ES2245084T3 - Sustancias capaces de inducir apoptosis. - Google Patents
Sustancias capaces de inducir apoptosis.Info
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Abstract
Un procedimiento para la fabricación de un compuesto seleccionado del grupo consistente en 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona y 4-5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona, caracterizado por incluir una etapa que consiste en someter al menos un compuesto seleccionado de los siguientes (a), (b), (c) y (d) a un tratamiento térmico: a) pentosa seleccionada del grupo consistente en xilosa yribosa; b) derivados de pentosa en el punto (a) anterior; c)compuestos que contienen pentosa en el punto (a) anterior; d) compuestos que contienen derivados en el punto (b) anterior.
Description
Sustancias capaces de inducir apóptosis.
La presente invención se refiere a una sustancia
que tiene capacidad para inducir apóptosis útil en el campo de
agentes farmacéuticos, alimentos y bebidas, a un procedimiento para
su fabricación y a agentes farmacéuticos, alimentos y bebidas que
contienen dicha sustancia que tiene capacidad para inducir
apóptosis.
En los últimos años, ha llamado la atención un
modo de apóptosis que se refiere a la muerte de tejidos celulares.
A diferencia de la necrosis que es una muerte celular patológica,
la apóptosis es una muerte que queda integrada desde el principio en
los genes de la propia célula. Así, se biosintetiza una proteína
génica de muerte programada activando un gen que programa la
apóptosis en el que algunas causas externas o internas actúan como
desencadenante, o en otros casos, se activa una proteína de muerte
programada que existe en una célula como tipo no activado. Se cree
que la propia célula se degrada por la proteína de muerte
programada producida de tipo activado por lo que se origina la
muerte de la célula. Si dicha apóptosis se pudiera expresar en
tejidos o células deseadas, sería ahora posible excluir las células
innecesarias o perjudiciales del cuerpo en su forma natural y esto
será significativamente importante.
Un objeto de la presente invención es ofrecer una
sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis útil en el
campo de agentes farmacéuticos, alimentos y bebidas, ofrecer un
procedimiento para su fabricación y además ofrecer agentes
farmacéuticos, alimentos y bebidas que contienen dicha sustancia
que tiene capacidad para inducir apóptosis como componente
efectivo.
Los autores de la invención han llevado a cabo
una intensa investigación para conseguir los objetos anteriormente
citados, han encontrado que un producto termotratado obtenido
calentando al menos un compuesto seleccionado de (a) pentosa, (b)
derivados de pentosa tales como desoxirribosa, (c) compuestos que
contienen pentosa tales como ribonucleósidos, ribonucleótidos y
ácido ribonucleico y (d) compuestos que contienen derivados de
pentosa tales como desoxirribonucleósidos, desoxirribonucleótidos y
ácido desoxirribonucleico tienen una fuerte acción inductora de
apóptosis hacia células cancerosas y tienen éxito en aislar una
sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis que es un
componente activo de dicho producto termotratado y constituye la
forma de llevar a cabo la presente invención.
El sumario de la presente invención es como
sigue. Así, la primera característica de la presente invención se
refiere a un procedimiento para la fabricación de un compuesto
seleccionado del grupo consistente en
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
y
4-5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
caracterizado porque incluye una etapa de someter al menos un
compuesto seleccionado de los siguientes (a), (b), (c) y (d) a un
tratamiento térmico:
- a)
- pentosa seleccionada del grupo consistente en xilosa y ribosa;
- b)
- derivados de pentosa en el punto (a) anterior;
- c)
- compuestos que contienen pentosa en el punto (a) anterior;
- d)
- compuestos que contienen derivados en el punto (b) anterior.
Ejemplos de los derivados de pentosa son
desoxipentosa tales como desoxirribosa y derivados de pentosa en
los que un grupo que puede tener una carga negativa tal como grupo
ácido fosfónico o grupo ácido sulfúrico, está unido en la posición
5. Ejemplos de los compuestos que contienen pentosa son
ribonucleósidos, ribonucleótidos, ácido ribonucleico y pentosa en
los que un grupo que puede tener una carga negativa tal como un
grupo ácido fosfórico o un grupo ácido sulfúrico está unido en la
posición 5. Ejemplos de los compuestos que contienen derivados de
pentosa son desoxirribonucleósidos, deoxirribonucleótidos y ácido
desoxirribonucleico. Ejemplos de la sustancia que tiene capacidad
para inducir apóptosis son los compuestos seleccionados de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
y
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
La segunda característica de la presente
invención se refiere a un compuesto que induce apóptosis
seleccionado de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
La tercera característica de la presente
invención se refiere a un agente farmacéutico para el tratamiento o
prevención de una enfermedad que es sensible a un compuesto
seleccionado de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona,
caracterizado porque dicho agente contiene un compuesto seleccionado
de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
como componente efectivo.
Ejemplos del agente farmacéutico en la
realización de la tercera característica de la presente invención
son agentes para el tratamiento de cáncer, reumatismo, diabetes
mellitus de tipo II, enanismo, enfermedad inflamatoria,
arteriosclerosis, enfermedad nerviosa, lesión por reperfusión
isquémica y enfermedad viral.
La cuarta característica de la presente invención
se refiere a alimentos o bebidas que contienen un compuesto
seleccionado de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
Ejemplos del alimento o bebida en la realización
de la cuarta característica de la presente invención se fabrican
para el tratamiento de cáncer, reumatismo, diabetes mellitus de
tipo II, enanismo, enfermedad inflamatoria, arteriosclerosis,
enfermedad nerviosa, lesión por reperfusión isquémica y enfermedad
viral.
La Figura 1 muestra un espectro de masas de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 2 muestra un espectro de RMN de ^{1}H
de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 3 muestra un espectro de masas de
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 4 muestra un espectro de RMN de ^{1}H
de
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 5 muestra un espectro de masas de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
La Figura 6 muestra un espectro de RMN de ^{1}H
de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
La Figura 7 muestra un espectro de masas de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
La Figura 8 muestra un espectro de RMN de ^{1}H
de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
La Figura 9 muestra la relación entre la
concentración de pentosa y la cantidad producida de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 10 muestra un espectro de masas del
pico 1.
La Figura 11 muestra un espectro de masas del
pico 3.
La Figura 12 muestra un espectro de RMN de
^{1}H del pico 1.
La Figura 13 muestra un espectro de RMN de
^{1}H del pico 3.
La Figura 14 muestra la concentración de
NO_{2}^{-} en el medio cuando se añadió
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
seguido por incubación bajo cada una de las condiciones de
incubación.
La presente invención se ilustrará a continuación
de forma específica como sigue.
Pentosa es un nombre general para sacáridos que
tienen cinco carbonos y arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa, y
similares están presentes en la naturaleza como aldopentosa,
mientras que ribulosa y xilulosa están presentes en la naturaleza
como cetopentosa.
Ejemplos de derivados de pentosa son
desoxipentosa y pentitol y, para la primera, desoxirribosa mientras
que para el último, ribitol, arabitol y xilitol están presentes de
forma natural. Además, son también derivados de pentosa
aminosacáridos, ácido aldónico, ácido aldárico y similares que
tienen cinco carbonos y se pueden preparar por un procedimientos de
síntesis.
Ejemplos del compuesto que contiene pentosa son
compuestos de bajo peso molecular tales como fosfato de pentosa,
ribonucleósidos y ribonucleótidos y compuestos de alto peso
molecular tales como ácido ribonucleico, arabinano y xilano. También
son compuestos que contienen pentosa ésteres, éteres, glicósidos y
similares de pentosa y sus sales, y éstos se preparan por un
procedimiento de síntesis.
Ejemplos del compuesto que contiene derivado de
pentosa son fosfato de desoxipentosa, desoxirribonucleósidos,
desoxirribonucleótidos y ácido desoxirribonucleico que contiene
desoxipentosa y riboflavina y ácido ribitolteioico que contiene
pentitol. Los compuestos que contienen derivado de pentosa son
también ésteres, éteres, amidas, glicósidos y similares de los
derivados de pentosa y sus sales y éstos se preparan por un
procedimiento de síntesis.
Ácido ribonucleico, ribonucleótidos,
ribonucleósidos, ácido desoxirribonucleico, desoxirribonucleótidos
y desoxirribonucleósidos actúan como coenzimas o desempeñan una
función de conservación y expresión de información genética y son
sustancias bastante importantes para los organismos vivos.
Ribosa-5-fosfato,
ribulosa-5-fosfato y
xilulosa-5-fosfato se encuentran en
una amplia gama de organismos como intermedios metabólicos del
ciclo de pentosa fosfato. Las sustancias gomosas de las plantas,
mucílago, hemicelulosa y polisacáridos bacterianos contienen
arabinosa y xilosa y lixoflavina en músculo cardíaco humano y un
cierto tipo de antibióticos son derivados de xilosa.
Pentosa cuando un grupo que puede tener una carga
negativa está unido en la posición 5 y un compuesto que contiene
pentosa cuando un grupo que puede tener una carga negativa está
unido en la posición 5 también están incluidas en el compuesto que
contiene pentosa usado en la presente invención. En la presente
invención, un grupo que puede tener una carga negativa puede ser
cualquier grupo con tal que éste tenga una carga negativa en una
solución acuosa en al menos unas condiciones de pH 1 a 13 y 0ºC a
200ºC y son ejemplos grupo ácido fosfórico y grupo ácido sulfúrico.
Además, en la presente memoria descriptiva están incluidas sales,
ésteres y anhídridos de ácido de los mismos en un grupo que puede
tener una carga negativa. No obstante, aunque un grupo carboxilo es
un grupo que puede tener una carga negativa, aldopentosa que tiene
un grupo carboxilo en la posición 5 es ácido urónico y, por tanto,
está excluido del compuesto que contiene pentosa usado en la
presente invención.
Ejemplos de la pentosa en la que un grupo que
puede tener una carga negativa está unido en la posición 5 son
ribosa-5-fosfato y
ribosa-5-sulfato.
Ejemplos de un compuesto que contiene pentosa en
el que un grupo que puede tener una carga negativa está unido en la
posición 5 son ácido ribonucleico, ribonucleótidos y
ribonucleósidos, así como productos degradados de los mismos, se
pueden usar derivados de los productos degradados y sales de los
productos degradados que son los productos preparados por
tratamiento químico, enzimático o físico de los mismos.
Pentosa, derivados de pentosa, compuestos que
contienen pentosa y compuestos que contienen derivados de pentosa
se obtienen por extracción de animales, plantas o microorganismos,
se fabrican por un procedimiento de fermentación, se sintetizan por
un medio químico y similares, y se puede usar un producto por
cualquiera de los medios de fabricación en la presente invención
con tal que se forme por un tratamiento térmico una sustancia que
tenga una capacidad para inducir apóptosis.
En la presente invención, se puede usar también
una sustancia que contiene pentosa seleccionada del grupo
consistente en xilosa + ribosa, derivados de pentosa, compuestos
que contienen pentosa y/o compuestos que contienen derivados de
pentosa. Tejidos de animales y plantas y células de animales,
plantas y microorganismos contienen diversos tipos de pentosa
seleccionados del grupo consistente en xilosa + ribosa, derivados de
pentosa, compuestos que contienen pentosa y compuestos que
contienen derivados de pentosa y, por tanto, éstos se pueden usar
en la presente invención como tales.
En la presente invención, no existe limitación
particular en cuanto al procedimiento de tratamiento térmico en la
fabricación de la sustancia que tiene capacidad para inducir
apóptosis con tal que esté en las condiciones en las que se obtiene
un producto termotratado que tiene capacidad para inducir apóptosis
y, por ejemplo, se calienta al menos un compuesto seleccionado de
los puntos (a) a (d) anteriormente citados a
30-400ºC durante desde unos pocos segundos a unos
pocos días o, con preferencia, a 50-200ºC durante
desde unos pocos segundos a 24 horas, después de lo cual se puede
obtener un producto termotratado que tiene capacidad para inducir
apóptosis. En el producto termotratado se producen dos o más
sustancias que tienen una capacidad para inducir apóptosis y,
dependiendo del objeto, las condiciones de tratamiento térmico
tales como pH, tiempo, temperatura y concentración de materiales se
pueden modificar, después de lo cual se puede preparar un producto
termotratado que tiene capacidad para inducir apóptosis que contiene
una sustancia deseada.
Por ejemplo, cuando se usan ribosa o
ribosa-5-fosfato, se puede obtener
un producto termotratado que contiene
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
calentando, por ejemplo, a 80-150ºC durante unos
pocos minutos a unos pocos días.
De aquí en adelante, se hará referencia al
producto termotratado del compuesto seleccionado de los puntos (a)
a (d) anteriores que tiene capacidad para inducir apóptosis
simplemente como el producto termotratado de la presente
invención.
No existe limitación particular para la
concentración del material una vez calentado con tal que la
concentración esté dentro de un intervalo tal que se pueda obtener
por el tratamiento térmico la sustancia que tiene capacidad para
inducir apóptosis. Así, la concentración se puede decidir teniendo
en consideración la facilidad de trabajo, el rendimiento y
consideraciones similares. El tratamiento término en la presente
invención puede ser calentamiento por vía húmeda o calentamiento por
vía seca. En el caso de un calentamiento por vía húmeda, se puede
usar cualquiera de los procedimientos de calentamiento por vía
húmeda tales como calentamiento con vapor, calentamiento con vapor a
alta presión, calentamiento a alta presión y similares, mientras
que, en el caso de un calentamiento por vía seca, se puede usar
cualquiera de los procedimiento de calentamiento por vía seca tales
como calentamiento directo usando aire seco y caliente y un
calentamiento indirecto desde una fuente de calor a través de una
separación. Ejemplos del calentamiento directo son un calentamiento
seco por una corriente de aire y un calentamiento seco por medio de
pulverización mientras que los de calentamiento indirecto son
calentamiento por medio de un tambor y similares. Además, el
material para la sustancia que tiene capacidad para inducir
apóptosis de la presente invención se puede tratar por cualquiera de
los procedimientos comunes de calentamiento tales como ebullición,
tostación, calcinación, decocción, inyección de vapor,
vesiculación, fritura y similares.
La sustancia que tiene capacidad para inducir
apóptosis de la presente invención se puede purificar usando una
acción que induce apóptosis como indicador. En lo que se refiere a
los medios de purificación, se pueden usar medios de purificación
conocidos convencionalmente tales como procedimiento químico y
procedimiento físico.
Por ejemplo, cuando se usa ribosa y su solución
acuosa 2M se calienta a 121ºC durante 14 horas, se produce
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en el producto termotratado. La
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en el producto termotratado se extrae con un disolvente y se
concentra el extracto. El concentrado se separa por una
cromatografía en columna sobre gel de sílice, se concentra la
fracción eluida de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
seguidamente se extrae la
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
del concentrado con cloroformo y el extracto concentrado se somete
a una cromatografía en columna en fase normal después de lo cual se
aísla
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en el producto termotratado de la presente invención.
