CN1250211C - 包含环戊烯酮化合物作为活性组分的治疗剂或预防剂 - Google Patents

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Abstract

用于治疗或预防需要免疫调节的疾病、需要抑制炎症的疾病、需要调节肿瘤坏死因子生成的疾病、需要调节真菌生长的疾病、需要调节细胞粘着的疾病、或需要诱导热激蛋白的疾病的治疗剂或预防剂，其中包含至少一种选自通式[I]环戊烯酮衍生物、其旋光异构体和其盐的化合物作为活性组分，其中R1和R2可相同或不同，并分别代表氢、脂族基、芳基、或芳脂族基。

Description

包含环戊烯酮化合物作为 活性组分的治疗剂或预防剂
                      技术领域
本发明涉及包含环戊烯酮酯作为活性组分的药物组合物。
                      背景技术
通常有多种药物，包括烷化剂、抗代谢药、制癌剂例如植物生物碱、抗生素、免疫增强剂和免疫调节剂用于临床治疗。然而，使用这些药物的药物疗法尚不完善。
在这些药物当中，据报道在其5元环中有α，β-不饱和羰基的天然前列腺素，即前列腺素A和J能抑制DNA合成，这意味着它们能用作高度安全的制癌剂。已合成了多种它们的衍生物(参见JP-A 62-96438)。
                      发明目的
本发明的主要目的是开发具有多种生理活性的环戊烯酮衍生物，以提供包含该化合物作为活性组分的药物组合物。
在下文中将参照附图详细地解释本发明的这些和其它目的以及优点。
                      附图简述
附图1是二异丁酰基环戊烯酮的1H-NMR光谱。
附图2是二甲氧基乙酰基环戊烯酮的1H-NMR光谱。
附图3是二甲基富马酰基环戊烯酮的1H-NMR光谱。
附图4是二甲基马来酰基环戊烯酮的1H-NMR光谱。
附图5表明了环戊烯酮衍生物的给药量与足水肿的增大比率之间的关系。
附图6表明了环戊烯酮衍生物的给药量与迟发型过敏反应的增大比率之间的关系。
附图7表明了二丙酰基环戊烯酮的浓度与3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量之间的关系。
附图8表明了二丙酰基环戊烯酮的浓度与3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量之间的关系。
                      发明简述
为了实现本发明目的，本发明者们已经作了大量研究，并且发现，通过将式[I I]所示4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(下文中简称为环戊烯酮)
Figure C9981231000041
与羧酸和/或其反应活性衍生物反应而制得的式[I]环戊烯酮衍生物：
其中R1和R2彼此之间可相同或不同，并且是氢、脂族基、芳基、或芳脂族基，
具有很强的生理活性，例如免疫调节活性、抗炎活性、抑制肿瘤坏死因子生成的活性、抗真菌活性、和抑制细胞粘着的活性。因此，本发明已得以完成。
因此，本发明提供了药物组合物，其中包含至少一种选自式[I]环戊烯酮衍生物或其旋光异构体、和其盐的化合物作为活性组分，所述组合物可用于治疗或预防下述疾病：对于其治疗或预防需要免疫调节的疾病，对于其治疗或预防需要抑制炎症的疾病，对于其治疗或预防需要抑制肿瘤坏死因子生成的疾病，对于其治疗或预防需要抑制真菌的疾病，对于其治疗或预防需要抑制细胞粘着的疾病，或者对于其治疗或预防需要诱导热激蛋白的疾病。
                      发明详述
在本发明中使用的环戊烯酮包括在4-位和5-位具有呈顺式构型的羟基的异构体和具有呈反式构型的羟基的异构体。环戊烯酮的顺式或反式异构体或顺式和反式异构体的混合物都可用于本发明。也可使用其旋光异构体。
环戊烯酮的顺式异构体是依据化学合成方法[HelveticaChimica Acta，55：2838-2844(1972)]获得的。环戊烯酮的反式异构体是依据化学合成方法[Carbohydrate Res.，247：217-222(1993)]，或通过加热糖醛酸(例如葡萄糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡萄糖醛内酯)或类似化合物(参见WO 98/13328)获得的。含有环戊烯酮的这些加热处理产物及其部分纯化或纯化产物可用于本发明。
例如，通过将1％D-葡萄糖醛酸(作为糖醛酸)溶液在121℃加热4小时来制备在热处理产物中的环戊烯酮。用溶剂提取热处理产物中的环戊烯酮。将提取液浓缩。然后通过硅胶柱色谱法分离浓缩物。将含有环戊烯酮的洗脱级分浓缩。用氯仿从浓缩物中提取环戊烯酮。通过正相色谱法纯化浓缩的提取液，由此分离出了热处理产物中的环戊烯酮。
旋光异构体(-)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮可通过将由此分离到的环戊烯酮进行旋光拆分而获得。当然，也可将合成的环戊烯酮进行旋光拆分。
本发明式[I]环戊烯酮衍生物：
Figure C9981231000051
或其旋光异构体是通过将环戊烯酮和/或其旋光异构体与具有氢、脂族基、芳基、或芳脂族基的羧酸和/或其反应活性衍生物同时或顺序反应而在反应混合物中制得的。
在本发明中使用具有氢、脂族基、芳基、或芳脂族基并且与式[I]环戊烯酮衍生物中的R1和R2相对应的下述羧酸或其反应活性衍生物。
甲酸可用作具有氢的羧酸。
具有烷基的羧酸和具有链烯基的羧酸可用作具有脂族基的羧酸。
具有直链或支链烷基的羧酸可用作具有烷基的羧酸。虽然可根据环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等适当地选择烷基链的长度，但是C1-30烷基是优选的。可使用的具有直链烷基的羧酸的实例包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、正辛酸、壬酸、正癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸、和三十烷酸。
可使用的具有支链烷基的羧酸的实例包括异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、新戊酸、4-甲基戊酸、和1，2-二甲基戊酸。
具有直链或支链链烯基的羧酸可用作具有链烯基的羧酸。虽然可根据环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等适当地选择链烯基的链长、不饱和度和不饱和键的位置，但是优选使用C2-30链烯基。
可使用的具有直链链烯基的羧酸的实例包括丙烯酸、乙烯基乙酸、巴豆酸、异巴豆酸、烯丙基乙酸、2-己烯酸、3-己烯酸、3-辛烯酸、4-癸烯酸、10-十一碳烯酸、棕榈烯酸、岩芹酸、反油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、桐酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、巴西烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、西门木烯酸、和21-三十碳烯酸。
可使用的具有支链链烯基的羧酸的实例包括异丁烯酸、惕各酸、当归酸、和α-乙基巴豆酸。
具有烷基、并且所述烷基具有C1-4低级烷氧基作为取代基的羧酸例如甲氧基乙酸可用作具有取代的脂族基的羧酸。可使用具有链烯基、并且所述链烯基具有C2-5低级烷氧基羰基作为取代基的羧酸例如甲基马来酸。
可使用的具有芳基的羧酸的实例包括苯甲酸、甲苯甲酸、氯苯甲酸、溴苯甲酸、硝基苯甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、水杨酸、乙酰水杨酸、乙酰水杨酰水杨酸、氨基水杨酸、对羟基苯甲酸、氨基苯甲酸、甲氧基苯甲酸、乙酰氨基苯甲酸、香草酸、苔色酸、萘甲酸、辛可部酸、黄尿烯酸、奎尼酸和犬尿酸。可根据欲制备的环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等选择使用的具有芳基的羧酸。
可使用的具有芳脂族基的羧酸的实例包括苯基乙酸、苯基丙酸、苯基乳酸、苯基丙酮酸、肉桂酸、阿托酸、和萘基乙酸。可根据欲制备的环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等选择具有所使用的芳脂族基的羧酸。
所述脂族基、芳基、或芳脂族基可具有取代基，例如官能团(例如氨基、硝基、氧代基、羟基、硫羟基、或硫酸根)或卤素(例如氟、氯、溴或碘)。
因此，式[I]中的R1和R2彼此之间可相同或不同，并且其实例包括氢、直链或支链C1-30烷基、直链或支链C2-30链烯基、C6-10芳基、和C1-30烷基C6-10芳基。所述基团可任选被至少一个选自下述基团的取代基取代：C1-30烷基、C1-4烷氧基、C2-5烷氧基羰基、氨基、硝基、氧代基、羟基、硫羟基、硫酸根和卤素(例如氟、氯、溴或碘)。
羧酸反应活性衍生物的实例有酰卤、酸酐、酸酯和盐。可根据使用目的制备所使用的羧酸的反应活性衍生物。
可进行羧酸或其反应活性衍生物与环戊烯酮之间的反应，以使得环戊烯酮衍生物中的R1和R2彼此之间相同或不同。具体来说，可将具有不同基团(对于R1和R2)的羧酸与环戊烯酮同时反应。或者可将它们顺序反应。对于后一种情况，通过将环戊烯酮的一个羟基保护，可以以高效率制得其中R1和R2彼此不同的环戊烯酮衍生物。
通过将环戊烯酮或其旋光异构体与羧酸反应而制得的环戊烯酮衍生物或其旋光异构体具有免疫调节活性、抗炎活性、抑制肿瘤坏死因子生成的活性、抗真菌活性、抑制细胞粘着的活性等。可使用这些活性中的一种作为指数从反应混合物中纯化和分离环戊烯酮衍生物或其旋光异构体。可使用包括化学方法和物理方法在内的已知纯化/分离方法进行纯化和分离。可联合使用常规纯化方法例如凝胶过滤、采用分子量分级膜的分级分离、溶剂提取、分馏以及各种色谱法，例如离子交换树脂，以从反应产物中纯化和分离环戊烯酮衍生物或其旋光异构体。
例如，在本发明中使用的环戊烯酮衍生物是按如下所述制得的：将环戊烯酮或其旋光异构体、4-二甲基氨基吡啶和羧酸溶于二氯甲烷中，在冰冷却下向其中加入N，N-二环己基碳化二亚胺来进行反应。可通过硅胶薄层色谱法将产物纯化以分离出所要的环戊烯酮衍生物。
此外，可从通过将环戊烯酮或其旋光异构体与乙酸酐在无水吡啶中反应而获得的反应产物中纯化和分离二乙酰基环戊烯酮。
在本发明中使用的环戊烯酮衍生物的旋光异构体可通过下述方法分离到：将外消旋混合物机械拆分，优选结晶法，通过作为非对映异构盐或包含物通过结晶进行拆分，用酶或微生物进行动力学拆分，色谱分离等。
可采用使用适当手性固定相的气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法等进行色谱拆分。
使用手性固定相的方法、使用手性洗脱剂的方法、作为非对映异构体分离等方法可用来通过液相色谱法进行旋光拆分。
酰胺型固定相、脲型固定相、配体交换型固定相、多糖或多糖衍生物固定相、蛋白固定相、聚异丁烯酸酯固定相、聚异丁烯酰胺固定相等可用作手性固定相。
根据所用的固定相，己烷型洗脱剂、醇型洗脱剂、水(缓冲液)洗脱剂等可适当地用作洗脱剂。
在本发明中使用的环戊烯酮衍生物或其旋光异构体的盐包括可药用盐。可使用已知方法将其转化成盐。
在本发明中使用的环戊烯酮衍生物的代表性实例包括二乙酰基环戊烯酮、二丙酰基环戊烯酮、二丁酰基环戊烯酮、二异丁酰基环戊烯酮、二戊酰基环戊烯酮、二己酰基环戊烯酮、二辛酰基环戊烯酮、二癸酰基环戊烯酮、二肉豆蔻酰基环戊烯酮、二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮、二(甲基富马酰基)环戊烯酮、二(甲基马来酰基)环戊烯酮、二(2-己烯酰基)环戊烯酮、二(3-辛烯酰基)环戊烯酮、和二苯甲酰基环戊烯酮。
在本发明中使用的环戊烯酮衍生物或其旋光异构体、或其盐具有免疫调节活性，例如抑制淋巴细胞芽生的活性、抑制混合淋巴细胞反应的活性、激活天然杀伤细胞的活性、激活癌细胞特异性淋巴细胞的活性；抗炎活性，例如抑制角叉菜胶诱导的水肿的活性、抑制迟发型过敏反应的活性；抑制肿瘤坏死因子生成的活性；抑制拓扑异构酶的活性；诱导热激蛋白的活性；抑制细胞粘着的活性；抗真菌活性等。由于具有这些活性，因此本发明化合物可用作用于治疗或预防下述疾病的药物组合物：对于其治疗或预防需要免疫调节的疾病，对于其治疗或预防需要抑制炎症的疾病，对于其治疗或预防需要抑制肿瘤坏死因子生成的疾病，需要抑制拓扑异构酶的疾病，对于其治疗或预防需要诱导热激蛋白的疾病，对于其治疗或预防需要抑制真菌生长的疾病，对于其治疗或预防需要抑制细胞粘着的疾病等。因此，可使用至少一种选自环戊烯酮衍生物或其旋光异构体、和其盐的化合物作为活性组分来制备免疫调节组合物、抗炎组合物、用于抑制肿瘤坏死因子生成的组合物、用于抑制拓扑异构酶的组合物、用于诱导热激蛋白的组合物、抗真菌组合物、和用于抑制细胞粘着的组合物。
