la función hepática y los valores de GOT y GPT vuelven
a la normalidad.
Además, la ciclopentenona o una sustancia o una
sal de ella ópticamente activas poseen la actividad de inducir
proteínas de choque térmico, tal como proteínas de choque térmico de
70 kDa (HSP70), etc., y poseen actividad antiviral hacia
ARN-virus y ADN-virus, tales como el
virus de la hepatitis, virus del SIDA, virus de la gripe, virus de
estomatitis vesicular y virus de herpes. Las proteínas de choque
térmico participan en la inmunidad al cáncer y poseen actividad de
biodefensa. Cuando se administra ciclopentenona o una sustancia o
una sal de ella ópticamente activas, se pueden prevenir y curar
enfermedades virales, tales como resfriados causados por el virus de
la gripe.
Como información complementaria, proteínas de
choque térmico es un nombre general que se da a las proteínas cuya
síntesis es inducida cuando se someten células o individuos a un
cambio brusco de temperatura, mayor que la temperatura normal en una
extensión de aproximadamente 5-10ºC, y que existen
abundantemente en procariotas y eucariotas superiores. HSP90, HSP70,
ubiquitina y HSP26, constituyen ejemplos de proteínas conocidas de
choque térmico. Entre ellas, la HSP70 es un tipo de acompañante
molecular que se une a la proteína cuando el desdoblamiento no se ha
completado o se ha efectuado incompletamente, para ayudar en la
formación de la estéreo-estructura. La secuencia de
aminoácidos de las proteínas de choque térmico se ha conservado bien
durante el curso de la evolución, de manera que la proteína HSP70 es
idéntica a la proteína DnaK de Escherichia coli. En seres
humanos, existen aproximadamente diez genes HSP70, algunos de ellos
expresados constitucionalmente mientras que otros son inducidos por
diversas estimulaciones. Además de por choque térmico, la síntesis
de las proteínas de choque térmico es inducida por diferentes
sustancias químicas y por daños celulares, tales como oxidación.
C. Amici et al. [Journal of Virology,
volumen 68, pp. 6890-6899 (1994)] publicaron que,
cuando se incuban células animales infectadas con virus de Sendal en
presencia de prostaglandina A_{1} que posee un grupo carbonilo
\alpha,\beta-insaturado, se induce la síntesis
de HSP70 y HSP90, y que al mismo tiempo que se induce la síntesis de
HSP70 se inhibe la síntesis de la proteína del virus. Además, A.
Rossi et al. [The Journal of Biological Chemistry, volumen
271, pp. 32192-32196 (1996)] publicaron que, como en
el caso de la prostaglandina A_{1}, la
2-ciclopenten-1-ona
induce la síntesis de HSP70 e inhibe la síntesis de la proteína del
virus de la estomatitis vesicular.
La capacidad de la ciclopentenona usada en la
presente invención para inducir HSP70 se percibe ya a concentración
10 \muM y se convierte en máxima a concentraciones de
20-30 \muM, con lo que puede decirse que la
capacidad de inducción es muy alta comparada con el hecho de que se
requiere una concentración de varios cientos \muM de
2-ciclopenten-1-ona
para inducir la proteína HSP70. Esta capacidad es equivalente a la
capacidad de la prostaglandina A_{1} para inducir la proteína
HSP70 y, dado que el peso molecular de la ciclopentenona no es más
que un tercio del de la prostaglandina A_{1}, la ciclopentenona
posee una capacidad de inducción mayor que la de la prostaglandina
A_{1} cuando se comparan en términos de concentración en peso.
Puesto que la ciclopentenona, o una sustancia de
ella o una sal de ella ópticamente activas, usada en la presente
invención posee una tal alta capacidad de inducir proteínas de
choque térmico, ella posee actividad antiviral hacia
ADN-virus, ARN-virus, retrovirus y
viroides. Ejemplos de tales virus y viroides son los que se han
mencionado anteriormente en este documento.
Además, la ciclopentenona, o una sustancia de
ella o una sal de ella ópticamente activas, posee la actividad de
inhibir el crecimiento de las células cancerosas que se transforman
mediante genes de cáncer y posee la actividad de impedir la
carcinogénesis debida a los genes de cáncer.
Por ejemplo, el virus del papiloma es un
ADN-virus que pertenece a la familia Papovaviridae y
género Papilomavirus y, con respecto al virus del papiloma humano
(VPH), se conoce como ejemplo el VPH del tipo 16, que es causa del
cáncer de cérvix.
La ciclopentenona, o una sustancia de ella o una
sal de ella ópticamente activas, posee la actividad de inhibir el
crecimiento de las células que se han convertido en cancerosas por
acción del gen del cáncer E7, de tipo VPH16. Así, puede ofrecerse un
agente inhibidor del crecimiento de las células cancerosas que se
han convertido en cancerosas por la acción de virus, mediante el uso
de al menos un compuesto seleccionado entre ciclopentenona, una
sustancia de ella o una sal de ella ópticamente activas, como
componente efectivo por medio del que se puede prevenir la
canceración provocada por genes del cáncer.
Como información complementaria, la
ciclopentenona, o una sustancia de ella o una sal de ella
ópticamente activas, posee una acción inhibidora de carcinogénesis
en dos etapas, como iniciador y promotor y, actualmente, es posible
ofrecer un agente de inhibición de canceración química que contiene
al menos un compuesto seleccionado entre ciclopentenona, una
sustancia de ella o una sal de ella ópticamente activas, como
componente efectivo.
En consecuencia, es posible ofrecer preparados
comestibles o bebibles para la prevención de carcinogénesis que
contienen al menos un compuesto seleccionado entre ciclopentenona,
una sustancia de ella o una sal de ella ópticamente activas.
Para la prevención de carcinogénesis por
oncogenes o para la supresión de carcinogénesis química, puede
usarse un agente, que contiene al menos un compuesto seleccionado
entre ciclopentenona o una sustancia o una sal de ella ópticamente
activas, para la fabricación de un medicamento que se administra
mediante un método similar al del agente antiviral.
En la fabricación del preparado comestible
antiviral o del preparado bebible antiviral de la presente
invención, es posible usar un compuesto, tal como la ciclopentenona,
una sustancia o una sal de ella ópticamente activas, que posee la
función de inducir resistencia a los virus en las células y además
la función de destruir selectivamente las células infectadas por
virus. También es posible usar el producto de un ácido urónico
sometido a tratamiento térmico que contiene ciclopentenona, o una
ciclopentenona purificada o parcialmente purificada obtenida a
partir de dicha sustancia sometida a tratamiento térmico.
Adicionalmente, en la fabricación del preparado
comestible activo o el preparado bebible activo que posee la acción
de mejorar la función hepática, inducir proteínas de choque térmico,
prevenir la carcinogénesis, etc., es también posible usar la
ciclopentenona, una sustancia o una sal de ella ópticamente activas,
o un producto de un ácido urónico sometido a tratamiento térmico que
contiene ciclopentenona, o una ciclopentenona purificada o
parcialmente purificada obtenida a partir de dicha sustancia
sometida a tratamiento térmico.
Así, el preparado comestible o bebible fabricado
mediante dilución y/o adición de ciclopentenona, una sustancia de
ella o una sal de ella ópticamente activas, o un material
seleccionado entre el producto sometido a tratamiento térmico que
contiene ciclopentenona, ciclopentenona parcialmente purificada y
ciclopentenona purificada obtenidas a partir del producto sometido a
tratamiento térmico, se incluye entre los preparados comestibles o
bebibles antivirales de la presente invención.
