CN1133611C - 具有细胞凋亡诱发能力的物质 - Google Patents

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Abstract

具有细胞凋亡诱发能力的物质的制造方法，其特征是包括加热处理从下述(a)、(b)、(c)、(d)中选择的至少一种化合物(但是，糖醛酸以及/或糖醛酸衍生物、以及含有糖醛酸以及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)的工序：(a)戊糖(b)戊糖衍生物(c)含有戊糖的化合物(d)含有戊糖衍生物的化合物。

Description

具有细胞凋亡诱发能力的物质
技术领域
本发明涉及在医药、饮食品领域有用的可以诱发细胞凋亡的物质及其制造方法，以及含有该诱发细胞凋亡物质的医药、食品或饮料。
先有技术
近年来，在细胞组织死亡中，细胞凋亡(apotosis，细胞自发突然性死亡或细胞自然死亡)的形式正引起关注。与由于病理原因导致的细胞坏死不同，细胞凋亡是从一开始就与细胞自身的基因结合在一起所导致的死亡。即，细胞凋亡以内部或外部因素作为引发剂使得编程基因活化，由此进行程序性死亡基因蛋白质的生化合成。另外某些情况下细胞内存在的非活性型程序性死亡蛋白质被活化。我们相信由此生成的活性型程序死亡蛋白质使得细胞自身分解，以至死亡。如果将细胞凋亡在所希望的组织、细胞中表达，则有可能将不需要或有害的细胞以它们自然的形态从生命体中排出，这将具有很深远的意义。
发明所要解决的问题
本发明的目的是提供医药、饮食品领域有用的可以诱发细胞凋亡的物质及其制造方法，以及提供含有以诱发细胞凋亡物质为主要成份的医药、食品或饮料。解决问题的手段
本发明者为达到上述目的，通过锐意探讨，结果发现加热从(a)戊糖、(b)脱氧核糖等戊糖衍生物、(c)核糖核苷、核糖核苷酸、核糖核酸等含有戊糖的化合物、(d)脱氧核苷、脱氧核苷酸、脱氧核糖核酸等含有戊糖衍生物的化合物中选择的至少一种化合物得到的加热处理物，对癌细胞具有强力细胞凋亡诱发能力，并成功地分离得到了具有细胞凋亡诱发能力的该加热处理物中活性成份，从而完成了本发明。
概述本发明如下。本发明的第一发明涉及具有细胞凋亡诱发能力的物质的制造方法，其特征包括加热处理从下述(a)、(b)、(c)、(d)中选择的至少一种化合物(但糖醛酸及/或糖醛酸衍生物、以及含有糖醛酸及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)的工序。
(a)戊糖
(b)戊糖衍生物
(c)含有戊糖的化合物
(d)含有戊糖衍生物的化合物。
本发明的第一发明中的戊糖是以核糖或木糖为例但本发明并不局限于此。作为戊糖衍生物的脱氧戊糖，例如脱氧核糖、5位上与带负电荷的基团键合的戊糖衍生物(如与磷酸基或硫酸基键合的戊糖衍生物)。作为含有戊糖的化合物，例如核糖核苷、核糖核苷酸或核糖核酸、以及5位上与带负电荷的基团键合的戊糖，例如与磷酸基或硫酸基键合的戊糖。作为含有戊糖衍生物的化合物，例如脱氧核苷、脱氧核苷酸或脱氧核糖核酸。具有细胞凋亡诱发能力的物质，例如从4，5-二羟基-2-戊烯醛，4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、以及4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮中选择的化合物。
本发明的第二发明涉及细胞凋亡诱发性化合物，该化合物是从4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环、以及下面通式[I]表示的化合物中选择的。
Figure C9980222900061
(式中，R表示从含有SH基团的化合物中除去SH基的剩余基团)。
本发明的第二发明并不是限定本发明的，含有SH基的化合物例如可以举出半胱氨酸、谷胱甘肽。
本发明的第三发明涉及对从4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、以及通式[I]表示的化合物中选择的化合物具有感受性的疾病的治疗用以及预防用医药品，其特征是含有从4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、以及通式[I]表示的化合物中选择的化合物为有效成份。
本发明的第三发明并不是限定本发明，药物可以是例如抗癌药、细胞凋亡诱发剂、抗风湿剂、人胰岛素样增殖因子产生诱导剂、活性氧产生抑制剂、或热休克蛋白诱导剂。
本发明的第四发明涉及食品或饮料，其中含有、稀释和/或添加通过加热处理下述(a)、(b)、(c)、(d)中选择的至少一种化合物(但糖醛酸及/或糖醛酸衍生物、以及含有糖醛酸及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)得到的具有细胞凋亡诱发能力的加热处理物以及/或其部分精制产物。
(a)戊糖
(b)戊糖衍生物
(c)含有戊糖的化合物
(d)含有戊糖衍生物的化合物。
本发明的第四发明并不是限定本发明，作为食品或饮料例如是抗癌用、细胞凋亡诱发用、抗风湿用、人胰岛素样增殖因子产生诱导用、活性氧产生抑制用、或热休克蛋白诱导用等的食品或饮料。
图1为4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的质谱图。
图2为4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的1H-NMR谱图。
图3为4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的质谱图。
图4为4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的1H-NMR谱图。
图5为1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮的质谱图。
图6为1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮的1H-NMR谱图。
图7为2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环的质谱图。
图8为2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环的1H-NMR谱图。
图9为戊糖浓度与4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮生成量的关系图。
图10为峰1的质谱图。
图11为峰3的质谱图。
图12为峰1的1H-NMR谱图。
图13为峰3的1H-NMR谱图。
图14为在各培养条件下添加2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环培养时培养基中NO2 -的浓度图。
下面详细说明本发明。
戊糖是具有5个碳原子糖的总称，天然存在的戊醛糖如阿糖、木糖、核糖、来苏糖等，戊酮糖如核酮糖、木酮糖等。
戊糖衍生物例如脱氧戊糖、戊糖醇等，前者天然存在的例如脱氧核糖、后者如核糖醇、阿糖醇、木糖醇等。另外碳原子数为5的氨基糖、糖醛酸、醛醇糖酸等也是戊糖衍生物，可通过合成的方法得到。
含有戊糖的化合物例如磷酸戊糖、核糖核苷、核糖核苷酸等低分子化合物，以及核糖核酸、阿拉伯糖(arabinan)以及木聚糖等高分子化合物。另外戊糖的酯、醚、苷、及其盐类等也是含戊糖化合物，可以通过合成法制备。
含有戊糖衍生物的化合物例如含有脱氧戊糖的脱氧戊糖磷酸、脱氧核糖核苷、脱氧核苷酸、脱氧核糖核酸，含有戊糖醇的核黄素、核糖醇胞壁酸等。另外戊糖衍生物的酯、醚、酰胺、苷、及其盐类等也是含戊糖衍生物的化合物，可以通过合成法制备。
核糖核酸、核糖核苷、核糖核苷酸、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核苷、脱氧核苷酸作为辅酶可保存并表达遗传信息，对生物体来说是非常重要的物质。核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、木酮糖-5-磷酸作为磷酸戊糖循环的代谢中间体在许多生物体中广泛存在。植物胶质、粘质、半纤维素或细菌多糖中含有阿糖或木糖，人心肌中的来苏黄素或某些抗生素是来苏糖的衍生物。
本发明中使用的含有戊糖的化合物也包括5位上与带有负电荷的基团键合的戊糖以及含有5位上与带有负电荷基团键合的戊糖的化合物。本发明中的带有负电荷的基团，是指在通常的化学反应条件下，即在至少满足PH1-13、0℃-200℃中一个条件下，在水溶液中带有负电荷的基团，例如磷酸基、硫酸基。另外，本说明书中也包括它们的盐、酯、酸酐等带负电荷的基团。但是，羧基虽为带负电荷的基团，但5位带有羧基的戊醛糖即糖醛酸，不包括在本发明使用的含有戊糖的化合物之内。
对本发明中可以使用的5位上与带有负电荷的基团键合的戊糖没有特别的限定，通过加热处理可以得到具有细胞凋亡诱发能力的物质例如4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的，均包括在本发明的含有戊糖的化合物中。即，只要是通过加热处理可以生成例如4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮即可，而不管其戊糖的种类、带有负电荷的基团的种类。5位上与带有负电荷的基团键合的戊糖例如核糖-5-磷酸、核糖-5-硫酸等。
对本发明中含有5位上与带有负电荷基团键合的戊糖的化合物没有特别的限定，例如可以使用核糖核酸、核糖核苷酸、核糖核苷，以及通过化学的、酶的、物理的方法得到的它们的降解产物、降解产物的衍生物、降解产物的盐类等。
将本发明中的上述戊糖、戊糖衍生物、含有戊糖的化合物、含有戊糖衍生物的化合物加热处理，只要能生成具有细胞凋亡诱发能力的物质，则没有任何限定。另外，戊糖、戊糖衍生物、含有戊糖的化合物、含有戊糖衍生物的化合物可以通过从动植物微生物细胞中分离的方法、发酵法等制备、也可通过化学合成的方法得到。不论使用何种方法制备，只要该物质通过加热处理可以生成具有细胞凋亡诱发能力的物质，则在本发明中就可以使用。
本发明也可以使用含有戊糖、戊糖衍生物、含有戊糖的化合物及/或含有戊糖衍生物的化合物的物质。由于在动植物的组织中、动植物微生物的细胞中含有各种戊糖、戊糖衍生物、含有戊糖的化合物、含有戊糖衍生物的化合物，这些物质可以直接在本发明中使用。另外，本发明中的含有戊糖的化合物及/或含有戊糖衍生物的化合物中，含有糖醛酸及/或糖醛酸衍生物的化合物除外。糖醛酸衍生物是指糖醛酸的内酯、糖醛酸的酯类、糖醛酸的酰胺类、糖醛酸的盐类等。
本发明具有细胞凋亡诱发能力的物质通过加热处理得到，对反应条件没有特别的限定，只要得到的加热处理物具有细胞凋亡诱发能力即可，例如将上述(a)～(d)中选择的至少一种化合物(糖醛酸及/或糖醛酸衍生物、及含有糖醛酸及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)，在例如30℃～400℃下加热处理数秒～数日，优选在50～200℃下加热处理数秒～24小时，得到具有细胞凋亡诱发能力的加热处理物。由于加热处理物中含有两种或更多的具有细胞凋亡诱发能力的物质，根据要求改变PH、时间、温度、原料浓度等加热处理条件，使制备的加热处理物中含有所期望的具有细胞凋亡诱发能力的物质。
例如在使用核糖或核糖-5-磷酸时，在80～150℃下加热处理数分钟～数日，可以得到含有4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的加热处理物。
下面将具有细胞凋亡诱发能力的、从上述(a)～(d)中选择的化合物的加热处理物，简称为本发明的加热处理物。
加热处理时原料的浓度，如经加热处理可得到具有细胞凋亡诱发能力的物质，则原料浓度范围没有特别的限定，最好从操作性、收率等方面考虑进行设定。本发明的加热处理方式可以是湿式加热法，也可以是干式加热法。湿式加热法可采用水蒸气加热、水蒸气加压加热、加压式加热等任意的湿式加热方法。干式加热法可采用通过干燥热风的直接加热法、通过在隔壁设置热源加热的间接加热法等。直接加热法例如气流干热法、喷雾干热法等，间接加热法例如滚筒干热法等。另外，生产本发明具有细胞凋亡诱发能力的物质的原料，可用通常的煮、烧、炒、煎、炸等任意的加热方法进行处理。
本发明的具有细胞凋亡诱发能力的物质可以细胞凋亡诱发作用作为指标进行精制处理。精制手段可以使用周知的化学方法、物理方法等。
例如，使用核糖时，将其2M的水溶液在121℃下加热处理14小时，在其加热处理物中生产4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。将加热处理物中的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮用溶剂萃取，浓缩萃取物。将该浓缩物通过硅胶柱色谱法分离，浓缩洗脱的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮组份，用氯仿从浓缩物中萃取4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮，通过萃取浓缩物的正相柱色谱法，可以分离得到本发明的加热处理物中的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
另外将上述核糖加热处理物通过离子交换树脂柱，优选阴离子交换树脂柱处理，收集非吸附性组份，得到精制的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。或将上述核糖加热处理物通过活性炭进行处理，除去非吸附组份，将柱洗净后，用亲水性有机溶剂例如乙醇水溶液、优选40％以上的乙醇水溶液进行洗脱，得到精制的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。将这些方法组合使用，可以得到更高纯度的精制4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
使用同样的精制方法，可以从本发明的加热处理物中得到从4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮中选择的化合物。
另外，通过这些精制方法精制得到的精制物以及部分精制物，也包括在本发明的具有细胞凋亡诱发能力的物质中。