肿瘤坏死因子是作为在肿瘤位点诱导出血性坏死的因子发现的。目前认为肿瘤坏死因子是广泛参与以炎症为基础的生物防御和免疫机制的细胞因子。肿瘤坏死因子生成调节机制中的障碍给宿主带来了多种困扰。肿瘤坏死因子的过度生成或失控生成导致多种疾病。这些疾病包括类风湿性关节炎、风湿性脊髓炎、骨关节炎、痛风性关节炎、脓毒病、败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性菌脓毒病、中毒性休克综合征、脑疟疾、慢性肺炎、移植物对宿主反应、同种移植物排斥、由于传染病例如流感所致的发热和肌痛、感染或恶性肿瘤的继发性恶病质、人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的继发性恶病质、AIDS、与AIDS有关的综合征、瘢痕瘤形成、溃疡性结膜炎、多发性硬化、和自身免疫性疾病例如自身免疫性糖尿病和全身性红斑狼疮[Molecular Medicine，33：1010-1020，1182-1189(1986)]。抑制肿瘤坏死因子生成的本发明组合物可用于治疗和预防由肿瘤坏死因子介导或被其加重的病症，例如由肿瘤坏死因子引起的胰岛素依赖型糖尿病[Nature，389：610-614(1997)]。
本发明提供了调节肿瘤坏死因子生成的方法，其中使用至少一种选自环戊烯酮衍生物或其旋光异构体和其盐的化合物作为活性组分。此外，本发明还提供了用于改善由肿瘤坏死因子介导或被其加重的病症的食品或饮料或者用于预防这类疾病的食品或饮料，其中包含至少一种选自环戊烯酮衍生物或其旋光异构体和其盐的化合物。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有免疫调节活性，例如抑制淋巴细胞芽生的活性、和抑制混合淋巴细胞反应的活性。含有至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分的免疫调节组合物可用作用于治疗或预防下述疾病的药物组合物：由于免疫系统或免疫因子异常所致的疾病，或者对于其治疗或预防需要免疫增强的疾病。
淋巴细胞芽生是其中促细胞分裂剂在淋巴细胞表面上与受体结合以激活淋巴细胞并促进其分裂和增殖的反应。混合淋巴细胞反应是这样的反应：将从同种异体动物中获得的淋巴细胞混合并培养，然后由于主要组织相容性抗原的不相容而诱使淋巴细胞激活，以促进淋巴细胞分裂和增殖。本发明免疫调节组合物抑制这些反应，并特别适用于治疗和预防由淋巴细胞异常增多所引起的疾病，例如慢性肾炎、慢性结肠炎、I型糖尿病、和类风湿性关节炎，并还可用于抑制移植物排斥。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有抑制足中角叉菜胶水肿的活性。因此，含有至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分的抗炎组合物可用作用于治疗或预防对于其治疗或预防需要抑制炎症的疾病的药物组合物。
角叉菜胶诱导的足水肿模型是这样的反应：通过将炎性剂角叉菜胶皮下注射到足底内来诱导炎性细胞例如巨噬细胞和嗜中性白细胞，由这些细胞产生的炎性因子提高了血管的渗透性，导致水肿。本发明抗炎组合物抑制水肿的活性可用于治疗或预防对于其治疗或预防需要抑制血管渗透性增加的疾病，例如类风湿性关节炎。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有抑制迟发型过敏反应的活性。因此，含有至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分的抗炎组合物可用作用于治疗或预防下述疾病的药物组合物：对于其治疗或预防需要抑制由传染病等引起的迟发型过敏反应的疾病。
迟发型过敏反应是依赖于由激活的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等介导的细胞免疫的炎性反应。在炎性位点渗入的由这些细胞产生的细胞因子提高了血管渗透性，导致水肿、肉芽肿、纤维变性和坏死，从而引起严重的病症。由迟发型过敏反应引起的变应性皮炎是导致大多数接触性皮炎的原因。此外，迟发型过敏反应还引起其中细菌、病毒或药物起抗原作用的变态反应。使用绵羊红细胞作为抗原的小鼠模型通常被用来测定迟发型过敏反应。在该模型中有效的化合物可用于治疗或预防上述变应性疾病。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有抑制拓扑异构酶II的活性。在正常细胞中，拓扑异构酶II仅在分裂期间短暂表达。另一方面，当细胞癌变时，它在整个细胞周期都高度表达。因此，含有至少一种选自这些化合物的化合物的抑制拓扑异构酶的组合物可用作制癌剂。此外，使用至少一种选自这些化合物的化合物抑制拓扑异构酶的方法可用于生化研究、筛分制癌剂等。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有抑制细胞粘着的活性。因此，本发明提供了含有至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分、用于抑制细胞粘着的组合物。本发明抑制细胞粘着的组合物可用作用于治疗或预防对于其治疗或预防需要抑制细胞粘着的疾病的药物组合物。
例如，癌转移是由于在癌原始发生部位生长的癌细胞释放到血管中、迁移到转移位点并浸渗到组织内所致。其中，癌细胞与血管内皮细胞的粘着是癌细胞从血管内部迁移到转移位点所必需的。已知在血管内皮细胞上的ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1是参与癌转移的粘着分子。已经鉴定了癌细胞上各自的相应配体LFA-1、VLA-4和唾液酸Lewis X。这些粘着分子通常在白血病细胞上表达，并被认为参与白血病细胞的血管外浸渗。因此，预计本发明抑制细胞粘着的组合物可抑制由这些粘着分子介导的癌细胞粘着，从而抑制癌转移。
环戊烯酮和由环戊烯酮制得的化合物以及在PCT/JP98/00815中描述的含SH基化合物也具有抑制细胞粘着的活性。因此，本发明提供了含有至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分、用于抑制细胞粘着的组合物。
本发明提供的抑制细胞粘着的组合物可用于抑制细胞粘着的方法。该方法可用于关于细胞粘着的生化研究，和筛分细胞粘着抑制剂或具有使细胞粘着的活性的活性剂。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有激活天然杀伤(NK)细胞的活性。因此，本发明提供了含有至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分、用于激活NK细胞的组合物。本发明激活NK细胞的组合物可用作用于治疗或预防对于其治疗或预防需要激活NK细胞的疾病的药物组合物。
NK细胞识别被细菌或病毒感染的细胞和癌细胞，并通过细胞膜攻击将这些细胞消除。激活NK细胞增强了活体中的免疫保护机制。因此，本发明激活NK细胞的组合物可用于治疗或预防细菌或病毒性疾病和癌症。
环戊烯酮和由环戊烯酮制得的化合物以及在PCT/JP98/00815中描述的含SH基化合物也具有激活NK细胞的活性。因此，本发明提供了含有至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分、用于激活NK细胞的组合物。
本发明提供的激活NK细胞的组合物可用于激活NK细胞的方法。该方法可用于关于免疫保护机制的生化研究，和筛分免疫保护剂。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有抗真菌活性。因此，可使用至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分与已知药物载体制备抗真菌组合物。
通常有多种治疗剂用于治疗真菌感染，包括两性霉素B、氟胞嘧啶、咪康唑和氟康唑。然而，这些治疗剂有效力和毒性方面的问题，或者具有对它们有抗药性的菌株。尤其是，具有低毒性、能有效治疗近来有增加趋势的系统感染的治疗剂很少。本发明抗真菌组分用于具有低的毒性而可用作新型抗真菌剂。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有诱导熟激蛋白的活性。因此，通过使用至少一种选自这些化合物的化合物作为活性组分可制得诱导热激蛋白的组合物。可经由合适的途径将该组合物给药以治疗或预防对于其治疗或预防需要诱导热激蛋白的疾病。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐具有诱导热激蛋白例如70-kDa热激蛋白(HSP70)的活性。它们具有抗RNA病毒和DNA病毒例如肝炎病毒、AIDS病毒、流感病毒、水疱性口炎病毒、和疱疹病毒的抗病毒活性。热激蛋白参与肿瘤免疫。此外，这些化合物还具有生物防卫活性例如抗炎活性。因此，通过施用本发明化合物或其旋光异构体或其盐，可预防或治疗病毒性疾病例如由流感病毒引起的感冒。
热激蛋白是当使细胞或个体经受温度快速改变至比常温高5-10℃的较高温度时所诱导合成的蛋白的俗称。热激蛋白分布在多种生物体中，包括原核生物和高级真核生物。HSP90、HSP70、遍在蛋白、HP26等是已知的真核生物热激蛋白。在这些热激蛋白当中，HSP70是一种分子伴侣蛋白，它结合折叠不完全的蛋白或不完全折叠蛋白，并帮助它们形成三维结构。热激蛋白的氨基酸序列在进化过程中很好地保存了下来。HSP70与大肠杆菌(Escherichia coli)DnaK蛋白类似。人体中存在大约10个HSP70基因。其中一些是组成性表达的，其余是由不同刺激诱导的。除了热激以外，不同的化学物质和细胞损伤例如氧化应力也诱导热激蛋白的合成。
C.Amici等人[Journal of Virology，68：6890-6899(1994)]报道：在具有α，β-不饱和羰基的前列腺素A1存在下培养用仙台病毒感染的动物细胞，诱导了HSP70和HSP90的合成，并且虽然诱导了HSP70的合成，但是病毒蛋白的合成被抑制了。A.Rossi等人[TheJournal of Biological Chemistry，271：32192-32196(1996)]报道：与前列腺素A1类似的2-环戊烯-1-酮诱导了HSP70的合成，并抑制了水疱性口炎病毒的蛋白合成。
例如，在1.25μM的浓度观察到二异丁酰基环戊烯酮-一种环戊烯酮衍生物诱导HSP70的能力。其诱导能力在2.5μM浓度最大。与需要以几百μM浓度使用才能诱导HSP70的2-环戊烯-1-酮相比，二异丁酰基环戊烯酮的诱导能力非常强。
本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐由于有着很高的诱导热激蛋白的活性而具有抗DNA病毒、RNA病毒、逆转录病毒和类病毒的抗病毒活性。上文中已经举例列举了病毒和类病毒。
本发明免疫调节组合物一般可这样制得：使用选自环戊烯酮衍生物或其旋光异构体和其盐的化合物作为活性组分，并将其与可药用液体或固体载体和任选使用的溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等混合来进行配制。制剂可呈固体制剂形式，例如片剂、粒剂、粉剂、撒粉剂和胶囊，或者液体制剂例如标准溶液剂、悬浮剂和乳剂。此外，可将组合物配制成干燥制剂，其可在使用前通过加入适当载体来重新配制成液体制剂。
可依据上述特定给药途径和剂型选择药物载体。对于口服制剂，可使用例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。在口服制剂中还可使用粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、矫味剂、着色剂、增香剂等。