No existen limitaciones concretas referentes al
método de fabricación del preparado comestible o bebible antiviral
de la presente invención y los métodos culinarios y de procesado
comúnmente usados para fabricar alimentos y bebidas pueden
aplicarse, con tal de que proporcionen una cantidad efectiva de al
menos un compuesto, seleccionado entre el compuesto que posee la
función de inducir resistencia a los virus en las células y además
posee la función de destruir selectivamente las células infectadas
por virus, tal como, por ejemplo, la ciclopentenona, una sustancia o
una sal de ella ópticamente activas, que esté contenido en el
preparado comestible o bebible resultante.
No existen limitaciones concretas referentes a la
forma del preparado comestible o bebible antiviral de la presente
invención, mientras que uno de los compuestos seleccionados entre el
compuesto que posee la función de inducir resistencia a los virus en
las células y además posee la función de destruir selectivamente las
células infectadas por virus, tal como, por ejemplo, la
ciclopentenona, una sustancia o una sal de ella ópticamente activas,
esté contenido en dicho preparado comestible o bebible, adicionado a
ellos y/o diluido en ellos. Así, entre las formas se incluyen
aquéllas que se pueden tomar por vía oral, tales como comprimidos,
gránulos, cápsulas, geles y soles.
No existen limitaciones concretas referentes a la
forma del preparado comestible o bebible que posee la acción de
mejorar la función hepática, inducir proteínas de choque térmico e
impedir la carcinogénesis, mientras que uno de los compuestos
seleccionados entre la ciclopentenona, una sustancia o una sal de
ella ópticamente activas, que poseen la acción de mejorar la función
hepática, inducir proteínas de choque térmico e impedir la
carcinogénesis, esté contenido en dicho preparado comestible o
bebible, adicionado a ellos y/o diluido en ellos. Así, entre las
formas se incluyen aquéllas que se pueden tomar por vía oral, tales
como comprimidos, gránulos cápsulas, geles y soles.
El preparado comestible o bebible de la presente
invención contiene ciclopentenona, o una sustancia o una sal de ella
ópticamente activas, que posee actividades fisiológicas y, debido a
las diferentes actividades fisiológicas de dicho compuesto, tales
como actividad antiviral, actividad de mejorar la función hepática,
inducir proteínas de choque térmico, impedir la carcinogénesis,
etc., constituye un preparado comestible o bebible saludable, que
ejerce los efectos de prevenir y tratar enfermedades virales, efecto
de mejorar la función hepática, efecto de impedir la carcinogénesis,
etc. y, adicionalmente, es un preparado comestible o bebible que es
útil para mantener la homeostasis de los seres vivos.
No se ha observado toxicidad en el compuesto
usado en la presente invención, ni incluso cuando se administra la
dosis que es efectiva para realizar las actividades fisiológicas. En
el caso de administración oral, por ejemplo, no se observaron casos
de muerte de ratas por administración oral simple de 100 mg/kg de la
ciclopentenona o una sustancia o una sal de ella ópticamente
activas.
En suma, el agente farmacéutico de la presente
invención puede usarse como agente terapéutico o preventivo de
enfermedades virales, enfermedades hepáticas, cáncer, etc., siendo
particularmente útil en la terapia del SIDA inducido por VIH y en la
mejoría de dicho síndrome.
La presente invención se ilustra adicionalmente
por medio de los siguientes ejemplos, si bien en ningún caso la
presente invención queda limitada a estos ejemplos. Como información
complementaria, el "%" usado en los ejemplos se refiere a "%
en peso".
Ejemplo de Referencia
1
Se disolvió ácido D-glucurónico
(10 g) (G 5269; fabricado por Sigma) en 1 litro de agua, se calentó
a 121ºC durante 4 horas y se concentró a vacío hasta
reducirse a un volumen de aproximadamente 10 mL. Este producto se
mezcló con 40 mL de la capa superior de una mezcla 3:2:2 de acetato
de butilo, ácido acético y agua, se centrifugó y se concentró a
vacío el líquido sobrenadante hasta reducirse a un volumen de
aproximadamente 10 mL.
El extracto anterior se sometió a una
cromatografía en columna de gel de sílice (BW-300SP;
2 x 28 cm; fabricada por Fuji Silycia) y se separó mediante el uso
de la capa superior de una mezcla 3:2:2 de acetato de butilo, ácido
acético y agua como eluyente, con una velocidad de flujo de
aproximadamente 5 mL/minuto a una presión de 0,2 kg/cm^{2},
lograda mediante el uso de un compresor. El fraccionamiento se
efectuó de manera que se obtuvieron fracciones con un volumen de 10
mL cada una y se analizó una muestra de cada fracción mediante
cromatografía en capa fina. Como consecuencia, se determinó que las
fracciones 61 a 80 contenían ciclopentenona de alta pureza. Dichas
fracciones se recogieron, se concentraron a vacío, se
extrajeron con 40 mL de cloroformo y el extracto se concentró a
vacío para proporcionar 100 mg de ciclopentenona.
La fracción se separó por medio de HPLC
(cromatografía de líquidos de alta eficacia) en fase normal, usando
una columna S de tipo Palpack (fabricada por Takara Shuzo) y, cuando
se efectuó la detección mediante absorción de radiación ultravioleta
a 215 nm, se determinó una pureza del 98%.
Se disolvió la ciclopentenona anterior (113,9 mg)
en 2,85 mL de etanol. Se añadieron a esta disolución etanólica 3,85
mL de hexano/etanol (94/6) para preparar una disolución de
ciclopentenona (17 mg/mL). Esta disolución se filtró a través de un
filtro de 0,5 \mum con objeto de preparar una muestra en
disolución para su resolución óptica por HPLC.
Esta muestra en disolución se sometió a HPLC de
resolución óptica, de manera que todas las fracciones de
(-)-ciclopentenona correspondientes al pico de menor
tiempo de retención y de (+)-ciclopentenona
correspondientes al pico de mayor tiempo de retención se evaporaron
a vacío hasta sequedad, para dar 43,2 mg de
(-)-ciclopentenona y 43,0 mg de
(+)-ciclopentenona.
Condiciones de la HPLC de Resolución Óptica:
Columnas: Chiral Pack AS (fabricado por Daicel)
de 2,0 cm x 25,0 cm
Temperatura de la columna: 40ºC
Fase móvil: hexano/etanol (94/6)
Velocidad de flujo: 14,0 mL/minuto
Detección: UV, 210 nm
Cantidad de muestra cargada: 150 \muL (2,55
mg)
Tanto la (-)-ciclopentenona como
la (+)-ciclopentenona así obtenidas contienen
aproximadamente 1% de enantiómero y, como consecuencia, se
sometieron de nuevo a resolución óptica bajo las condiciones
anteriormente mencionadas. Como resultado, se obtuvieron 19,7 mg de
(-)-ciclopentenona sin contener enantiómero a partir
de 30,0 mg de la (-)-ciclopentenona del pico de
menor tiempo de retención, mientras que, a partir de 37,4 mg de
(+)-ciclopentenona del pico de mayor tiempo de
retención, se obtuvieron 27,7 mg de
(+)-ciclopentenona sin contener enantiómero. Como
información complementaria, los tiempos de elución de la HPLC de
resolución óptica de la (-)-ciclopentenona y la
(+)-ciclopentenona fueron 33 minutos y 40 minutos
respectivamente.