Cuando el producto termotratado anterior de
ribosa se somete a un tratamiento con una columna de resina de
intercambio iónico o, con preferencia, una columna de resina de
intercambio iónico aniónica y se recogen las fracciones no
adsorbidas, se purifica a continuación la
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Como alternativa, el producto termotratado anterior de ribosa se
trata con una columna de carbón activado, se separan las fracciones
no absorbentes y se lava la columna y eluye con un disolvente
orgánico hidrófilo tal como una solución acuosa de etanol, con
preferencia una solución acuosa de etanol al 40% o superior, dando
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
pura. Cuando se combinan ambos procedimientos, se puede obtener
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
de mayor pureza.
Mediante el uso del mismo medio de purificación,
es posible obtener un compuesto seleccionado de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
y
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
a partir del producto termotratado de la presente invención.
A propósito, el producto puro y el producto
parcialmente puro que se purifica por dichos medios de purificación
también están incluidos en la sustancia que tiene capacidad para
inducir apóptosis de la presente invención.
Los autores de la presente invención han
descubierto que
trans-4,5-dihidroxi-2-ciclopentenal
citado en Biochemistry, 35, 659-665
(1996) y sus análogos están contenidos en el producto termotratado
de la presente invención y han descubierto que estos compuestos
muestran una acción anticancerígena, una acción que induce apóptosis
y similares.
Los autores de la presente invención también han
podido aislar
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
y
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
a partir del producto termotratado de la presente invención. Estos
han descubierto además que se produce
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
a partir de
4,5-dihidroxi-2-pentenal
y han podido aislarlo con éxito. También han descubierto que
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
reacciona con un compuesto que contiene SH dando un compuesto
representado por la fórmula [I] y han podido aislarlo con éxito.
Ellos también han descubierto que estos compuestos tienen
actividades fisiológicas tales como actividad para suprimir el
crecimiento de células de cáncer y actividad para inducir
apóptosis.
En consecuencia, cuando se usa como componente
efectivo un compuesto seleccionado de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
(en lo sucesivo denominados el compuesto de la presente invención),
es posible ahora ofrecer un agente farmacéutico para el tratamiento
o prevención de una enfermedad que muestre una sensibilidad hacia el
compuesto de la presente invención tal como una enfermedad
cancerígena, una enfermedad que requiera inducción de apóptosis,
una enfermedad que requiera la supresión de la producción de oxígeno
activo, una enfermedad que requiera la inducción de producción de
factor de crecimiento tipo insulina humana, una enfermedad que
requiera la inducción de producción de proteína de choque térmico y
similares.
Cuando un compuesto que se selecciona del
producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la
presente invención se usa como componente efectivo y se prepara en
una preparación farmacéutica mezclándolo con vehículos farmacéuticos
conocidos, es posible ahora preparar un inductor de apóptosis. Por
lo general, un compuesto que se selecciona del producto termotratado
de la presente invención o el compuesto de la presente invención se
mezcla con un vehículo líquido o sólido farmacéuticamente aceptable
y, si fuera necesario, se añade al mismo un disolvente, agente de
dispersión, emulsionante, tampón, estabilizador, carga, ligante,
agente disgregante, lubricante y similares, dando un inductor de
apóptosis que puede estar en forma sólida tal como comprimidos,
granulados, polvos diluidos, polvos, cápsulas y similares o en forma
líquida tal como soluciones, suspensiones, emulsiones y similares.
Además, este puede estar en una preparación seca que se puede hacer
líquida añadiendo un vehículo apropiado antes de
usar.
usar.
El inductor de apóptosis de la presente invención
se puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo,
por inyección o infusión por goteo intravenoso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar
dependiendo del modo anteriormente citado de administración y de la
forma de la preparación. En el caso de preparaciones orales, se
pueden usar almidón, lactosa, azúcar, manitol, carboximetilcelulosa,
almidón de maíz, sales inorgánicas y similares. En la fabricación
de preparaciones orales, se pueden mezclar con los mismos además
ligantes, agentes disgregantes, agentes tensioactivos, lubricantes,
promotores de la fluidez, correctores del sabor, agentes
colorantes, aromatizantes y similares.
Por otro lado, en el caso de preparaciones
parenterales, éstas se pueden preparar por procedimientos comunes en
los que se disuelve o se suspende un compuesto que se selecciona del
producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la
presente invención que es un componente efectivo de la presente
invención en un diluyente tal como agua destilada para inyección,
solución salina fisiológica, solución acuosa de glucosa, aceite
vegetal para inyección, aceite de sésamo, aceite de cacahuete,
aceite de semilla de soja, aceite de maíz, propilenglicol,
polietilenglicol y similares, seguido, en caso necesario, por la
adición de bactericidas, estabilizadores, agentes de isotonicidad,
analgésicos y similares.
El inductor de apóptosis que contiene un
compuesto que se selecciona del producto termotratado de la
presente invención o el compuesto de la presente invención se
administra por una vía adecuada dependiendo de la forma de
preparación. Tampoco existe limitación particular para el
procedimiento de administración y se puede administrar mediante uso
oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para inyección se
administran, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular,
subcutánea, intracutánea y vías similares, mientras que las
preparaciones para uso externo incluyen supositorios y
similares.
La dosis como inductor de apóptosis que contiene
el producto termotratado de la presente invención como componente
efectivo está determinada de forma apropiada por su forma de
preparación, procedimiento de administración, objeto de uso y edad,
peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es
constante, aunque normalmente, la cantidad del componente efectivo
contenida en la preparación varía de 1 a 1000 mg, con preferencia,
de 10 a 200 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede
variar dependiendo de los diversos estados patológicos y, por
tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en
algunos casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una
dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la
presente invención se puede administrar directamente por vía oral
y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo
que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como un inductor de apóptosis que
contiene el compuesto seleccionado del compuesto de la presente
invención como componente efectivo está determinada de forma
apropiada por su forma de preparación, procedimiento de
administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del
paciente que se trata y no es constante, aunque normalmente, la
cantidad del componente efectivo contenido en la preparación varía
de 0,01 a 50 mg, con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para
adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los
diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes
dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en
otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las
anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención se
puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede
añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente puede
ingerirse de una forma rutinaria.
El producto termotratado de la presente invención
o el compuesto de la presente invención tiene una acción que induce
apóptosis frente a células de cáncer, una acción supresora del
crecimiento celular y una acción inhibidora de la topoisomerasa II.
Se puede fabricar un agente anticancerígeno cuando un producto
termotratado de la presente invención o un compuesto de la presente
invención se use como componente efectivo. Así, cuando un producto
termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente
invención se usa como componente efectivo y se elabora en forma de
una preparación combinando con un vehículo farmacéutico conocido,
se puede fabricar un agente anticancerígeno. La fabricación del
agente anticancerígeno se puede llevar a cabo por un procedimiento
similar al citado antes.
El agente anticancerígeno se puede administrar
bien por vía oral o parenteral, por ejemplo, por inyección o
infusión por goteo intravenoso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar
dependiendo del modo de administración anteriormente citado y de la
forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso
del inductor de apóptosis anteriormente citado.
El agente anticancerígeno se administra por una
vía apropiada dependiendo de la forma de administración. No existe
tampoco limitación particular en cuanto al procedimiento de
administración y se puede administrar por medio de uso oral, uso
externo e inyección. Las preparaciones para inyección se
administran, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular,
subcutánea, intracutánea y similares, mientras que las preparaciones
para uso externo incluyen supositorios y similares.
La dosis como un agente anticancerígeno que
contiene el producto termotratado de la presente invención como
componente efectivo está determinada apropiadamente por su forma de
preparación, procedimiento de administración, objeto de uso y edad,
peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es
constante aunque, normalmente, la cantidad del producto
termotratado de la presente invención contenida en la preparación
varía de 1 a 1000 mg, con preferencia de 10 a 200 mg por día (para
adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los
diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes
dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en
otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las
anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención se
puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede
añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente puede
ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como agente anticancerígeno que contiene
el compuesto seleccionado del compuesto de la presente invención
como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su
forma de preparación, procedimiento de administración, objeto de
uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no
es constante, aunque normalmente, la cantidad del componente eficaz
contenido en la preparación varía de 0,01 a 50 mg, con preferencia
de 0,1 a 10 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede
variar dependiendo de los diversos estados patológicos y, por tanto,
pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos
casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis
mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente
invención se puede administrar directamente por vía oral y, además,
se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente
puede ingerirse de una forma rutinaria.
El reumatismo es una enfermedad autoinmune en la
que los impedimentos tienen lugar en células periosteales y células
del cartílago. El producto termotratado de la presente invención o
el compuesto de la presente invención tiene una acción inductora de
apóptosis hacia células sinoviales. Por consiguiente, se puede
fabricar un agente antirreumático cuando se use como componente
eficaz un producto termotratado de la presente invención o el
compuesto de la presente invención. Así, cuando un producto
termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente
invención se usa como componente efectivo y se elabora en forma de
una preparación combinando con un vehículo farmacéutico conocido,
se puede fabricar un agente antirreumático. La fabricación del
agente antirreumático se puede llevar a cabo por un procedimiento
similar al que ya se ha citado.
El agente antirreumático se puede administrar
bien por vía oral o parenteral, por ejemplo, por inyección o
infusión por goteo intravenoso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar
dependiendo del modo de administración anteriormente citado y de la
forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso
del inductor de apóptosis anteriormente citado.
El agente antirreumático se administra por una
vía apropiada dependiendo de la forma de administración. No existe
tampoco limitación particular en cuanto al procedimiento de
administración y se puede administrar por medio de uso oral, uso
externo e inyección. Las preparaciones para inyección se
administran, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular,
subcutánea, intracutánea y similares, mientras que las preparaciones
para uso externo incluyen supositorios y similares.
La dosis como un agente antirreumático que
contiene el producto termotratado de la presente invención como
componente efectivo está determinada apropiadamente por su forma de
preparación, procedimiento de administración, objeto de uso y edad,
peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es
constante aunque, normalmente, la cantidad del producto
termotratado de la presente invención contenida en la preparación
varía de 1 a 1000 mg, con preferencia de 10 a 200 mg por día (para
adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los
diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes
dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en
otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las
anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención se
puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede
añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente puede
ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como agente antirreumático que contiene
el compuesto seleccionado del compuesto de la presente invención
como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su
forma de preparación, procedimiento de administración, objeto de
uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no
es constante, aunque normalmente, la cantidad del componente eficaz
contenido en la preparación varía de 0,01 a 50 mg, con preferencia
de 0,1 a 10 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede
variar dependiendo de los diversos estados patológicos y, por tanto,
pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos
casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis
mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente
invención se puede administrar directamente por vía oral y, además,
se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente
puede ingerirse de una forma rutinaria.
El factor de crecimiento de la insulina humana
(en lo sucesivo denominado hlGF-1) tiene diversas
acciones fisiológicas frente a diversas células y se ha usado como
agente terapéutico para la diabetes mellitus tipo II (no dependiente
de la insulina) y para la incapacidad para crecer (enanismo). Un
producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la
presente invención tiene una acción inductora de la producción de
hIGF-1. Por consiguiente, se puede preparar un
inductor de la producción de hIGF-1 cuando el
producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la
presente invención se use como componente eficaz. Así, cuando se
usa un producto termotratado de la presente invención o el
compuesto de la presente invención como componente efectivo y se
elabora en forma de una preparación combinando con un vehículo
farmacéutico conocido, se puede fabricar un inductor de la
producción de hIGF-1. La fabricación del inductor de
la producción de hIGF-1 se puede llevar a cabo por
un procedimiento similar al ya citado anteriormente. Se puede usar
un inductor de la producción de hlGF-1 como agente
terapéutico y preventivo para una enfermedad que requiera la
inducción de la producción de hlGF-1 y para
diabetes mellitus de tipo II y también como agente terapéutico para
el enanismo.
El inductor de la producción de
hIGF-1 se puede administrar bien por vía oral o
parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión por goteo
intravenoso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar
dependiendo del modo de administración anteriormente citado y de la
forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso
del inductor de apóptosis anteriormente citado.
El inductor de la producción de
hIGF-1 se administra por una vía apropiada
dependiendo de la forma de administración. No existe tampoco
limitación particular en cuanto al procedimiento de administración
y se puede administrar por medio de uso oral, uso externo e
inyección. Las preparaciones para inyección se administran, por
ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea,
intracutánea y similares, mientras que las preparaciones para uso
externo incluyen supositorios y similares.
La dosis como inductor de la producción de
hIGF-1 que contiene el producto termotratado de la
presente invención como componente efectivo está determinada
apropiadamente por su forma de preparación, procedimiento de
administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del
paciente que se trata y no es constante aunque, normalmente, la
cantidad del producto termotratado de la presente invención
contenida en la preparación varía de 1 a 1000 mg, con preferencia de
10 a 200 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede
variar dependiendo de los diversos estados patológicos y, por
tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en
algunos casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una
dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la
presente invención se puede administrar directamente por vía oral y,
además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo que
el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como inductor de la producción de
hIGF-1 que contiene el compuesto seleccionado del
compuesto de la presente invención como componente efectivo está
determinada de forma apropiada por su forma de preparación,
procedimiento de administración, objeto de uso y edad, peso corporal
y síntomas del paciente que se trata y no es constante, aunque
normalmente, la cantidad del componente eficaz contenido en la
preparación varía de 0,01 a 50 mg, con preferencia de 0,1 a 10 mg
por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar
dependiendo de los diversos estados patológicos y, por tanto,
pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos
casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis
mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente
invención se puede administrar directamente por vía oral y, además,
se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente
puede ingerirse de una forma rutinaria.
El producto termotratado de la presente invención
o el compuesto de la presente invención tiene una acción de
suprimir la producción de oxígeno activo y es posible fabricar un
supresor de la producción de oxígeno activo cuando el producto
termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente
invención sea un componente efectivo y dicho supresor se puede
administrar por un procedimiento que corresponde a una enfermedad
que requiera supresión de la producción de oxígeno activo.
Así, el producto termotratado de la presente
invención o el compuesto de la presente invención es útil para
suprimir la producción de oxígeno activo y un antioxidante tal como
un supresor de la producción de oxígeno activo que contiene dicho
compuesto como componente efectivo es útil como una terapia o una
prevención de enfermedades provocadas por producción y/o flujo
excesivo de oxígeno activo.
El oxígeno activo se puede clasificar de forma
aproximada en radicales y no radicales. Ejemplos de oxígeno activo
del tipo radicálico son el radical hidroxi, radical hidroxiperoxi,
radical peroxi, radical alcoxi, radical dióxido de nitrógeno,
monóxido de nitrógeno (denominado en lo sucesivo NO), radical tiilo
y superóxido, mientras que los ejemplos de oxígeno activo de un
tipo no radicálico son oxígeno singlete, peróxido de oxígeno,
hidroperóxido lipídico, ácido hipocloroso, ozono y ácido
peroxinitroso. Todos ellos están relacionados con muchas
enfermedades tales como diversas enfermedades inflamatorias,
diabetes mellitus, cáncer, arteriosclerosis, enfermedades nerviosas
y lesión por reperfusión isquémica.