非胃肠道给药制剂可这样制得：依据常规方法，将本发明活性组分，即选自环戊烯酮衍生物或其旋光异构体和其盐的化合物溶解或悬浮在稀释剂中。稀释剂包括可注射蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、可注射植物油、芝麻油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇和聚乙二醇。可任选将灭菌剂、稳定剂、渗透调节剂、光滑剂等加到这种溶液或悬浮液中。
经由适于组合物剂型的途径施用本发明免疫调节组合物。给药途径不限于具体一种。本发明组合物可内用或外用(或局部施用)或通过注射施用。注射剂可例如静脉内、肌内、皮下、真皮内等施用。外用制剂包括栓剂。
根据具体剂型、给药途径和目的、以及欲治疗患者的年龄、体重和身体状况来适当地确定本发明免疫调节组合物的剂量，并且剂量可随着这些因素的不同而变化。对于成人，按制剂中包含的选自环戊烯酮或其旋光异构体和其盐的化合物的量计，日剂量一般为0.1μg-200mg/kg。当然，剂量可随各种因素而变。因此，在某些情况下，低于上述剂量范围的剂量可能就足够了，但是在另一些情况下，可能需要超过上述剂量范围的剂量。本发明药物组合物可口服给药，或者既然如此可通过将其加到所选择的食品和饮料中来每天服用。
可依据与上述配制本发明免疫调节组合物所用的方式相同的方式配制本发明抑制肿瘤坏死因子生成的组合物、抗炎组合物、抑制拓扑异构酶的组合物、抑制细胞粘着的组合物、诱导热激蛋白的组合物和抗真菌组合物。可经由适于所治疗疾病的途径施用这些组合物。当然，组合物剂量可随各种因素而变。因此，在某些情况下，低于上述剂量范围的剂量可能就足够了，但是在另一些情况下，可能需要超过上述剂量范围的剂量。本发明药物组合物可口服给药，或者既然如此可通过将其加到所选择的食品和饮料中来每天服用。
在本发明中使用的环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐可由环戊烯酮和任一种羧酸或其反应活性衍生物高效率地制得。
依据上述制备方法，提供了二异丁酰基环戊烯酮(环戊烯酮与异丁酸酐之间的反应产物)、二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮(环戊烯酮与甲氧基乙酸之间的反应产物)、二(甲基富马酰基)环戊烯酮、和二(甲基马来酰基)环戊烯酮(环戊烯酮与甲基马来酸之间的反应产物)。
这些化合物具有制癌活性、抑制拓扑异构酶的活性等。通过使用这些化合物或其旋光异构体或其盐作为活性组分可制得药物组合物例如制癌组合物。
制备含有依据本发明获得的环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐作为活性组分的食品和饮料的方法不限于具体一种。可使用任意方法，包括烹饪、加工、和生产食品与饮料的其它常用方法，只要所得食品和饮料包含有效量的具有生理活性的选自环戊烯酮衍生物或其旋光异构体和其盐的化合物即可。可由此制得功能食品或饮料例如免疫调节食品或饮料。
当施用生理有效量的依据本发明获得的环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐时，没有观察到毒性作用。例如，当以100mg/kg的单次剂量将二丙酰基环戊烯酮、二己酰基环戊烯酮、二(2-己酰基)环戊烯酮、二异丁酰基环戊烯酮、二苯甲酰基环戊烯酮或它们的旋光异构体或其盐对小鼠口服给药时，没有观察到死亡。
如上所述，本发明环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐可方便地制得，并且由于具有多种生理功能，它们非常适用于包括医药和食品在内的多种领域。
下述实施例进一步详细地举例说明了本发明，但是不应当将其理解为对本发明范围的限制。实施例中的百分比(％)是指重量百分比。
实施例1
(1)将10g D-葡萄糖醛酸(Sigma，G 5269)溶于1升水中。将该溶液在121℃加热4小时，然后减压浓缩至约10ml体积。向其中加入40ml乙酸丁酯∶乙酸∶水＝3∶2∶2的上层混合物，并混合。将该混合物离心，把所得上清液减压浓缩至约10ml体积。
将该萃取液进行硅胶BW-300SP柱色谱(2×28cm，FujiSylysia)纯化。使用乙酸丁酯∶乙酸∶水＝3∶2∶2的上层混合物作为洗脱剂、在0.2kg/cm2压力下、用压缩机以5ml/分钟的流速进行分离。每一级分含有10ml分级洗脱液。通过薄层色谱法分析每一级分的一部分。结果发现，第61到第80个级分含有高程度环戊烯酮。合并这些级分，并减压浓缩。用40ml氯仿提取该浓缩物。将该提取液减压浓缩，获得了10mg环戊烯酮。
通过使用Palpack Type S柱的正相HPLC分离该制备物，并根据在215nm的紫外线吸收度进行检测。该操作证实了该制备物的纯度为98％。
将113.9mg依据上述方法制得的环戊烯酮溶于2.85ml乙醇中。向该乙醇溶液中加入3.85ml己烷/乙醇(94/6)，获得了17mg/ml的环戊烯酮溶液。将该溶液经由0.5μm滤器过滤，获得了用于旋光拆分HPLC的样本溶液。
将该样本溶液在下述条件下进行旋光拆分HPLC操作。分别从前峰和后峰收集含有环戊烯酮(-)异构体和(+)异构体的级分。将级分减压蒸发至干，获得了43.2mg环戊烯酮(-)异构体和43.0mg环戊烯酮(+)异构体。
旋光拆分HPLC所采用的条件
柱：Chiralpack AS(Dicel Chemical Industries)2.0cm×25.0cm；
柱温：40℃；
流动相：己烷/乙醇(94/6)；
流速：14.0ml/分钟；
检测：UV 210nm；
进样量：150μl(2.55mg)。
因为所得环戊烯酮(-)异构体和(+)异构体都含有约1％浓度的对映异构体，所以在上述条件下将它们再次旋光拆分。结果从由前峰获得的30.0mg(-)异构体中获得了不含对映异构体的19.7mg(-)异构体。从由后峰获得的37.4mg(+)异构体中获得了不含对映异构体的27.7mg(+)异构体。对于(-)异构体，旋光拆分HPLC中的洗脱时间为33分钟，对于(+)异构体，洗脱时间为40分钟。
(2)将1ml无水吡啶(Nacalai Tesque，295-26)和0.1ml乙酸酐(Nacalai Tesque，002-26)加到29.6mg如实施例1-(1)所述获得的环戊烯酮中。将该混合物在室温搅拌3小时。用氯仿提取该反应混合物，获得了36mg二乙酰基环戊烯酮。
用DX302质谱仪(Nippon Denshi)将所得二乙酰基环戊烯酮进行质谱分析。此外，将二乙酰基环戊烯酮溶于CDCl3，并用核磁共振仪JNM-A500(Nippon Denshi)通过NMR进行结构分析。所得结果如下所示。1H-NMR中的化学位移值是假定氯仿的化学位移值为7.24ppm表示的。
MS m/z 199(M+H)+
1H-NMR
δ2.12(3H，S，-OCOCH3)，2.16(3H，S，-OCOCH3)，5.16(1H，d，J＝3.0Hz，H-5)，5.89(1H，m，H-4)，6.40(1H，d-d，J＝1.5，6.5Hz，H-2)，7.43(1H，d-d，J＝2.5，6.5Hz，H-3)。
(3)用15.9mg如实施例1-(1)所述制得的环戊烯酮(-)异构体如实施例1-(2)所述进行反应，获得了15.1mg二乙酰基环戊烯酮(-)异构体。当如实施例1-(2)所述通过质谱法和核磁共振对该异构体进行结构分析时，获得了与实施例1-(2)中的结果相类似的结果。
(4)用16.7mg如实施例1-(1)所述制得的环戊烯酮(+)异构体如实施例1-(2)所述进行反应，获得了18.8mg二乙酰基环戊烯酮(+)异构体。当如实施例1-(2)所述通过质谱法和核磁共振对该异构体进行结构分析时，获得了与实施例1-(2)中的结果相类似的结果。
(5)将44.3mg苯甲酸(Nacalai Tesque，041-20)、7.5mg二甲基氨基吡啶(DMAP；Tokyo Kasei Kogyo，D1450)、51.0mg N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC：Peptide Institute，1001)和5ml氯仿加到13.8mg环戊烯酮中。将该混合物在冰上搅拌4小时。将该反应混合物过滤，将滤液施加到硅胶柱(75ml)上，用氯仿洗脱，获得了含有二苯甲酰基环戊烯酮的级分。将级分中的溶剂减压除去，把残余物溶于乙醇中，通过硅胶薄层色谱法分离该溶液，用99∶1的氯仿和甲醇混合物作为展开溶剂。将在Rf＝0.45-0.55处的硅胶从该薄层上刮掉，并用氯仿提取，获得了3.2mg二苯甲酰基环戊烯酮。
如实施例1-(2)所述通过质谱法和核磁共振对由此获得的二苯甲酰基环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
MS m/z 323(M+H)+
1H-NMR
δ5.56(1H，d，J＝3.0Hz，H-5)，6.30(1H，m，H-4)，6.54(1H，d-d，J＝1.5，6.5Hz，H-2)，7.44(4H，m，芳环上的氢)，7.58(2H，m，芳环上的H)，7.64(1H，d-d，J＝2.0，6.5Hz，H-3)，8.06(4H，m，芳环上的H)。
(6)用22.1mg环戊烯酮(-)异构体、71.9mg苯甲酸、12.1mgDMAP和80.3mg DCC如实施例1-(5)所述进行反应，获得了19.2mg二苯甲酰基环戊烯酮(-)异构体。当如实施例1-(5)所述通过质谱法和核磁共振对该异构体进行结构分析时，获得了与实施例1-(5)中的结果相类似的结果。
(7)用20.4mg环戊烯酮(+)异构体、65.6mg苯甲酸、11.0mgDMAP和74.3mg DCC如实施例1-(5)所述进行反应，获得了21.4mg二苯甲酰基环戊烯酮(+)异构体。当如实施例1-(5)所述通过质谱法和核磁共振对该异构体进行结构分析时，获得了与实施例1-(5)中的结果相类似的结果。
(8)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和153mg己酸(NacalaiTesque，070-26)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mg DCC，同时在冰上冷却。反应1小时后，通过硅胶薄层色谱法分离和纯化该反应混合物，用氯仿作为展开溶剂。将在Rf＝0.3-0.4处的硅胶从该薄层上刮掉，并用氯仿提取，获得了11mg二己酰基环戊烯酮。
将由此获得的二己酰基环戊烯酮溶于CDCl3，用核磁共振仪JNM-EX270(Nippon Denshi)通过核磁共振(NMR)证实其结构。1H-NMR中的化学位移值是假定四甲基硅烷的化学位移值为0ppm表示的。
所得结果如下所示。
1H-NMR
δ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.98Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.32Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.26Hz)，2.38(2H，t，J＝7.76Hz)，1.65(4H，m)，1.26(8H，m)，0.88(6H，t)。
(9)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和301mg肉豆蔻酸(TokyoKasei Kogyo，M0476)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mgDCC，同时在冰上冷却。反应1小时后，通过硅胶薄层色谱法分离该反应混合物，用氯仿作为展开溶剂。将在Rf＝0.45-0.55处的硅胶从该薄层上刮掉，并用氯仿提取，获得了53mg二肉豆蔻酰基环戊烯酮。
如实施例1-(8)所述通过核磁共振对由此获得的二肉豆蔻酰基环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ7.45(1H，dd，J2-3＝5.94Hz，J3-4＝2.31Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝5.31Hz，J3-4＝1.32Hz，H-2)，5.92(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.64Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.26Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.63(4H，m)，1.26(32H，m)，0.88(6H，t)。