本发明者在本发明的加热处理物中，发现含有Biochemistry第35卷、第659～665页(1996)中记载的反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛及其类似物，发现这些化合物具有抗癌作用，和细胞凋亡诱发作用等。
另外，通过本发明的加热处理物，可以成功地分离得到4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。另外，发现通过4，5-二羟基-2-戊烯醛可以生成2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环，并成功地分离。另外，发现将4-羟基-2-环戊烯-1-酮与含有SH基的化合物反应，可以生成由通式[I]表示的化合物并成功地分离。并且发现这些化合物具有癌细胞增殖抑制活性、以及细胞凋亡诱发活性等生理活性。
所以，以从4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮以及通式[I]表示的化合物(以下称为本发明的化合物)中选择的化合物作为有效成份，可以提供一种预防及治疗对本发明化合物具有感受性的疾病，例如癌症、需要诱发细胞凋亡的疾病、需要抑制产生活性氧的疾病、需要诱导产生人胰岛素样增殖因子的疾病、需要诱导产生热休克蛋白质的疾病有用的医药品。
将本发明的加热处理物、或从本发明化合物中选择的化合物作为有效成份，与公知的医药用载体组合作成制剂，可以制得细胞凋亡诱发剂。即一般来说，将本发明的加热处理物或从本发明化合物中选择的化合物，与药学上允许的液体或固体载体配合，根据需要可以加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，可以制成片剂、颗粒剂、散剂、粉剂、胶囊剂等固体制剂，以及常用的溶液剂、混悬剂、乳剂等液体制剂。另外，另外也可制成干燥品，在使用前加入适当载体制成溶液剂。
含有以本发明的加热处理物、或从本发明化合物中选择的化合物作为有效成份的细胞凋亡诱发剂，可以制成口服制剂、注射剂和输液用制剂等非口服制剂。
医药用载体，可以根据上述给药形式或剂型进行选择，口服制剂例如可使用淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外在调剂口服制剂时，也可以配合使用粘合剂、崩解剂、界面活性剂、润滑剂、增流剂、矫味剂、着色剂、香料等。
另一方面，在非口服制剂时，根据常法，将本发明的有效成份即本发明的加热处理物、或从本发明化合物中选择的化合物，在稀释剂例如注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等溶剂中溶解或混悬，根据需要可以加入抑菌剂、稳定剂、等渗剂、无痛剂等进行调剂。
含有本发明的加热处理物或从本发明化合物中选择的化合物作为有效成份的细胞凋亡诱发剂，可根据制剂形态采取适当的形式给药。给药方法没有特别的限定，可通过内服、外用或注射等给药。注射剂给药包括静脉内、肌内、皮下、皮内给药等，外用制剂如栓剂等。
本发明的加热处理物作为有效成份的细胞凋亡诱发剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的有效成份成人通常为1日1～1000mg，优选10～200mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明的化合物中选择的化合物作为有效成份的细胞凋亡诱发剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的有效成份成人通常为1日0.01～50mg，优选0.1～10mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明的加热处理物、或本发明的化合物对癌细胞具有细胞凋亡诱发作用、细胞增殖抑制作用、拓朴异构酶II阻碍作用等，所以将本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物作为有效成份，可以制成抗癌剂。即，将本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物作为有效成份，与公知的医药用载体组合制剂化，可以制成抗癌剂。抗癌剂的制造可以按照上述的方法进行。
抗癌剂可制成口服剂、或注射剂、点滴用药剂等非口服制剂给药。
医药用载体可以根据上述制剂剂型进行选择，按照上述细胞凋亡诱发剂的要求使用。
抗癌剂可以根据制剂形式采用适当的给药途径。给药方式没有特别的限定，可采用内服、外用或注射等方式。注射剂例如静脉内、肌内、皮下、皮内给药等、外用制剂包括栓剂等。
本发明的加热处理物作为有效成份的抗癌剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的本发明的加热处理物的量成人通常为1日1～1000mg，优选10～200mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明化合物中选择的化合物作为有效成份的抗癌剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的有效成份成人通常为1日0.01～50mg，优选0.1～10mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
风湿是由于骨膜细胞或软骨细胞障碍引起的自身免疫疾病。本发明的加热处理物、或本发明的化合物，对synovial细胞具有细胞凋亡诱发作用，所以将本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物作为有效成份，可以制成抗风湿剂。即，将本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物作为有效成份，与公知的医药用载体组合制剂化，可以制成抗风湿剂。抗风湿剂的制造可以按照上述的方法进行。
抗风湿剂可制成口服剂、或注射剂、点滴用药剂等非口服制剂给药。
医药用载体可以根据上述制剂剂型进行选择，按照上述细胞凋亡诱发剂的要求使用。
抗风湿剂可以根据制剂形式采用适当的给药途径。给药方式没有特别的限定，可采用内服、外用或注射等方式。注射剂例如静脉内、肌内、皮下、皮内给药等、外用制剂包括栓剂等。
本发明的加热处理物作为有效成份的抗风湿剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的本发明的加热处理物的量成人为1日1～1000mg，优选10～200mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明化合物中选择的化合物作为有效成份的抗风湿剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的有效成份成人为1日0.01～50mg，优选0.1～10mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
人胰岛素样增殖因子(以下称hIGF-1)对各种细胞具有多种生理作用，作为II-型糖尿病(胰岛素非依赖型)和生长障碍疾病(侏儒症)的治疗药物使用。本发明的加热处理物、或本发明的化合物具有hIGF-1产生诱导作用。所以将本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物作为有效成份，可以制成hIGF-1产生诱导剂。即，将本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物作为有效成份，与公知的医药用载体组合制剂化，可以制成hIGF-1产生诱导剂。hIGF-1产生诱导剂的制造可以按照上述的方法进行。hIGF-1产生诱导剂用于需要诱导产生hIGF-1的疾病、作为II型糖尿病治疗药、预防药、侏儒症的治疗药使用。
hIGF-1产生诱导剂可制成口服剂、或注射剂、点滴用药剂等非口服制剂给药。
医药用载体可以根据上述制剂剂型进行选择，按照上述细胞凋亡诱发剂的要求使用。
hIGF-1产生诱导剂可以根据制剂形式采用适当的给药途径。给药方式没有特别的限定，可采用内服、外用或注射等方式。注射剂例如静脉内、肌内、皮下、皮内给药等、外用制剂包括栓剂等。
本发明的加热处理物作为有效成份的hIGF-1产生诱导剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的本发明的加热处理物的量成人为1日1～1000mg，优选10～200mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明化合物中选择的化合物作为有效成份的hIGF-1产生诱导剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的有效成份成人为1日0.01～50mg，优选0.1～10mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明的加热处理物、或本发明化合物具有活性氧产生的抑制作用，所以将本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物作为有效成份，可以制成活性氧产生抑制剂，对有必要抑制活性氧产生的疾病按一定方法给药。
即，本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物具有抑制活性氧产生的作用，将该化合物作为有效成份的活性氧产生抑制剂等抗氧化剂对由于活性氧的产生以及/或过剩引起的疾病具有治疗或预防作用。
活性氧可以大体分为游离基型与非游离基型活性氧两类。游离基型活性氧为羟基游离基、羟基过氧游离基、过氧游离基、烷氧基游离基、二氧化氮、一氧化氮(以下称NO)、硫游离基、超氧化物。非游离基型活性氧为单态氧、过氧化氢、脂质氢过氧化物、次氯酸、臭氧、过氧亚硝酸盐。这些物质与许多病态，即各种炎症性疾病、糖尿病、癌、动脉硬化、神经系统疾病、缺血牲再回流障碍等有关。
例如NO是内皮细胞血管平滑肌松弛因子(EDRF)的主要成份〔Nature、第327卷、第524～526页(1987)〕。本发明提供了对有必要抑制NO产生的疾病的治疗剂或预防剂。
在本发明中，对有必要抑制NO产生的疾病没有特别的限定，例如由于毒性休克或用某种细胞素治疗产生的全身性血压低下、血压应答低下、自身免疫疾病、炎症、关节炎、风湿性关节炎、糖尿病、炎症性肠道疾病、血管机能不全、病因性血管扩张、组织损伤、心脏血管系统缺血、过敏性疼痛、脑缺血、血管新生伴随的疾病、癌症等，在特表平9-504524号、特表平9-505288号、特表平8-501069号、特表平8-512318号、特表平6-508849号各公报中记载的疾病。本发明的活性氧产生抑制剂，作为NO产生抑制剂，对需要抑制NO产生的疾病具有治疗、预防作用。
活性氧产生抑制剂可制成口服剂、或注射剂、点滴用药剂等非口服制剂给药。
医药用载体可以根据上述制剂剂型进行选择，按照上述细胞凋亡诱发剂使用。
活性氧产生抑制剂可以根据制剂形式采用适当的给药途径。给药方式没有特别的限定，可采用内服、外用或注射等方式。注射剂例如静脉内、肌内、皮下、皮内给药等、外用制剂包括栓剂等。
本发明的加热处理物作为有效成份的活性氧产生抑制剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的本发明的加热处理物的量成人为1日1～1000mg，优选10～200mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明化合物中选择的化合物作为有效成份的活性氧产生抑制剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的有效成份成人为1日0.01～50mg，优选0.1～10mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明的加热处理物、或本发明化合物具有热休克蛋白诱导作用，以本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物作为有效成份可以制成热休克蛋白诱导剂，对有必要诱导产生热休克蛋白的疾病按一定方法给药。
即，本发明的加热处理物、或本发明化合物对70kDa(HSP70)等的热休克蛋白有诱导活性，对肝炎病毒、爱滋病毒、流感病毒、水疱性口内炎病毒、疱疹性病毒等RNA病毒、DNA病毒具有抗病毒作用。另外热休克蛋白与癌症免疫有关，这些化合物对癌症免疫有效。另外也对抗炎症等具有生体防御作用。通过摄入本发明的加热处理物、或本发明化合物中选择的化合物，可以预防、治疗由于流感病毒引起的感冒等病毒性疾病。
热休克蛋白是细胞或个体在突然受到比平常温度高5～10℃的温度变化情况下合成的蛋白质的总称，在原核生物到高等真核生物中广泛分布。真核生物的热休克蛋白为HSP90、HSP70、ubiquitin和HSP26等。其中HSP70为分子chaperone的一种，在开合没有完成或不完全开合部位的蛋白质结合，以促成立体构造的形成。热休克蛋白的氨基酸排列在进化过程中被很好地保存下来，HSP70与大肠杆菌的DanK蛋白质相同。人体中大约存在10个HSP70的遗传基因，其中有些在机体组成中被表达，有些通过各种刺激诱导产生。热休克蛋白的合成除热休克以外，还可以通过各种化学物质、氧化应激等细胞障碍诱导产生。
热休克蛋白诱导剂可制成口服剂、或注射剂、点滴用药剂等非口服制剂给药。
医药用载体可以根据上述制剂剂型进行选择，按照上述细胞凋亡诱发剂的要求使用。
热休克蛋白诱导剂可以根据制剂形式采用适当的给药途径。给药方式没有特别的限定，可采用内服、外用或注射等方式。注射剂例如静脉内、肌内、皮下、皮内给药等、外用制剂包括栓剂等。
本发明的加热处理物作为有效成份的热休克蛋白诱导剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的本发明的加热处理物的量成人为1日1～1000mg，优选10～200mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明化合物中选择的化合物作为有效成份的热休克蛋白诱导剂的给药量，可根据制剂形态、给药方法、使用目的以及适用的患者年龄、体重、症状等进行适当调整，没有一定的限定，一般制剂中含有的有效成份成人为1日0.01～50mg，优选0.1～10mg。当然给药量随各种条件不同会发生变化，有时比上述给药量少就已经足够，有时则有必要超出上述范围。本发明的药剂可以直接经口给药，也可以任意添加至饮料食品当中日常服用。