Por ejemplo, el NO es un factor fundamental del
factor relajante dependiente del endotelio (EDRF) [Nature, volumen
327, páginas 524-526 (1987)]. La presente invención
ofrece un agente terapéutico o preventivo para las enfermedades que
requieren la supresión de producción de NO.
No existe limitación particular en cuanto a
enfermedades que requieren la supresión de la producción de NO y
sus ejemplos son hipotensión sistémica causada por choque tóxico o
por terapia de ciertas citoquinas, disminución en la respuesta de la
tensión arterial, enfermedades autoinmunes, inflamación, artritis,
artritis reumatoide, diabetes mellitus, enfermedades inflamatorias
del intestino, insuficiencia de la función de los vasos sanguíneos,
dilatación etiológica de los vasos sanguíneos, lesión a los tejidos,
isquemia cardiovascular, sensibilidad al dolor, isquemia cerebral,
enfermedades causadas por angiogénesis, cáncer y similares. Las
enfermedades incluyen las que se citan en las publicaciones de
patente japonesa abierta a consulta pública
Hei-09/504.524; 09/505.288; 08/501.069; 08/512.318;
y 06/508.849. Un supresor de la producción de oxígeno activo es útil
para la terapia y prevención de enfermedades que requieren la
supresión de la producción de NO como un supresor de la producción
de NO.
El supresor de la producción de oxígeno activo se
puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo, por
inyección o infusión por goteo intravenoso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar
dependiendo del modo de administración anteriormente citado y de la
forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso
del inductor de apóptosis anteriormente citado.
El supresor de la producción de oxígeno activo se
administra por una vía apropiada dependiendo de la forma de
administración. No existe tampoco limitación particular en cuanto
al procedimiento de administración y se puede administrar por medio
de uso oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para
inyección se administran, por ejemplo, por vía intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intracutánea y similares, mientras que
las preparaciones para uso externo incluyen supositorios y
similares.
La dosis como supresor de la producción de
oxígeno activo que contiene el producto termotratado de la presente
invención como componente efectivo está determinada apropiadamente
por su forma de preparación, procedimiento de administración,
objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se
trata y no es constante aunque, normalmente, la cantidad del
producto termotratado de la presente invención contenida en la
preparación varía de 1 a 1000 mg, con preferencia de 10 a 200 mg por
día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo
de los diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser
suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos
mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor
que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención
se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede
añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente puede
ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como un supresor de la producción de
oxígeno activo que contiene el compuesto seleccionado del compuesto
de la presente invención como componente efectivo está determinada
de forma apropiada por su forma de preparación, procedimiento de
administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del
paciente que se trata y no es constante, aunque normalmente, la
cantidad del componente eficaz contenido en la preparación varía de
0,01 a 50 mg, con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para
adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los
diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes
dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en
otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores.
El agente farmacéutico de la presente invención se puede
administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a
cualquier alimento o bebida de modo que el agente puede ingerirse
de una forma rutinaria.
El producto termotratado de la presente invención
o el compuesto de la presente invención tiene una acción de inducir
la producción de proteína de choque térmico y es posible fabricar
un inductor de la proteína de choque térmico en el que el producto
termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente
invención es un componente efectivo y dicho inductor se puede
administrar por un procedimiento conforme a la enfermedad que
requiere la inducción de la proteína de choque térmico.
Por consiguiente, el producto termotratado de la
presente invención o el compuesto de la presente invención tiene
actividad inductora de la proteína de choque térmico de 70 kDa
(HSP70), y tiene actividad antiviral hacia virus ARN y virus ADN
tales como virus de la hepatitis, virus del SIDA, virus influenza,
virus de la estomatitis vesicular y virus del herpes. La proteína
de choque térmico participa en la inmunidad frente al cáncer y los
compuestos son eficaces también para la inmunidad frente al cáncer.
Además, los compuestos tienen actividad de defensa biológica tal
como actividad antiinflamación. Cuando se toma el producto
termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente
invención se pueden prevenir y curar enfermedades virales tales
como resfriado por influenza.
A propósito, la proteína de choque térmico es un
nombre general para la proteína cuya síntesis se induce cuando se
somete una célula o un individuo a un cambio repentino de
temperatura que es mayor que la temperatura normal hasta un grado de
aproximadamente 5 a 10ºC y existe ampliamente en procariotas y
eucariotas superiores. Ejemplos de proteínas conocidas de choque
térmico son HSP90, HSP70, ubiquitina y HSP26. Entre ellas, HSP70 es
un tipo de chaperona molecular y está unida a una proteína en la que
no se ha completado el plegamiento o se ha realizado de forma
incompleta para ayudar a la formación de la estereoestructura. La
secuencia de aminoácidos de la proteína de choque térmico se ha
conservado bien durante el curso de la evolución y HSP70 es idéntica
a la proteína DnaK de Escherichia coli. En seres humanos,
existen aproximadamente diez genes de HSP70 y algunos de ellos son
expresados de forma constitutiva mientras que otros son inducidos
por diversos estímulos. Además de choque térmico, la síntesis de la
proteína de choque térmico es inducida por diversas sustancias
químicas y por impedimentos celulares tales como la oxidación.
\newpage
El inductor de la proteína de choque térmico se
puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo, por
inyección o infusión por goteo intravenoso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar
dependiendo del modo de administración anteriormente citado y de la
forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso
del inductor de apóptosis anteriormente citado.
El inductor de la proteína de choque térmico se
administra por una vía apropiada dependiendo de la forma de
administración. No existe tampoco limitación particular en cuanto
al procedimiento de administración y se puede administrar por medio
de uso oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para
inyección se administran, por ejemplo, por vía intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intracutánea y similares, mientras que
las preparaciones para uso externo incluyen supositorios y
similares.
La dosis como inductor de la proteína de choque
térmico que contiene el producto termotratado de la presente
invención como componente efectivo está determinada apropiadamente
por su forma de preparación, procedimiento de administración,
objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se
trata y no es constante aunque, normalmente, la cantidad del
producto termotratado de la presente invención contenida en la
preparación varía de 1 a 1000 mg, con preferencia de 10 a 200 mg por
día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo
de los diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser
suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos
mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor
que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención
se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede
añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente puede
ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como inductor de la proteína de choque
térmico que contiene el compuesto seleccionado del compuesto de la
presente invención como componente efectivo está determinada de
forma apropiada por su forma de preparación, procedimiento de
administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del
paciente que se trata y no es constante, aunque normalmente, la
cantidad del componente eficaz contenido en la preparación varía de
0,01 a 50 mg, con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para
adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los
diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes
dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en
otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores.
El agente farmacéutico de la presente invención se puede
administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a
cualquier alimento o bebida de modo que el agente puede ingerirse de
una forma rutinaria.
Se puede usar un compuesto que se selecciona del
producto termotratado de la presente invención y/o uno de sus
productos parcialmente purificados o el compuesto de la presente
invención como un material para alimento/bebida que induce
apóptosis, alimento/bebida carcinostático, alimento/bebida
antirreumático, alimento/bebida que induce la producción de
hIGF-1, alimento/bebida supresora de la producción
de oxígeno activo o alimento/bebida que induce la proteína de
choque térmico.
Un alimento o bebida en el que un compuesto que
se selecciona del producto termotratado de la presente invención y/o
un producto parcialmente purificado del mismo o el compuesto de la
presente invención está(n) contenido(s) en los mismos,
diluidos con los mismos y/o añadidos a los mismos es suficiente si
dicho alimento o bebida contiene una cantidad que es necesaria para
expresar la acción fisiológica de un compuesto que se selecciona
del producto termotratado de la presente invención y/o un producto
parcialmente purificado del mismo o el compuesto de la presente
invención.
No existe limitación particular en cuanto al
procedimiento para fabricar el alimento o bebida de la presente
invención tal como alimento que induce apóptosis, bebida que induce
apóptosis, alimento carcinostático y bebida carcinostática y se
puede usar la fabricación por un procedimiento de fabricación de
alimentos o bebidas que se ha usado para cocinado, procesado y
otros procesos en general con tal que esté contenida en, diluida con
y/o añadida al alimento o bebida fabricada una cantidad eficaz del
compuesto seleccionado del producto termotratado y/o uno de sus
productos parcialmente purificados o el compuesto de la presente
invención que tiene acción que induce apóptosis, acción
anticancerígena y similares.
El producto parcialmente purificado del producto
termotratado de la presente invención se obtiene por purificación
del producto termotratado de la presente invención cuando no existe
limitación para ello, con tal que tenga una capacidad para inducir
apóptosis y no existe limitación particular para ello con tal que
sea un producto obtenido por un procedimiento habitual en una etapa
de purificación de alimentos y bebidas.
Para dicho alimento y bebida, no existe
limitación particular en cuanto a su forma con tal que esté
contenida en el mismo, diluida con el mismo y/o añadida al mismo
una cantidad eficaz del compuesto seleccionado del producto
termotratado y/o uno de sus productos parcialmente purificados o el
compuesto de la presente invención que tiene acción que induce
apóptosis, acción anticancerígena y similares y dicho alimento o
bebida incluye la formas que pueden administrarse por vía oral
tales como comprimidos, granulados, cápsulas, gel y sol.
Cuando se administra a ratones una dosis
fisiológicamente activa eficaz del producto termotratado de la
presente invención y uno de sus productos parcialmente purificados
y el compuesto de la presente invención, no se aprecia toxicidad
aguda. Por ejemplo, no existen casos de muerte por una
administración oral única de 100 mg/kg de cada uno de
4,5-dihidroxi-2-pentenal
y
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
El agente farmacéutico de la presente invención
es útil para mantener la homeostasis del cuerpo humano. Además, un
procedimiento para inducir apóptosis usando el compuesto
seleccionado del producto termotratado de la presente invención y/o
uno de sus productos parcialmente purificados o el compuesto de la
presente invención como componente efectivo es útil en
investigación del mecanismo de defensa del organismo, mecanismo
inmune o la relación entre cáncer, enfermedades virales y similares,
y el cuerpo humano, en el desarrollo de inhibidores que inducen
apóptosis y similares.
Cuando el producto termotratado de la presente
invención y/o un producto parcialmente purificado está(n)
contenido(s) en un alimento o bebida, es posible fabricar
alimentos o bebidas que inducen apóptosis, alimentos o bebidas
carcinostáticos, alimentos o bebidas antirreumáticos, alimentos o
bebidas que inducen la producción de hIGF-1,
alimentos o bebidas que suprimen la producción de oxígeno activo o
alimentos o bebidas que inducen la proteína de choque térmico. Los
alimentos o bebidas que contienen el producto termotratado de la
presente invención y/o uno de sus productos purificados es un
alimento o bebida saludable que tiene un efecto de prevención de la
carcinogénesis, un efecto anticancerígeno, un efecto antiviral y
efectos similares al tomarlo y es un alimento o bebida útil para
mantener la homeostasis, en particular mantener la salud del
estómago e intestino, del organismo debido a diversas actividades
fisiológicas de dicho producto termotratado y/o uno de sus
productos purificados tales como acción inductora de apóptosis,
acción anticancerígena, acción antirreumática, acción inductora de
la producción de hlGF-1, acción supresora de la
producción de oxígeno activo y acción inductora de la proteína de
choque térmico.
A propósito, se puede preparar
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
por un procedimiento de síntesis química. Ejemplos de
procedimientos conocidos de síntesis son un procedimiento de N.
Tanaka, et al. [Tetrahedron, 32, 1713 (1976)], un
procedimiento de M. Nara, et al. [Tetrahedron, 36,
3161 (1980)] y un procedimiento de M. Gill, et al.
[Australian Journal of Chemistry, 34, 2587(1981)]. No
obstante, los procedimientos son complicados, consistiendo en
muchas etapas de síntesis y además los rendimientos son bajos, por
lo que no son los procedimientos que tienen una alta eficiencia. A
la vista de lo anterior, los autores de la presente invención han
descubierto que, cuando se reduce
4-ciclopenten-1,3-diona
con cloruro de cerio (III) y borohidruro sódico, es posible ahora
producir
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en una única etapa y con un alto rendimiento. Así, la presente
invención ofrece un procedimiento industrial para la síntesis de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Cuando se hace reaccionar
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
una de sus sustancias ópticamente activas y/o una de sus sales con
un compuesto que contiene SH, se produce en la solución de reacción
el compuesto representado por la fórmula [I] ya mencionada, (en lo
sucesivo denominado derivado tio).
No existe ninguna limitación para el compuesto
que contiene un grupo SH y son ejemplos de los mismos metanotiol,
butanotiol, mercaptoetanol, aminoácido que contiene un grupo SH y
derivado aminoacídico que contiene un grupo SH. Ejemplos del
aminoácido que contiene un grupo SH son cisteína y homocisteína.
Ejemplos del derivado aminoacídico que contiene
un grupo SH son derivados de los aminoácidos anteriormente citados
tales como derivados de cisteína, péptidos que contiene cisteína y
péptidos que contienen derivados de cisteína. No hay limitación
particular para el péptido que contiene cisteína con tal que
cisteína sea un componente constituyente en el péptido. El péptido
que contiene cisteína cubre desde sustancias de bajo peso molecular
tales como oligopéptidos (por ejemplo glutatión) hasta las de alto
peso molecular tales como proteínas. El péptido que contiene
cisteína u homocisteína también se puede usar como péptido que
contiene cisteína u homocisteína en la condiciones en las que éste
da cisteína u homocisteína durante la reacción tal como combinando
con un tratamiento reductor. A propósito, el péptido que contiene
cisteína cubre también aquellos que contienen cisteína sacáridos,
lípidos y similares. Además, también puede ser una sal anhídrido de
ácido, éster o similar de las sustancias anteriormente citadas.
Para resumir,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
reacciona con un compuesto que contiene un grupo SH formando un
derivado tio.
El medio para la purificación y aislamiento del
derivado tio o una de sus sustancias ópticamente activas que se
prepara mediante la reacción de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
una de sus sustancias ópticamente activas y/o una de sus sales, con
un compuesto que contiene un grupo SH tal como un aminoácido que
contiene un grupo SH o uno de sus derivados puede ser un medio de
purificación conocido tal como un procedimiento químico y un
procedimiento físico. Así, se combinan procedimientos convencionales
conocidos tales como filtración en gel, fraccionamiento usando una
membrana de fraccionamiento de pesos moleculares, extracción con
disolvente, destilación fraccionada y diversos procedimientos
cromatográficos usando resina de intercambio iónico, y similares,
por lo que se puede purificar o aislar el compuesto de la presente
invención o una de sus sustancias ópticamente activas o una de sus
sales.