(10)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和190mg辛酸(NacalaiTesque，071-11)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mg DCC，同时在冰上冷却。反应1小时后，通过硅胶薄层色谱法分离该反应混合物，用氯仿作为展开溶剂。将在Rf＝0.25-0.35处的硅胶从该薄层上刮掉，并用氯仿提取，获得了27mg二辛酰基环戊烯酮。
如实施例1-(8)所述通过核磁共振对由此获得的二辛酰基环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ7.44(1H，dd，J2-3＝6.1Hz，J3-4＝2.16Hz，H-3)，6.41(1H，dd，J2-3＝6.1Hz，J3-4＝1.48Hz，H-2)，5.92(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.59Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.65(4H，m)，1.29(16H，m)，0.88(6H，t)。
(11)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和190mg 3-辛烯酸(TokyoKasei Kogyo，00070)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mgDCC，同时在冰上冷却。反应1小时后，通过硅胶薄层色谱法分离该反应混合物，用氯仿作为展开溶剂。将在Rf＝0.25-0.35处的硅胶从该薄层上刮掉，并用氯仿提取，获得了25mg二(3-辛烯酰基)环戊烯酮。
如实施例1-(8)所述通过核磁共振对由此获得的二(3-辛烯酰基)环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.32Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.49Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.55(4H，m)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，3.12(4H，dd，J＝12.85Hz，J＝6.59Hz)，2.04(4H，m)，1.33(8H，m)，0.89(6H，t)。
(12)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和115mg正丁酸(TokyoKasei Kogyo，B0754)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mgDCC，同时在冰上冷却。反应1小时后，通过硅胶薄层色谱法分离该反应混合物，用氯仿作为展开溶剂。将在Rf＝0.20-0.30处的硅胶从该薄层上刮掉，并用氯仿提取，获得了16mg二丁酰基环戊烯酮。
如实施例1-(8)所述通过核磁共振对由此获得的二丁酰基环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ7.45(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.13Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.65Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.64Hz，H-5)。
(13)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和226mg正癸酸(TokyoKasei Kogyo，D0017)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mgDCC，同时在冰上冷却。反应1小时后，通过硅胶薄层色谱法分离该反应混合物，用氯仿作为展开溶剂。将在Rf＝0.35-0.45处的硅胶从该薄层上刮掉，并用氯仿提取，获得了35mg二癸酰基环戊烯酮。
如实施例卜(8)所述通过核磁共振对由此获得的二癸酰基环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.97Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.3Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.15(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.24Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.65(4H，m)，1.26(24H，m)，0.88(6H，t)。
(14)将30mg环戊烯酮、16mg DMAP、66mg三乙胺(Tokyo KaseiKogyo，T0424)和122mg正戊酸酐(Tokyo Kasei Kogyo，V0006)溶于5.9ml二氯甲烷中。将该混合物在冰上反应1小时。通过硅胶薄层色谱法分离该反应混合物，用氯仿∶甲醇＝200∶1作为展开溶剂。将在Rf＝0.7-0.8处的硅胶从该薄层上到掉，并用氯仿提取，获得了39mg二戊酰基环戊烯酮。
如实施例1-(8)所述通过核磁共振对由此获得的二戊酰基环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ7.45(1H，dd，J2-3＝6.11Hz，J3-4＝1.66Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.11Hz，J3-4＝1.66Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.43(2H，dd，J＝7.59，7.59Hz)，2.39(2H，dd，J＝7.59，7.59Hz)，1.65(4H，m)，1.38(4H，m)，0.93(6H，dd，J＝7.26，7.26Hz)。
(15)将30mg环戊烯酮、16mg DMAP、66mg三乙胺和86mg丙酸酐(Tokyo Kasei Kogyo，P0513)溶于5.9ml二氯甲烷中。将该混合物在冰上反应1小时。通过硅胶薄层色谱法分离该反应混合物，用氯仿∶甲醇＝200∶1作为展开溶剂。将在Rf＝0.5-0.6处的硅胶从该薄层上刮掉，并用氯仿提取，获得了31mg二丙酰基环戊烯酮。
如实施例1-(8)所述通过核磁共振对由此获得的二丙酰基环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ7.45(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.15Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.49Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.46(2H，dd，J＝15.01，7.59Hz)，2.42(2H，dd，J＝15.01，7.59Hz)，1.18(6H，dd，J＝7.59，7.59Hz)。
(16)将2g环戊烯酮、733mg DMAP、4.1ml反式-2-己烯酸(TokyoKasei Kogyo，H0383)和5.57g DCC溶于200ml二氯甲烷中。将该混合物在室温反应2小时。通过硅胶柱色谱法纯化该反应混合物，用己烷∶乙酸乙酯＝8∶1洗脱，获得了在硅胶薄层色谱中仅产生一个点的级分。将该级分减压浓缩，获得了900mg二(2-己烯酰基)环戊烯酮，为油状物。
如实施例1-(8)所述通过核磁共振对由此获得的二(2-己烯酰基)环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ0.92(6H，m，11-H+11′-H)，1.48(4H，m，10-H+10′-H)，2.18(4H，m，9-H，9′-H)，5.22(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，5.85(2H，m，7-H+7′-H)，5.98(1H，m，4-H)，6.41(1H，dd，J＝1.0，6.0Hz，2-H)，7.04(2H，m，8-H+8′-H)，7.47(1H，dd，J＝2.0，6.0Hz，3-H)。
从羰基开始计起，连在环戊烯酮5-位上的2-己烯酰基中碳的位置定义为6-位-11-位。从羰基开始计起，连在环戊烯酮4-位上的2-己烯酰基中碳的位置定义为6′-位-11′-位。
(17)将1.2g环戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入1.7ml异丁酸酐(Nacalai Tesque)、427mg DMAP和1.46ml三乙胺(Nacalai Tesque)。将该混合物在室温反应1小时，并减压浓缩。将该残余物溶于乙酸乙酯中，并用10％柠檬酸和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。将该溶液减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化该浓缩物，用己烷∶乙酸乙酯＝8∶1洗脱，获得了在硅胶薄层色谱中在Rf＝0.2有一个点的级分(用己烷∶乙酸乙酯＝6∶1作为展开溶剂)。通过减压蒸发除去该级分中的溶剂，获得了470mg含有高纯度二异丁酰基环戊烯酮的油状物。
如实施例1-(2)所述通过核磁共振对溶于重氯仿中的由此获得的二异丁酰基环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ1.18(12H，m，7-H，8-H，10-H，11-H)，2.61(2H，m，6-H，9-H)，5-10(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，5.88(1H，m，4-H)，6.39(1H，dd，J＝1.5，6.0Hz，2-H)，7.41(1H，dd，J＝2.5，6.0Hz，3-H)。
NMR结果是假定重氯仿的残留质子的化学位移值是7.24ppm来表示的。
二异丁酰基环戊烯酮的1H-NMR光谱如附图1所示。在附图1中，横轴代表化学位移值(ppm)，纵轴代表信号强度。
用于1H-NMR中信号标识的编号如下式[III]所示。
Figure C9981231000241
(18)将1.5g环戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入2.7g甲氧基乙酸(Nacalai Tesque)、794mg DMAP和5.36g二环己基碳化二亚胺(DCC；Nacalai Tesque)。将该混合物在室温反应2小时，并减压浓缩。将该残余物溶于乙酸乙酯中，并用10％柠檬酸和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。将该溶液减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化该浓缩物，用己烷∶乙酸乙酯＝2∶3洗脱，获得了在硅胶薄层色谱中在Rf＝0.34有一个点的级分(用己烷∶乙酸乙酯＝1∶1作为展开溶剂)。通过减压蒸发除去该级分中的溶剂，获得了300mg含有高纯度二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮的油状物。
如实施例1-(2)所述通过核磁共振对溶于重氯仿中的由此获得的二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ3.45(6H，s，7-H，9-H)，4.13(4H，m，6-H，8-H)，5.30(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，5.99(1H，m，4-H)，6.44(1H，dd，J＝1.5，6.5Hz，2-H)，7.46(1H，dd，J＝2.0，6.5Hz，3-H).