本发明的加热处理物以及/或其部分精制物、或本发明化合物中选择的化合物，可以作为细胞凋亡诱发用饮食品、抗癌用饮食品、抗风湿用饮食品、hIGF-1产生诱导用饮食品、活性氧产生抑制用饮食品或热休克蛋白诱导用饮食品的原料使用。
含有、稀释以及/或添加本发明的加热处理物以及/或其部分精制物、或本发明化合物中选择的化合物的食品或饮料中，需要含有必要量的本发明的加热处理物以及/或其部分精制物、或本发明化合物中选择的化合物，以发挥其生理作用。
本发明的食品或饮料，例如细胞凋亡诱发用食品或细胞凋亡诱发用饮料、抗癌用食品或抗癌用饮料的制造方法，没有特别的限定，可以采用调理、加工以及常用的食品或饮料的制造方法生产，通过含有、稀释以及/或添加的方法，使制得的食品或饮料中含有有效量的具有细胞凋亡诱发作用或抗癌作用等的本发明的加热处理物以及/或其部分精制物、或本发明的化合物中选择的化合物。
另外，本发明的加热处理物的部分精制物，是通过精制本发明的加热处理物得到的具有细胞凋亡诱发能力的物质，没有特别的限定，可以使用常用的食品、饮料原料的精制工序得到，没有特别的限定。
这些食品或饮料中，含有、添加以及/或稀释含有有效量的具有细胞凋亡诱发作用或抗癌作用等的本发明的加热处理物以及/或其部分精制物、或本发明的化合物中选择的化合物，其形状没有特别的限定，可以包括片状、颗粒状、胶囊状、散剂状、溶胶状等各种可通过口服摄入的形状。
将具有生理活性的有效剂量的本发明加热处理物、其部分精制物、本发明的化合物给小鼠灌胃，没有发现急性毒性，例如给小鼠分别单次灌胃4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮各100mg/kg，没有发现死亡例。
本发明的药剂具有维持机体体内平衡的作用。将本发明的加热处理物以及/或其部分精制物、或本发明的化合物中选择的化合物作为有效成份诱发细胞凋亡的方法，对研究机体防御机能、免疫机能或癌、病毒性疾病等与机体的关系，开发细胞凋亡诱发阻滞剂是等是有用的。
通过使食品或饮料中含有本发明的加热处理物以及/或其精制物，可以开发制造细胞凋亡诱发用食品或饮料、抗癌用食品或饮料、抗风湿用食品或饮料、hIGF-1产生诱导用食品或饮料、活性氧产生抑制用或者热休克蛋白诱导用的食品或饮料。含有本发明的加热处理物以及/或其精制物的食品或饮料是一种健康食品或饮料，具有该加热处理物以及/或其精制物具有的各种生理活性，即细胞凋亡诱发作用、抗癌作用、抗风湿作用、hIGF-1产生诱导作用、活性氧产生抑制作用、热休克蛋白诱导作用等，摄入体内具有预防癌症、抑制癌症效果、抗病毒效果等，是对维持机体体内平衡、特别是对维持胃肠道健康有用的食品或饮料。
另外，4-羟基-2-环戊烯-1-酮可以通过化学合成的方法制造。作为公知的方法，例如Tanaka，T.等的方法〔Tetrahedron、第32卷、第1713页(1976)〕、Nara，M.等的方法〔Tetrahedron、第36卷、第3161页(1980)〕、以及Gill，M.等的方法〔Aust.J.Chem.、第34卷、第2587页(1981)〕等。这些方法的合成步骤多而且复杂，收率低，效果不好。在此，本发明者等将4-环戊烯-1，3-二酮用氯化铈(III)以及硼氢化钠还原，发现仅用一步反应，就得到了高收率的4-羟基-2-环戊烯-1-酮。所以通过本发明可以提供工业上4-羟基-2-环戊烯-1-酮的合成方法。
将4-羟基-2-环戊烯-1-酮其光学异构体以及/或它们的盐与含有SH的化合物反应，在反应液中生成上述通式[I]表示的化合物(以下称硫衍生物)。
含有SH基团的化合物没有特别的限定，例如甲硫醇、丁硫醇、巯基乙醇、含有SH的氨基酸、含有SH的氨基酸衍生物等。含有SH的氨基酸例如半胱氨酸、高半胱氨酸等。
含有SH的氨基酸衍生物例如上述的氨基酸衍生物，如半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸的肽、含有半胱氨酸衍生物的肽等。含有半胱氨酸的肽是指肽中有半胱氨酸作为组成成份，没有特别的限定。含有半胱氨酸的肽例如低聚肽，包括低分子化合物如谷胱苷肽到高分子化合物如蛋白质等。另外若反应中存在可以生成含有半胱氨酸或高半胱氨酸的肽的条件的话，例如通过还原处理等，包含胱氨酸或高胱氨酸的肽也可以作为含有半胱氨酸或高半胱氨酸的肽来使用。作为含有半胱氨酸的肽，例如包括含糖、脂质等的半胱氨酸的肽。另外上述各种物质的盐类、酸酐、酯等也可以。
4-羟基-2-环戊烯-1-酮与上述的含有SH的化合物反应，可以形成硫衍生物。
4-羟基-2-环戊烯-1-酮、其光学异构体以及/或它们的盐类，与含有SH的化合物例如含有SH的氨基酸、或其衍生物反应，生成硫衍生物或其光学异构体，其精制、分离的方法可以按照公知的化学、物理等精制方法进行，例如通过将凝胶过滤法、利用分子量分级膜的分级法、溶剂萃取法、分馏法、使用离子交换树脂等各种色谱法等以往公知的精制方法组合使用，可以从反应生成物中精制、分离出本发明的化合物或其光学异构体或它们的盐类。
例如将等摩尔的4-羟基-2-环戊烯-1-酮与谷胱苷肽(还原型)反应，在反应液中生成下面通式[II]表示的硫衍生物，将含有该衍生物的反应生成物通过硅胶柱色谱法，可以精制、分离得到该硫衍生物。
Figure C9980222900231
硫衍生物光学异构体的分离可以用消旋混合物的机械拆分法、优先结晶法、作为非对映异构物或包接物的结晶拆分法、使用酶或微生物的动力学拆分法、使用色谱法的拆分法等。
作为色谱拆分法，例如气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法等，分别使用适当的手性固定相。
作为通过液相色谱法的光学拆分，可以举出使用手性固定相的方法、使用手性洗脱液的方法、拆分消旋体等方法。
作为手性的固定相，例如酰胺系固定相、尿素系固定相、配位体交换型固定相、多糖、多糖衍生物固定相、蛋白质固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等。
作为洗脱液，例如可以使用己烷类、醇类、水(缓冲液)等，可以与上述固定相按适当组合配合使用。
作为硫衍生物或其光学异构体的盐，是医药学允许的盐类，可以按照公知的方法进行变换。
硫衍生物或其光学异构体或它们的盐类，具有抗癌活性、抑制癌细胞增殖的活性、细胞凋亡诱发活性等生理活性，利用这些活性，可以提供含有从硫衍生物或其光学异构体或它们的盐类中选择的化合物作为有效成份的医药品。
实施例
下面通过实施例详细说明本发明，但本发明并不仅限于实施例。另外实施例中的％表示重量％。
实施例1
1M L(+)-阿糖(和光春药社生产、010-04582)水溶液、1M D(-)-阿糖(和光春药社生产、013-04572)水溶液、1M D(+)-木糖(Nacalaitesque社生产、367-19)水溶液、D-核糖(Nacalai tesque社销售、302-10)水溶液，PH值依次为5.3、4.9、4.4、4.7。
在121℃下加热处理4小时，按下述方法测定对人前骨髓性白血病细胞HL-60的细胞凋亡诱发活性。
用0.22μm的滤膜将各加热物以及非加热物灭菌，配制细胞凋亡诱发活性的试样。将这些试样用灭菌蒸馏水稀释2倍、4倍、8倍、16倍以及32倍，按下面方法测定对人前骨髓性白血病细胞HL-60的细胞增殖抑制活性，比较细胞凋亡诱发活性的强度。
即，将稀释液各10μl或灭菌蒸馏水各10μl分别注入96孔微量滴定板的池中。加入含5000个HL-60细胞(ATCC CCL240)的10％牛胎儿血清(Gibco公司生产)的RPMI 1640培养基(Nissui公司生产)90μl，在5％二氧化碳气体中37℃下培养48小时。用光学显微镜观察细胞形态后，加入5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT；Sigma公司生产)的磷酸缓冲氯化钠水溶液10μl，在培养4小时后，用显微镜观察细胞的发育状态，观察细胞内甲的形成。然后加入含有0.04N HCl的2-丙醇100μl，充分搅拌，在590nm处测定吸光度作为细胞增殖度(MTT法)。
结果在添加了未加热的L(+)-阿糖水溶液、D(-)-阿糖水溶液、D(+)-木糖水溶液、D-核糖水溶液的区域与添加了水分作为对照的区域，未发现细胞增殖差异，未发现细胞凋亡诱发活性。相反，在添加了经121℃加热处理4小时的L(+)-阿糖水溶液、D(-)-阿糖水溶液、D(+)-木糖水溶液、D-核糖水溶液的各4倍、4倍、8倍、16倍稀释液的区域，通过镜检发现细胞变形，与添加水分的对照相比，590nm的吸光度减少，由此确认了抑制癌细胞增殖的活性。
实施例2
(1)1M 2-脱氧-D-核糖(Sigma公司生产、D2751)水溶液与0.1M 2-脱氧-D-核糖水溶液的pH值分别为4.7、5.4。取0.1M 2-脱氧-D-核糖水溶液的一部分，用1N的NaOH调整pH为7.1。在121℃下加热处理4小时，按实施例1的方法测定对HL-60细胞的细胞凋亡诱发活性。另外，稀释倍数为2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍以及128倍。
结果发现添加未加热的2-脱氧-D-核糖水溶液的区域与添加对照水分的区域未发现细胞增殖差异，未发现细胞凋亡诱发活性。相反，在分别添加了经121℃下加热处理4小时的1M的2-脱氧-D-核糖水溶液、0.1M的2-脱氧-D-核糖水溶液(未调整pH)、0.1M的2-脱氧-D-核糖水溶液(pH7.1)的128倍、16倍、16倍稀释液的区域，发现细胞增殖受到抑制。
(2)将实施例2-(1)得到的1M的2-脱氧-D-核糖水溶液的121℃下4小时的加热处理物用以下的反相HPLC进行分离。
试样注入量：40μl
柱：YMC-Pack ODS-AM(4.6×250nm、YMC公司生产)
流动相A：水
      B：80％乙腈水溶液
流速：0.8ml/分
洗脱：流动相A(5分钟)→从流动相A到B的浓度梯度(20分钟)→流动相B(5分钟)
检测：在215nm处测定吸光度
每2分钟收集馏分，减压浓缩，按实施例1的方法测定对HL-60细胞的细胞凋亡诱发活性。结果发现，馏分4(保留时间6分钟～8分钟)活性强，馏分8(保留时间14分钟～16分钟)活性弱。
(3)将馏分4反复通过实施例2-(2)的反相HPLC，得到馏分4的干燥物。用DX302(日本电子公司生产)进行本试样的质量分析。另外，将本试样溶解在重二甲亚砜中，用JNM-A500(日本电子公司生产)进行核磁共振测定。
FAB-MS
m/z 117[M+H]+
但是，使用甘油作为基质进行测定。1H-NMRδ3.44(2H，m，5-H)，4.27(1H，m，4-H)，4.95(1H，t，5-OHのH)，5.32(1H，d，J＝5.0Hz，4-OHのH)，6.20(1H，ddd，J＝2.0，8.0，15.5Hz，2-H)，7.10(1H，dd，J＝4.0，15.5Hz，3-H)，9.55(1H，d，J＝8.0Hz，1-H)
但是，重二甲亚砜的残留质子的化学位移值为2.49ppm。
1H-NMR的信号归属序号如下式[III]所示。
结果发现本试样的物理参数与反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛一致，由此表明本试样为下式[III]表示的反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛。
本试样表现出强的细胞凋亡诱发活性以及癌细胞增殖抑制活性。
实施例3
(1)将4种100mM的脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)在121℃下加热4小时。按实施例1记载的MMT法测定各加热试样的细胞增殖抑制活性。
结果发现，在添加了dATP、dGTP的各加热处理物的16倍稀释液、以及dCTP、dTTP的各加热处理物的8倍稀释液的培养基中，与添加水的培养基相比，活细胞数目明显减少。另外，通过光学显微镜观察，在添加试样培养的细胞中，分别发现了细胞核聚集、细胞缩小、形成细胞凋亡体等。在对照的添加了10μl水的培养细胞中没有发现这些现象。
(2)配制5种脱氧核苷(脱氧腺核苷、脱氧鸟苷、脱氧胞啶、脱氧胸腺啶、脱氧尿啶)的水溶液，在121℃下加热4小时。但由于各自的溶解度不同，在水溶液中的浓度分别为脱氧腺核苷：25mM、脱氧鸟苷：25mM、脱氧胞啶：1M、脱氧胸腺啶：0.4M、脱氧尿啶：1M。
用实施例1记载的MTT法测定各加热试样的癌细胞增殖抑制活性。结果发现，在添加了脱氧腺核苷加热处理液的2倍稀释液(换算为1.25mM脱氧核苷)、脱氧鸟苷加热处理液的4倍稀释液(换算为0.625mM脱氧核苷)、脱氧胞啶加热处理液的128倍稀释液(换算为0.78mM脱氧核苷)、脱氧胸腺啶加热处理液的16倍稀释液(换算为2.5mM脱氧核苷)、脱氧尿啶加热处理液的64倍稀释液(换算为1.56mM脱氧核苷)的培养基中，与添加水的相比活细胞数显著减少。另外，通过光学显微镜观察，在添加试样培养的细胞中，分别发现了细胞核聚集、细胞缩小、形成细胞凋亡体等。在对照的添加了10μl水的培养细胞中没有发现这些现象。
(3)将实施例3-(2)配制的各加热处理物在下面条件下用HPLC进行分离。
柱：TSKgel ODS-80Ts(5μm)、(20mm×25cm：Tosoh公司生产)
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
      B：0.1％TFA/50％乙腈水溶液
流速：8ml/分
洗脱：流动相A100％(10分钟)→经40分钟从流动相A100％到流动相B100％→流动相B100％(10分钟)
检测：在215nm处测定吸光度
将实施例3-(2)配制的加热处理物各1.5ml分别通过HPLC，将每1分钟收集馏分浓缩干燥后再溶解于水，按实施例1的MTT法测定，发现所有加热溶液试样15～16分附近峰以及25～28分附近峰均具有细胞凋亡诱发活性。
(4)将实施例3-(3)得到的在15～16分附近出峰的物质，与实施例2-(3)分离、结构解析得到的反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛，在下述条件下用HPLC进行比较。
柱：TSKgel ODS-80Ts(5μm)、4.6×250mm
流动相A：0.1％TFA水溶液
      B：0.1％TFA/50％乙腈水溶液
流速：1ml/分
洗脱：流动相A100％(10分钟)→经10分钟从流动相A100％到流动相B100％→流动相B100％(10分钟)
检测：在215nm处测定吸光度