Por ejemplo, cuando se hacen reaccionar
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
y glutatión equimolares (tipo reducido), se forma en la solución de
reacción el derivado tio representado por la fórmula [II] siguiente
y, como resultado de cromatografía en columna sobre gel de sílice
de los productos de reacción que contienen dicho derivado, se puede
purificar y aislar dicho derivado tio.
La separación de la sustancia ópticamente activa
del derivado tio se puede llevar a cabo sometiendo la mezcla
racémica a resolución mecánica, cristalización preferente,
resolución por cristalización como sales diastereoisoméricas o como
compuestos de inclusión, resolución dinámica usando enzimas o
microorganismos, resolución por medio de cromatografía y técnicas
similares.
Se pueden usar cromatografía de gases,
cromatografía líquida, cromatografía en capa fina y similares en el
caso de una resolución por cromatografía y se puede usar una fase
estacionaria quiral que es adecuada para cada una de ellas.
Se puede usar un procedimiento que utiliza una
fase estacionaria quiral, un procedimiento que utiliza un eluato
quiral, separación como un diastereoisómero y similares en una
resolución óptica por cromatografía líquida.
Como fase estacionaria quiral se puede usar una
fase estacionaria de tipo amida, la de tipo urea, la de tipo
intercambio de ligando, fase estacionaria derivada de
polisacárido-polisacárido, fase estacionaria de
proteína, fase estacionaria de éster del ácido polimetacrílico,
fase estacionaria de polimetacrilamida y similares.
Con respecto a un líquido eluyente, del tipo
hexano, se puede usar de forma adecuada un tipo alcohol, un tipo
acuoso (tampón) y similares, teniendo en cuenta la combinación con
la fase estacionaria anteriormente citada.
Con respecto a la sal del derivado tio o su
sustancia ópticamente activa que son aceptables como agentes
farmacéuticos se ejemplifican y se pueden preparar convirtiendo por
medio de procedimientos conocidos.
El derivado tio, su sustancia ópticamente activa
o una de sus sales tiene actividades fisiológicas tales como
actividad anticancerígena, actividad para suprimir el crecimiento
de células cancerosas, actividad para inducir apóptosis y debido a
estas actividades es posible ofrecer los agentes farmacéuticos que
contienen el derivado tio, su sustancia ópticamente activa o una de
sus sales como componente efectivo.
La presente invención se ilustrará con más
detalle por medio de los siguientes ejemplos aunque la presente
invención no queda limitada en modo alguno a dichos ejemplos. A
propósito, "%" usado en los ejemplos significa "% en
peso".
Los valores de pH de una solución acuosa 1M de
L(+)-arabinosa (fabricada por Wako Pure Chemical;
010-04582)), una solución acuosa 1M de
D-(-)-arabinosa (fabricada por Wako Pure Chemical;
013-04572), una solución acuosa 1M de xilosa
(fabricada por Nacalai Tesque; 367-19) y una
solución acuosa de D-ribosa (comercializada por
Nacalai Tesque; 302-10) fueron 5,3, 4,9, 4,4 y 4,7,
respectivamente.
Estas se trataron a 121ºC durante cuatro horas y
se midió su actividad para inducir apóptosis frente a leucemia
promielocítica humana HL-60 como sigue.
Se esterilizaron sustancias calentadas y no
calentadas de cada una de ellas por un filtro de membrana de 0,22
\mum preparando muestras para la actividad para inducir
apóptosis. Se diluyeron dichas muestras con agua destilada aséptica
hasta un grado de 2, 4, 8, 16 y 32 veces, se midió su actividad
para suprimir el crecimiento celular frente a leucemia
promielocítica humana HL-60 como sigue y se comparó
su intensidad para inducir apóptosis.
Así, se colocaron 10 \mul de cada una de las
soluciones diluidas o 10 \mul de agua destilada aséptica en un
pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos. A
continuación se añadieron a la misma 90 \mul de un medio RPMI 1640
(fabricado por Nissui) que contenía 10% de suero bovino fetal
(fabricado por Gibco) que contenía 5000 células
HL-60 (ATCC CCL240) y se procedió a la incubación a
37ºC durante 48 horas en presencia de dióxido de carbono gaseoso al
5%. Después de observar la forma de las células al microscopio
óptico, se añadieron 10 \mul de una solución salina acuosa
tamponada con fosfato que contenía 5 mg/ml de bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT; fabricado por Sigma), se continuó la incubación durante cuatro
horas más y se observaron los estados de crecimiento de células y
la formación de formazán producido en las células al microscopio.
Además, se añadieron 100 \mul de 2-propanol que
contenía HCl 0,04N, seguido por agitación del pocillo y se midió la
absorbancia a 590 nm y se usó como un grado de crecimiento de las
células (un procedimiento con MTT).
El resultado fue que, en las secciones a las que
no se añadió solución acuosa no calentada de
L(+)-arabinosa, solución acuosa de
D-(-)-arabinosa, solución acuosa de
D(+)-xilosa y solución acuosa de
D-ribosa, no hubo diferencia con respecto a la
sección a la que se añadió agua (control) en términos de crecimiento
celular, por lo que no se apreció actividad inductora de apóptosis.
Por el contrario, en las secciones en las que se añadieron
soluciones diluidas 4, 4, 8 y 16 veces de solución acuosa de
L(+)-arabinosa, solución acuosa de
D(-)-arabinosa, solución acuosa de
D(+)-xilosa y solución acuosa de
D-ribosa calentadas a 121ºC durante 4 horas se
apreció deformación de las células al microscopio y, puesto que la
absorbancia a 590 nm disminuyó al compararla con el control al que
se añadió agua, se apreció actividad de supresión del crecimiento
de células cancerígenas.
(1) Los valores de pH de una solución acuosa 1M
de 2-desoxi-D-ribosa
(fabricada por Sigma; D2751) y una solución acuosa 0,1 M de
2-desoxi-D-ribosa
fueron 4,7 y 5,4, respectivamente. Se tomó una parte de la solución
acuosa 0,1 M de
2-desoxi-D-ribosa y
se ajustó a pH 7,1 con NaOH 1N. Se calentó esta a 121ºC durante
cuatro horas y se midió la actividad inductora de apóptosis frente
a células HL-60 por el procedimiento citado en el
Ejemplo 1. A propósito, las relaciones de dilución fueron 2, 4, 8,
16, 32, 64 y 128 veces.
El resultado fue que, en la sección en la que se
añadió solución acuosa no calentada de
2-desoxi-D-ribosa no
se produjo diferencia con respecto a la sección control a la que se
añadió agua en términos de crecimiento celular, por lo que no se
apreció actividad inductora de apóptosis. Por otro lado, se apreció
supresión del crecimiento celular en las secciones en las que se
añadieron soluciones diluidas 128, 16 y 16 veces de una solución
acuosa 1M de
2-desoxi-D-ribosa,
una solución acuosa 0,1 M de
2-desoxi-D-ribosa
(pH sin ajustar) y una solución acuosa 0,1 M de
2-desoxi-D-ribosa
(pH 7,1), respectivamente, calentadas a 121ºC durante cuatro
horas.
(2) Se separó el producto termotratado a 121ºC
durante cuatro horas de una solución acuosa 1M de
2-desoxi-D-ribosa
obtenido en el Ejemplo 2-(1) por la siguiente HPLC de fase
inversa.
- Cantidad de muestra inyectada: 40 \mul
- Columna: YMC-Pack ODS-AM (4,6 x 250 mm; fabricada por YMC)
- Fase móvil A: agua
- Fase móvil B: solución acuosa al 80% de acetonitrilo
- Caudal: 0,8 ml/minuto
- Elución: Fase móvil A (cinco minutos) \rightarrow gradiente de concentración lineal desde la fase móvil A a B (20 minutos) \rightarrow fase móvil B (cinco minutos)
- Detección: absorbancia a 215 nm
Cada una de las fracciones recogidas cada dos
minutos se concentró a vacío y se midió la actividad inductora de
apóptosis frente a células HL-60 por un
procedimiento del Ejemplo 1. El resultado fue que la fracción 4
(tiempo de retención: 6-8 minutos) mostró una
fuerte actividad y la fracción 8 (tiempo de retención:
14-16 minutos) mostró una actividad débil.
(3) Se repitió una HPLC de fase inversa del
Ejemplo 2-(2) para preparar un producto seco de la fracción 4. El
análisis de masas de esta muestra se llevó a cabo usando DX302
(fabricado por Nippon Denshi). Además, se disolvió esta muestra en
dimetil sulfóxido pesado y se midió un espectro de resonancia
magnética nuclear usando JNM-A500 (fabricado por
Nippon Denshi).
FAB-MS (Espectro de masas -
Bombardeo de átomos rápidos)
m/z 117 [M+H]+
En el anterior se usó como matriz glicerol.
RMN de ^{1}H
\delta 3,44 (2H, m, 5-H), 4,27
(1H, m, 4-H), 4,95 (1H, t, H de
5-OH), 5,32 (1 H, d, J = 5,0 Hz, H de
4-OH), 6,20 (1H, ddd, J = 2,0, 8,0, 15,5 Hz,
2-H), 7,10 (1H, dd, J = 4,0, 15,5 Hz,
3-H), 9,55 (1H, d, J = 8,0 Hz,
1-H)
En los datos anteriores, el desplazamiento
químico del protón residual de dimetil sulfóxido pesado se expresó
como 2,49 ppm.
Los números de asignación de las señales en la
RMN de ^{1}H son como se muestran en la fórmula [III]
siguiente.
Como resultado, los datos físicos para esta
muestra fueron idénticos a los de
trans-4,5-dihidroxi-2-pentanal
y se ha deducido que esta muestra es
trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal
representado por la fórmula [III] siguiente.
Esta muestra mostró una fuerte actividad
inductora de apóptosis y actividad supresora de crecimiento de
células cancerígenas.
(1) Se calentaron a 121ºC durante cuatro horas
cuatro tipos de desoxirribonucleótido 100 nM (dATP, dGTP, dCTP y
dTTP). Se midió por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 1
la actividad supresora de crecimiento de células cancerígenas de
cada una de las muestras calentadas.
El resultado fue que, en un medio al que se
añadieron productos termotratados de dATP y dGTP hasta las
soluciones diluidas 16 veces y en un medio al que se añadieron con
productos termotratados de dCTP y dTTP hasta las soluciones diluidas
8 veces, los números de células viables se redujeron de forma
significativa al compararlos con el caso al que se añadió agua.
Además, en la observación al microscopio óptico, se apreció
agregación de núcleos, reducción en el tamaño de las células y
formación de cuerpos apoptóticos en las células cultivadas a las
que se añadieron las muestras. A propósito, no se apreciaron tales
fenómenos en las células cultivadas a las que se añadieron 10
\mul de agua (control).
(2) Se prepararon soluciones acuosas de cinco
tipos de desoxirribonucleótido (desoxiadenosina, desoxiguanosina,
desoxicitidina, desoxitimidina y desoxiuridina) y se calentaron a
121ºC durante cuatro horas. Puesto que la solubilidad de cada una
de ellas es diferente, las concentraciones de las soluciones acuosas
fueron 25 mM para desoxiadenosina, 25 mM para desoxiguanosina, 1M
para desoxicitidina, 0,4M para desoxitimidina y 1M para
desoxiuridina.
Se midió la actividad supresora de crecimiento de
células cancerígenas de cada una de las muestras calentadas por un
procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 1. El resultado fue que
los números de células viables se redujeron significativamente en
los medios en los que se añadieron solución diluida hasta dos veces
(1,25 M en base al desoxirribonucleósido) de solución termotratada
de desoxiadenosina, solución diluida hasta 4 veces (0,625 M en base
a desoxirribonucleósido) de solución termotratada de
desoxiguanosina, solución diluida hasta 128 veces (0,78 mM en base a
desoxirribonucleósido) de solución termotratada de desoxicitidina,
solución diluida hasta 16 veces (2,5 mM en base a
desoxirribonucleósido) de solución termotratada de desoxitimidina o
solución diluida hasta 64 veces (1,56 mM en base a
desoxirribonucleósido) de solución termotratada de desoxiuridina al
compararlas con la que se añadió únicamente agua. Además, en una
observación al microscopio óptico, se confirmaron agregación de
núcleos, reducción en el tamaño de las células y formación de
cuerpos apoptóticos en las células cultivadas a las que se añadió
la muestra. A propósito, tales fenómenos no se apreciaron en las
células cultivadas a las que se añadieron 10 \mul de agua
(control).
(control).
(3) Cada una de las soluciones calentadas
preparadas en el Ejemplo 3-(2) se separó por medio de una HPLC en
las siguientes condiciones.
- Columna: gel TSK ODS-80Ts (5 \mum) (20 mm x 25 cm; fabricada por Tosoh)
- Fase móvil A: solución acuosa al 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA)
- Fase móvil B: solución acuosa de TFA al 0,1% /acetonitrilo al 50%
- Caudal: 8 ml/minuto
- Condiciones de elución: Fase móvil A al 100% durante diez minutos \rightarrow desde la fase móvil A al 100% hasta la fase móvil B al 100% durante 40 minutos \rightarrow fase móvil al 100% durante diez minutos
- Detección: absorbancia a 215 nm
Cada 1,5 ml de las soluciones preparadas en el
Ejemplo 3-(2) se sometieron a una HPLC y se fraccionaron cada
minuto y cada fracción se concentró, se evaporó hasta sequedad, se
volvió a disolver en agua y se sometió a un procedimiento con MTT
citado en el Ejemplo 1, después de lo cual se confirmó la actividad
inductora de apóptosis en los picos próximos a los
15-16 minutos y próximos a 25-28
minutos en todas las muestras de solución calentadas.
(4) Se llevó a cabo la comparación de la
sustancia que tiene un pico próximo a 15-16 minutos
citada en el Ejemplo 3-(3) con
trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal
cuya estructura ya se aisló y analizó en el Ejemplo 2-(3) por medio
de una HPLC en las siguientes condiciones.
- Columna gel TSK ODS-80Ts (5 \mum), 4,6 X 250 mm
- Fase móvil A: solución acuosa de TFA al 0,1%
- Fase móvil B: solución acuosa de TFA al 0,1% /acetonitrilo al 50%
- Caudal: 1 ml/minuto
- Condiciones de elución: Fase móvil A al 100% durante diez minutos \rightarrow desde fase móvil A al 100% hasta fase móvil B al 100% durante diez minutos \rightarrow fase móvil al 100% durante diez minutos
- Detección: absorbancia a 215 nm
El resultado fue que la posición de elución de la
sustancia activa cercana a 15-16 minutos fue
idéntica a la de
trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal.
Además, el análisis estructural de sustancias
activas próximas a 15-16 minutos de cada uno de los
productos calentados se llevó a cabo por resonancia magnética
nuclear (RMN de ^{1}H). Como resultado, la sustancia activa
próxima a 15-16 minutos se identificó como
trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal.