NMR结果是假定重氯仿的残留质子的化学位移值是7.24ppm来表示的。
二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮的1H-NMR光谱如附图2所示。在附图2中，横轴代表化学位移值(ppm)，纵轴代表信号强度。
用于1H-NMR中信号标识的编号如下式[IV]所示。
(19)将1.1g环戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入3.4g甲基马来酸、610mg DMAP和4.12g二环己基碳化二亚胺。将该混合物在室温反应2小时，并减压浓缩。将该残余物溶于乙酸乙酯中，并用10％柠檬酸和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。将该溶液减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化该浓缩物，用己烷∶乙酸乙酯＝3∶2洗脱，获得了在硅胶薄层色谱中在Rf＝0.6有一个点的级分和在Rf＝0.45有一个点的级分(用己烷∶乙酸乙酯＝1∶1作为展开溶剂)。
通过减压蒸发除去该级分中的溶剂，由Rf＝0.6级分获得了300mg含有高纯度二(甲基富马酰基)环戊烯酮的固体，由Rf＝0.45级分获得了300mg含有高纯度二(甲基马来酰基)环戊烯酮的油状物。
如实施例1-(2)所述通过核磁共振对溶于重氯仿中产物进行结构分析。所得结果如下所示。
1H-NMR
二(甲基富马酰基)环戊烯酮
δ3.80(6H，s，10-H，15-H)，5.31(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，6.03(1H，m，4-H)，6.48(1H，dd，J＝1.0，6.0Hz，2-H)，6.90(4H，m，7-H，8-H，12-H，13-H)，7.50(1H，dd，J＝2.0，6.0Hz，3-H)。
二(甲基马来酰基)环戊烯酮
δ3.76(6H，s，10-H，15-H)，5.31(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，6.07(1H，m，4-H)，6.31(4H，m，7-H，8-H，12-H，13-H)，6.44(1H，dd，J＝1.5，6.0Hz，2-H)，7.58(1H，dd，J＝2.0，6.0Hz，3-H)。
NMR结果是假定重氯仿的残留质子的化学位移值是7.24ppm来表示的。
二(甲基富马酰基)环戊烯酮的1H-NMR光谱如附图3所示。二(甲基马来酰基)环戊烯酮的1H-NMR光谱如附图4所示。在附图3和4中，横轴代表化学位移值(ppm)，纵轴代表信号强度。
用于二(甲基富马酰基)环戊烯酮1H-NMR中信号标识的编号如下式[V]所示。
用于二(甲基马来酰基)环戊烯酮1H-NMR中信号标识的编号如下式[VI]所示。
(20)将100μl 1M环戊烯酮水溶液和500l 200mM谷胱甘肽(还原的；Nacalai Tesque，170-10)水溶液(pH 3.0)混合在一起。将该混合物在60℃反应5小时。将该反应混合物经由0.5-μmCosmonice滤器过滤，并在下述条件下通过HPLC分离：
柱：TSKgel ODS-80Ts(5μm)20mm×25cm；
流动相A：0.1％TFA水溶液；
      B：含有0.1％TFA/50％乙腈的水溶液；
流速：7.5ml/分钟；
梯度：流动相A(10分钟)→流动相A到A∶B＝1∶1(55分钟)→A∶B＝1∶1到流动相B(15分钟)；
检测：在220nm的吸收度。
将200μl该反应混合物进行HPLC分离。收集在保留时间35.7分钟和36.1分钟的峰值级分，并减压蒸发至干，获得了5.5mg干燥的固体。
分析该干燥固体的结构。分别用JNM-A500(Nippon Denshi)测定核磁共振(NMR)光谱，用DX302质谱仪(Nippon Denshi)测定质谱(MS)，用UV-2500分光光度计(Shimadzu)测定紫外(UV)吸收光谱，用FTIR-8000PC红外分光光度计(Shimadzu)测定红外吸收(IR)光谱。所得结果如下所示。
1H-NMR
δ2.09(2H，m，5′-H)，2.28(1H，dd，J＝13.0，20.0Hz，5-H)，2.44(2H，m，4′-H)，2.78(1H，dd，J＝8.5，14.0，1′-H)，2.85或2.89(1H，dd，J＝3.0，6.0Hz，5-H)，2.92或2.95(1H，dd，J＝1.0，5.5Hz，1′-H)，3.86(2H，S，9′-H)，3.95(2H，m，4-H，6′-H)，4.46(1H，m，2′-H)，6.47或6.49(1H，d，J＝3.0Hz，3-H)。
将样本溶于0.1N DCl在重水中的溶液。所得结果是假定HOD的化学位移值为4.65ppm来表示的。
13C-NMR
δ26.3(5′-C)，31.7(4′-C)，31.9或32.1(1′-C)，39.3(4-C)，41.9(9′-C)，42.2或42.3(5-C)，53.3(6′-C)，54.1(2′-C)，133.5(3-C)，154.4(2-C)，around 173(3′-C，7′-C，8′-C，10′-C)，205.8(1-C)。
将样本溶于0.1N DCl在重水中的溶液。所得结果是假定二氧杂环己烷的化学位移值为67.4ppm来表示的。
用于1H-NMR和1C-NMR中峰标识的编号如下式[VII]所示。
Figure C9981231000281
FAB-MS
m/z 404(M+H)+，426(M+Na)+
使用甘油作为基质。
UV λmax251nm(水)
IR νKBr maxcm-12949，1710，1660，1539，1404，1203。
依据浸反射方法进行测定。
这些结果表明，该干燥的固体是2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮(下文简称为GM)。
实施例2
将HL-60(ATCC CCL-240)细胞在含有10％胎牛血清(FCS；JRH)的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker)中于37℃培养，其中细胞已经在56℃处理了30分钟，并且以2.5×105个细胞/ml的浓度悬浮在RPMI 1640培养基中。
将稀释至不同浓度的10μl二异丁酰基环戊烯酮、二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮、二(甲基富马酰基)环戊烯酮或二(甲基马来酰基)环戊烯酮在70％乙醇/水中的溶液加到5ml上述悬浮液中。在5％CO2存在下将该混合物在37℃培养24小时。使用10μl放线菌素D(Sigma)水溶液(0.5mg/ml)(诱导细胞程序死亡的已知试剂)代替样本，将该混合物在相同条件下培养以证实。
用光学显微镜检查培养的细胞。对于加入样本和放线菌素D培养的细胞，观察到细胞核缩合、细胞收缩并且形成了细胞程序死亡体。对于加入10μl 70％乙醇水溶液培养的对照细胞，没有观察到任何这种现象。
此外，用0.4％台盼蓝将一部分如上所述培养的细胞染色，并在光学显微镜下检查。计数没有被染色的活细胞数目和被染成蓝色的死亡细胞的数目。确定导致50％存活率的各样本的浓度(存活50(μM))。
表1
  样本   存活50(μM)
  二异丁酰基环戊烯酮二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮二(甲基富马酰基)环戊烯酮二(甲基马来酰基)环戊烯酮   8.8142.93.4
如上所述，每一种化合物都表现出抗肿瘤细胞的抗增殖活性和诱导细胞程序死亡的活性。此外，各化合物的旋光异构体和其盐表现出类似活性。
实施例3
(1)将2μl拓扑异构酶II(TopoGEN；2单位/ul)、2μl 10倍浓缩缓冲液[0.5M Tris-HCl(pH 8.0)，1.2M KCl，0.1M MgCl2，2.5mM三磷酸腺苷，5mM二硫苏糖醇]、2μl 1％牛血清白蛋白(TakaraShuzo)、11μl蒸馏水和2μl蒸馏水(对照)或2μl不同浓度的二丙酰基环戊烯酮、二异丁酰基环戊烯酮、二苯甲酰基环戊烯酮、二己酰基环戊烯酮、二(2-己烯酰基)环戊烯酮、二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮、二(甲基富马酰基)环戊烯酮或二(甲基马来酰基)环戊烯酮水溶液混合在一起。向其中加入1μl 0.25μg/μl pBR322 DNA(TakaraShuzo)。将所得混合物在37℃反应。反应30分钟后，向其中加入2μl含有1％十二烷基硫酸钠、50％甘油和0.02％溴酚蓝的水溶液以终止反应。
将20μl反应混合物施加到1％用琼脂糖L03(Takara Shuzo)和TAE缓冲液[40mM Tris，5mM乙酸钠，1mM乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)；用乙酸调节至pH 7.8]制备的琼脂糖凝胶上，并在TAE缓冲液中电泳。电泳后，将凝胶浸泡在1μg/ml溴化 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓水溶液中。将凝胶置于紫外线下，以显形DNA的电泳模式。对于加入水的对照，DNA形状从超螺旋型完全改转变成松弛型，而如果拓扑异构酶II的活性被抑制的话，则从超螺旋型到松弛型的转变被部分或完全抑制。