结果发现15～16分钟附近洗脱的活性物质与反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛的位置相同。
然后，用核磁共振1H-NMR对各加热物15～16分钟附近的活性物质进行构造解析。结果发现15～16分钟附近的活性物质与反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛的相同。
实施例4
(1)0.25mg/ml脱氧核糖核酸(DNA)钠盐(和光纯药公司生产、047-22491)的水溶液pH为8.9。取其中部分用1N的HCl调整pH为7.3。在121℃下加热4小时，在实施例1的方法测定对HL-60细胞的细胞增殖抑制活性。稀释倍数为2倍、4倍、8倍、16倍以及32倍。
结果发现，在添加了121℃下加热处理4小时的DNA钠盐水溶液(未调整pH)、DNA钠盐水溶液(pH7.3)的各8倍、16倍稀释液的区域与添加水的对照区域相比较，590nm处的吸光度减少，具有细胞增殖抑制活性。
(2)将在121℃下加热处理2小时的10W/V％的DNA钠盐水溶液，按1∶2与乙酸乙酯分配，乙酸乙酯萃取液减压馏去溶剂后，溶解在氯仿和甲醇比为9∶1的混和液中。
然后，将大约250cm3的柱色谱用硅胶(富士Silicia Kagaku公司生产、BW-300SP)用氯仿与甲醇为9∶1的混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，将上述溶解液用氯仿∶甲醇为9∶1的混和液在0.25Kgf/cm2的压力下色谱分离，每8ml作为一馏分。
将馏分馏去适量溶剂，用50％乙醇水溶液置换，按实施例1记载的MTT法测定癌细胞增殖抑制活性。其中，将试样用50％乙醇水溶液按2倍系列稀释，将各稀释液2μl或50％乙醇水溶液2μl分别注入平底96孔微量滴定板的池中。培养时间为16小时。
结果发现，添加了馏分65～81、或177进行培养的细胞，与添加50％乙醇水溶液的相比较，活细胞数明显减少。另外，通过光学显微镜观察，添加馏分65～81、或177培养的细胞中分别发现细胞核凝聚、细胞缩小、形成细胞凋亡体等现象。与此对照的添加了50％乙醇水溶液2μl的培养细胞中没有发现这些现象。
(3)将馏分65～81用薄层色谱法以及反相HLPLC法进行分析，按实施例1记载的MTT法测定癌细胞增殖抑制活性以及细胞凋亡体形成的情况，结果发现具有癌细胞增殖抑制活性以及细胞凋亡诱发活性。
薄层色谱法使用Silicagel 60F254(Merck公司生产、1.05554)，用氯仿与甲醇为9∶1的混和液展开，用苔黑酚硫酸显色试液进行检测。
反相HPLC使用TSKgel ODS-80Ts柱(4.6×250mm，Tosoh公司生产)，用水在0.8ml/分流速下洗脱5分钟后，用浓度梯度法洗脱20分钟至乙腈水溶液为80％，在206nm处测定吸光度。
上述馏分65～81的活性物质，与薄层色谱法中Rf值为0.42点的物质对应，与反相HPLC分析中保留时间8.8分钟峰的物质对应。
收集Rf值为0.42的点的物质，减压馏去溶剂。
另外，用HPLC精制活性成份。使用TSKgel ODS-80Ts柱(φ20×250mm，Tosoh公司生产)，用水以6.5ml/分的流速洗脱，检测206nm吸光度。收集每个峰的馏分，减压浓缩后，按上述的MTT法测定活性，将确认具有活性的峰溶解在重水或重二甲亚砜中，通过核磁共振分析。
结果如下所示。1H-NMRδ2.38(1H，dd，J＝2.0，19.0Hz，5-H)，2.98(1H，dd，J＝6.5，19.0Hz，5-H)，5.18(1H，m，4-H)，6.47(1H，dd，J＝1.5，6.0Hz，2-H)，7.94(1H，dd，J＝2.5，6.0Hz，3-H)，
但是，HOD的化学位移值为4.65ppm。
1H-NMR的信号归属序号如下式[IV]所示。
Figure C9980222900301
由上述可明确判断本物质为4-羟基-2-环戊烯-1-酮。
(4)对于馏分177，按实施例4-(3)同样通过薄层色谱法以及反相HPLC进行分析，按照实施例4-(2)记载的MTT法测定癌细胞增殖抑制活性以及细胞凋亡体的形成，结果确认了癌细胞增殖抑制活性以及细胞凋亡诱发活性。
上述馏分177的活性物质，与薄层色谱法中Rf值为0.37的点的物质对应，与反相HPLC分析中保留时间16.8分钟峰的物质对应。
收集Rf值为0.37的点的馏分177，减压馏去溶剂。
另外，用HPLC精制活性成份。使用TSKgel ODS-80Ts柱(φ20×250mm，Tosoh公司生产)，用水以6.5ml/分的流速洗脱，检测206nm吸光度。收集每个峰的馏分，减压浓缩后，按上述的MTT法测定活性，用DX302质量分析计(日本电子公司生产)进行确认具有活性的峰的质量分析。用间-硝基苄基醇为基质，按正离子方式测定。FAB-MSm/z 216〔M+H〕+
然后，用核磁共振测定。核磁共振装置使用JNM-A500(日本电子公司生产)，结果如下所示。1H-NMRδ2.71(1H，dd，J＝3.0，18.5Hz，5-H)，2.98(1H，dd，J＝7.5，18.5Hz，5-H)，5.89(1H，m，4-H)，6.50(1H，dd，J＝2.0，5.5Hz，2-H)，7.24(2H，br-s，6’-NH2のH)，7.85(1H，dd，J＝2.5，5.5Hz，3-H)，8.10(1H，s，2’-H)，8.14(1H，s，8’-H)
但是，试样溶解在重二甲亚砜中，重二甲亚砜的残留质子的化学位移值为2.49ppm。
1H-NMR的信号归属序号如下式[V]所示。
Figure C9980222900311
从上述可确认本物质为4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮。
图1是4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的质谱图。图中，横坐标表示m/z，纵坐标表示相对强度(％)。
图2是4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的1H-NMR图。图中，横坐标表示化学位移值(ppm)，纵坐标表示信号的强度。
(5)将10W/V％的DNA钠盐水溶液在121℃下加热处理2小时。该加热处理液与乙酸乙酯按1∶2分配，将得到的水相按1∶1与氯仿和甲醇为3∶1的混和液进行再分配，减压馏去有机溶剂相后，加入氯仿与甲醇为9∶1的混和液，除去残渣得到溶解液。
然后，将大约250cm3的硅胶柱色谱用硅胶(富士Silicia Kagaku公司生产、BW-300SP)用上述混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，在0.25Kgf/cm2的压力下将上述溶解液在用氯仿∶甲醇为9∶1的混和液、然后用6∶1的混和液色谱分离，每8ml作为一馏分。
将各馏分用氯仿∶甲醇为4∶1的混和液进行薄层色谱展开，用苔黑酚硫酸显色试液进行检测。馏分380～500检测出呈赤褐色的Rf值0.36的点。
收集馏分400～420，减压馏去溶剂后用乙醇置换，进行反相HPLC。
反相HPLC使用TSKgel ODS-80Ts柱(φ20×250mm，Tosoh公司生产)，用8％乙腈水溶液在6ml/分流速下洗脱5分钟后，按浓度梯度法洗脱30分钟至乙腈水溶液为40％，在206nm处测定吸光度，分馏洗脱时间为35分钟的峰。
将洗脱时间为35分钟的峰进行反相HPLC分析，以及HL-60细胞的MTT检定。
反相HPLC分析使用YMC-Pack ODS-AM柱(φ4.6×250mm，YMC公司生产)，在0.8ml/分的流速下，按浓度梯度法用20分钟使用从4％至24％的乙腈水溶液进行洗脱，检测210nm吸光度，检测洗脱时间为14分的峰。
在MTT检定中使用约13μg/ml的洗脱时间为35分钟的峰的干燥物，就可发现细胞变形以及细胞凋亡体的形成，确认癌细胞增殖抑制活性和细胞凋亡诱发活性。
对洗脱时间35分钟的峰进行质量分析以及溶解在重二甲亚砜中进行核磁共振分析。
质量分析使用DX302质量分析计。用甘油为基质，按正离子方式测定。FAB-MSm/z 232〔M+H〕+
核磁共振装置使用JNM-A500(日本电子公司生产)，将试样溶解在重二甲亚砜中，重二甲亚砜的残留质子的化学位移值为2.49ppm。1H-NMRσ2.61(1H，dd，J＝3.5，18.5Hz，5-H)，2.91(1H，dd，J＝7.0，18.5Hz，5-H)，5.65(1H，m，4-H)，6.42(2H，br-s，2’-NH2のH)，6.46(1H，dd，J＝2.0，6.0Hz，2-H)，7.65(1H，s，8’-H)，7.81(1H，dd，J＝2.5，6.0Hz，3-H)
信号归属序号如下式[VI]所示。
从上述可确认本物质为4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮。
图3是4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的质谱图。图中，横坐标表示m/z，纵坐标表示相对强度(％)。
图4是4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的1H-NMR图。图中，横坐标表示化学位移值(ppm)，纵坐标表示信号的强度。
实施例5
(1)将2M的D-核糖(Nacalai Tesque公司生产、302-10)水溶液在121℃下加热处理4小时。将该加热处理液减压浓缩后与乙酸乙酯按1∶2分配，在乙酸乙酯中萃取，减压馏去乙酸乙酯后，溶解在氯仿与甲醇为9∶1的混和液中。
将大约250cm3的柱色谱用硅胶(富士Silicia Kagaku公司生产、BW-300SP)用氯仿与甲醇为9∶1的混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，将上述溶解液用氯仿∶甲醇为9∶1的混和液在0.2Kgf/cm2的压力下色谱分离，每8ml作为一馏分。将馏分馏去适量的溶剂，用50％乙醇水溶液置换后，按实施例4-(2)记载的MTT法测定细胞增殖抑制活性。
结果发现，添加了馏分28～36进行培养的细胞，与添加50％乙醇水溶液的相比较，活细胞数明显减少。另外，通过光学显微镜观察，添加馏分28～36培养的细胞中分别发现细胞核凝聚、细胞缩小、形成细胞凋亡体等现象。与此对照的添加了50％乙醇水溶液2μl的培养细胞中没有发现这些现象。
(2)对于馏分28～36，按实施例4-(3)同样通过薄层色谱法以及反相HPLC进行分析，按照实施例4-(2)记载的MTT法测定癌细胞增殖抑制活性以及细胞凋亡体的形成，结果确认了癌细胞增殖抑制活性以及细胞凋亡诱发活性。
上述馏分28～36的活性物质，与薄层色谱法中Rf值为0.44的点的物质对应，与反相HPLC分析中保留时间9.7分钟峰的物质对应。
收集主要含Rf值0.44的点的馏分28～36，减压浓缩，用反相HPLC分析，检测保留时间为9.7分钟的信号峰。
将该馏分用DX302质量分析计进行质量分析。以硫代甘油为基质，按正离子方式测定。FAB-MSm/z 115〔M+H〕+
97〔M-H2O+H〕+
79〔M-2H2O+H〕+
然后，测定核磁共振谱。核磁共振使用JNM-A500装置，结果如下所示。1H-NMRδ4.27(1H，ddd，J＝2.0，4.0，19.5Hz，5-H)，4.51(1H，td，J＝2.5，19.5Hz，5-H)，4.93(1H，d，J＝6.0Hz，1-H)，6.02(1H，m，3-H)，7.23(1H，ddd，J＝2.5，4.0，10.0Hz，4-H)，7.26(1H，d，J＝6.0Hz，1-OHのH)
但将试样溶解在重二甲亚砜中，重二甲亚砜的残留质子的化学位移值为2.49ppm。
1H-NMR的信号归属序号如下式[VII]所示。
从上述可确认本物质为1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮。
图5是1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮的质谱图。图中，横坐标表示m/z，纵坐标表示相对强度(％)。
图6是1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮的1H-NMR图。图中，横坐标表示化学位移值(ppm)，纵坐标表示信号的强度。
实施例6
(1)将2M的2-脱氧-D-核糖(Sigma公司生产、D2851)水溶液在121℃下加热处理4小时。将该加热处理液5ml减压干燥后溶解在氯仿与甲醇为98∶2的混和液中。
将大约250cm3的柱色谱用硅胶(富士Silicia Kagaku公司生产、BW-300SP)用上述混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，将上述溶解液用氯仿∶甲醇为98∶2的混和液在0.2Kgf/cm2的压力下色谱分离，每8ml作为一馏分。
将馏分馏去溶剂，用50％乙醇水溶液置换后，用于薄层色谱法、反相HPLC分析以及人前骨髓性白血病细胞HL-60细胞的MTT测定。
薄层色谱法使用Silicagel 60F254(Merck公司生产、1.05554)，用氯仿与甲醇为9∶1的混和液展开，用苔黑酚硫酸显色试液进行检测。反相HPLC分析使用TSKgel ODS-80Ts柱(4.6×250mm，Tosoh公司生产)，用水在0.8ml/分流速下洗脱5分钟后，用浓度梯度法洗脱20分钟至乙腈水溶液为80％，在206nm处测定吸光度。
MTT分析按照实施例4-(2)记载的方法进行。
通过MTT分析，发现馏分48以及88具有强的细胞增殖抑制活性。馏分48在薄层色谱法中为Rf值0.52的点，反相HPLC分析中在保留时间9.1分钟的峰被检出。馏分88在薄层色谱法中为Rf值0.35的点，反相HPLC分析中在保留时间9.1分钟的峰被检出。
通过对这些馏分的质量分析以及溶解在重二甲亚砜中进行的核磁共振分析，表明馏分48为4-羟基-2-环戊烯-1-酮，馏分88为反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛。
(2)将实施例6-(1)调制的反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛的乙醇溶液，在-40℃的冷冻机中静置保存，产生白色固体物质。
用滤纸过滤该固体物质，用冷乙醇洗涤，得到乙醇溶液和固体物质。
将乙醇溶液用硅胶柱再次进行色谱法。即，将大约250cm3的柱色谱用硅胶(富士Silicia Kagaku公司生产、BW-300SP)用氯仿∶甲醇为98∶2的混和液平衡后，用上述混和液在0.2Kgf/cm2的压力下色谱分离，每8ml作为一馏分。