(1) El pH de una solución acuosa (0,25 mg/ml) de
sal sódica de ácido desoxirribonucleico (DNA) (fabricada por Wako
Pure Chemical; 047-22491) fue 8,9. Por separado se
tomo una muestra y se ajustó a pH 7,3 con HCl 1N. Esta se calentó a
121ºC durante cuatro horas y se midió la actividad supresora de
crecimiento celular frente a células HL-60 por un
procedimiento del Ejemplo 1. A propósito, las relaciones de
dilución fueron 2, 4, 8, 16 y 32 veces.
El resultado fue que, en las secciones a las que
se añadieron soluciones diluidas 8 y 16 veces de solución acuosa
termotratada (a 121ºC durante cuatro horas) de sal sódica de ADN
(pH sin ajustar) y solución acuosa de sal sódica de ADN (pH 7,3), la
absorbancia a 590 nm se redujo al compararla con el control en el
que solo se añadió agua. Así, se apreció una actividad supresora
del crecimiento celular.
(2) Se calentó a 121ºC durante cuatro horas una
solución acuosa al 10% p/v de sal sódica de ADN y se repartió con
acetato de etilo a una relación de 1:2 para extraer en acetato de
etilo, el extracto se evaporó a vacío y el residuo se disolvió en
una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol.
El gel de sílice para la cromatografía en columna
(fabricado por Fuji Silicia Kagaku; BW-300SP)
(aproximadamente 250 cm^{3}) se equilibró con una mezcla 9:1 de
cloroformo y metanol y se cargó en una columna de 25 cm de diámetro
x 60 cm de longitud y se sometió la solución anteriormente
preparada a cromatografía con una mezcla 9:1 de cloroformo y
metanol a una presión de 24516 Pa seguida por fraccionamiento
aproximadamente cada 8 ml.
El disolvente de la fracción se evaporó de forma
apropiada para sustituirlo con una solución acuosa al 50% de etanol
y se midió la actividad para suprimir el crecimiento de células
cancerígenas por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 1
salvo que la muestra se diluyó en serie a la mitad usando una
solución acuosa al 50% de etanol y se colocaron en un pocillo de
una placa de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos 2 \mul
de cada una de las soluciones diluidas o 2 \mul de una solución
acuosa al 50% de etanol. El tiempo de incubación fue de 16
horas.
horas.
El resultado fue que, en las células incubadas en
las que se añadieron fracciones 65-81 ó 177, los
números de células viables se redujeron de forma significativa al
compararlas con el caso en el que se añadió una solución acuosa al
50% de etanol. Además, en una observación al microscopio óptico, se
apreció agregación de núcleos, reducción del tamaño de las células
y formación de cuerpos apoptóticos en las células incubadas cuando
se añadieron las fracciones 65-81 ó 177. A
propósito, tales fenómenos no se apreciaron en las células
incubadas en las que se añadieron 2,0 \mul de una solución acuosa
al 50% de etanol (control).
(3) Las fracciones 65-81 se
sometieron a cromatografía en capa fina y a una HPLC de fase
inversa y se midió la actividad supresora del crecimiento de células
cancerígenas y la formación de cuerpos apoptóticos por un
procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 1, tras lo cual se
apreció actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas
y actividad inductora de cuerpos apoptóticos.
En la cromatografía en capa fina, se usó gel de
sílice 60F_{254} (fabricado por Merck; 1.05554) y se desarrolló
una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y se realizó la detección
por un reaccionante de coloración de orcinol-ácido sulfúrico.
En el análisis HPLC de fase inversa, se usó una
columna con gel TSK ODS-80 Ts (4,6 x 250 mm;
fabricada por Tosoh) y, después de eluir con agua durante cinco
minutos a un caudal de 0,8 ml/minuto, se llevó a cabo la elución
hasta una solución acuosa al 80% de acetonitrilo por medio de un
gradiente de concentración durante 20 minutos y se realizó la
detección midiendo la absorbancia a 206 nm.
La sustancia activa de las fracciones
65-81 anteriores corresponde a una sustancia que
tiene una mancha a Rf 0,42 en la cromatografía en capa fina y a una
sustancia que tiene un pico en el tiempo de retención de 8,8
minutos en la HPLC de fase inversa.
Las fracciones en las que se detectó una mancha
de Rf 0,42 se recogieron y se evaporó el disolvente de las mismas a
vacío.
El componente activo se recogió seguidamente y se
purificó por medio de una HPLC de fase inversa. Se usó una columna
de gel TSK ODS-80 Ts (20 mm de diámetro x 250 mm de
longitud; fabricada por Tosoh) como columna y se eluyó con agua a
un caudal de 6,5 ml/minuto y se realizó la detección por
absorbancia a 206 nm. Cada uno de los picos se fraccionó y
concentró a vacío, se midió su actividad por el procedimiento con
MTT anteriormente citado y los picos en los que se apreció actividad
se disolvieron en agua pesada y dimetil sulfóxido pesado seguido
por someterlos a análisis por medio de espectro de resonancia
magnética nuclear.
Los resultados se dan a continuación.
RMN de ^{1}H
\delta 2,38 (1H, dd, J = 2,0, 19,0 Hz,
5-H), 2,98 (1H, dd, J = 6,5, 19,0 Hz,
5-H), 5,18 (1H, m, 4-H), 6,47 (1H,
dd, J = 1,5, 6,0 Hz, 2-H), 7,94 (1H, dd, J = 2,5,
6,0 Hz, 3-H).
En los datos anteriores, los valores de
desplazamientos químicos de HOD se expresan como 4,65 ppm.
Los números de asignación de las señales en la
RMN de ^{1}H son como se muestran en la fórmula [IV]
siguiente.
Como resultado, se ha deducido que esta sustancia
es
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
(4) Se sometió la fracción 177 a una
cromatografía en capa fina y a una HPLC de fase inversa del mismo
modo que en el Ejemplo 4-(3) y se midió la actividad supresora del
crecimiento de células cancerígenas y la formación de cuerpos
apoptóticos por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 4-(2)
tras lo cual se apreció una actividad supresora del crecimiento de
células cancerígenas y actividad inductora de cuerpos
apoptóticos.
La sustancia activa de la fracción 177 anterior
corresponde a una sustancia que tiene una mancha a Rf 0,37 en la
cromatografía en capa fina y a una sustancia que tiene un pico del
tiempo de retención de 16,8 minutos en la HPLC de fase inversa.
La fracción 177 en la que se detectó que la
sustancia tiene una mancha a Rf 0,37 se recogió y se evaporó el
disolvente de la misma a vacío.
El componente activo se recogió seguidamente y se
purificó por medio de una HPLC de fase inversa. Se usó una columna
de gel TSK ODS-80 Ts (20 mm de diámetro x 250 mm de
longitud; fabricada por Tosoh) como columna y eluyó con agua a un
caudal de 6,5 ml/minutos y la detección se llevó a cabo a una
absorbancia a 206 nm. Cada uno de los picos se fraccionó y se
concentró a vacío y se midió su actividad por el procedimiento con
MTT anteriormente citado y se llevó a cabo un análisis de masas de
los picos en el que se apreció la actividad usando un espectrómetro
de masas DX302 (fabricado por Nippon Denshi). Se usó alcohol
m-nitrobencílico como matriz y la medida se llevó a
cabo en un modo de ion positivo.
FAB-MS
m/z 216[M+H]^{+}
Seguidamente, se midió un espectro de resonancia
magnética nuclear. El espectrómetro de resonancia magnética nuclear
usado fue un JNM-A500 (fabricado por Nippon
Denshi). Los resultados son como se muestran a continuación.
RMN de ^{1}H
\delta 2,71 (1H, dd, J = 3,0, 18,5 Hz,
5-H), 2,98 (1H, dd, J = 7,5, 18,5 Hz,
5-H), 5,89 (1H, m, 4-H), 6,50 (1H,
dd, J = 2,0, 5,5 Hz, 2-H), 7,24 (2H, s ancho, H de
6'-NH_{2}), 7,85 (1H, dd, J = 2,5, 5,5 Hz,
3-H), 8,10 (1H, s, 2'-H), 8,14 (1H,
s, 8'-H).
En los datos anteriores, la muestra se disolvió
en dimetil sulfóxido pesado y los desplazamientos químicos de
protón residual de dimetil sulfóxido pesado se expresaron como 2,49
ppm.
Los números de asignación de las señales en la
RMN de ^{1}H son como se muestran en la fórmula [V]
siguiente.
Como resultado, se ha identificado que esta
sustancia es
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 1 muestra un espectro de masas de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona
en el que el eje de abscisas incida los valores m/z mientras que el
eje de ordenadas indica la intensidad relativa (%).
La Figura 2 muestra un espectro de RMN de ^{1}H
de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona
en el que el eje de abscisas indica el valor de los desplazamientos
químicos (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica la
intensidad de la señal.
(5) Se calentó a 121ºC durante 4 horas una
solución acuosa al 10% p/v % de sal sódica de ADN. Se repartió esta
solución calentada con acetato de etilo en una relación de 1:2, se
volvió a repartir la fase acuosa resultante con una mezcla 3:1 de
cloroformo y metanol en una relación de 1:1, se evaporó la fase del
disolvente orgánico a vacío, se añadió a la misma una mezcla 9:1 de
cloroformo y metanol y se eliminó el residuo dando una
solución.
El gel de sílice para la cromatografía en columna
(fabricado por Fuji Silicia Kagaku; BW-30SP)
(aproximadamente 250 cm^{3}) se equilibró con la solución mixta
anterior y se cargó en una columna de 25 mm de diámetro x 60 cm de
longitud y se desarrolló la solución preparada anteriormente a una
presión de 24516 Pa primero con una mezcla 9:1 de
clo-
roformo y metanol y luego con una mezcla 6:1 de los mismos y se fraccionaron para cada una aproximadamente 8 ml.
roformo y metanol y luego con una mezcla 6:1 de los mismos y se fraccionaron para cada una aproximadamente 8 ml.
Cada una de las fracciones se desarrolló por una
cromatografía en capa fina usando una mezcla 4:1 de cloroformo y
metanol y se detectó por un reaccionante de coloración de
orcinol-ácido sulfúrico. De las fracciones 380 a 500, se detectó una
mancha de Rf 0,36 de color marrón rojizo.
Se recogieron las fracciones
400-420 y se evaporó el disolvente orgánico a vacío
y se sustituyó por etanol, seguido por HPLC de fase inversa.
En la HPLC, se usó una columna de gel TSK
ODS-80 Ts (20 mm de diámetro x 250 mm de longitud;
fabricada por Tosoh), se eluyó con una solución acuosa al 8% de
acetonitrilo a un caudal de 6 ml/minuto durante cinco minutos, luego
eluyó hasta una solución acuosa al 40% de acetonitrilo con un
gradiente de concentración durante 30 minutos, la detección se
llevó a cabo por medio de absorbancia a 206 nm y se separó el pico
de un tiempo de elución de 35 minutos.
El pico de un tiempo de elución de 35 minutos se
sometió a un análisis por HPLC de fase inversa y a un ensayo con
MTT usando células HL-60.
En un análisis por HPLC de fase inversa, se usó
una columna YMC-Pack ODS-AM (4,6 mm
de diámetro x 250 mm de longitud; fabricada por YMC) y eluyó durante
20 minutos a un caudal de 0,8 ml/minuto por un procedimiento de
gradiente de concentración de soluciones acuosas de 4% a 25% de
acetonitrilo y la detección se llevó a cabo por medio de una
absorbancia de 210 nm, después de lo cual se detectó un único pico
a un tiempo de elución de 14 minutos.
En un ensayo con MTT, aproximadamente 13
\mug/ml de producto secado del pico del tiempo de elución de 35
minutos mostraron una deformación y formación de cuerpos
apoptóticos en las células, por lo que se apreció actividad
supresora del crecimiento de células cancerígenas y actividad
inductora de apóptosis.
Se analizó el pico de un tiempo de elución de 35
minutos por medio de análisis de masas y por espectro de resonancia
magnética nuclear después de disolver en dimetil sulfóxido
pesado.
En el análisis de masas, se usó un espectrómetro
de masas DX 302. Se uso glicerol como una matriz y se llevó a cabo
la medida en modo de ion positivo.
FAB-MS
m/z 232 [M+H]^{+}
El espectrómetro de resonancia magnética nuclear
usado fue un JNM-A500. La muestra se disolvió en
dimetil sulfóxido pesado y los desplazamientos químicos del protón
residual del dimetil sulfóxido pesado se expresaron como 2,49
ppm.
RMN de ^{1}H
\sigma 2,61 (1H, dd, J = 3,5, 18,5 Hz,
5-H), 2,91 (1H, dd, J = 7,0, 18,5 Hz,
5-H), 5,65 (1H, m, 4-H), 6,42 (2H, s
ancho, H de 2'-NH_{2}), 6,46 (1H, dd, J = 2,0, 6,0
Hz, 2-H), 7,65 (1H, s, 8'-H), 7,81
(1H, dd, J = 2,5, 6,0 Hz, 3-H).
Los números de asignación de las señales en la
RMN de ^{1}H son como se muestran en la fórmula [VI]
siguiente.
Como resultado, se ha deducido que esta sustancia
es
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 3 muestra un espectro de masas de
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
en el que el eje de abscisas indica valores m/z mientras que el eje
de ordenadas indica intensidad relativa (%).
La Figura 4 muestra un espectro de RMN de ^{1}H
de
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
en el que el eje de abscisas indica valores de desplazamiento
químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica intensidad de
la señal.
(1) Se calentó a 121ºC durante 4 horas una
solución acuosa 2M de D-ribosa (fabricada por
Nacalai Tesque; 302-10). Esta solución calentada se
concentró a vacío, se repartió con acetato de etilo a la relación
de 1:2 para extraer hasta acetato de etilo, luego se evaporó el
acetato de etilo a vacío del extracto y se disolvió el residuo en
una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol.
El gel de sílice para la cromatografía en columna
(fabricado por Fuji Silicia Kagaku; BW-300SP)
(aproximadamente 250 cm^{3}) se equilibró con una mezcla 9:1 de
cloroformo y metanol y se cargó en una columna de 25 mm de diámetro
x 60 cm de longitud y se desarrolló la solución preparada
anteriormente por medio de cromatografía usando una mezcla 9:1 de
cloroformo y metanol con una presión de 19613 Pa y se fraccionó
aproximadamente cada 8 ml. Se evaporó el disolvente de las
fracciones y se sustituyó con una solución acuosa al 50% de etanol
y se midió la actividad para suprimir el crecimiento de células
cancerígenas por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo
4-(2).
El resultado fue que las células cultivadas en
las que se añadieron las fracciones 28 a 36 mostraron una reducción
significativa en el número de células viables al compararlas con el
caso en el que se añadió una solución acuosa al 50% de etanol.
Además, en la observación al microscopio óptico se confirmaron
agregación de núcleos, reducción en el tamaño de las células y
formación de cuerpos apoptóticos en las células cultivadas en las
que se añadieron las fracciones 28 a 36. A propósito, tales
fenómenos no se apreciaron en las células cultivadas en las que se
añadieron \mul de una solución acuosa al 50% de etanol
(control).