Se colocaron en cada pocillo de una placa de seis
pocillos 5 mL de medio RPMI 1640 que contenía 10% de suero bovino
fetal que contenía 2 x 10^{5} células /mL de células de leucemia
promielocítica humana HL-60 (ATCC
CCL-240) y se incubaron a 37ºC durante 24 horas en
presencia de 5% de CO_{2}. A continuación, se añadió a los
pocillos la ciclopentenona descrita en el ejemplo de referencia 1,
de manera que su concentración final fue 0, 10, 20, 30, 40, 50 o 100
\muM, continuándose adicionalmente la incubación durante ocho
horas más.
Una vez completada la incubación, se contó el
número de células y las células se recuperaron por centrifugación y
se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), con
objeto de preparar las células tratadas con ciclopentenona. Mientras
tanto, se prepararon también células que se calentaron a 45ºC
durante diez minutos y se sometieron a continuación a las mismas
condiciones de incubación.
Las células así tratadas se sometieron a
electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS
(SDS-PAGE) mediante un método mencionado en
"Molecular Cloning" [Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989)]. Las células tratadas se suspendieron en una muestra de
tampón SDS-PAGE para conseguir una concentración de
2,5 x 10^{6} células/mL, la suspensión resultante de las células
se trató a 100ºC durante diez minutos y se aplicaron 5 \muL de
ella a cada una de las dos láminas de geles SDS-PAGE
(5% de gel empaquetador ("stacking gel"); 10% de gel de
separación) para efectuar la electroforesis. Uno de los geles se
tiñó con Coomassie mientras que el otro se sometió a "blotting"
(separación de proteínas indicada mediante manchas) para
transferirlo a una membrana de difluoruro de polivinilideno
(Immobilon^{TM}, fabricado por Millipore, catálogo nº
IPVH000-10).La membrana se sometió a bloqueo a 4ºC
durante una noche con Block Ace (fabricado por Dainippon
Pharmaceutical; catálogo nº UK-B25).
La membrana bloqueada se hizo reaccionar con
anticuerpos monoclonales HSP 72/73 (Ab-1)
(fabricados por Oncogene Research Products, catálogo nº HSP01), que
reaccionan específicamente con proteínas de choque térmico inducidas
por calor de 70 kDa, se lavó con TBS que contenía 0,05% de Tween 20
y a continuación se lavó adicionalmente con TBS. Después de esto, se
hizo reaccionar con el anticuerpo secundario mezclado con peroxidasa
IgG HRP-conejo Anti-ratón (H+L)
(fabricado por Zymed Laboratories, catálogo nº
61-6520) y se lavó mediante el mismo procedimiento
que en la operación anterior. Las membranas que se trataron así con
anticuerpos primarios y secundarios, se hicieron reaccionar con
Renaissance^{TM} (un reactivo de quimioluminiscencia fabricado por
Dupont NEN, catálogo nº NEL-100) y se
fotosensibilizaron con una película de rayos-X para
confirmar la inducción de proteínas de choque térmico de 70 kDa.
El resultado obtenido fue que, por adición de
ciclopentenona (20 a 30 \muM), se confirmó la inducción de
proteína de choque térmico de 70 kDa, que es casi la misma que la
obtenida por tratamiento térmico a 45ºC durante 10 minutos. En la
Tabla 1 se muestra la intensidad de la inducción. En la Tabla 1,
"+" indica el grado de intensidad de inducción y cuanto mayor
el número de "+", mayor la intensidad de la inducción.
Complementariamente, "-" significa que no se detectó inducción
y "\pm" significa que la inducción fue leve.
Se obtuvieron los mismos resultados en los casos
de (-)-ciclopentenona y
(+)-ciclopentenona.
(1) Se incubaron células HeLa (ATCC
CCL-2) en medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM; fabricado por Nissuisha) que contenía 10% de suero fetal
bovino en una placa de 10 cm a 37ºC y en presencia de 5% de gas
dióxido de carbono, hasta que resultó un 80% de confluencia. A
continuación, se añadió ciclopentenona de manera que su
concentración final fue 0, 5, 10, 20 o 40 \muM, continuándose
adicionalmente la incubación durante seis horas bajo las condiciones
anteriormente mencionadas. Se desechó el medio, se adicionó a cada
pocillo 1 mL de ácido tricloroacético al 10% y se recuperaron las
células mediante raspado.
Las células así preparadas se sometieron a
SDS-PAGE y blotting según el método del Ejemplo 1,
con objeto de detectar la expresión de proteínas de choque térmico
de 70 kDa.
Como resultado, se detectó inducción de proteínas
de choque térmico de 70 kDa en las secciones en que se añadió
ciclopentenona de 5 \muM a 40 \muM. El resultado se muestra en
la Tabla 2. Como información complementaria, en la Tabla 2 el
símbolo "+" muestra la potencia de las señales observadas en el
"blotting" de las proteínas de choque térmico de 70 kDa y,
cuanto mayor el número de +, mayor la potencia de las señales. El
símbolo "\pm" significa que la señal fue muy débil.
(2) Se incubaron células HeLa en medio DMEM que
contenía 10% de suero fetal bovino en una placa de 10 cm a 37ºC y en
presencia de 5% de gas dióxido de carbono, hasta que resultó un 80%
de confluencia. A continuación se añadió ciclopentenona de manera
que su concentración final fue 0, 5, 10, 20 o 40 \muM,
continuándose adicionalmente la incubación durante seis horas bajo
las condiciones anteriormente mencionadas. Después de esto, se
lavaron las células con medio DMEM que contenía 5% de suero fetal
bovino y seguidamente se añadió a las células medio DMEM con 5% de
suero fetal bovino que contenía Ad5 dlX [un adenovirus; Saito et
al.; Journal of Virology, volumen 54, pp.
711-719 (1985)], de manera que las células fueron
así infectadas, efectuándose a continuación una incubación durante
20 horas. Como información complementaria, la multiplicidad de
infección (m.o.i.) se ajustó a 50. Se desechó el medio, se adicionó
a cada pocillo 1 mL de ácido tricloroacético al 10% y se recuperaron
las células mediante raspado.
Seguidamente, se efectuaron
SDS-PAGE y "blotting" de las células obtenidas
según se ha descrito anteriormente, mediante el método del Ejemplo
1, con objeto de detectar la expresión de las proteínas del exón del
adenovirus. Como información complementaria, se usaron como
anticuerpos primarios anticuerpos de exón
anti-adenovirus (AB 1056; fabricados por Chemicon
Internacional Inc.).
En las secciones en las que se añadió
ciclopentenona en concentraciones 10 \muM o mayor, la cantidad de
proteína del exón disminuyó claramente en comparación con la sección
de control, en la que no se añadió ciclopentenona. En las secciones
en las que se añadió ciclopentenona en concentraciones 20 \muM o
menor, se observó un crecimiento de las células similar al de la
sección en la que no se añadió ciclopentenona.
(3) Se extrajo ADN viral de las células HeLa que
se trataron con ciclopentenona y se infectaron con adenovirus según
el método mencionado en "Protocols for Experiments of Virus"
(pp. 24-25; publicado por Medical View), incubándose
a continuación de la misma manera que en el Ejemplo 2-(2).