反式-4，5-二羟基-2-戊烯醛在馏分90至126中洗脱，副产物在馏分67到76中洗脱。
反相HPLC分析使用YMC-Pack ODS-AM柱(φ4.6×250mm，YMC公司生产)，用水在0.8ml/分流速下洗脱5分钟后，用浓度梯度法洗脱20分钟至乙腈水溶液为80％，在210nm处测定吸光度。
固体物质在洗脱时间18分钟的单峰中被检出，副产物在洗脱时间18分钟的主峰中被检出。
MTT分析在固体物质、副产物中均发现细胞变形以及细胞凋亡体形成，确认分别具有细胞凋亡抑制活性、细胞凋亡诱导活性。
对固体物质进行质量分析，并溶解在重二甲亚砜中进行核磁共振分析。
质量分析使用DX302质量分析计。以甘油为基质，按正离子方式测定。FAB-MSm/z 215〔M+H〕+
237〔M+Na〕+
然后，测定核磁共振谱。核磁共振使用NM-A500装置，将试样溶解在重二甲亚砜中，重二甲亚砜的残留质子的化学位移值为2.49ppm。1H-NMRσ3.30(2H，m，1-H)，3.80(1H，dd，J＝5.0，8.5Hz，7-H)，4.01(1H，m，2-H)，4.05(1H，t，J＝8.5Hz，7-H)，4.66(1H，t，J＝6.0Hz，1-OHのH)，4.84(1H，m，6-H)，4.96(1H，d，J＝5.0Hz，2-OHのH)，5.31(1H，d，J＝6.5Hz，5-H)，5.66(1H，ddd，J＝1.5，6.5，15.5Hz，4-H)，6.01(1H，dd，J＝4.5，15.5Hz，3-H)，6.21(1H，ddd，J＝1.5，8.0，15.5Hz，9-H)，7.03(1H，dd，J＝5.5，15.5Hz，8-H)，9.57(1H，d，J＝8.0Hz，10-H)
信号归属序号如下式[VIII]所示。
Figure C9980222900381
从上述可确认本物质为2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环。
图7是2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环的质谱图。图中，横坐标表示m/z，纵坐标表示相对强度(％)。
图8是2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环的1H-NMR图。图中，横坐标表示化学位移值(ppm)，纵坐标表示信号的强度。
(3)调制实施例6-(1)记载的加热处理物的浓缩物，将该浓缩物进行硅胶柱色谱。即将大约250cm3的柱色谱用硅胶(富士SiliciaKagaku公司生产、BW-300SP)用氯仿∶甲醇为98∶2的混和液平衡后，用上述混和液在0.2Kgf/cm2的压力下色谱分离，每8ml作为一馏分。
分馏67～76的馏分，浓缩后用YMC-Pack ODS-AM柱(φ4.6×250mm，YMC公司生产)，用水在0.8ml/分流速下洗脱5分钟后，用浓度梯度法洗脱20分钟至乙腈水溶液为80％，在210nm处测定吸光度，分馏洗脱时间18分钟的单峰，得到2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环。
实施例7
(1)将10g的D-葡糖醛酸(Sigma公司生产G 5269)溶解在1升的水中，在121℃下加热4小时后减压浓缩至10ml。在其中加入乙酸丁酯∶乙酸∶水＝3∶2∶2混和液的上层溶液40ml，混和后离心，将得到的上清液减压浓缩至10ml。
将上述萃取液作用于硅胶BW-300SP(2×28cm、富士Silicia化学公司生产)进行柱色谱法，用乙酸丁酯∶乙酸∶水＝3∶2∶2的上层溶液作为洗脱液，以5ml/分的流速在压缩机作用的0.2kg/cm2压力下洗脱。分馏以每10ml作为一个馏分，取各馏分的一部分进行薄层色谱分析，发现从馏分61至馏分80中含有高纯度的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。收集这些馏分减压下浓缩，用40ml的氯仿萃取，减压浓缩萃取液得到100mg下式[IX]表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
Figure C9980222900391
(2)实施例7-(1)得到的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的物理性质如下所示。4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的质量分析使用DX302质量分析计(日本电子公司生产)。另外，NMR谱的测定使用重氯仿溶剂，JNM-A500(日本电子公司生产)。比旋光度、UV吸收光谱、红外吸收光谱分别使用DIP-370型旋光计(日本分光公司生产)、UV-2500分光光度计(岛津制作所公司生产)、FTIR-8000红外分光光度计(岛津制作所生产)。FAB-MS m/z 115〔M+H〕+
使用甘油作为基质。1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)
但1H-NMR的化学位移值以CHCl3的化学位移值7.26ppm表示。旋光度：〔α〕D 20 0°( c1.3、水)IR(KBr法)：3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1有吸收UV：λmax 215nm(水)
该馏分使用Palpack S柱进行正相HPLC分离，用215nm的紫外线吸收检测，纯度为98％。
(3)取2M D-核糖(Nakalai Tesque公司生产、302-10)水溶液或2M D-(+)-木糖(Nakalai Tesque公司生产、367-19)水溶液，分别在121℃下加热14小时。在90μl的加热处理液中加入1M苯硫酚(Nakalai Tesque公司生产、338-01)乙醇溶液10μl，在37℃下反应30分钟。将加热处理液以及加热处理液的苯硫酚反应物通过下面的反相HPLC进行分析。
柱：YMC-Pack ODS-AM、(4.6×250mm：YMC公司生产)
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
      B：0.1％TFA/80％乙腈水溶液
流速：0.8ml/分
洗脱：流动相A(5分钟)→流动相A到流动相B的直线浓度梯度(20分钟)→流动相B(5分钟)
检测：在215nm处测定吸光度
试样注入量：10μl
对加热处理液进行分析，结果发现核糖与木糖都有保留时间6.5分钟的峰。这与实施例7-(1)得到的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的保留时间一致。
对加热处理液的苯硫酚反应物分析，结果发现核糖与木糖的保留时间6.5分钟的峰均消失，新出现保留时间19.6分钟的峰。新出现的峰与实施例7-(1)得到的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮与苯硫酚反应时生成的峰一致。
由上述可知，将核糖或木糖加热，可以生成4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
(4)将0.1M、0.2M、0.5M、1M或2M的D-核糖或D-(+)-木糖水溶液分别在121℃下加热14小时。按实施例7-(2)同样进行反相HPLC分析，测定保留时间6.5分钟的峰高，测定4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的生成量。其结果如图9所示。即，图9为戊糖浓度与4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮生成量的关系图，横轴表示戊糖浓度(M)，纵轴表示4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮生成量(mM)。另外，图9中黑色圆圈表示D-核糖加热处理物中4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的生成量，黑三角形表示D-(+)-木糖加热处理物中4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的生成量。
实施例8
(1)将50mg的核糖-5-磷酸钠(Nakalai Tesque公司生产、302-12)溶解在5ml水中，用HCl调制pH为3，在121℃下加热4小时。将上述的加热物用下面的反相HPLC进行分析。
柱：TSK gel ODS-80Ts、(4.6mm×250mm：Tosoh公司生产)
流动相：TFA水溶液
流速：1ml/分
检测：在215nm处测定吸光度
试样注入量：20μl
结果发现保留时间4.7分钟的峰，与实施例7-(1)得到的精制4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的保留时间一致。另外，从表示用该精制4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮得到的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮与峰面积间关系的标准曲线，可以计算出本加热物中的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的浓度为6.3μg/ml。
与上述方法相同，取本加热物200μl进行HPLC，分馏保留时间3.8～5.8分钟的馏分。反复进行同样操作2次，将分馏的馏分减压浓缩，得到干燥固体。在其中加入N，O-双(三甲基甲硅烷基)-乙酰胺(Nakalai Tesque公司生产)∶三甲基氯硅烷(G.L.Science生产)∶吡啶(Pierce公司生产)＝4∶1∶1的混和液进行三甲基硅烷化，用DX-302质量分析计(日本电子公司生产)进行气相色谱/质量分析，得到的构造解析结果表明，与实施例7-(1)得到的精制4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮具有相同保留时间的峰的质谱，与该精制4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮一致。
由此，确认生成了4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
(2)将30mg的核糖-5-磷酸钠溶解在3ml水中，用1N HCl调节pH为2.5。本试样中含有的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的量可通过下面的凝胶过滤HPLC进行测定。
柱：TSK gel G2500PW(XL)(7.8×300mm：Tosoh公司生产)
柱温：40℃
流动相：水
流速：1ml/分
检测：在215nm处测定吸光度
结果发现保留时间11.4分钟的峰，与实施例7-(1)得到的精制4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的保留时间一致。另外，从表示用该精制4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮得到的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮与峰面积间关系的标准曲线，可以计算出本加热物中的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的浓度为8.9μg/ml。
所以，通过将核糖-5-磷酸钠加热，可以生成4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
实施例9
将2M D-核糖水溶液在121℃下加热处理4小时。将该加热处理液减压浓缩后乙酸乙酯按1∶2分配，用乙酸乙酯萃取，减压馏去乙酸乙酯后，溶解在氯仿与甲醇为9∶1的混和液中。
将大约250cm3的柱色谱用硅胶(富士Silicia Kagaku公司生产、BW-300SP)用上述混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，将上述溶解液用氯仿∶甲醇为9∶1的混和液在0.2Kgf/cm2的压力下色谱分离，每8ml作为一馏分。将馏分馏去适量溶剂，用于薄层色谱法，收集馏分38至57，其中含有Rf值0.5的点，馏去溶剂后用50％乙醇水溶液置换。
薄层色谱法使用Silicagel 60F254，用氯仿与甲醇为9∶1的混和液展开，用苔黑酚硫酸显色试液进行检测。然后，通过反相HPLC进行活性物质的精制。分馏使用TSKgel ODS-80Ts柱(4.6×250mm)，用水在6.5ml/分流速下洗脱10分钟后，用浓度梯度法洗脱15分钟至乙腈水溶液为60％，在206nm处测定吸光度。分馏洗脱时间为15分的峰。
将洗脱时间为15分的峰按实施例4-(2)记载的MTT法测定细胞增殖抑制活性以及细胞凋亡诱发活性，发现细胞变形以及阻碍甲形成，确认细胞增殖阻碍活性以及细胞凋亡诱发活性。
将洗脱时间15分的峰进行反相HPLC分析。分析使用TSKgelODS-80Ts柱(4.6×250mm)，用水在0.8ml/分流速下洗脱5分钟后，用浓度梯度法洗脱20分钟至乙腈水溶液为80％，在206nm处测定吸光度。在该分馏中，洗脱时间15分钟的峰在洗脱时间5.7分钟被洗脱出，与实施例7-(1)记载的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的洗脱时间一致。另外，将洗脱时间为15分钟的峰的馏分溶解在重二甲亚砜中，通过核磁共振分析，确认为4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的图谱。
实施例10
将4-环戊烯-1，3-二酮(Aldrich公司，编码16，168-3)10g以及氯化铈(III).7H2O(Nacalai Tesque公司，编码077-20)1.94g(5.2mmol)溶解在25ml水中。在冰浴搅拌下，边搅拌边缓慢添加NaBH4(Nacalai Tesque公司，编码312-29)198mg(5.2mmol)，添加结束后用1N的HCl调制pH在中性以下。