(2) Las fracciones 28-36 se
someten a cromatografía en capa fina y a HPLC de fase inversa por
el mismo procedimiento que en el Ejemplo 4-(3) y se midieron la
actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas y la
formación de cuerpos apoptóticos por un procedimiento con MTT
citado en el Ejemplo 4-(2), después de lo cual se apreciaron
actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas y
actividad inductora de cuerpos apoptóticos.
La sustancia activa de las fracciones
28-36 anteriores corresponde a una sustancia que
tiene una mancha a Rf 0,44 en la cromatografía en capa fina y a una
sustancia que tiene un pico del tiempo de retención de 9,7 minutos
en la HPLC de fase inversa.
Las fracciones 28-36 en las que
se detectó la sustancia de una mancha de Rf 0,44 se concentraron a
vacío, y se sometieron a HPLC de fase inversa, después de lo cual
se detectó un único pico a un tiempo de retención de 9,7
minutos.
En los ensayos de masas, se usó un espectrómetro
de masas DX302. Se usó tioglicerol como una matriz y la medida se
llevó a cabo en un modo de ion positivo
FAB-MS
m/z 115 [M+H]^{+}
97 [M-H_{2}
0+H]^{+}
79 [M-2H_{2}
0+H]^{+}
Además, se midió un espectro de resonancia
magnética nuclear. El espectrómetro de resonancia magnética nuclear
usado fue un JNM-A500. Los resultados son como se
muestran a continuación.
RMN de ^{1}H
\delta 4,27 (1H, ddd, J = 2,0, 4,0, 19,5 Hz,
5-H), 4,51 (1H, td, J = 2,5, 19,5 Hz,
5-H), 4,93 (1H, d, J = 6,0Hz, 1-H),
6,02 (1H, m, 3-H), 7,23 (1H, ddd, J = 2,5, 4,0,
10,0 Hz, 4-H), 7,26 (1H, d, J = 6,0 Hz, H de
1-OH).
En los datos anteriores, la muestra se disolvió
en dimetil sulfóxido pesado y los desplazamientos químicos del
protón residual de dimetil sulfóxido pesado se expresaron como 2,49
ppm.
Los números de asignación de las señales en la
RMN de ^{1}H son como se muestran en la fórmula [VII]
siguiente.
Como resultado, se ha identificado que esta
sustancia es
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
La Figura 5 muestra un espectro de masas de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
en el que el eje de abscisas indica valores m/z mientras que el eje
de ordenadas indica intensidad relativa (%).
La Figura 6 muestra un espectro de RMN de ^{1}H
de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
en el que el eje de abscisas indica valor de desplazamiento químico
(ppm) mientras que el eje de ordenadas indica intensidad de la
señal.
(1) Se calentó a 121ºC durante 4 horas una
solución acuosa 2M de
2-desoxi-D-ribosa
(fabricada por Sigma; D2851). Se evaporó esta solución calentada (5
ml) a vacío y se disolvió el residuo en una mezcla 98:2 de
cloroformo y metanol.
El gel de sílice para la cromatografía (fabricado
por Fuji Silicia Kagaku; BW-300SP) (aproximadamente
250 cm^{3}) se equilibró con la mezcla anterior y se cargó en una
columna de 25 mm de diámetro x 60 cm de longitud y se sometió la
solución preparada anterior a cromatografía con una mezcla 98:2 de
cloroformo y metanol con una presión de 19613 Pa y fraccionamiento
aproximadamente cada 8 ml.
Se evaporó el disolvente de cada una de las
fracciones y se sustituyó con una solución acuosa al 50% de etanol
y se sometió la solución resultante a cromatografía en capa fina, a
un análisis de HPLC de fase inversa y a un ensayo con MTT por
células de leucemia promielocítica humana (células
HL-60).
En la cromatografía en capa fina se usó gel de
sílice 60F_{254} (fabricado por Merck; 1.05554), se desarrolló
por una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y se detectó por un
reaccionante de coloración de orcinol-ácido sulfúrico. En el
análisis de HPLC de fase inversa se usó una columna de gel TSK
ODS-80 Ts (4,6 x 250 mm; fabricada por Tosoh),
eluyó con agua durante cinco minutos a un caudal de 0,8 ml/minuto,
eluyó durante 20 minutos hasta una solución acuosa al 80% de
acetonitrilo mediante un procedimiento de gradiente de concentración
por medio de una absorbancia a 206 nm.
El ensayo con MTT se llevó a cabo por un
procedimiento citado en el Ejemplo 4-(2).
Como resultado del ensayo con MTT se apreció una
fuerte actividad para suprimir el crecimiento celular en las
fracciones 48 y 88. En la fracción 48, se detectó una mancha de Rf
0,52 por una cromatografía en capa fina, mientras que se detectó un
pico del tiempo de retención de 9,1 minutos por un análisis de HPLC
de fase inversa. En la fracción 88, se detectó una mancha de Rf
0,35 por una cromatografía en capa fina mientras que se detectó un
pico del tiempo de retención de 9,1 minutos por un análisis de HPLC
de fase inversa.
Estas fracciones se sometieron a un análisis de
masas y a un análisis por espectro de resonancia magnética nuclear
después de disolver en dimetil sulfóxido pesado, tras lo cual la
fracción 48 era
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
mientras que la fracción 88 era
trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal.
(2) Se dejó reposar a -40ºC en un congelador de
baja temperatura una solución etanólica de
trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal
que se preparó en el Ejemplo 6-(1), después de lo cual se generó un
sólido.
El sólido se filtró por un papel de filtro y se
lavó con etanol frío dando una solución etanólica y un sólido.
La solución etanólica se sometió de nuevo a
cromatografía usando columna de sílice. Así, el gel de sílice para
la cromatografía en columna (fabricado por Fuji Silicia Kagaku;
BW-300SP) (aproximadamente 250 cm^{3}) se
equilibró con una mezcla 98:2 de cloroformo y metanol y se sometió
a cromatografía por la misma mezcla a presión de 19613 Pa y se
fraccionó aproximadamente en 8 ml cada una.
Trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal
eluyó en las fracciones 90 a 126 mientras que en las fracciones 67
a 76 eluyó una sustancia secundaria.
El sólido anterior y la sustancia secundaria se
sometieron a un análisis HPLC de fase inversa y a un ensayo con MTT
usando células HL-60.
En el análisis HPLC de fase inversa se usó una
columna YMC-Pack ODS-AM (4,6 mm de
diámetro x 250 mm de longitud; fabricada por YMC), eluyó con agua a
un caudal de 0,8 ml/minuto durante cinco minutos, luego eluyó hasta
una solución acuosa al 80% de acetonitrilo a un caudal de 0,8
ml/minuto por medio de un procedimiento con gradiente de
concentración durante 20 minutos y se detectó por una absorbancia a
210 nm.
En el sólido, se detectó un único pico a un
tiempo de elución de 18 minutos, mientras que en la sustancia
secundaria, se detectó un pico principal a un tiempo de elución de
18 minutos.
En el ensayo con MTT, se apreciaron deformación y
formación de cuerpos apoptóticos en el sólido y en la sustancia
secundaria por lo que se apreciaron actividad de supresión del
crecimiento celular y actividad de inducción de apóptosis.
El sólido se sometió a un análisis de masas y a
un análisis por espectro de resonancia magnética nuclear después de
disolver en dimetil sulfóxido pesado.
En el análisis de masas, se usó un espectrómetro
de masas DX 302. Se usó glicerol como matriz y la medida se llevó a
cabo en un modo de ion positivo.
FAB-MS
m/z 215 [M+H]^{+}
237 [M+Na]^{+}
El espectrómetro de resonancia magnética nuclear
usado fue un JNM-A500. La muestra se disolvió en
dimetil sulfóxido pesado y el desplazamiento químico del protón
residual del dimetil sulfóxido se expresó como 2,49 ppm.
RMN de ^{1}H
\delta 3,30 (2H, m, 1-H), 3,80
(1H, dd, J = 5,0, 8,5 Hz, 7-H), 4,01 (1H, m,
2-H), 4,05 (1H, t, J = 8,5 Hz,
7-H),4,66 (1H, t, J = 6,0 Hz, H de
1-OH), 4,84 (1H, m, 6-H), 4,96 (1H,
d, J = 5,0 Hz, H de 2-OH), 5,31 (1H, d, J = 6,5 Hz,
5-H), 5,66 (1H, ddd, J = 1,5, 6,5, 15,5 Hz,
4-H), 6,01 (1H, dd, J = 4,5, 15,5 Hz,
3-H), 6,21 (1H, ddd, J = 1,5, 8,0, 15,5 Hz,
9-H), 7,03 (1H, dd, J = 5,5, 15,5 Hz,
8-H), 9,57 (1H, d, J = 8,0 Hz,
10-H)
Los números de asignación de las señales en RMN
de ^{1}H son como se muestran en la fórmula [VIII] siguiente.
Como resultado se ha deducido que esta sustancia
es
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
La Figura 7 muestra un espectro de masas de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
en el que el eje de abscisas indica los valores m/z mientras que el
eje de ordenadas indica intensidad relativa (%).
La Figura 8 muestra un espectro de RMN de ^{1}H
de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
en el que el eje de abscisas indica el valor del desplazamiento
químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica la intensidad
relativa.
(3) Se preparó el concentrado del producto
termotratado citado en el Ejemplo 6-(1) y se sometió este
concentrado a una cromatografía en sílice. Así, el gel de sílice
para la cromatografía en columna (fabricado por Fuji Silicia Kagaku;
BW-300SP) (aproximadamente 250 cm^{3}) se
equilibró con una mezcla 98:2 de cloroformo y metanol, se sometió a
cromatografía con la misma mezcla a una presión de 19613 Pa y se
fraccionó aproximadamente en 8 ml cada una.
Las fracciones 67 a 76 se recogieron, se
concentraron, eluyeron en una columna YMC-Pack
ODS-AM (4,6 mm de diámetro x 250 mm de longitud;
fabricada por YMC) con agua a un caudal de 0,8 ml/minuto durante
cinco minutos, luego eluyeron hasta una solución acuosa al 80% de
acetonitrilo por un procedimiento de gradiente de concentración
durante 20 minutos y se detectó por medio de una absorbancia a 210
nm, después de lo cual se obtuvo un único pico a un tiempo de
elución de 18 minutos dando
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
(1) Se disolvió ácido
D-glucurónico (fabricado por Sigma; G 5269) (10 g)
en un litro de agua, se calentó a 21ºC durante cuatro horas y se
concentró a vacío hasta aproximadamente 10 ml. Se añadió una capa
superior (40 ml) de una mezcla 3:2:2 de acetato de butilo, ácido
acético y agua y se mezcló con el ácido y luego se concentró a
vacío hasta aproximadamente 10 ml el fluido sobrenadante obtenido
por centrifugación.
El extracto anterior se aplicó a gel de sílice
BW-300SP para cromatografía en columna (2 x 28 cm;
fabricado por Fuji Silicia Kagaku) y se separó usando una capa
superior de una mezcla 3:2:2 de acetato de butilo, ácido acético y
agua como eluyente a un caudal de 5 ml/minuto con una presión de
20.265 Pa por un compresor. Se llevó a cabo un fraccionamiento de
modo que se preparó una fracción de 10 ml y, cuando se tomó una
parte de cada una de las fracciones y se analizó por una
cromatografía en capa fina, las fracciones nº 61 a nº 80 contenían
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
de alta pureza. Se combinaron estas fracciones, se concentraron a
vacío y se extrajeron con 40 ml de cloroformo y se concentró el
extracto a vacío dando 100 mg de 4,
5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
representada por la fórmula [IX] siguiente.
(2) Las propiedades físicas de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
obtenida en el Ejemplo 7-(1) se dan a continuación. A propósito, el
análisis de masas de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
se llevó a cabo por un espectrómetro de masas DX 302 (fabricado por
Nippon Denshi). En la medida del espectro de RMN usando como
disolvente cloroformo pesado, se usó un JNM-A500
(fabricado por Nippon Denshi). La rotación específica, el espectro
de absorción UV y el espectro de absorción de infrarrojos (IR) se
midieron usando un polarímetro (tipo DIP-370;
fabricado por Nippon Bunko), un espectrofotómetro (tipo
UV-2500; fabricado por Shimadzu) y un
espectrofotómetro de infrarrojos (tipo FTIR-8000;
fabricado por Shimadzu), respectivamente.
FAB-MS m/z
115[M+H]^{+}
Como matriz se usó glicerol.
RMN de ^{1}H(CDCl_{3})
\delta 4,20 (1H, d, J = 2,4 Hz,
5-H), 4,83 (1H, m, 4-H), 6,30 (1H,
dd, J = 1,2, 6,1 Hz, 2-H), 7,48 (1H, dd, J = 2,1,
6,1 Hz, 3-H)
En los datos anteriores el valor del
desplazamiento químico de RMN de ^{1}H se dio en base a que el
valor del desplazamiento químico del CHCl_{3} era 7,26 ppm.
Rotación óptica: [\alpha]_{D}^{20}
0º (c 1,3, agua)
IR (procedimiento de KBr): se apreciaron
absorciones a 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm^{-1}.
UV: \lambda_{max}215 nm (agua)
Esta fracción se separó por una HPLC en fase
normal usando una columna de Palpack tipo S y detección por medio
de absorción ultravioleta a 215 nm, después de lo cual la pureza
fue de 98%.
(3) Se calentó a 121ºC durante 4 horas una
solución acuosa 2M de D-ribosa (comercializada por
Nacalai Tesque; 302-10) o una solución acuosa 2M de
D-(+)-xilosa (fabricada por Nacalai Tesque;
367-19). La solución termotratada (90 \mul) se
preparó para que reaccionara con 10 \mul de una solución 1M en
etanol de tiofenol (fabricado por Nacalai Tesque;
338-01) a 37ºC durante 30 minutos. La solución
termotratada y su producto de reacción con tiofenol se analizaron
por la siguiente HPLC de fase inversa.
- Columna: YMC-Pack ODS-AM (4,6 x 250 mm; fabricada por YMC)
- Fase móvil A: solución acuosa al 0,1 % de ácido trifluoroacético (TFA)
- Fase móvil B: solución acuosa que contiene TFA al 0,1% y acetonitrilo al 80%
- Caudal: 0,8 ml/minuto
- Elución: fase móvil A (durante cinco minutos) \rightarrow gradiente de concentración lineal desde la fase móvil A hasta la fase móvil B (durante 20 minutos) \rightarrow fase móvil B (durante cinco minutos)
- Detección: absorbancia a 215 nm
- Tamaño de la muestra inyectada: 10 \mul
Cuando se analizó la solución termotratada se
apreció un pico de tiempo de retención de 6,5 minutos en ribosa y
xilosa. Esto coincide con el tiempo de retención de
4,5-dihidroxi-1-ciclopenten-1-ona
obtenido en el Ejemplo 7-(1).