Así, se lavaron las células infectadas por virus
con una solución salina tamponada con ácido fosfórico, se
suspendieron en 1 mL de disolución acuosa de laurilsulfato de sodio
(SDS) al 0,6% y se añadieron AEDT 10 mM y 3,0 mL de disolución
acuosa de cloruro de sodio 5 M. La mezcla se dejó a 0ºC durante una
hora, se centrifugó y se añadieron 3 mL de etanol al líquido
sobrenadante resultante, mezclándose a continuación. El precipitado
obtenido por separación mediante centrífuga se disolvió en 0,2 mL de
tampón TE (Tris-HCl 10 mM de pH 8,0 y AEDT 1 mM), se
añadieron a continuación 2 \muL de SDS al 10% y 4 \muL de
proteinasa K de concentración 10 mg/mL (fabricada por Takara Shuzo)
y la mezcla se mantuvo a 37ºC durante una hora. Se extrajo dos veces
con una mezcla de cantidades iguales de fenol y cloroformo, se
añadieron a la fase acuosa 20 \muL de acetato de sodio 3 M y 400
\muL de etanol, se centrifugó la mezcla y el precipitado se
disolvió en 50 \muL de tampón TE, para formar una disolución de
ADN. La disolución de ADN (10 \muL) se sometió a digestión con 10
unidades de EcoT22I (fabricado por Takara Shuzo) y 1 \muL de
disolución de ribonucleasa A de concentración 10 mg/mL, sometiéndose
seguidamente a electroforesis en gel de agarosa para determinar la
cantidad de ADN viral. El resultado fue que hubo una disminución
evidente de la cantidad de ADN viral en las secciones en las que se
añadió ciclopentenona en concentración 5 \muM o mayor en
comparación con el control, en el que no se añadió
ciclopentenona.
(4) Después de incubar células HeLa de la misma
manera que en el Ejemplo 2-(2), se añadió a las células DMEM con 5%
de suero fetal bovino que contenía adenovirus de tipo 5 (Adenoid 75;
ATCC VR-5) sin adición de ciclopentenona, siendo así
las células consecuentemente infectadas. Como información
complementaria, la multiplicidad de infección (m.o.i.) se ajustó a
50. Después de esto, se añadió ciclopentenona de manera que su
concentración final fuera 0, 5, 10, 20 o 40 \muM y se efectuó una
incubación durante 20 horas. Después de la incubación, se efectuó la
detección de las proteínas del exón del adenovirus de la misma
manera que en el Ejemplo 2-(2). El resultado fue que hubo una
disminución evidente de la cantidad de proteínas del exón en las
secciones en las que se añadió ciclopentenona en concentración 10
\muM o mayor en comparación con el control, en el que no se añadió
ciclopentenona. Como información complementaria, el crecimiento de
las células encontrado en las secciones en las que se añadió
ciclopentenona en concentraciones 20 \muM o mayor, fue el mismo
que en las secciones en las que no se añadió ciclopentenona.
(5) Se incubaron células HeLa de la misma manera
que en el Ejemplo 2-(2) y se trataron con ciclopentenona. Después de
esto, se infectaron las células con el adenovirus tipo 5 (Adenoid
75; ATCC VR-5) de la misma manera que en el Ejemplo
2-(4) y se incubaron en el medio al que se añadió ciclopentenona.
Después de la incubación, se efectuó la detección de las proteínas
del exón del adenovirus de la misma manera que en el Ejemplo 2-(2).
El resultado fue que hubo una disminución evidente de la cantidad de
proteínas del exón en las secciones en las que se añadió
ciclopentenona en concentración 10 \muM o mayor en comparación con
el control, en el que no se añadió ciclopentenona. Como información
complementaria, el crecimiento de las células encontrado en las
secciones en las que se añadió ciclopentenona en concentraciones 20
\muM o menor, fue el mismo que en las secciones en las que no se
añadió ciclopentenona.
(6) Se midió, de la misma manera que en el
Ejemplo 2-(3), la cantidad de ADN viral de las células HeLa que se
trataron con ciclopentenona infectada con adenovirus tipo 5 (Adenoid
75; ATCC VR-5) y a continuación se incubaron las
células de la misma manera que en el Ejemplo 2-(5). El resultado fue
que hubo una disminución evidente de la cantidad de ADN viral en las
secciones en las que se añadió ciclopentenona en concentración 5
\muM o mayor en comparación con el control, en el que no se añadió
ciclopentenona.
A partir de los resultados de los Ejemplos 2-(2)
- (6) anteriormente mencionados, es evidente que la administración
de ciclopentenona antes, después o antes y después de la infección
presentó actividad antiviral hacia el adenovirus. Se obtuvieron los
mismos resultados en los casos de (-)-ciclopentenona
y (+)-ciclopentenona.
(1) El gen recombinado que contiene
\beta-galactosidasa del vector BAG de retrovirus y
el gen de resistencia a la neomicina se usaron como genes testigo,
como se menciona en Proceedings of the National Academy of Sciences
of the U.S.A., volumen 84, pp. 156-160 (1987), y se
sometieron a digestión por la enzima de restricción BamHI, con
objeto de efectuar una auto-unión a consecuencia de
la que se construyó un DOL donde fue eliminado el gen de la
\beta-galactosidasa.
(2) El plasmidio del vector DOL mencionado en el
Ejemplo 3-(1) se transformó en E. coli HB 101, se incubó en
medio de L-cultivo, se extrajo el plasmidio de las
células recogidas y se purificó el plasmidio DOL por medio de una
ultracentrifugación en gradiente de densidad de cloruro de
cesio.
El plasmidio DOL purificado (10 \mug) se
introdujo en una célula \Psi; CRIP de encapsulación de retrovirus
[Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A.,
volumen 85, pp. 6460-6464 (1988)] mediante el uso de
un liposoma catiónico (Trans 2T LT-1; fabricado por
Takara Shuzo).
Después de la introducción, se seleccionaron las
células durante dos semanas a 37ºC bajo la condición de 5% de
CO_{2} en medio de Eagle modificado por Dulbecco con 10% de suero
de bovino joven que contenía 0,4 mg/mL de G4 18 (Gibco), se clonaron
20 colonias de células, se extendieron en una placa de 100 mm de
diámetro, se intercambió el medio en condición de semiconfluencia,
se recuperó el líquido sobrenadante después de 24 horas y se filtró
a través de un filtro de 0,45 \mum (Mllex HV; fabricado por
Millipore) para obtener el líquido sobrenadante del virus. Entre
tanto, las células se rasparon con tripsina y se preservaron en
nitrógeno líquido.
La titulación del líquido sobrenadante del virus
obtenido a partir de cada una de las colonias se determinó según el
método mencionado en el Ejemplo siguiente 3-(3) y el clonaje del que
se obtuvo la disolución del virus de titulación mayor se estableció
como la célula \Psi; CRIP/DOL productora de retrovirus
recombinante. La titulación del líquido sobrenadante del virus
obtenido a partir de las células productoras en el momento del
establecimiento fue 1 x 10^{6} unidades formadoras de colonias
(ufc)/mL. Las células productoras así establecidas se mantuvieron en
medio de Eagle modificado por Dulbecco con 10% de suero de bovino
joven que contenía 0,2 mg/mL de G418.