用CHCl3∶MeOH＝9∶1的展开液将反应液在TLC展开，苔黑酚硫酸检测，在Rf值0.5附近检测出红色点。将该中和反应液减压浓缩至糖浆状，用100ml的CHCl3∶MeOH＝40∶l的溶液萃取该糖浆，萃取液用硅胶过滤。滤液减压浓缩后，用80g的中压硅胶柱色谱法(CHCl3∶MeOH＝40∶1)精制，得到淡黄色的油状的高纯度4-羟基-2-环戊烯-1-酮236mg(收率23％)，通过核磁共振进行确认。
实施例11
将含有50mM 4-羟基-2-环戊烯-1-酮以及100mM L-谷胱甘肽的200mM磷酸缓冲液(pH7)2ml，在37℃下加热1小时作为试样，用反向HPLC色谱法分馏峰。使用的柱子为TSKgel ODS-80Ts(φ20×250mm，Tosoh公司生产)，用蒸馏水在6.5ml/分下洗脱，206nm出检测吸光度。分馏峰后，减压浓缩，用于实施例1记载的人前骨髓性白血病细胞HL-60细胞的MTT检测。
通过MTT检测，发现洗脱时间14.4分的峰1以及洗脱时间16.6分钟的峰3具有细胞增殖抑制活性并形成细胞凋亡体。将确认具有活性的两个峰物质用相同的柱子再次进行色谱精制。
对确认具有活性的两个峰进行质量分析以及核磁共振分析。
质量分析使用DX302质量分析计(日本电子公司)，将甘油作为基质，按正离子方式测定。
峰1的FAB-MS；m/z 406[M+H]+
峰3的FAB-MS；m/z 406[M+H]+
                 428[M+Na]+
核磁共振装置为JNM-A500(日本电子公司)，溶解在重水中测定。HOD的化学位移值为4.65ppm时1H-NMR的化学位移值如下所示。
峰1；σ2.13(2H，m，5’-H)、2.29(1H，m，2-H)、2.45(1H，m，5-H)、2.50(2H，m，4’-H)、2.65(1H，m，5-H)、2.69(1H，m，2-H)、2.90～3.00(1H，m，1’-H)、3.10～3.18(1H，m，1’-H)、3.61(1H，m，3-H)、3.76(1H，m，6’-H)、3.89(2H，s，9’-H)、4.50～4.62(2H，m，4-H，2’-H)
峰3；σ2.10(2H，m，5’-H)、2.27(1H，m，2-H)、2.29(1H，m，5-H)、2.48(2H，m，4’-H)、2.76～2.84(1H，m，5-H)、2.84～2.92(1H，m，2-H)、2.93～3.02(1H，m，1’-H)、3.09～3.21(1H，m，1’-H)、3.40(1H，m，3-H)、3.73(1H，m，6’-H)、3.86(2H，s，9’-H)、4.31～4.40(1H，m，4-H)、4.59(1H，m，2’-H)
峰1以及峰3的信号归属如下式[X]所示。
峰1为3R、4S体与3S、4R体的非对映异构体混合物、峰3为3R、4R体与3S、4S体的非对映异构体混合物。
由此可知，本试样峰1的3位和4位为顺式的顺-3-L-谷胱甘肽-s-基-4-羟基-2-环戊烯-1-酮，峰3的3位和4位为反式的反-3-L-谷胱甘肽-s-基-4-羟基-2-环戊烯-1-酮。
图10为峰1的质谱图。图中，横轴表示m/z，纵轴表示相对强度(％)。
图11为峰3的质谱图。图中，横轴表示m/z，纵轴表示相对强度(％)。
图12为峰1的1H-NMR谱。图中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。
图13为峰3的1H-NMR谱。图中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。
实施例12
(1)将用含10％胎牛血清(56℃下经30分钟处理)的RPMI1640培养基(BioWhittaker公司生产)在37℃下培养的HL-60(ATCCCCL-240)在RPMI1640培养基上混悬成2.5×105个/5ml。
该混悬液每5ml中，分别添加10μl的实施例6-(1)配制的4，5-二羟基-2-戊烯醛的12.5mM、25mM、50mM或100mM的70％乙醇水溶液、实施例6-(1)配制的4-羟基-2-环戊烯-1-酮的0.05mM、0.5mM、5mM或50mM的70％乙醇水溶液、实施例4-(4)配制的4-(9-adenynl)-2-环戊烯-1-酮的5mM、10mM或20mM的70％乙醇水溶液、实施例4-(5)配制的4-(9-guanynl)-2-环戊烯-1-酮的2.5mM、5mM、15mM或25mM的70％乙醇水溶液、实施例5-(2)配制的1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮的75mM、150mM或300mM的70％乙醇水溶液、或实施例6-(2)配制的2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧戊烷的5mM、25mM或50mM的70％乙醇水溶液，在37℃、5％二氧化碳存在下培养24小时。
用光学显微镜观察培养细胞，发现在添加了最终浓度为1μM以上的4，5-二羟基-2-戊烯醛、最终浓度为10μM以上的4-羟基-2-环戊烯-1-酮、最终浓度为10μM以上的4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、最终浓度为39μM以上的4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、最终浓度为625μM以上的1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、最终浓度为80μM以上的2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环进行培养的细胞中分别出现细胞核凝集、细胞缩小、细胞凋亡体形成等。在作为对照的添加了70％乙醇溶液10ml的培养细胞中没有发现这些现象。
(2)将用含10％胎牛血清(56℃下经30分钟处理)的RPMI1640培养基在37℃下培养的HL-60在RPMI1640培养基上混悬成2.5×105个/5ml。
该混悬液每5ml，分别添加10μl的4，5-二羟基-2-戊烯醛的12.5mM、25mM、50mM或100mM的70％乙醇水溶液、4-羟基-2-环戊烯-1-酮的0.05mM、0.5mM、5mM或50mM的70％乙醇水溶液、实施例4-(4)配制的4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的5mM、10mM或20mM的70％乙醇水溶液、实施例4-(5)配制的4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮的2.5mM、5mM、15mM或25mM的70％乙醇水溶液、实施例5-(2)配制的1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮的75mM、150mM或300mM的70％乙醇水溶液、或实施例6-(2)配制的2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环的5mM、25mM或50mM的70％乙醇水溶液，在37℃、5％二氧化碳存在下培养24小时和48小时。取这些细胞，按1994年秀润社发行的细胞工学别册实验”ExperimentalProtocol Series-Apoptosis Experiment Protocol”，第129～130页记载的方法，用FACScan进行细胞凋亡细胞的测定，按1995年羊土社发行的”Biomanual Up Series-New  Experimental Methods forApoptosis”第61～63页记载的方法进行DNA片断的解析。
在添加了最终浓度为50μM以上的4，5-二羟基-2-戊烯醛、最终浓度为10μM以上的4-羟基-2-环戊烯-1-酮、最终浓度为10μM以上的4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、最终浓度为20μM以上的4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、最终浓度为600μM以上的1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、最终浓度为50μM以上的2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环进行培养的细胞中发现了细胞凋亡细胞形成。在添加了最终浓度50、100、200μM的4，5-二羟基-2-戊烯醛、最终浓度为10μM以上的4-羟基-2-环戊烯-1-酮、最终浓度为10、30μM以上的4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮进行培养的细胞中，发现了DNA片断。另外，在作为对照的添加了70％乙醇溶液10μl的培养细胞中没有发现这些现象。
(3)按实施例9-(2)同样的方法，将培养24小时的细胞部分取样，用0.4％锥虫蓝染色后，用光学显微镜观察，测定未被染色的活细胞数以及被染成蓝色的死细胞数目，求出生存率为50％的各样品的浓度(生存率50)，如表1所示。
表1物质名称                                                生存率50(μm)4，5-二羟基-2-戊烯醛                                    1244-羟基-2-环戊烯-1-酮                                    25.54-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮                            22.44-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮                            67.91，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮                            4382-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反74.4式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环
实施例13
(1)在2μl拓扑异构酶II[Topogen公司生产、2单位/μl]、2μl的10倍浓度缓冲液[0.5M Tris-HCl(pH8.0)、1.2M KCl、0.1M MgCl2、5mM三磷酸腺苷、5mM二硫苏糖醇]、2μl的0.1％牛血清白蛋白(宝酒造社生产)、11μl蒸馏水以及2μl的对照蒸馏水或用水配制的各种浓度的4，5-二羟基-2-戊烯醛、或4-羟基-2-环戊烯-1-酮的混合液中，添加0.25μg/μl pBR322 DNA(宝酒造社生产)1μl，在37℃下反应。反应30分钟后，添加1％十二烷基硫酸钠、50％甘油、0.02％溴酚蓝水溶液2μl，使反应停止。
在琼脂糖L03(宝酒造社生产)与TAE缓冲液[40mM Tris、5mM乙酸钠、1mM乙二胺四醋酸(EDTA)二钠、用乙酸调整pH7.8]制成的1％琼脂糖凝胶中，加入上述反应液20μl，在TAE缓冲液中电泳。电泳后，将凝胶在1μg/ml的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁水溶液中浸润，紫外线照射观察DNA电泳模式。另外，在添加水的对照中，DNA由超螺旋型至弛缓型发生完全变化，阻碍拓扑异构酶II活性，则超螺旋型至弛缓型的变化部分或完全被阻碍。
结果发现，在添加水的对照中，DNA从超螺旋型至弛缓型发生完全变化，通过添加100μM以上的4，5-二羟基-2-戊烯醛、或4-羟基-2-环戊烯-1-酮，使得DNA超螺旋型至弛缓型的变化部分或完全被阻碍，确认了各化合物的拓扑异构酶II阻碍活性。
(2)按实施例13-(1)同样的方法，测定各化合物的拓扑异构酶I阻碍活性。但用拓扑异构酶I[Topogen公司生产、0.01单位/μl]代替拓扑异构酶II，10倍浓度的缓冲液为100mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM EDTA二钠、1mM精脒、50％甘油。
结果发现各化合物对拓扑异构酶I没有阻碍活性。
如上所述，各化合物对拓扑异构酶II仅在正常细胞分裂期发生瞬间效果，但对癌变细胞整个周期均高度有效。另外，本发明的其他化合物也具有同样的阻碍活性。
实施例14
5％CO2存在下，37℃下将人细胞株Hs68细胞(ATCC CRL-1635)在含有10％胎牛血清(FBS：BioWhittaker)的D-MEM培养基(Gibco BRL)中培养至培养器饱和，用胰蛋白酶-EDTA溶液(BioWhittaker)在上述培养基中混悬使得细胞为3×105个/ml，分别取200μl注入96孔微量滴定板的池中。培养5天后，当细胞几乎在培养器中饱和时清除培养基，加入含有5、10、20、40、100或200μM的4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮的培养基。取96小时作为一个时间段，每24小时回收培养的上清液，用hIGF-1的ELISA-kit(DiagnosticSystem Labo.)来测定4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮对Hs68细胞的hIGF-1产生诱导活性的影响。
结果对Hs68细胞来说，添加100μM以上的4，5-二羟基-2-戊烯醛、或4-羟基-2-环戊烯-1-酮时，hIGF产生诱导活性在第24小时最大，然后经时减少。另外，与4，5-二羟基-2-戊烯醛相比，4-羟基-2-环戊烯-1-酮的hIGF-1诱导活性强。
结果如表2和表3所示。