结果是，对于加入水的对照，DNA形状从超螺旋型完全改转变成松弛型。另一方面，DNA形状从超螺旋型到松弛型的转变被下述浓度的化合物部分抑制或完全抑制：浓度为0.1μM或更高的二丙酰基环戊烯酮、浓度为1μM或更高的二异丁酰基环戊烯酮、浓度为1μM或更高的二苯甲酰基环戊烯酮、浓度为10μM或更高的二己酰基环戊烯酮、浓度为10μM或更高的二(2-己烯酰基)环戊烯酮、浓度为50μM或更高的二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮、浓度为10μM或更高的二(甲基富马酰基)环戊烯酮、或浓度为5μM或更高的二(甲基马来酰基)环戊烯酮，这证实了各环戊烯酮衍生物抑制拓扑异构酶II的活性。
(2)如实施例3-(1)所述测定各环戊烯酮衍生物抑制拓扑异构酶I的活性，只是使用拓扑异构酶I(TopoGEN；0.01单位/ul)代替拓扑异构酶II，并使用含有100mM Tris-HCl(pH 7.9)，10mM EDTA，1mM亚精胺和50％甘油的溶液作为10倍浓缩缓冲液。
结果是，对于加入水的对照，DNA形状从超螺旋型完全改转变成松弛型。另一方面，DNA形状从超螺旋型到松弛型的转变被下述浓度的化合物部分抑制或完全抑制：浓度为1000μM或更高的二丙酰基环戊烯酮、浓度为500μM或更高的二异丁酰基环戊烯酮、浓度为50μM或更高的二苯甲酰基环戊烯酮、浓度为1000μM或更高的二己酰基环戊烯酮、浓度为500μM或更高的二(2-己烯酰基)环戊烯酮、浓度为1000μM或更高的二(甲氧基乙酰基)环戊烯酮、浓度为1000μM或更高的二(甲基富马酰基)环戊烯酮、或浓度为1000μM或更高的二(甲基马来酰基)环戊烯酮，这证实了各环戊烯酮衍生物抑制拓扑异构酶I的活性。
如上所述，上述每一种环戊烯酮衍生物以及在实施例1中描述的其它环戊烯酮衍生物都表现出抑制拓扑异构酶II的活性。在正常细胞中，拓扑异构酶II仅在分裂期间短暂表达，而当细胞癌变时，它在整个细胞周期都高度表达。这些环戊烯酮衍生物对拓扑异构酶II的抑制活性比对拓扑异构酶I(在癌变时拓扑异构酶I的表达水平或活性增加)的抑制活性强。
此外，各化合物的旋光异构体或其盐也表现出对拓扑异构酶II有特异性的类似活性。
实施例4
(1)将含有10％胎牛血清和浓度为2×105个细胞/ml的HL-60(ATCC CCL-240)细胞的5ml RPMI 1640培养基置于6-孔板的各个孔中。将该6-孔板在在5％CO2存在下于37℃培养24小时。然后向其中加入终浓度为0、0.63、1.3、2.5、5、10或20μM的二丙酰基环戊烯酮、二异丁酰基环戊烯酮或二(2-己烯酰基)环戊烯酮。继续培养6小时。
培养后，计数细胞数目。通过离心收获细胞，用PBS洗涤，以制备用一种样本处理的细胞。还制备在45℃加热10分钟后以相同方式培养的细胞。
依据在Molecular Cloning[Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)]中描述的方法将这些处理的细胞进行SDS-PAGE。将处理的细胞以2.5×106个细胞/ml的浓度悬浮在SDS-PAGE缓冲液中。将细胞悬浮液在100℃处理10分钟。将5μl每一细胞悬浮液施加到两个SDS-PAGE凝胶(5％堆积凝胶，10％分离凝胶)上，并进行电泳。将其中一个凝胶进行考马斯染色。把另一凝胶点在聚二氟乙烯迁移膜(ImmobilomTM，Millipore，Cat.#IPVH000-10)上。用Block Ace(Dainippon Pharmaceutical，Cat.#UK-B25)将该膜在4℃阻断。
将该阻断的膜与单克隆抗体HSP72/73(Ab-1)(Oncogene ResearchProducts，Cat.#HSP01)反应，其中该单克隆抗体能特异性地与热-诱导70-kDa热激蛋白反应。用含有0.05％吐温20的TBS洗涤该膜，然后用TBS洗涤。之后将该膜与缀合有过氧化物酶的第二抗体HRP-兔抗-小鼠IgG(H+L)(Zymed Laboratories，Inc.，Cat.#61-6520)反应，然后如上所述进行洗涤。将与第一和第二抗体反应过的该膜与致化学发光试剂RenaissanceTM(Dupont NEN，Cat.#NEL-100)反应。然后将该膜露置于X-射线底片上以证实诱导70-kDa热激蛋白。
结果观察到了热激蛋白。诱导程度如表2所示。在表2中，+代表诱导水平。+的增加数目表示增加的诱导。-表示没有观察到任何诱导。±表示观察到轻微诱导。
表2
  环戊烯酮衍生物   浓度(μM)
0.63   1.3   2.5   5   10   20
  二丙酰基环戊烯酮二异丁酰基环戊烯酮二(2-己烯酰基)环戊烯酮 -±±   ±++   ++++++   +++++++++   +++±   +++-
未处理对照的结果是-，在45℃加热10分钟后培养的细胞的结果是++。如上所述，每一化合物都在较低浓度下表现出诱导热激蛋白的活性。此外，各化合物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐表现出类似活性。
实施例5
使用二丙酰基环戊烯酮、二异丁酰基环戊烯酮和二(2-己烯酰基)环戊烯酮来测定它们抗白色念珠菌(Candida albicans)TIMMO136的抗真菌活性。
将白色念珠菌细胞在含有0.67％Yeast Nitrogen Base(Difco)和1.0％葡萄糖的YNBG培养基中培养(接种培养)。然后用新鲜的Yeast Nitrogen Base培养基将该培养物稀释至浓度为1×106个细胞/ml。将100μl该稀释液分散到96孔微量滴定板的每一孔中。
将10μl二丙酰基环戊烯酮、二异丁酰基环戊烯酮或二(2-己烯酰基)环戊烯酮在70％乙醇中的溶液以100μg/ml或500μg/ml的浓度加到孔中，或者将10μl 70％乙醇溶液加到孔中。将该微量滴定板在不振摇的情况下于30℃培养48小时(主要培养)。
二丙酰基环戊烯酮、二异丁酰基环戊烯酮和二(2-己烯酰基)环戊烯酮以500μg/ml的浓度抑制了白色念珠菌的生长。每一种化合物的最小生长抑制浓度都是500μg/ml。因此，这些化合物可用作抗真菌组合物的活性组分。此外，这些环戊烯酮衍生物的旋光异构体和其盐表现出类似活性。
实施例6
将人血管内皮细胞(Sanko Junyaku出售)以1×105个细胞/ml的浓度悬浮在含有10％FCS(HyClone)的RPMI-1640培养基(Gibco)中。将该悬浮液以100μl/孔的量接种到96孔微量滴定板中。
在5％CO2恒温箱中于37℃培养2天后，将100U/ml人重组TNF-α(Promega)加到单层血管内皮细胞中。将该微量滴定板在5％CO2恒温箱中于37℃培养6小时，以制备用TNF-α刺激的血管内皮细胞。
另一方面，将环戊烯酮、GM或二丙酰基环戊烯酮以不同浓度加到以1×106个细胞/ml的浓度悬浮在含有10％FCS的RPMI-1640培养基中的HL-60细胞中。将细胞在5％CO2恒温箱中于37℃培养3小时。培养后，向其中加入荧光剂5-羧基荧光素二乙酸酯、6-羧基荧光素二乙酸酯、琥珀酰亚胺酯(Molecular Probe)，并在37℃反应10分钟。将细胞用RPMI-1640培养基洗涤2次，并悬浮在含有10％FSC的RPMI-1640培养基中。
将荧光标记的HL-60细胞以100μl/ml的量铺在用TNF-α刺激的血管内皮细胞上。向其中以不同浓度加入环戊烯酮、GM或二丙酰基环戊烯酮。将该微量滴定板在5％CO2恒温箱中于37℃培养20分钟，以使血管内皮细胞与HL-60细胞之间发生粘着反应。
粘着反应后，洗涤该板以除去未粘着的细胞。向其中加入1％Triton X(Nacalai Tesque)以破坏粘着的细胞。用滤器测定在485/22nm(激发)和530/25nm(发射)的荧光强度。
将1×105个荧光标记细胞的荧光强度定义为100％，来确定代表与血管内皮细胞粘着的细胞比率的粘着比率。
结果如表3所示。当用TNF-α刺激时，血管内皮细胞与HL-60粘着的比率增加了。环戊烯酮、GM或二丙酰基环戊烯酮在10-7-10-4M浓度范围内以剂量依赖方式抑制了该增加。因此，环戊烯酮、GM和二丙酰基环戊烯酮都抑制了癌细胞与血管内皮细胞之间的粘着，这是抑制癌转移所必需的。此外，各化合物的旋光异构体和其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
表3
  测试物   浓度(μM)   粘着比例(％)
  未刺激对照用TNF-α刺激的对照环戊烯酮GM二丙酰基环戊烯酮 0.11101000.11101000.1110100   3.650.951.746.022.217.953.948.323.916.349.235.115.315.5
实施例7
将购自Japan SLC的ddY小鼠(雌性，7周大小)在用于实验前预饲养1周。
将1×106个Ehrlich腹水癌细胞腹膜内接种到每一小鼠中。在接种后这天给小鼠腹膜内施用10mg/kg环戊烯酮、30mg/kg GM或10mg/kg二丙酰基环戊烯酮。给对照小鼠施用盐水。
用癌细胞接种10天后，从小鼠中取出脾脏，细细地切碎，并悬浮在含有10％FCS(HyClone)的RPMI-1640培养基(Gibco)中，以获得一个细胞悬浮液。除去细胞悬浮液中粘着在塑料陪替氏培养皿上的粘着细胞，将未粘着细胞用作脾脏淋巴细胞。
将脾脏淋巴细胞以2×106/ml的浓度悬浮在含有10％FCS的RPMI-1640培养基中。将该悬浮液以100μl/孔的量接种到微量滴定板中。
如下所述制备受刺激细胞。将丝裂霉素C(Kyowa Hakko Kogyo)以50μg/ml的浓度加到以2×106个细胞/ml的浓度悬浮在RPMI-1640培养基中的Ehrlich腹水癌细胞中。将细胞在37℃处理30分钟，洗涤2次，然后悬浮在含有10％FCS的RPMI-1640培养基中，以制备浓度为2×106个细胞/ml的受刺激细胞。