(3) Para la medida de titulación del virus se
usaron células NIH3T3 (ATCC CRL-1658). Las células
NIH3T3 incubadas en medio de Eagle modificado por Dulbecco que
contenía 10% de suero de bovino joven se transplantaron a una tasa
de 50.000 células/pocillo de una placa de seis pocillos (Iwaki
Glass) y, al día siguiente, las células NIH3T3 se infectaron durante
tres horas mediante 1 mL de disolución diluida del virus, que
contenía 8 \mug/mL de Polybrene (Sigma). Para la dilución del
virus se usó medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 10%
de suero de bovino joven. Una vez completada la infección, se
añadieron 2 mL más de medio de Eagle modificado por Dulbecco que
contenía 10% de suero de bovino joven. Al día siguiente, se efectuó
un intercambio con un medio de Eagle modificado por Dulbecco con 10%
de suero de bovino joven que contenía 0,4 mg/mL de G418. La
selección se efectuó durante dos semanas mediante intercambio del
medio, de la forma anteriormente descrita, cada tres a cuatro días,
formándose en consecuencia las colonias. Las colonias resultantes se
tiñeron para el recuento de modo convencional, mediante el uso del
líquido de tinción de Giemsa (Gibco). El valor obtenido al
multiplicar el número de colonias contadas por el grado de dilución
se definió como ufc y se usó como valor de titulación del virus.
(4) Las células \Psi; CRIP/DOL productoras de
retrovirus recombinantes mencionadas en el Ejemplo 3-(2) se
transplantaron a una placa de seis pocillos y, cuando se llegó al
estado de semiconfluencia, se efectuó un intercambio con medio de
Eagle modificado por Dulbecco con 10% de suero de bovino joven que
contenía 0 a 20 \muM de ciclopentenona. Después de 24 horas, se
recuperó el líquido sobrenadante. Se midió la titulación del virus
en el líquido sobrenadante según el método mencionado en el Ejemplo
2-(3) y se investigó la influencia de las células productoras de
retrovirus recombinantes en la reproducción del virus por adición de
ciclopentenona.
La titulación obtenida de la disolución del virus
de la sección experimental de control, a la que no se añadió
ciclopentenona, fue 9,5 x 10^{4} ufc/mL, mientras que las
titulaciones de las disoluciones de virus en presencia de 0,1, 0,5,
1,0, 2,0, 5,0, 10 y 20 \muM de ciclopentenona fueron 8,3 x
10^{4}, 6,4 x 10^{4}, 6,1 x 10^{4}, 3,8 x 10^{4}, 5,6 x
10^{4}, 5,1 x 10^{4} y 4,1 x 10^{4} ufc/mL respectivamente. En
consecuencia, se determinó que el valor de la titulación de las
disoluciones de virus obtenidas de células productoras disminuye por
adición de ciclopentenona. Así, se confirmó la acción de la
ciclopentenona de suprimir la producción de virus de células
productoras de retrovirus recombinantes.
(5) El plasmidio de control
pcD2-Y, que expresa los genes de resistencia a G418
[Mol. Cell. Biol., volumen 7, pp. 2745-2752 (1987)]
y el plasmidio pcD2-16E7, que expresa tanto los
genes de resistencia a G418 como a VPH16-tipo E7
[Jpn. J. Cancer Res., volumen 82, pp. 1340-1343
(1981)], se transformaron en E. coli HB 101, se incubaron en
medio L-caldo de cultivo, se extrajo el plasmidio de
las células recogidas y se purificó por medio de una
ultracentrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio,
con objeto de proporcionar un plasmidio vector para introducción de
genes.
Las células NIH3T3 se incubaron en medio de Eagle
modificado por Dulbecco que contenía 10% de suero de bovino joven a
37ºC en condición de 5% de CO_{2}.
El plasmidio purificado (10 \mug) se introdujo
en las células NIH3T3 mediante el uso de un liposoma catiónico
(TransIT LT-1; fabricado por Takara Shuzo), se
seleccionaron las células durante dos semanas en medio de Eagle
modificado por Dulbecco con 10% de suero de bovino joven que
contenía 0,4 mg/mL de G418 (Gibco) en condición de 5% de CO_{2} y
las colonias resultantes se clonaron, se cultivaron en una placa de
cultivo de tejidos de 100 mm de diámetro y se conservaron
continuamente en nitrógeno líquido.
Como resultado, se establecieron cada una de las
nueve cepas de células NIH3T3 en las que se habían introducido
vectores de control y las células NIH3T3 que se transformaron
tumorgénicamente por VPH 16 de tipo E7.
Las cepas de células en las que se introdujeron
vectores de control se designaron como NIH3T3/Y-1,
NIH3T3/Y-2, NIH3T3/Y-3,
NIH3T3/Y-4, NIH3T3/Y-5,
NIH3T3/Y-6, NIH3T3/Y-7,
NIH3T3/Y-8 y NIH3T3/Y-9.
Las cepas de células en las que se introdujo E7
se designaron como NIH3T3/ET-1,
NIH3T3/ET-2, NIH3T3/ET-3,
NIH3T3/ET-4, NIH3T3/ET-5,
NIH3T3/ET-6, NIH3T3/ET-7,
NIH3T3/ET-8 y NIH3T3/ET-9.
(6) Las células NIH3T3, las cepas de células en
las que se introdujeron los vectores de control y las cepas de
células en las que se introdujo E7, se cultivaron hasta una
extensión de 50-70% de confluencia en una placa de
cultivo de tejidos de 100 mm en medio de Eagle modificado por
Dulbecco que contenía 10% de suero de bovino joven y se lavaron con
PBS. Las células se separaron por raspado con disolución de
AEDT-tripsina al 0,25% y se suspendieron en 5 mL de
medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 10% de suero de
bovino joven.
Se tomó una parte de la suspensión y se calculó
la densidad celular mediante un contador de células sanguíneas de
tipo Newbauer. En base a los datos resultantes, se diluyó la
suspensión con medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía
10% de suero de bovino joven y se sembró en una placa de cultivo de
tejido de 60 mm de diámetro hasta llegar a una concentración de 200
células /placa, comenzándose la incubación en 3 mL de medio. Después
de 24 horas desde el inicio de la incubación, se añadió
ciclopentenona en concentración 5 \muM. Después de 24 horas más,
se intercambió el medio con otro recién preparado y se añadió
ciclopentenona en concentración 5 \muM.
Después de esto, se intercambió el medio y se
añadió ciclopentenona en concentración 5 \muM cada dos a tres
días. Como sección experimental de control, se preparó una placa a
la que no se añadió ciclopentenona, intercambiándose el medio de la
misma manera anteriormente descrita. Cada incubación se efectuó tres
veces. Después de incubar durante nueve días, se efectuó una
fijación con metanol y las colonias se tiñeron con disolución de
Giemsa (Gibco).
Como información complementaria, la evaluación se
efectuó usando NIH3T3, NIH3T3/Y-1 y
NIH3T3/E7-2.
Los resultados del recuento de las colonias
teñidas se dan en la Tabla 3. Las células en las que se introdujo E7
mostraron alta sensibilidad a la ciclopentenona en comparación con
las células de control. Así, la ciclopentenona actuó selectivamente
sobre las células transformadas por oncogenes.
Se obtuvieron resultados similares cuando se
usaron otras cepas de células del Ejemplo 3-(5). Además,
(-)-ciclopentenona y
(+)-ciclopentenona dieron también resultados
similares.
(1) Se añadió ciclopentenona a células MDCK
(conservadas en el Prefectural Public Hygiene Laboratory del
Ayuntamiento de Osaka) incubadas en una microplaca de 24 pocillos
mediante MEM (medio esencial mínimo) de Eagle con 10% de suero fetal
bovino en presencia de 5% de gas dióxido de carbono hasta obtención
de monocapas, de manera que la concentración final de ciclopentenona
fue 0, 5, 10, 20 o 40 \muM, continuándose la incubación durante
seis horas más bajo las condiciones anteriormente mencionadas.