Cuando se analizó el producto de reacción de la
solución termotratada con tiofenol, el pico del tiempo de retención
de 6,5 minutos desapareció en ribosa y xilosa y apareció nuevamente
un pico de tiempo de retención de 19,6 minutos. El pico recién
aparecido era idéntico al pico obtenido después de la retención de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
con tiofenol del Ejemplo 7-(1) con tiofenol.
A partir de lo anterior, es evidente que se
produce
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
cuando se calientan ribosa o xilosa.
(4) Se calentó a 121ºC durante 14 horas cada una
de las soluciones acuosas 0,1 M, 0,2 M, 0,5 M, 1 M y 2 M de
D-ribosa o D-(+)-xilosa. Estas se
analizaron por la misma HPLC de fase inversa que en el Ejemplo
7-(2) y se midió el pico de tiempo de retención de 6,5 minutos con
el fin de determinar la cantidad producida de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
El resultado se da en la Figura 9. Así, la Figura 9 muestra la
relación entre la concentración de pentosa y la cantidad producida
de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
indicando el eje de abscisas la concentración de pentosa (M) y el
eje de ordenadas la cantidad producida (mM) de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
A propósito, en la Figura 9, los puntos negros son la cantidad de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
producida en la ribosa termotratada mientras que los triángulos
negros son la cantidad de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
producida en la D-(+)-xilosa termotratada.
(1) Se disolvió en 5 ml de agua
ribosa-5-fosfato sódico (50 mg)
(fabricado por Nacalai Tesque; 302-12), se ajustó a
pH 3 con HCl y se calentó a 121ºC durante cuatro horas. El producto
calentado resultante se analizó por la HPLC de fase inversa
siguiente.
- Columna: gel TSK ODS-80 Ts (4,6 mm x 250 mm; fabricada por Tosoh)
- Fase móvil: solución acuosa de TFA
- Caudal: 1 ml/minuto
- Detección: absorbancia a 215 nm
- Tamaño de la muestra inyectada: 20 \mul
El resultado fue que se encontró un pico de
tiempo de retención de 4,7 minutos y que era idéntico al tiempo de
retención de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
obtenido en el Ejemplo 7(1). Además, a partir de la curva de
calibración que muestra la relación entre el área del pico y
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
obtenido a partir de dicha
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
pura, se calculó la concentración de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en este producto calentado como 6,3 \mug/ml.
Se sometió este producto calentado (200 \mul) a
una HPLC del mismo modo que antes y se recogió una fracción de
tiempo de retención de 3,8-5,8 minutos. Se repitió
dos veces la misma operación y la fracción recogida se concentró y
evaporó a vacío. Se añadió a esta una mezcla 4:1:1 de
N,O-bis(trimetilsilil)-acetamida
(fabricada por Nacalai Tesque), trimetilclorosilano (fabricado por
G. L. Science) y piridina (fabricada por Pierce) para llevar a cabo
la trimetilsililación y se analizó la estructura por cromatografía
de gases/análisis de masas usando un analizador de masas (tipo
DX-302; fabricado por Nippon Denshi) después de lo
cual el espectro de masas de un pico que apareció al mismo tiempo de
retención que la
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
obtenido en el Ejemplo 7-(1) fue idéntico al de dicha
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
pura.
Por consiguiente, se confirmó ahora la producción
de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
(2) Se disolvió
ribosa-5-fosfato sódico (30 mg) en 3
ml de agua y se ajustó hasta pH 2,5 por HCl 1N. Se midió la
cantidad de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
contenida en esta muestra por la siguiente HPLC de filtración en
gel.
- Columna: gel TSK G2500PW (XL) (7,8 x 300 mm; fabricada por Tosoh)
- Temperatura de la columna: 40ºC
- Fase móvil: agua
- Caudal: 1 ml/minuto
- Detección: absorbancia a 215 nm
El resultado fue que se observó un pico de tiempo
de retención de 11,4 minutos y el tiempo de retención fue idéntico
al de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
pura obtenido en el Ejemplo 7-(1). Además, a partir de la curva de
calibración que muestra la relación entre el área del pico y
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
obtenida a partir de dicha
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
pura, se calculó la concentración de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en este producto calentado como 8,9 \mug/ml.
A partir de lo anterior, es ahora evidente que,
cuando se calienta ribosa-5-fosfato
sódico, se produce
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Se calentó a 121ºC durante cuatro horas una
solución acuosa 2M de D-ribosa. Se concentró esta
solución calentada a vacío y se repartió con acetato de etilo a la
relación de 1:2 para extraer hasta acetato de etilo, se evaporó el
acetato de etilo a vacío y se disolvió el residuo en una mezcla 9:1
de cloroformo y metanol.
El gel de sílice para la cromatografía en columna
(BW-30 SP fabricado por Fuji Silicia Kagaku)
(aproximadamente 250 cm^{3}) se equilibró con la mezcla anterior y
se cargó en una columna de 25 mm de diámetro x 60 cm de longitud y
se sometió a cromatografía la solución anteriormente preparada con
una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol a una presión de 19613 Pa y
se fraccionó aproximadamente cada 8 ml. El disolvente de la fracción
se evaporó apropiadamente seguido por una cromatografía en capa
fina, se recogieron las fracciones 38-57 que tenían
una mancha de Rf 0,5 y se evaporó de las mismas el disolvente y se
sustituyó por una solución acuosa al 50% de etanol. En la
cromatografía en capa fina se usó gel de sílice 60F_{254}, se
llevó a cabo el desarrollo con una mezcla 9:1 de cloroformo y
metanol y la detección se realizó por un reaccionante de coloración
de orcinol-ácido sulfúrico.
A continuación se separó la sustancia activa y se
purificó por una HPLC de fase inversa. En la separación, se usó una
columna de gel TSK ODS-80 Ts (4,6 x 250 mm), eluyó
con agua durante 10 minutos a un caudal de 6,5 ml/minuto, luego
eluyó hasta una solución acuosa al 60% de acetonitrilo por un
procedimiento de gradiente de concentración durante 15 minutos y la
detección fue por absorbancia a 206 nm. Se recogió el pico de
tiempo de elución de 15 minutos.
Se sometió el pico de tiempo de elución de 15
minutos a una medida de la actividad supresora del crecimiento de
células cancerígenas y actividad inductora de apóptosis por un
procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 4-(2), después de lo cual
se apreció deformación de las células y supresión de la formación
de formazán, por tanto, se confirmó la actividad supresora del
crecimiento celular y actividad inductora de apóptosis.
Se sometió el pico de tiempo de retención de 15
minutos a un análisis de HPLC de fase inversa. En el análisis se
usó una columna de gel TSK ODS-80 Ts (4,6 x 250 mm)
y ésta eluyó con 0,8 ml/minuto de agua durante cinco minutos, eluyó
hasta una solución acuosa al 80% de acetonitrilo por un
procedimiento de gradiente de concentración durante 20 minutos y,
la detección fue por medio de absorbancia a 206 nm. En este análisis
un pico de tiempo de retención de 15 minutos eluyó a un tiempo de
elución de 5,7 minutos y su tiempo de elución fue idéntico al de la
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
citada en el Ejemplo 7-(1). Además, se analizó la fracción del pico
de tiempo de retención de 15 minutos por espectro de resonancia
magnética nuclear después de disolver en dimetil sulfóxido pesado y
se confirmó el espectro de
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Se disolvieron en 25 ml de agua
4-ciclopenten-1,3-diona
(Aldrich; código 16.168-3) (1 g; 10,4 mmol) y 1,94
g (5,2 mmol) de cloruro de cerio (III)\cdot7H_{2}O
(Nacalai Tesque; código 077-20). Se añadió de forma
gradual NaBH_{4} (Nacalai Tesque; código 312-29)
(198 mg; 5,2 mmol) con agitación y, después de completarse la
adición el pH se hizo neutro o menor con HCl 1N.
La solución de reacción se sometió a una TLC
usando un disolvente de desarrollo que era una mezcla 9:1 de
cloroformo y metanol y se detectó por orcinol-ácido sulfúrico,
después de lo cual se detectó una mancha roja aproximadamente a Rf
0,5. La solución de reacción neutralizada se concentró a vacío
hasta el estado de jarabe, se extrajo el jarabe con 100 ml de una
mezcla 40:1 de cloroformo y metanol y se filtró el extracto a través
de gel de sílice. El filtrado se concentró a vacío y se purificó
sometiendo a una cromatografía sobre gel de sílice de media presión
(80 g) usando una mezcla 40:1 de cloroformo y metanol, dando 236
mg (rendimiento: 23%) de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
de alta pureza en un aceite amarillo pálido que se confirmó a
partir de su espectro de resonancia magnética nuclear.
Se calentó a 37ºC durante una hora un tampón
fosfato 200 mM de pH 7 (2 ml) que contenía
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
50 mM y L-glutatión 100 mM para preparar una
muestra y se sometió esta muestra a una HPLC de fase inversa para
recoger los picos. La columna usada fue una columna de gel TSK
ODS-80 Ts (20 mm de diámetro x 250 mm de longitud;
fabricada por Tosoh). La elución se llevó a cabo con 6,5 ml/minuto
de agua destilada y la detección se realizó por una absorbancia a
206 nm. Se recogieron los picos, se concentraron a vacío y se
sometieron a un ensayo con MTT usando células de leucemia
promielocítica humana (células HL-60) citadas en el
Ejemplo 1.
Como resultado del ensayo con MTT se apreciaron
en el pico 1 de tiempo de elución de 14,4 minutos y en el pico 3 de
tiempo de elución de 16,6 minutos actividad supresora del
crecimiento de células cancerígenas y producción de cuerpos
apoptóticos. Los dos picos en los que se apreció la actividad se
purificaron sometiendo a una cromatografía de nuevo usando la misma
columna.
Se analizaron los dos picos en los que se apreció
actividad por un análisis de masas y un espectro de resonancia
magnética nuclear.
El análisis de masas se llevó a cabo por un
espectrómetro de masas de tipo DX 302 (Nippon Denshi) en modo de
ion positivo usando glicerol como matriz.
FAB-MS del pico 1: | m/z 406 [M+H]^{+} |
FAB-MS del pico 3: | m/z 406 [M+Z]^{+} |
428 [M+Na]^{+} |
El espectrómetro de resonancia magnética nuclear
usado fue un JNM-A500 (Nippon Denshi) y la medida
se llevó a cabo disolviendo en agua pesada. Los valores de
desplazamiento químico en la RMN de ^{1}H cuando se fijó el HOD a
4,65 ppm fueron los siguientes.
Pico 1; \sigma 2,13 (2H, m,
5'-H), 2,29 (1H, m, 2-H), 2,45 (1H,
m, 5-H), 2,50 (2H, m, 4'-H), 2,65
(1H, m, 5-H), 2,69 (1H, m, 2-H),
2,90-3,00 (1H, m, 1'-H),
3,10-3,18 (1H, m, 1'-H), 3,61 (1H,
m, 3-H), 3,76 (1H, m, 6'-H), 3,89
(2H, s, 9'-H), 4,50-4,62 (2H, m,
4-H, 2'-H)
Pico 3; \sigma 2,10 (2H, m,
5'-H), 2,27 (1H, m, 2-H), 2,29 (1H,
m, 5-H), 2,48 (2H, m, 4'-H),
2,76-2,84 (1H, m, 5-H),
2,84-2,92 (1H,m, 2-H),
2,93-3,02 (1H, m, 1'-H),
3,09-3,21 (1H,m, 1'-H), 3,40 (1H, m,
3-H), 3,73 (1H, m, 6'-H), 3,86 (2H,
s, 9'-H), 4,31-4,40 (1H, m,
4-H), 4,59 (1H, m, 2'-H).
Los números de asignación de las señales del pico
1 y del pico 3 son como se muestra en la fórmula [X] siguiente.
El pico 1 fue una mezcla de diastereoisómeros de
un compuesto 3R,4S y un compuesto 3S,4R mientras que el pico 3 fue
una mezcla de diastereoisómeros de un compuesto 3R,4R y un
compuesto 3S,4S.
A partir de lo anterior fue evidente que el pico
1 de la presente muestra era
cis-3-L-glutatión-s-il-4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en la que las posiciones 3 y 4 estaban en forma cis mientras
que el pico 3 de la presente muestra era
trans-3-L-glutatión-s-il-4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en la que las posiciones 3 y 4 estaban en trans.
La Figura 10 muestra un espectro de masas del
pico 1 en el que el eje de abscisas indica m/z mientras que el eje
de ordenadas indica la intensidad relativa (%).
La Figura 11 muestra un espectro de masas del
pico 3 en el que el eje de abscisas indica m/z mientras que el eje
de ordenadas indica la intensidad relativa (%).
La Figura 12 muestra un espectro de RMN de
^{1}H del pico 1 en el que el eje de abscisas indica el valor de
desplazamiento químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas
indica la intensidad de señal.
La Figura 13 muestra un espectro de RMN de
^{1}H del pico 3 en el que el eje de abscisas indica el valor de
desplazamiento químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas
indica la intensidad de señal.
(1) Se suspendieron en un medio RPMI 1640 hasta
una concentración de 2,5 x 10^{5} células/5 ml) células
HL-60 (ATCC CCL-240) incubadas a
37ºC en un medio RPMI 1640 (fabricado por BioWhittaker) que
contenía 10% de suero bovino fetal (fabricado por JRH) tratado a
56ºC durante 30 minutos.
Se añadieron a 5 ml de esta suspensión 10 \mul
de 12,5 mM, 25 mM, 50 mM o 100 mM de una solución en etanol al 70%
de
4,5-dihidroxi-2-pentenal
preparado en el Ejemplo 6-(1), 0,05 mM, 0,5 mM, 5 mM o 50 mM de una
solución en etanol al 70% de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ol
preparado en el Ejemplo 6-(1), 5 mM, 10 mM o 20 mM de una solución
en etanol al 70% de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona
preparada en el Ejemplo 4-(4), 2,5 mM, 5mM, 15 mM o 25 mM de una
solución en etanol al 70% de
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
preparada en el Ejemplo 4-(5), 75 mM, 150 mM o 300 mM de una
solución en etanol al 70% de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
preparada en el Ejemplo 5-(2) o 5 mM, 25 mM o 50 mM de una solución
en etanol al 70% de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
preparado en el Ejemplo 6-(2), seguido por incubación a 37ºC en
presencia de dióxido de carbono gaseoso al 5% durante 24 horas.
Las células incubadas se observaron al
microscopio óptico y se confirmó la agregación de los núcleos,
reducción en el tamaño de las células y formación de cuerpos
apoptóticos en las células incubadas cuando se añadió una
concentración final 1 \muM o superior de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
una concentración final 10 \muM o superior de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
una concentración final 10 \muM o superior de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
una concentración final 39 \muM o superior de
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
una concentración final 625 \muM o superior de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
o una concentración final 80 \muM o superior de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
A propósito, dichos fenómenos no se apreciaron en las células
incubadas a las que se añadieron 10 ml de solución en etanol al 70%
usada como control.