将100μl由此制得的受刺激细胞铺在已经加入100μl/孔脾脏淋巴细胞的微量滴定板的每一孔上。将该板在5％CO2恒温箱中于37℃培养5天。在培养结束的前一天，向孔中加入37kBq3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(Daiichi Pure Chemicals)以脉冲标记细胞。培养结束后，将细胞收获到玻璃滤器上，以测定放射性。
所得结果如表4所示。通过用癌细胞刺激，显著地促进了从施用环戊烯酮、GM或二丙酰基环戊烯酮的小鼠中获得的脾脏淋巴细胞的生长，这意味着诱导了淋巴细胞与癌细胞的特异性反应。此外，各化合物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
表4
  测试物   剂量(mg/kg)   用癌细胞刺激  3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取(CPM)
  对照环戊烯酮GM二丙酰基环戊烯酮 103010   -+-+-+-+   104928806968025756870036291925020748
实施例8
将购自Japan SLC的ddY小鼠(雌性，7周大小)在用于实验前预饲养1周。
将1×106个Ehrlich腹水癌细胞腹膜内接种到每一小鼠中。在接种后这天给小鼠腹膜内施用10mg/kg环戊烯酮、30mg/kg GM或10mg/kg二丙酰基环戊烯酮。给对照小鼠施用盐水。
用癌细胞接种10天后，从小鼠中取出脾脏，细细地切碎，并悬浮在含有10％FCS(HyClone)的RPMI-1640培养基中，以获得一个细胞悬浮液。除去细胞悬浮液中粘着在塑料陪替氏培养皿上的粘着细胞，将未粘着细胞用作NK细胞。
将NK细胞以6×106/ml的浓度悬浮在含有10％FCS的RPMI-1640培养基中。将该悬浮液以100μl/孔的量接种到微量滴定板中。
如下所述制备靶细胞。将3700kBq51Cr(Amersham)加到1×106YAC-1细胞(Dainippon Pharmaceutical)中。将细胞在37℃培养1小时以进行标记。将标记的细胞洗涤2次，并以2×105/ml的浓度悬浮在含有10％FCS的RPMI-1640培养基中。
将100μl由此制得的靶细胞铺在已经加入NK细胞的微量滴定板的每一孔上。将该板在5％CO2恒温箱中于37℃培养5小时。培养后，将该板以1500rpm的转速离心5分钟。把100μl上清液收集在γ计数器管中。用自动γ计数器测定放射性(实验值)。
将100μl培养基加到反应系统中以代替NK细胞，测定放射性，以测定出从靶细胞自动释放出的放射性(对照值)。
此外，当把1％Triton(Nacalai Tesque)加到反应系统中以溶解51Cr标记的YAC-1细胞时，测定释放到上清液中的放射性，以测定出反应系统中包含的总放射性(总放射性值)。
依据下述方程可确定由NK细胞特异性介导的细胞毒性(％)。细胞毒性(％)＝[(实验值-对照值)/(总放射性值-对照值)]×100
结果如表5所示。在施用环戊烯酮、GM或二丙酰基环戊烯酮的小鼠中观察到了NK细胞的激活。施用这些化合物增强了活体中的免疫保护机制和抗癌细胞的细胞毒害活性。此外，各化合物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
表5
  测试物   剂量(mg/kg)   细胞毒性(％)
  对照环戊烯酮GM二丙酰基环戊烯酮 103010   3.515.519.013.5
实施例9
从Seac Yoshitomi购买Lewis大鼠(雄性，9周大小，体重约为250g)。
在开始实验前将大鼠禁食18小时。将溶于橄榄油(NacalaiTesque)中的二丙酰基环戊烯酮、二己酰基环戊烯酮、二(2-己烯酰基)环戊烯酮、二异丁酰基环戊烯酮或二苯甲酰基环戊烯酮以1或10mg/10ml/kg的剂量对大鼠(每组4只)口服给药。
施用测试物0.5小时后，将100μl 1％λ-角叉菜胶(Wako PureChemical)在盐水(Otsuka Pharmaceutical)中的悬浮液注射到大鼠右爪的足底内，以诱导足水肿。注射角叉菜胶3小时后，用测定足体积的装置(Ugo Basile)测定大鼠右足的体积。测定结果以增加比率表示，其中增加比率是基于施用角叉菜胶前测定的每只大鼠右足体积计算的。
所得结果如附图5所示。附图5表示的是环戊烯酮衍生物的给药量与足水肿增大比率之间的关系。横轴代表剂量(mg/ml)，纵轴代表增大比率(％)。
当以1mg/kg的剂量施用二丙酰基环戊烯酮时，观察到了抑制足水肿的趋势。以10mg/kg的剂量施用导致了显著抑制。以1或10mg/kg的剂量施用二己酰基环戊烯酮或二(2-己烯酰基)环戊烯酮导致了显著抑制。当以1mg/kg的剂量施用二异丁酰基环戊烯酮或二苯甲酰基环戊烯酮时，观察到了抑制足水肿的趋势。以10mg/kg的剂量施用导致了显著抑制。此外，各化合物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
在附图5中，标记*和**分别代表与对照组相比p＜0.05和p＜0.01的显著性差异。
实施例10
从Japan SLC购买C57BL/6小鼠(雄性，7周大小，体重约为25g)，并在实验前预饲养1周。
用盐水(Otsuka Pharmaceutical)将用作提高抗原的绵羊红细胞(Shimizu Laboratory Supplies)洗涤3次，并将其以1×109个细胞/ml的浓度悬浮在盐水中。将200μl该悬浮液腹膜内注射到小鼠体内以用抗原致敏。致敏5天后，将40μl类似制得的抗原注射到右爪的足底内，以进行抗原诱导来诱使足水肿。
从用抗原致敏当天开始，将溶于盐水中的二丙酰基环戊烯酮以不同浓度对小鼠(每组5只)腹膜内给药或口服给药，每天给药一次，给药3天。抗原诱导2天后，用测定足体积的装置(Ugo Basile)测定大鼠右足的体积，并用作DTH的指数。测定结果以增加比率表示，其中增加比率是依据下述公式基于抗原诱导前测定的每只大鼠右足体积计算的。
增加比率＝(抗原诱导后右足体积-抗原诱导前右足体积)/抗原诱导前右足体积
所得结果如附图6所示。在附图6中，纵轴代表抗原诱导所致的足体积增加比率(％)。当以1mg/kg的剂量腹膜内施用二丙酰基环戊烯酮时，观察到了抑制足水肿的趋势。以10mg/kg的剂量腹膜内给药或者以30mg/kg的剂量口服给药导致了显著抑制。此外，该环戊烯酮衍生物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
在附图6中，标记*和**分别代表与对照组相比p＜0.05和p＜0.01的显著性差异。
实施例11
(1)从ddY小鼠(雄性，7周大小，购自Japan SLC)中取出脾脏，细细地切碎，并悬浮在含有10％FCS(HyClone)的RPMI-1640培养基中，以获得一个细胞悬浮液。将该细胞悬浮液接种到塑料陪替氏培养皿中，并在CO2恒温箱中于37℃培养2小时，以除去粘着在培养皿上的粘着细胞。将未粘着细胞用作脾脏淋巴细胞。将200μl该脾脏淋巴细胞悬浮液以2×106/ml的细胞浓度接种到96孔微量滴定板的每一孔中。向除了对照孔以外的每一孔中都加入不同浓度的二丙酰基环戊烯酮。此外，向每一孔中加入5μgCon A(Nacalai Tesque)。将该板在CO2恒温箱中于37℃培养1天。培养后，向每一孔中加入1μCi 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷。再培养1天后，用液体闪烁计数器测定摄取到细胞内的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的量。
结果如附图7所示。附图7表示的是二丙酰基环戊烯酮的浓度与3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量之间的关系。横轴代表二丙酰基环戊烯酮的浓度(μM)，纵轴代表3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量(CPM)。中空棒代表没有刺激时3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量。阴影棒代表当用Con A刺激细胞时3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量。从附图7中可知，二丙酰基环戊烯酮以剂量依赖方式表现出抗由促细胞分裂剂刺激的小鼠淋巴细胞增殖的抑制活性。在10μM浓度时，增殖几乎被完全抑制。此外，该环戊烯酮衍生物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
(2)从BALB/c小鼠(雄性，6周大小，购自Japan SLC)和C57BL/6小鼠(雄性，6周大小，购自Japan SLC)中取出脾脏，并依据如实施例11-(1)所述的方法制得脾脏淋巴细胞。将每一细胞悬浮液的浓度调节至2×106个细胞/ml，从各悬浮液中取出100μl并混合在一起，接种到96孔微量滴定板中。向除了对照孔以外的每一孔中都加入不同浓度的二丙酰基环戊烯酮，并将该板在CO2恒温箱中于37℃培养4天。培养后，向每一孔中加入1μCi 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷，将该板再培养1天。用液体闪烁计数器测定摄取到细胞内的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的量。