A continuación, las células se lavaron con PBS,
se infectaron con la cepa A/PR/8/34 del virus de la gripe
(conservada en el Prefectural Public Hygiene Laboratory del
Ayuntamiento de Osaka) y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos.
Como información complementaria, la multiplicidad de infección
(m.o.i.) se ajustó a 0,01. Después de la incubación, las células se
lavaron con PBS y se incubaron en MEM de Eagle que contenía 10
\mug/mL de tripsina.
Se recogió el líquido sobrenadante de las células
infectadas 0, 1, 2 y 3 días después, y se determinó la titulación
del virus mediante un método PAP usando el método de recuento de
focos [J. Clin. Microbiol., volumen 28, pp.
1308-1313 (1990)].
El resultado fue que, en las secciones en las que
se añadió ciclopentenona en concentración 10 \muM o mayor, el
valor de la titulación del virus disminuyó claramente en comparación
con el control, al que no se había añadido ciclopentenona. El
resultado se da en la Tabla 4. Además, las células no fueron
eliminadas, sino que se adhirieron a cada una de las secciones a las
que se añadió ciclopentenona.
(2) De acuerdo con las mismas operaciones que en
el ejemplo 4-(1), se añadió virus de la gripe a células MDCK
incubadas hasta formación de monocapas en ausencia de
ciclopentenona, y dichas células se infectaron por dichos virus de
la misma manera que en el Ejemplo 4-(1) y se incubaron en un MEM de
Eagle que contenía 10 \mug/mL de tripsina al que se añadió
ciclopentenona hasta lograr una concentración final de 0, 5, 10, 20
ó 40 \muM. Después de esto, se determinó el valor de la titulación
del virus de la misma manera que en el Ejemplo 4-(1). El resultado
fue que, en las secciones en las que se añadió ciclopentenona en
concentración 10 \muM o mayor, el valor de la titulación del virus
disminuyó claramente en comparación con el control, al que no se
había añadido ciclopentenona. El resultado se da en la Tabla 5.
Además, las células no fueron eliminadas, sino que se adhirieron a
cada una de las secciones a las que se añadió ciclopentenona.
(3) De acuerdo con las mismas operaciones que en
el ejemplo 4-(1), las células MDCK se incubaron hasta formación de
monocapas, se trataron con ciclopentenona de concentración final 0,
20 ó 40 \muM durante seis horas y se infectaron con virus de la
gripe de la misma manera que en el ejemplo 4-(1), continuándose la
incubación en MEM de Eagle que contenía 10 \mug/mL de tripsina al
que se añadió ciclopentenona en la misma concentración que antes de
la infección. El resultado fue que, en las secciones en las que se
añadió ciclopentenona en concentración 20 \muM o mayor, el valor
de la titulación del virus disminuyó claramente en comparación con
el control, al que no se había añadido ciclopentenona. El resultado
se da en la Tabla 6. Además, las células no fueron eliminadas, sino
que se adhirieron a cada una de las secciones a las que se añadió
ciclopentenona.
(4) Se llevó a cabo el mismo experimento que en
el Ejemplo 4-(1) en el que la multiplicidad de la infección (m.o.i.)
se ajustó a 0,001. El resultado fue que, en las secciones en las que
se añadió ciclopentenona en concentración 10 \muM o mayor, el
valor de la titulación del virus disminuyó claramente en comparación
con el control, al que no se había añadido ciclopentenona. El
resultado se da en la Tabla 7. Además, las células no fueron
eliminadas, sino que se adhirieron a cada una de las secciones a las
que se añadió ciclopentenona.
(5) Se llevó a cabo el mismo experimento que en
el Ejemplo 4-(2) en el que la multiplicidad de la infección (m.o.i.)
se ajustó a 0,001. El resultado fue que, en las secciones en las que
se añadió ciclopentenona en concentración 10 \muM o mayor, el
valor de la titulación del virus disminuyó claramente en comparación
con el control, al que no se había añadido ciclopentenona. El
resultado se da en la Tabla 8. Además, las células no fueron
eliminadas, sino que se adhirieron a cada una de las secciones a las
que se añadió ciclopentenona.
(6) Se llevó a cabo el mismo experimento que en
el Ejemplo 4-(3) en el que la multiplicidad de la infección (m.o.i.)
se ajustó a 0,001. El resultado fue que, en las secciones en las que
se añadió ciclopentenona en concentración 10 \muM o mayor, el
valor de la titulación del virus disminuyó claramente en comparación
con el control, al que no se había añadido ciclopentenona. El
resultado se da en la Tabla 9. Además, las células no fueron
eliminadas, sino que se adhirieron a cada una de las secciones a las
que se añadió ciclopentenona.
Es evidente, a partir de los resultados del
Ejemplo 4-(1) - (6), que la ciclopentenona presentó actividad
antiviral al virus de la gripe. Además,
(-)-ciclopentenona y
(+)-ciclopentenona dieron también resultados
similares.
Se añadió ciclopentenona (0,5-5
\muM) a células CEM-SS (ATCC
CCL-119) o a células H9 (ATCC
HTB-176), ambas en concentración de 2 x 10^{5}
células/mL. Las células se incubaron durante tres días y se contó el
número de células vivas y de células muertas, después de lo cual se
calculó el índice de supervivencia de las células.
El resultado fue que, en ambos tipos de células,
no hubo disminución significativa en el índice de supervivencia de
las células debido a la adición de ciclopentenona. El resultado se
da en la Fig. 1 y en la Fig. 2. Así, en la Fig. 1 y en la Fig. 2 se
representan los gráficos que muestran la relación entre la
concentración de ciclopentenona añadida y el índice de supervivencia
de las células, representándose en abscisas la concentración
(\muM) de ciclopentenona añadida, mientras que en ordenadas se
representa el índice de supervivencia (%) de las células después de
tres días de incubación. La Fig. 1 presenta el resultado cuando se
usaron células CEM-SS, mientras que la Fig. 2
presenta el resultado cuando se usaron células H9.
Se añadió ciclopentenona (1-5
\muM) a células CEM-SS infectadas con
VIH-1_{IIIB} (abreviadas como
CEM-3B) o a células H9 infectadas con
VIH-1_{IIIB} (abreviadas como
H9-3B) y se incubaron durante tres días. En ambos
tipos de células, resultaron infectadas por
VIH-1_{IIIB} el 90% de las células o más. Se contó
el número de células vivas y muertas y se calculó a partir de esos
datos el índice de supervivencia.
El resultado fue que, en ambos tipos de células,
el índice de supervivencia de las células disminuyó
significativamente por adición de ciclopentenona 3 \muM y, en el
caso de la adición de ciclopentenona 5 \muM, el índice de
supervivencia de las células disminuyó adicionalmente. Así, en
comparación con el Ejemplo 5-(1), la ciclopentenona presentó acción
anti-VIH. El resultado se muestra en la Fig. 3 y en
la Fig. 4. Así, en la Fig. 3 y en la Fig. 4 se representan los
gráficos que muestran la relación entre la concentración de
ciclopentenona añadida y el índice de supervivencia de las células,
representándose en abscisas la concentración (\muM) de
ciclopentenona añadida, mientras que en ordenadas se representa el
índice de supervivencia (%) de las células después de tres días de
incubación. La Fig. 3 presenta el resultado cuando se usaron células
CEM-3B, mientras que la Fig. 4 presenta el resultado
cuando se usaron células H9-3B.