表24-羟基-2-环戊                                    培养时间烯-1-酮              24小时              48小时           72小时         96小时浓度(μM)                             hIGF-1产生诱导活性(ng/ml)0                    0                   0                 0             040                   0                   0                 0             0100                  39.9                10.0              9.6           4.4200                  37.9                10.4              9.9           4.2表34，5-二羟基-2-                                     培养时间戊烯                24小时               48小时            72小时        96小时浓度(μM)                       hIGF-1产生诱导活性(ng/ml)0                   0                    0                 0             040                  0                    0                 0             0100                 15.3                 10.0              5.2           4.6200                 11.3                 11.1              9.9           4.5
以上显示了4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮的hIGF-1产生诱导活性。另外，本发明的其他物质也具有相同的活性。
实施例15
(1)将从组织性淋巴瘤患者的胸水中得到的滑膜细胞株U937细胞(ATCC CRL-1593)在含有10％FBS的RPMI1640培养基上混悬成5×105个/ml，在96孔微量滴定板的池中各注入100μl。然后，加入上述培养基100μl，再加入4，5-二羟基-2-戊烯醛或4-羟基-2-环戊烯-1-酮使之浓度为50、75、100、150或200μM。在37℃下二氧化碳中培养，24、48、72小时后，加入10μl的Premix WST-1(MK 400，TakaraShuzo生产)，37℃下反应3小时，将450nm的吸光度(A450)至650nm的吸光度(A650)的差值(A450-650)作为细胞增殖度。
结果如表4和表5所示。
表44-羟基-2-环戊烯-1-酮                               培养时间
                     24小时                48小时            72小时浓度(μM)                                    细胞增殖度(A450-650)0                        0.940                 3.912             1.82950                       0.501                 0.930             0.87575                       0.557                 0.968             0.821100                      0.591                 1.054             0.532150                      0.524                 1.126             0.478200                      0.353                 0.643             0.338
表54，5-二羟基-2-戊烯醛                                      培养时间
                    24小时                 48小时             72小时浓度(μM)                                   细胞增殖度(A450-650)0                       0.940                  3.912              1.82950                      0.821                  1.471              1.24575                      0.606                  0.879              0.862100                     0.560                  0.948              0.597150                     0.505                  0.823              0.465200                     0.370                  0.644              0.753
以上显示了4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮对滑膜细胞的增殖抑制活性。另外，本发明的其他物质也具有相同的活性。
(2)5％CO2存在下，37℃下将从人慢性风湿患者的滑膜得到的织维芽细胞株DSEK细胞(体外试验中作为风湿模型，琦玉医科大学综合医疗中心第二内科保存)在含有10％FBS(BioWhittaker)的Iscov-MEM培养基(IMDM：Gibco BRL)中培养至培养器饱和，用胰蛋白酶-EDTA溶液(BioWhittaker)在上述培养基中混悬使得细胞为3×104个/ml，分别取200μl注入96孔微量滴定板(FALCON公司生产)的池中。培养5～7天后，当细胞在培养器中达到80％饱和时更换培养基，加入含有50、75、100、150μM的4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮的上述培养基。
取96小时作为一个时间段，每24小时加入10μl的Premix WST-1(MK 400，Takara Shuzo生产)，37℃下反应3.5小时，将450nm的吸光度(A450)至650nm的吸光度(A650)的差值(A450-650)作为细胞增殖度。
结果如表6和表7所示。
表64-羟基-2-环戊                                     培养时间烯-1-酮                   24小时               48小时             72小时         96小时浓度(μM)                                      细胞增殖度(A450-650)0                         1.04                  1.25              1.46           2.3550                        0.57                  0.71              0.73           0.5475                        0.51                  0.68              0.68           0.55100                       0.50                  0.64              0.67           0.51150                       0.46                  0.55              0.63           0.50
表74，5-二羟基-2-                             培养时间戊烯醛                  24小时           48小时           72小时         96小时浓度(μM)                                细胞增殖度(A450-650)0                       1.04             1.25             1.46           2.3350                      1.12             0.83             0.96           0.9875                      1.11             0.77             0.67           0.59100                     1.02             0.63             0.54           0.59150                     0.96             0.61             0.41           0.55
通过A450-650的数值求得的半数细胞增殖抑制浓度-IC50如表8所示。
表8IC50                   4-羟基-2-环戊烯-1-4，5-二羟基-2-戊烯醛
                    48小时       96小时        48小时        96小时浓度(μM)               60           35            165           75
(3)在实施例15-(2)记载的条件下调整DSEK细胞，加入含有25、50、75、100、200或400μM的4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环的培养基20μl。
取72小时作为一个时间段，每24小时测定细胞增殖度。另外，求出各化合物的IC50。
结果如表9所示。
表9物质名                                             IC50(μM)
                                        24小时             72小时4-羟基-2-环戊烯-1-酮                        207                604，5-二羟基-2-戊烯醛                        232                1194-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮                132                672-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-      267                682-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环
未添加试样的对照品在第24小时、第72小时的增殖度分别为3.95、3.97。
以上，在体外试验风湿模型的DSEK细胞中，添加了4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环，与添加PBS的对照区域相比，添加各化合物的区域内风湿细胞的增殖受到强烈抑制。另外通过经时观察，发现这些化合物的增殖抑制活性不仅持续存在，而且随时间变化增强的趋势。
根据以上结果，发现4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环具有强的抗风湿活性，并期待开发出对治疗慢性风湿有用的治疗药品以及健康食品。另外，本发明的其他化合物也具有同样的抗风湿活性。
在DSEK细胞培养时，每24小时经时回收150μl/池的培养上清液，分别使用对细胞素具有特异性的ELISA-kit(人FGF-β和人IL-10、INTERGEN公司生产、人TGF-β和人IL-1α、Promega公司生产)，来测定4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮对细胞产生的细胞素(人TGF-β、人FGF-β、人IL-1α、人IL-10)的影响。
结果发现，4-羟基-2-环戊烯-1-酮抑制人FGF-β和人IL-1α的产生。4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮抑制人TGF-β和人FGF-β的产生，但使人IL-1α活化。2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环使人IL-1α活化。4，5-二羟基-2-戊烯醛使人IL-1 α和人IL-10活化。
实施例16
将从肝胚细胞瘤患者的原发性肝芽细胞瘤中得到的细胞株HepG2细胞(ATCC HB-8065)在含有10％FBS(Bio Whittaker)的DMEM(Gibco)培养基上混悬成3.8×103个/ml，在96孔微量滴定板的池中各注入200μl，5％CO2存在下，37℃下培养至培养器饱和。交换培养基后，加入4，5-二羟基-2-戊烯醛或4-羟基-2-环戊烯-1-酮，使浓度分别为25、50、100或150μM，培养24、48、72小时后，加入10μl的Premix WST-1(MK 400，Takara Shuzo生产)，37℃下反应3小时，将450nm的吸光度(A450)至650nm的吸光度(A650)的差值(A450-650)作为细胞增殖度。
结果如表10和表11所示
表104-羟基-2-环戊烯-1-酮                             培养时间
                                 24小时        48小时         72小时浓度(μM)                                    细胞增殖度(A450-650)0                                   3.47           2.96           2.5725                                  1.30           0.70           0.4950                                  1.38           0.81           0.47100                                 1.31           0.56           0.35150                                 1.23           0.43           0.30