结果如附图8所示。附图8表示的是二丙酰基环戊烯酮的浓度与3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量之间的关系。横轴代表二丙酰基环戊烯酮的浓度(μM)，纵轴代表3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量(CPM)。中空棒代表当取自其中一个细胞系的细胞独立地使用时3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量。阴影棒代表当取自两个细胞系的细胞混合在一起时3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取量。从附图8中可知，二丙酰基环戊烯酮以剂量依赖方式表现出抗由同种抗原刺激的淋巴细胞激活的抑制活性。在1μM浓度时，该反应几乎被完全抑制。此外，该环戊烯酮衍生物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
实施例12
(1)用CDF1小鼠(8周大小，雌性，购自Japan SLC)建立败血症性休克模型。用蒸馏水(对照)、或10mg/kg二丙酰基环戊烯酮或二异丁酰基环戊烯酮对小鼠皮下给药。给药30分钟后，给每一小鼠腹膜内施用20μg脂多糖(LPS；Sigma)。施用LPS 1.5小时后，从小鼠中采集血样。使用市售ELISA用具(R&D)测定从采集的血样分离出的血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α的量。每组由4只小鼠构成。
所得结果如表6所示。
表6
  组   剂量(mg/kg)   TNF的量(ng/ml)平均±SE
  对照二丙酰基环戊烯酮二异丁酰基环戊烯酮 1010   7.53±0.484.61±0.57**3.39±0.33***
与施用蒸馏水的对照组相比，在施用10mg/kg二异丙酰基环戊烯酮或二异丁酰基环戊烯酮的组中，TNF-α的生成被显著抑制了。在表6中，标记**和***分别代表与对照组相比p＜0.01和p＜0.001的显著性差异。此外，该环戊烯酮衍生物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
(2)通过给CDF1小鼠(8周大小，雌性)腹膜内施用20μgLPS来建立败血症性休克模型。施用LPS前30分钟，口服施用30或100mg/kg二丙酰基环戊烯酮或二异丁酰基环戊烯酮。施用LPS 1.5小时后，从小鼠中采集血样。使用市售ELISA用具测定从采集的血样分离出的血清中TNF-α的量。每组由4只小鼠构成。
所得结果如表7所示。与对照组相比，口服施用二丙酰基环戊烯酮或二异丁酰基环戊烯酮以剂量依赖方式抑制了TNF的生成。此外，该环戊烯酮衍生物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
表7
  组   剂量(mg/kg)   TNF的量(ng/ml)平均±SE
  对照二丙酰基环戊烯酮二丙酰基环戊烯酮二异丁酰基环戊烯酮二异丁酰基环戊烯酮 3010030100   5.72±1.022.95±0.14*1.26±0.15**3.92±0.132.48±0.43*
*，**：p＜0.05，0.01与对照比较
实施例13
(1)给7周大小的雌性DBA/2小鼠腹膜内施用小鼠白血病P-388(1.1×106个细胞/小鼠)。施用后立即腹膜内给予单次剂量的10mg/kg二丙酰基环戊烯酮。另一方面，以类似方式给对照组腹膜内施用盐水。计算分别由8只小鼠构成的2个组中的小鼠存活数目、平均存活天数和存活延长比率。
结果是，对于对照组，平均存活天数是10.1天。对于施用二丙酰基环戊烯酮的这一组，平均存活天数是13.9天。计算的存活延长比率为137.0％。因此，观察到了显著的存活延长作用。
以类似方式使用Meth A肿瘤细胞系统：BALB/c小鼠进行测试。结果是，对于对照组，平均存活天数是13.4天。对于施用二丙酰基环戊烯酮的这一组，平均存活天数是16.9天。计算的存活延长比率为126.2％，这表明具有显著的存活延长作用。
此外，该环戊烯酮衍生物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
(2)将小鼠实体瘤Meth A(2×106个细胞/小鼠)皮下注射到8周大小的雌性BALB/c小鼠的背部内。然后，在同一位点皮下注射二丙酰基环戊烯酮，连续注射5天。以类似方式给对照组小鼠皮下注射盐水。每组由8只小鼠构成。
2周后，取出在小鼠背部形成的癌变组织，并测定该组织的重量。
结果如表8所示。对于对照组，癌变组织的平均重量为0.61g。对于施用二丙酰基环戊烯酮的组，癌变组织的平均重量为0.05g。计算的抑制比率为92.3％。在施用二丙酰基环戊烯酮这一组的8只小鼠当中，有5只没有形成癌变组织。此外，该环戊烯酮衍生物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
表8
  组  癌重量(g)平均±SE   抑制比率(％)
  对照二丙酰基环戊烯酮   0.61±0.200.05±0.08   -92.3
(3)使用两种类型癌细胞-Ehrlich腹水癌(EAC)和Meth A测定二丙酰基环戊烯酮和二异丁酰基环戊烯酮抗不同腹水癌的制癌活性，其中测试物是以不同剂量腹膜内给药或口服给药。腹膜内移植的细胞数量和宿主动物如表9所示。
表9
  癌细胞   小鼠   移植的细胞数目
  EACMeth A   ddY(雌性，5周大小)BALB/c(雌性，7周大小)   1.2×1062.0×106
从移植癌细胞后的这天开始，将二丙酰基环戊烯酮或二异丁酰基环戊烯酮腹膜内给药或口服给药，连续给药5天。以类似方式用可注射蒸馏水给对照组给药。计算由8只小鼠构成的每组的平均存活天数、存活延长比率、和存活30天的数目。
所得结果如表10-13所示。表10表示的是当把各测试物对移植EAC的小鼠腹膜内给药时的存活延长作用。表11表示的是当把各测试物对移植Meth A的小鼠腹膜内给药时的存活延长作用。表12表示的是当把各测试物对移植EAC的小鼠口服给药时的存活延长作用。表13表示的是当把各测试物对移植Meth A的小鼠口服给药时的存活延长作用。
二丙酰基环戊烯酮和二异丁酰基环戊烯酮在移植EAC的小鼠中表现出优良的存活延长作用。尤其是，在两个腹膜内给药组中都观察到了存活30天的小鼠。二丙酰基环戊烯酮甚至在口服给药时也表现出很强的作用。
此外，在通过对移植Meth A的小鼠腹膜内给药来治疗的组中也观察到了存活延长作用。在口服给药二丙酰基环戊烯酮的组中观察到了存活30天的小鼠。
此外，该环戊烯酮衍生物的旋光异构体及其盐表现出类似活性。
另外，其它环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐也表现出类似活性。
表10
  组   剂量(mg/kg)   平均存活天数(天)   延长比率(％)   存活30天的数目
  对照二丙酰基环戊烯酮二异丁酰基环戊烯酮 103010   12.528.125.317.0   100＞225＞202136   0630
表11
  组   剂量(mg/kg)   平均存活天数(天)   延长比率(％)   存活30天的数目
  对照二丙酰基环戊烯酮二异丁酰基环戊烯酮 1010   11.820.515.5   100174132   000
表12
  组   剂量(mg/kg)   平均存活天数(天)   延长比率(％)   存活30天的数目
  对照二丙酰基环戊烯酮二异丁酰基环戊烯酮 3010030   12.524.120.915.1   100＞193167121   0400
表13
  组   剂量(mg/kg)   平均存活天数(天)   延长比率(％)   存活30天的数目
  对照二丙酰基环戊烯酮 30   11.817.3   100＞147   02
实施例14
注射剂
(1)将二异丁酰基环戊烯酮、二丙酰基环戊烯酮或二甲氧基环戊烯酮以1％的浓度加到盐水中，以制备注射剂。
(2)将二(甲基富马酰基)环戊烯酮或二(甲基马来酰基)环戊烯酮和甘草酸分别以0.5％和0.1％的浓度加到盐水中，以制备注射剂。
实施例15
片剂
(1)制备每片含有100mg二异丁酰基环戊烯酮或二丙酰基环戊烯酮和适量微晶纤维素的片剂，并进行糖包衣。
(2)制备每片含有0.1mg二(甲基富马酰基)环戊烯酮、10mg甘草酸二钾盐和适量微晶纤维素的片剂，并进行糖包衣。
如上所述，本发明提供了具有生理活性，例如免疫调节活性、抗炎活性、抑制肿瘤坏死因子生成的活性、和抗真菌活性的环戊烯酮衍生物或其旋光异构体或其盐。含有这些化合物作为其活性组分的药物组合物可用于维持活体内的内环境稳定，和用作用于治疗或预防下述疾病的药物组合物：对于其治疗或预防需要免疫调节的疾病，对于其治疗或预防需要抑制炎症的疾病，对于其治疗或预防需要抑制肿瘤坏死因子生成的疾病，对于其治疗或预防需要抑制病理性微生物的疾病等。

Claims (1)

1.一种药物组合物，其包含至少一种化合物作为活性成分，所述化合物选自：二乙酰氧基环戊烯酮、二丙酰氧基环戊烯酮、二丁酰氧基环戊烯酮、二异丁酰氧基环戊烯酮、二戊酰氧基环戊烯酮、二己酰氧基环戊烯酮、二辛酰氧基环戊烯酮、二癸酰氧基环戊烯酮、二肉豆蔻酰氧基环戊烯酮、二(甲氧基乙酰氧基)环戊烯酮、二(甲基富马酰氧基)环戊烯酮、二(甲基马来酰氧基)环戊烯酮、二(2-己烯酰氧基)环戊烯酮、二(3-辛烯酰氧基)环戊烯酮和二苯甲酰氧基环戊烯酮。
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