Se midió la concentarción de antígeno p24
contenida en el líquido sobrenadante del cultivo después de la
incubación durante tres días del caso del Ejemplo 5-(2). El
resultado fue que la concentración de p24 disminuyó en respuesta a
la concentración de ciclopentenona añadida, de manera que, en
consecuencia, se percibió su acción anti-VIH. El
resultado se muestra en la Tabla 10. En la Tabla 10, los números
entre paréntesis son la razón de cada líquido sobrenadante de los
cultivos celulares (cuando no se añadió ciclopentenona) a la
concentración de p24 expresada en términos de %.
Se suspendieron células Vero (ATCC
CCL-81) en MEM de Eagle que contenía 10% de suero
fetal bovino hasta llegar a una concentración celular de 5 x
10^{4} células/100 \muL. La suspensión se colocó en una placa de
microtitulación de 96 pocillos, de manera que se vertió en cada
pocillo una cantidad de 100 \muL de suspensión celular y se incubó
durante toda la noche a 37ºC en presencia de 5% de gas dióxido de
carbono, con lo que se prepararon células Vero en estado de
monocapas.
Se añadió a las células medio MEM de Eagle al que
se había adicionado ciclopentenona hasta una concentración final de
0, 5, 10, 20 ó 40 \muM, efectuándose seguidamente una incubación a
37ºC durante siete horas en presencia de 5% de gas dióxido de
carbono.
Una vez completada la incubación, se retiró el
medio, se efectuó dos veces lavado con PBS y, a continuación, se
inoculó el virus de la encefalitis japonesa (cepa JEV
Ja0Ar-363-70) en concentración de
4,9 x 10^{2} ufp/mL, se llevó a cabo una incubación a 37ºC durante
30 horas en presencia de 5% de gas dióxido de carbono, se fijaron
las células mediante etanol y se efectuó el recuento de focos por
medio de un contador de focos por el método PAP [Arch. Virol.,
volumen 86, pp. 129-135 (1985)].
El resultado fue que, en las secciones en las que
se añadió ciclopentenona 40 \muM, los números de focos
disminuyeron claramente en comparación con el control, en el que no
se había añadido ciclopentenona. El resultado se da en la tabla 11.
Como información complementaria, las células no fueron eliminadas,
sino que se adhirieron a cada una de las secciones a las que se
añadió ciclopentenona.
(2) Las células Vero que se incubaron en una
microplaca de 24 pocillos en MEM de Eagle que contenía 10% suero
fetal de bovino en presencia de 5% de gas dióxido de carbono a 37ºC
hasta formación de monocapas, se lavaron con PBS, se infectaron con
virus de la encefalitis japonesa (4,9 x 10^{2} ufp/mL, cepa JEV
Ja0Ar-363-70) y se incubaron a 37ºC
durante 90 minutos.
Después de la incubación, las células se lavaron
con PBS y se incubaron en MEM al que se había añadido ciclopentenona
hasta llegar a una concentración final de 0, 5, 10, 20 ó 40
\muM.
Se recogió el líquido sobrenadante de las células
infectadas después de 0, 1, 2 y 3 día(s) y se determinaron
las titulaciones del virus por medio del recuento de focos por el
método PAP [J. Clin. Microbiol., volumen 28, pp.
1308-1313 (1990)].
El resultado fue que, en las secciones en las que
se añadió ciclopentenona en concentración 10 \muM o mayor, los
números de focos disminuyeron claramente en comparación con el
control, en el que no se había añadido ciclopentenona. El resultado
se da en la tabla 12. Como información complementaria, las células
no fueron eliminadas, sino que se adhirieron a cada una de las
secciones a las que se añadió ciclopentenona.
De los anteriores resultados de los Ejemplos
7-(1) y 7-(2), es evidente que la ciclopentenona presenta actividad
antiviral contra el virus de la encefalitis japonesa. Como
información complementaria, el virus de la encefalitis japonesa
pertenece a una especie del mismo tipo que el virus de la hepatitis
C y, bajo las presentes circunstancias, en las que todavía no se ha
establecido la incubación in vitro de la hepatitis C, el
virus de la encefalitis japonesa se usa como modelo del virus de la
hepatitis C. Consecuentemente, la ciclopentenona es efectiva también
como agente terapéutico de la hepatitis C.
Además, se obtuvieron los mismos resultados con
(-)-ciclopentenona y
(+)-ciclopentenona.
Cuando una mujer a quien se diagnosticó hepatitis
C cinco años atrás, que no había mostrado mejoría en las funciones
hepáticas, ya que tanto la GOT como la GTP estaban aproximadamente
en 150 a pesar de tratamiento con Interferón y Minofagen Strong,
tomó un preparado bebible preparado según el ejemplo 13 en dosis de
50 mL (con 2 mg de ciclopentenona) durante dos meses, tanto la GOT
como la GTP mejoraron hasta un valor de 80. Cuando tomó la bebida
adicionalmente durante un mes más, tanto la GOT como la GTP bajaron
a 30, observándose por tanto, una mejora significativa de la función
hepática.
Se afeitó el pelo del dorso de ratones de la cepa
ICR (adquiridos en Nippon SLC; edad, siete semanas; hembras) y se
aplicó en la zona DMBA (dimetilbenzantraceno) como iniciador, en
forma de disolución en acetona y en dosis de 50 \mug/ratón.
Después de una semana, se aplicó TPA (13-acetato de
12-o-tetradecanoil forbol) como
promotor dos veces por semana, en forma de disolución de acetona y
en dosis de 1 \mug/ratón, en el local en el que se aplicó el
iniciador, hasta completar el ensayo. Al mismo tiempo, se aplicó,
una hora antes de cada aplicación de TPA, una disolución en etanol
al 80% de ciclopentenona, o bien etanol al 80% (control),
observándose en consecuencia, durante 20 semanas, la acción
anti-carcinogénica a la carcinogénesis causada por
una carcinogénesis en dos etapas sobre la piel.
El grupo de control (grupo al que se aplicó sólo
el vehículo) presentó un índice carcinogénico del 100% (12 ratones
de 12) en 15 semanas, mientras que la ciclopentenona suprimió
intensamente la carcinogénesis, siendo 8,3% el índice carcinogénico
de los ratones a los que se administraron 2,5 mg durante 15 semanas
(1 ratón de 12), y 25% durante y después de 19 semanas (3 ratones de
12). El resultado se da en la Fig.5. Así, en la Fig. 5 se representa
un gráfico que muestra la acción anti-carcinogénica
de la ciclopentenona, representándose en ordenadas el índice
carcinogénico, mientras que en abscisas se representa el tiempo
(semanas). En el gráfico, triángulos huecos, triángulos en negro y
círculos huecos representan, respectivamente, el grupo tratado con
2,5 mg de ciclopentenona por ratón (12 ratones en total), el grupo
tratado con 0,8 mg de ciclopentenona por ratón (11 ratones en total)
y el grupo de control (12 ratones en total).
Como información complementaria, en el ensayo de
actividad anti-inflamatoria de TPA en orejas de
ratón, la ciclopentenona no presentó actividad
anti-inflamatoria por aplicación de 2,5 mg (por
ratón) en la oreja del ratón.