表114，5-二羟基-2-戊烯醛                           培养时间
                             24小时         48小时         72小时浓度(μM)                                  细胞增殖度(A450-650)0                                3.47           2.96           2.5725                               3.39           2.69           1.7050                               1.97           2.96           1.70100                              1.81           2.70           0.89150                              1.40           0.79           0.35
由此表明，4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮对人肝胚细胞瘤的HepG2细胞具有癌细胞增殖抑制活性。另外，本发明的其他化合物也具有相同的活性。
实施例17
将RAW264.7细胞(ATCC TIB 71)在含有10％胎牛血清(Gibco)、不含酚红、含有2mM L-谷氨酸(Lifetech Oriental生产、25030-149)的、由Dulbecco(BioWhittaker、12-917F)改良的Eagle培养基上混悬至3×105个/ml，在48孔微量滴定板的池中各注入500μl，5％CO2存在下，37℃下培养12小时。在池中，加入10μl的50μg/ml脂聚糖(LPS、Sigma制、L-2012)或2.5μg/mlLPS与500单位/ml干扰素γ(Genzyme：MG-IFN)各10μl，再加入10μl的1000、500或250μM的2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环水溶液，培养18小时后，根据在培养基中氧化的NO测定生成的NO2 -的浓度。作为对照，设定不添加LPS和干扰素γ的区域，以及不添加2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环的区域。
上述培养后，在100μl的培养基中加入100μl的4％Griess试剂(Sigma，G4410)，在室温下放置15分钟后，490nm处测定吸光度。通过上述培养基中溶解的已知浓度的NaNO2制作的检量线，计算培养基中NO2 -的浓度。所有测定都进行3次。
结果2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环根据浓度不同可以抑制LPS产生NO，也可以抑制LPS和干扰素γ产生NO。
结果如图14所示。即，图14为添加2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环在各培养条件下培养时，培养基中NO2 -的浓度。图14中横轴为培养条件，纵轴为NO2 -的浓度(μM)。另外图中2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环简单记载为二氧杂戊环。
最终浓度10μM的2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环，即使完全没有细胞增殖抑制的活性，也显示具有约50％NO产生抑制的活性。结果表明，2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环抑制NO的产生，并不是由2-(反式-3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环引起的细胞增殖抑制的起因。另外，本发明的其他化合物也具有同样的活性。
实施例18
将含有2×105个/ml HL-60(ATCC CCL-240)的含10％FBS的RPMI1640培养基5ml，注入6孔滴定板的个池中，5％CO2存在下，37℃下培养24小时后，添加4，5-二羟基-2-戊烯醛使最终浓度为0、12.5、25、50或100μM，或添加4-羟基-2-环戊烯-1-酮使最终浓度为0、2.5、5、10、20、40或80μM，再持续培养6小时。
培养结束后，计测细胞数，用离心分离回收细胞，PBS洗涤后，配制各试样的处理细胞。在45℃下加热处理5分钟后，同样配制培养的细胞。
用这些处理细胞，按Molecular Cloning Cold Spring Harb orLaboratory Press(1989)记载的方法，进行SDS-PAGE。将这些处理细胞在SDS-PAGE Sample buffer中混悬成2×106个/ml。将该细胞混悬液在100℃下处理10分钟后，各取5μl分别加至2个SDS-PAGE(5％积层凝胶和10％分离凝胶)中，进行电泳。其中一个凝胶被Coomassie染色，另外的凝胶吸附在聚偏氟乙烯转移膜[ImmobilonTM：MILLIPORE Cat.IPVH000-10]上。将该膜在Block Ace(大日本制药株式会社Cat.UK-B25)4℃下封闭一夜。
将该封闭的膜与和被热诱导的70kDa热休克蛋白具有特异反应的单克隆抗体HSP72/73(Ab-1)(Oncogene Research Products；catalogno.HSP01)反应后，用含有0.05％Tween20的TBS洗涤，再用TBS洗涤。然后，与Peroxidase复合物二次抗体HRP-Rabbit Anti MouseIgG(H+L)[ZYMED Laboratories，Inc.生产Cat.61-6520]反应，与上述同样操作进行洗涤。将与一次抗体、二次抗体反应的膜，与chemiluminol试剂RENAISSANCEAM[Dupont NEN，catalog no.NEL-100]反应后，在X-射线下感光，确认70kDa的热休克蛋白的诱导。
结果确认4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮的热休克蛋白诱导活性。其诱导的强弱如表13和表13所示。另外，在表12、表13中，+表示诱导强度，+越多表示诱导越强。另外，-说明没有发现诱导作用，±说明稍微有诱导作用。另外，本发明的其他化合物也具有同样的热休克蛋白诱导活性。
表12
          浓度(μM)
                    1.25          25       50       1004，5-二羟基-2-戊烯醛    -             ±                +++      -
表13
                     浓度(μM)
                     2.5       5        10      20      40      804-羟基-2-环戊烯-1-酮     -         ±                +       +++     ++      ±
但是，未处理的为-，45℃下加热处理5分钟为++。
实施例19  注射剂
将实施例1记载的D-核糖的加热处理物的中和物的浓缩干燥固体溶解在注射用蒸馏水中，配制1％的溶液。将该溶液填充至冷冻干燥用瓶中，1瓶内换算为上清液中的干燥物为10mg，冷冻干燥。添加2ml生理食盐水作为另外的溶解液。
同样，用4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环配制注射液。
实施例20 片剂
按下面处方配制片剂。
    DNA钠盐加热处理物     10mg
    玉米淀粉     65mg
    羧甲基纤维素     20mg
    聚乙烯吡咯烷酮     3mg
    硬脂酸镁     2mg
    1片     合计100mg
使用实施例4记载的DNA钠盐加热处理物的冷冻干燥物。
同样，用4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环制成片剂。
本发明提供了具有细胞凋亡诱发能力的、可以诱发癌症细胞细胞凋亡的、对该疾病的预防、治疗有效的本发明的加热处理物以及/或其部分精制物，以及具有细胞凋亡诱发能力的物质。另外，提供了从除糖醛酸以外的戊糖类得到4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的制造方法。对于癌症疾病，特别是大肠癌、胃癌等消化系统的癌症，通过经口服用含有从具有细胞凋亡诱发能力的、本发明的加热处理物以及/或部分精制物中选择的化合物的食品和饮料，可以引发癌症细胞凋亡，含有、添加以及/或稀释具有细胞凋亡诱发能力的、从本发明的加热处理物以及/或部分精制物中选择的物质得到的食品或饮料，对消化系统癌症的治疗和预防具有优良的效果。含有以具有细胞凋亡诱发能力的、从本发明的加热处理物以及/或其部分精制物中选择的物质作为有效成分的医药品，对癌细胞、滑膜细胞等异常增殖细胞具有增殖抑制活性，对维持机体的恒常性极为有用。另外，通过hIGF产生诱导能力，对治疗和预防需要诱导产生hIGF的疾病有用。另外，对需要抑制活性氧，例如抑制NO产生的疾病的治疗和预防有用。再有，由于具有热休克蛋白诱导能力，对治疗和预防需要诱导热休克蛋白的疾病，例如病毒性疾病有用。
具有细胞凋亡诱发能力的、本发明的加热处理物以及/或其部分精制物，可以廉价并大量的供给作为食品的原料。另外，通过使用具有细胞凋亡诱发能力的、本发明的加热处理物以及/或其部分精制物，作为有效成分使用，可以提供简便的诱发细胞凋亡的方法，通过使用该方法，可以进行细胞凋亡机制的研究、开发细胞凋亡诱发阻碍剂的。
本发明提供了以本发明的化合物中选择的化合物作为有效成分的医药品，该医药品对治疗和预防癌症疾病、风湿、糖尿病、病毒性疾病等疑难病症极为有用。
另外，本发明提供了通过含有、添加以及/或稀释得到的含有本发明化合物中选择的化合物组成的食品或饮料，该食品或饮料对预防癌症疾病、风湿、糖尿病、病毒性疾病等疑难病以及改善症状等有用，是具有细胞凋亡诱发用、抗癌用、抗风湿用、抗糖尿病用、热休克蛋白诱导用等的功能性食品或饮料。
另外，通过本发明，可以提供简单的生产4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮的方法。另外，可以提供具有生理活性的新型化合物，例如4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环以及通式[I]表示的化合物。

Claims (15)

1.具有细胞凋亡诱发能力的物质的制造方法，其特征是包括加热处理从下述(a)、(b)、(c)、(d)中选择的至少一种化合物的工序，
(a)选自阿糖、木糖、核糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖的戊糖
(b)衍生自上述(a)的戊糖衍生物
(c)含有上述(a)的戊糖的化合物
(d)含有上述(b)的戊糖衍生物的化合物。
2.权利要求1记载的制造方法，其中戊糖是核糖或木糖。
3.权利要求1记载的制造方法，其中戊糖衍生物是脱氧戊糖。
4.权利要求3记载的制造方法，其中戊糖衍生物是脱氧核糖。
5.权利要求1记载的制造方法，其中含有戊糖的化合物是核糖核苷、核糖核苷酸、核糖核酸。
6.权利要求1记载的制造方法，其中含有戊糖的化合物是5位上与带负电荷的基团键合的戊糖。
7.权利要求1记载的制造方法，其中戊糖衍生物是5位上与带负电荷的基团键合的戊糖衍生物。
8.权利要求6或7记载的制造方法，其中带负电荷的基团是磷酸基或硫酸基。
9.权利要求1记载的制造方法，其中含有戊糖衍生物的化合物是脱氧核苷、脱氧核苷酸或脱氧核糖核酸。
10.权利要求1-9任一项记载的制造方法，其中具有细胞凋亡诱发能力的物质是从4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮中选择的化合物。
11.细胞凋亡诱发性化合物，是从4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环以及下面通式[I]表示的化合物中选择的化合物，
式中，R表示从含有SH基团的化合物中除去SH的残基。
12.对从4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮以及通式[I]表示的化合物中选择的化合物具有感受性的疾病的治疗和预防用药物，其特征是含有从4，5-二羟基-2-戊烯醛、4-羟基-2-环戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、4-(9-鸟嘌呤基)-2-环戊烯-1-酮、2-(3，4-二羟基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1，3-二氧杂戊环、1，5-环氧-1-羟基-3-戊烯-2-酮以及通式[I]表示的化合物中选择的化合物作为有效成份，
Figure C9980222900032
13.权利要求12中记载的药物，是抗癌剂、细胞凋亡诱发剂、抗风湿剂、人胰岛素样增殖因子产生诱导剂、活性氧产生抑制剂、或热休克蛋白诱导剂。
14.一种食品或饮料，其中含有、稀释以及/或添加将选自下述(a)、(b)、(c)、(d)中的至少一种化合物加热处理得到的具有细胞凋亡诱发能力的加热处理物以及/或其部分精制物，
(a)选自阿糖、木糖、核糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖的戊糖
(b)衍生自上述(a)的戊糖衍生物
(c)含有上述(a)的戊糖的化合物
(d)含有上述(b)的戊糖衍生物的化合物。
15.权利要求14记载的食品或饮料，是抗癌用、细胞凋亡诱发用、抗风湿用、人胰岛素样增殖因子产生诱导用、活性氧产生抑制用或热休克蛋白诱导用的食品或饮料。
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