En suma, la ciclopentenona presentó acción
anti-promotora de la carcinogénesis química en dos
fases. El producto de calentamiento del ácido glucurónico que
contiene ciclopentenona, la (-)-ciclopentenona y la
(+)-ciclopentenona presentaron los mismos
resultados.
(1) Se añadió ciclopentenona a una solución
salina fisiológica (como las incluidas en la farmacopea japonesa) en
concentración de 1%, con objeto de preparar una preparación
inyectable.
(2) Se añadió (-)-ciclopentenona
y ácido glicirrícico a una solución salina fisiológica (la misma
mencionada en el párrafo anterior) en concentración de 0,5% y 1,0%
respectivamente, con objeto de preparar una preparación
inyectable.
(1) Se preparó un comprimido con 10 mg de
ciclopentenona y la cantidad apropiada de celulosa microcristalina y
se revistió con azúcar, con objeto de fabricar una preparación en
forma de comprimidos.
(2) Se preparó un comprimido con 0,1 mg de
(+)-ciclopentenona, 10 mg de glicirricinato de
dipotasio y la cantidad apropiada de celulosa microcristalina y se
revistió con azúcar, con objeto de fabricar una preparación en forma
de comprimidos.
| Ciclopentenona | 1 g |
| Ungüento de absorción (como los indicados en la farmacopea japonesa) | 99 g |
En primer lugar, la ciclopentenona se mezcló bien
con una pequeña cantidad de ungüento de absorción, añadiéndose
gradualmente a continuación el resto del ungüento de absorción,
mezclándose continuamente hasta conseguir la homogenización de la
mezcla, con objeto de preparar una preparación en forma de
ungüento.
Este ungüento se aplicó cuatro o cinco veces al
día sobre la zona afectada.
(1) Se añadieron 5 kg de pectina (Pomosin Pectin
LM-13CG; fabricado por Hercules) a 100 litros de
agua del grifo y se calentó la mezcla, desde la temperatura del
líquido, de 28ºC, hasta 120ºC, mediante corriente de vapor durante
35 minutos. Se mantuvo en agitación a 120ºC durante cinco horas y a
continuación se enfrió, con objeto de preparar 135 litros de mezcla
en frío. Se añadieron a esta mezcla 1,35 kg de Celite #545
(fabricado por Celite) y 1,35 kg de Silica #600-S
(fabricado por Chuo Silica) como auxiliares de filtración, y se
efectuó una filtración mediante un filtro compacto (papel de filtro
de 6 pulgadas en 16 fases; ADVANTEC #327) prerrevestido con 0,1 kg
de Celite #545 y 0,1 kg de Silica #600-S. El
filtrado resultante se sometió a un tratamiento térmico instantáneo
y continuo (a 98ºC durante 60 segundos) mediante una placa
calefactora (fabricada por Nichihan Seisakusho), enfriándose a
continuación para preparar 150 litros de disolución de pectina
sometida a tratamiento térmico que contiene
ciclopentenona.
ciclopentenona.
Dicha disolución de pectina sometida a
tratamiento térmico que contiene ciclopentenona, presentó un pH de
aproximadamente 3,5, una acidez de 6,2 mL y un grado de azúcar Brix
de 5,8%. Como información complementaria, el pH se midió en un
pHmetro, la acidez se expresó en términos de cantidad (mL) de NaOH
0,1 N usada para neutralización hasta pH 7,0, y el grado de azúcar
se midió mediante un sacarímetro Brix.
(2) El preparado bebible se preparó según la
siguiente formulación:
| Azúcar Líquido Fructosa-glucosa | 5,00% | |
| Azúcar | 4,00% | |
| Agente Ácido | 1,20% | |
| Perfumes | 0,30% | |
| Material que contiene Ciclopentenona | 0,5% | |
| Agua pura | balance | |
| Total | 100,00% |
La disolución de pectina sometida a tratamiento
térmico que contiene ciclopentenona mencionada en el Ejemplo 13-(1)
se usó como material que contiene ciclopentenona y su cantidad se
calculó sobre la base de sólido añadido. Este preparado bebible (100
mL) contiene 4 mg de ciclopentenona.
La presente invención ofrece un agente antiviral
que contiene un compuesto como componente efectivo, tal como la
ciclopentenona o una sustancia o una sal de ella ópticamente
activas, que posee la función de inducir resistencia a los virus en
las células y la función de destruir selectivamente las células
infectadas por virus. El agente antiviral de la presente invención
destruye selectivamente las células infectadas por virus y confiere
resistencia a los virus a las células normales que no están
infectadas por virus y, como resultado de su acción sinérgica, es
un agente antiviral extremadamente útil en las terapias de
enfermedades virales persistentes, tales como SIDA y hepatitis C, y
también en la mejoría de los síntomas. Además, la presente invención
ofrece un agente farmacéutico, que contiene ciclopentenona, o una
sustancia o una sal de ella ópticamente activas, que presenta varias
actividades fisiológicas, tales como la acción de mejorar la función
hepática, acción de inducir proteínas de choque térmico, acción de
impedir la carcinogénesis viral y acción
anti-promotora. Dicho agente farmacéutico
proporciona un fármaco que es útil para mantener la homeostasis de
los organismos vivos, manteniendo en particular la salud de estómago
e intestino.
La presente invención ofrece adicionalmente un
preparado comestible antiviral y un preparado bebible antiviral que
contienen un compuesto como componente efectivo que posee la función
de inducir resistencia a los virus en las células y la función de
destruir selectivamente las células infectadas por virus, tal como
la ciclopentenona o una sustancia o una sal de ella ópticamente
activas. Tales preparados comestibles y bebibles son útiles como
preparados comestibles y bebibles para mejorar los síntomas de
varias enfermedades causadas por virus. Además, la presente
invención ofrece preparados comestibles y bebibles que contienen
ciclopentenona o una sustancia o una sal de ella ópticamente activas
que presentan actividades fisiológicas, tales como la acción de
mejorar la función hepática, acción de inducir proteínas de choque
térmico, acción de impedir la carcinogénesis viral y acción
anti-promotora. Dichos preparados comestibles o
bebibles son útiles para mantener la homeostasis de los organismos
vivos, manteniendo en particular la salud de estómago e
intestino.
Claims (6)
1. El uso de al menos un compuesto seleccionado
entre cis-, trans- o una mezcla de isómeros de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
representada a continuación por la fórmula [1], y sus
correspondientes formas ópticamente activas o una sal de ella,
en la fabricación de un agente para
el tratamiento o prevención de enfermedades
virales.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que el
agente se utiliza para el tratamiento de SIDA o hepatitis de tipo C
en seres humanos.
3. El uso según la reivindicación 1, en el que el
agente se utiliza para el tratamiento de seres humanos, de animales
o para aplicación en plantas.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que el
agente se utiliza para el tratamiento de animales domésticos, aves
de corral, peces o crustáceos.
5. El uso de al menos un compuesto seleccionado
entre cis-, trans- o una mezcla de isómeros de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
representada a continuación por la fórmula [1], y sus
correspondientes formas ópticamente activas o una de sus sales,
en la fabricación de un preparado
comestible o bebible para el tratamiento o prevención de
enfermedades
virales.
6. El uso de al menos un compuesto seleccionado
entre cis-, trans- o una mezcla de isómeros de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
representada a continuación por la fórmula [1], y sus
correspondientes formas ópticamente activas o una sal de ella,
en la fabricación de un agente para
inducir proteína de choque
térmico.
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