(2) Se suspendieron en medio RPMI 1640 hasta 2,5
x 10^{5} células/5 ml células HL-60 que se
incubaron en un medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al
10% procesado a 56ºC durante 30 minutos.
Se añadieron a 5 ml de la suspensión 10 \mul de
12,5 mM, 25 mM, 50 mM o 100 mM de una solución en etanol al 70% de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
0,05 mM, 0,5 mM, 5mM o 50mM de una solución en etanol al 70% de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
5mM, 10mM o 20 mM de una solución en etanol al 70% de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona
preparada en el Ejemplo 4-(4), 2,5 mM, 5 mM, 15 mM o 25 mM de una
solución en etanol al 70% de
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
preparada en el Ejemplo 4- (5), 75 mM, 150 mM o 300 mM de una
solución en etanol al 70% de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
preparada en el Ejemplo 5-(2) o 5 mM, 25 mM o 50 mM de una solución
en etanol al 70% de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
preparado en el Ejemplo 6-(2) seguido por incubación a 37ºC en
presencia de 5% de dióxido de carbono gaseoso durante 24 horas y 48
horas y las células resultantes se sometieron a una medida de las
células apoptóticas usando FACScan por un procedimiento citado en
las páginas 129-130 de "Experimental Protocol
Series - Apoptosis Experiment Protocol" que era una edición
especial de "Saibo Kogaku (Cell Technology)" (editado por
Shujunsha en 1994) y también a una medida del análisis de
fragmentación de ADN por un procedimiento citado en las páginas
61-63 de "Biomanual UP Series - New Experimental
Methods for Apoptosis" (editado por Yodosha en 1995).
El resultado fue que se confirmaron células
apoptóticas en las células incubadas en las que se añadió una
concentración final 50 \muM o superior de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
una concentración final 10 \muM o superior de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
una concentración final 10 \muM o superior de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
una concentración final 20 \muM o superior de
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
una concentración final 600 \muM o superior de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
o una concentración final 50 \muM o superior de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
Además, se confirmó fragmentación de ADN en las células incubadas
cuando se añadieron concentraciones finales 50, 100 y \muM de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
concentración final 10 \muM de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
y concentraciones finales 10 y 30 \muM de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona.
A propósito, dichos fenómenos no se apreciaron en las células
incubadas a las que se añadieron 10 \mul de solución en etanol al
70% usada como control.
(3) Se tiñeron con azul de tripano al 0,4% las
células que se incubaron durante 24 horas del mismo modo que en el
Ejemplo 9-(2) y se observaron al microscopio óptico el número de
células viables que no se tiñeron y de células muertas que se
tiñeron de azul, se determinó la concentración (tasa de
supervivencia_{50}) de cada una de las muestras en las que la
tasa de supervivencia era del 50% y los resultados se dan en la
Tabla 1.
Nombre de la sustancia | Tasa de supervivencia_{50} |
(\muM) | |
4,5-dihidroxi-2-pentenal | 124 |
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona | 25,5 |
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona | 22,4 |
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona | 67,9 |
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona | 438 |
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano | 74,4 |
(1) Se añadió un \mul de un ADN pBR322 (0,25
\mug/(\mul) (fabricado por Takara Shuzo) a una mezcla de 2
\mul de topoisomerasa II [fabricada por Topogen; 2
unidades/\mul], 2 \mul de tampón diluido diez veces
[Tris-HCl 0,5M (pH 8,0), KCl 1,2M, MgCl_{2} 0,1
M, trifosfato de adenosina 5 mM y ditiotreitol 5 mM], 2 \mul de
albúmina sérica bovina al 0,1% (fabricada por Takara Shuzo), 11
\mul de agua destilada y 2 \mul de agua destilada (un control)
o
4,5-dihidroxi-2-pentenal
o
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
en diversas concentraciones con agua y luego se hizo reaccionar
durante 30 minutos, se detuvo la reacción añadiendo 2 \mul de una
solución acuosa de dodecilsulfato sódico al 1%, glicerol al 50% y
Azul de Bromofenol al 0,02%.
La solución de reacción anterior (\mul) se
aplicó a un gel de agarosa al 1% preparado a partir de agarosa L03
(fabricada por Takara Shuzo) tampón TAE [consistente en 40 mM de
Tris, 5 mM de acetato sódico y 1 mM de etilendiamina tetraacetato
disódico (EDTA); ajustado hasta pH 7,8 con ácido acético] y se
llevó a cabo una electroforesis en un tampón TAE. Después de la
electroforesis, se sumergió el gel en una solución acuosa 1
\mug/ml de bromuro de etidio y se irradió con radiación
ultravioleta y se observó el patrón electroforético de ADN. A
propósito, en el control en el que se añadió agua, el ADN cambió
totalmente desde un tipo superarrollado a un tipo circular relajado
mientras que cuando se inhibió la actividad topoisomerasa II, el
cambio del tipo superarrollado al tipo circular relajado se inhibió
total o parcialmente.
Como resultado, en el control al que se añadió
agua, el ADN cambió totalmente desde un tipo superarrollado a un
tipo circular relajado pero el cambio desde un tipo superarrollado
a un tipo circular relajado estuvo parcial o totalmente inhibido por
100 \muM o más de
4,5-dihidroxi-2-pentenal
o
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
por lo que se confirmó la actividad inhibidora de topoisomerasa II
de cada uno de los compuestos.
(2) La actividad inhibidora de topoisomerasa I de
cada uno de los compuestos se midió por el mismo procedimiento que
en Ejemplo 13-(1) salvo que se usó topoisomerasa I [fabricada por
Topogen; 0,01 unidades/(\mul] en lugar de topoisomerasa I y, como
patrón diluido a la décima parte se usaron Tris-HCl
100 mM (pH 7,9), EDTA disódico 10 mM, espermidina 1 mM y glicerol
al 50%.
El resultado fue que no se confirmó en ninguno de
los compuestos actividad inhibidora de topoisomerasa I.
Como se ha citado antes, cada uno de los
compuestos mostró actividad inhibidora específica hacia
topoisomerasa II que apareció transitoriamente solo en una etapa de
la división en células normales pero que se expresa a alto nivel a
lo largo de todos los períodos celulares como resultado de la
aparición de cáncer. A propósito, todos los demás compuestos de la
presente invención mostraron también la misma actividad
inhibidora.
Se incubaron células Hs 68 (ATCC
CRL-1635) que eran células de cáncer humano en un
medio D-MEM (fabricado por Gibco BRL) que contenía
suero bovino fetal al 10% (FBS fabricado por BioWhittaker) a 37ºC en
presencia de 5% de CO_{2} hasta que las células se saturaron en el
medio de cultivo, se suspendió solución de
tripsina-EDTA (fabricado por BioWhittaker) en el
medio anterior hasta 3 x 10^{5} células/ml y se colocaron 200
\mul de la suspensión en cada uno de los pocillos de una placa de
microvaloración de 96 pocillos. Después de cinco días desde la
incubación, se descartó el medio en la etapa en la que las células
estaban casi saturadas en el medio de cultivo y se añadió un medio
que contenía 5, 10, 20, 40, 100 ó 200 \muM de
4,5-dihidroxi-2-pentenal
o
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Se adoptó un período de tiempo de 96 horas y, cada 24 horas se
recuperó el líquido sobrenadante del medio incubado y se midió la
influencia de
4,5-dihidroxi-2-pentenal
y
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
sobre la inducción de producción de hlGF-1 en
células Hs68 usando un kit ELISA para hlGF-1
(fabricado por Diagnostic System Labo).
El resultado fue que en células Hs68, la
actividad inductora de la producción de hlGF llegó a un máximo
después de 24 horas y luego se redujo con el paso del tiempo cuando
se añadían 100 \muM o más de
4,5-dihidroxi-2-pentenal
o
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
A propósito, la actividad inductora de hlGF-1 de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
fue mayor que la de
4,5-dihidroxi-2-pentenal.
Los resultados se dan en la Tabla 2 y en la Tabla
3.
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona | Tiempo de incubación | |||
Concentración (\muM) | 24 horas | 48 horas | 72 horas | 96 horas |
Actividad inductora de la producción de hlGF-1 (ng/ml) | ||||
0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
40 | 0 | 0 | 0 | 0 |
100 | 39,9 | 10,0 | 9,6 | 4,4 |
200 | 37,9 | 10,4 | 9,9 | 4,2 |
4,5-dihidroxi-2-pentenal | Tiempo de incubación | |||
Concentración (\muM) | 24 horas | 48 horas | 72 horas | 96 horas |
Actividad inductora de la producción de hlGF-1 (ng/ml) | ||||
0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
40 | 0 | 0 | 0 | 0 |
100 | 15,3 | 10,0 | 5,2 | 4,6 |
200 | 11,3 | 11,1 | 9,9 | 4,5 |
Como tales,
4,5-dihidroxi-2-pentenal
y
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
mostraron actividad inductora de la producción de
hlGF-1. Otros compuestos de la presente invención
también mostraron la misma actividad.
(1) Se suspendieron células U937 (ATCC
CRL-1593) que era una cepa de células sinoviales
establecidas a partir de efusión pleural de pacientes que sufren
linfoma de tejido en un medio RPMI 1640 que contenía 10% de FBS
hasta que su concentración fue 5 x 10^{5} células/ml y se
colocaron 100 \mul de la suspensión en cada uno de los pocillos de
una placa de microvaloración de 96 pocillos. Después de esto, se
añadieron 100 \mul del medio anterior y luego se añadió
4,5-dihidroxi-2-pentenal
o
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
hasta que su concentración fue 5, 75, 100, 150 ó 200 \muM. La
mezcla se incubó a 37ºC en presencia de dióxido de carbono gas y,
después de 24, 48 y 72 horas, se añadieron 10 \mul de Premix
WST-1 (MK400; fabricado por Takara Shuzo). La mezcla
se hizo reaccionar a 37ºC durante tres horas y se definió el valor
(A_{450-650}) obtenido restando la absorbancia a
650 nm (A_{650}) de la absorbancia a 450 nm (A_{450}) como el
grado de crecimiento celular.
Los resultados se dan en la Tabla 4 y en la Tabla
5.
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona | Tiempo de incubación | ||
Concentración (\muM) | 24 horas | 48 horas | 72 horas |
Grado de crecimiento celular (A_{450-650}) | |||
0 | 0,940 | 3,912 | 1,829 |
50 | 0,501 | 0,930 | 0,875 |
75 | 0,557 | 0,968 | 0,821 |
100 | 0,591 | 1,054 | 0,532 |
150 | 0,524 | 1,126 | 0,478 |
200 | 0,353 | 0,643 | 0,338 |
4,5-dihidroxi-2-pentenal | Tiempo de incubación | ||
24 horas | 48 horas | 72 horas | |
Concentración (\muM) | Grado de crecimiento celular (A_{450-650}) | ||
0 | 0,940 | 3,912 | 1,829 |
50 | 0,821 | 1,471 | 1,245 |
75 | 0,606 | 0,879 | 0,862 |
100 | 0,560 | 0,948 | 0,597 |
150 | 0,505 | 0,823 | 0,465 |
200 | 0,370 | 0,644 | 0,753 |
Como tales,
4,5-dihidroxi-2-pentenal
y
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
mostraron actividad supresora del crecimiento celular frente a
células sinoviales. Otros compuestos de la presente invención
mostraron también la misma actividad.
(2) Se incubaron células DSEK (propiedad del
Department of Second Internal Medicine, Total Medical Center,
Saitama Medical College, como modelo de reumatismo in vitro)
que eran cepas de células fibroblastos establecidas a partir de
membrana sinovial de un paciente que sufría reumatismo crónico en un
medio Iscov-MEM (IMDM; fabricado por Gibco BRL) que
contenía 10% de FBS (fabricado por BioWhittaker) a 37ºC en
presencia de CO_{2} al 5% hasta que las células se saturaron en un
incubador, se suspendió una solución de
tripsina-EDTA (fabricada por BioWhittaker) en el
medio anterior hasta 3 x 10^{4} células/ml y se colocaron 200
\mul de la suspensión en cada pocillo de una placa de
microvaloración de 96 pocillos (fabricada por Falcon). Cuando las
células estaban casi en un estado de saturación del 80% después de
5-7 días desde la incubación, se cambio el medio y
se añadieron 200 \mul del medio anterior que contenía 50, 75, 100
ó 150 \muM de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
o
4,5-dihidroxi-2-pentenal.
Se adoptó un intervalo de tiempo de 96 horas y,
cada 24 horas se añadieron 10 \mul de Premix
WST-1 (MK 400; fabricado por Takara Shuzo) seguido
por reacción a 37ºC durante 3,5 horas y el valor
(A_{450-650}) obtenido restando la absorbancia a
650 nm (A_{650}) de la absorbancia a 450 nm (A_{450}) se definió
como grado de crecimiento celular.
Los resultados se dan en la Tabla 6 y en la Tabla
7.
Además, en la Tabla 8 se muestran las
concentraciones inhibidoras de crecimiento celular al 50%
(CI_{50}) calculadas a partir de los datos de
A_{450-650}.
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona | Tiempo de incubación | |||
Concentración (\muM) | 24 horas | 24 horas | 72 horas | 96 horas |
Grado de crecimiento celular (A_{450-650}) | ||||
0 | 1,04 | 1,25 | 1,45 | 2,35 |
50 | 0,57 | 0,71 | 0,73 | 0,54 |
75 | 0,51 | 0,68 | 0,68 | 0,55 |
100 | 0,50 | 0,64 | 0,67 | 0,51 |
150 | 0,46 | 0,55 | 0,63 | 0,50 |
\vskip1.000000\baselineskip
4,5-dihidroxi-2-pentenal | Tiempo de incubación | |||
24 horas | 24 horas | 72 horas | 96 horas | |
Concentración (\muM) | Grado de crecimiento celular (A_{450-650}) | |||
0 | 1,04 | 1,25 | 1,46 | 2,33 |
50 | 1,12 | 0,83 | 0,96 | 0,98 |
75 | 1,11 | 0,77 | 0,67 | 0,59 |
100 | 1,02 | 0,63 | 0,54 | 0,59 |
150 | 0,96 | 0,61 | 0,41 | 0,55 |
\vskip1.000000\baselineskip
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona | 4,5-dihidroxi-2-pentenal | |||
48 horas | 96 horas | 48 horas | 96 horas | |
Concentración (\muM) | 60 | 35 | 165 | 75 |
(3) Se prepararon células DSEK en las condiciones
citadas en el Ejemplo 15-(2) y se añadieron 20 \mul de medio que
contenía 25, 50, 75, 100, 200 ó 400 \muM de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
o
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
Se adoptó un período de tiempo de 72 horas y,
cada 24 horas se midió el grado de crecimiento celular con el paso
del tiempo. Se midieron también los valores de CI_{50} de cada
uno de los compuestos.
El resultado se da en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre de la sustancia | CI_{50} (\muM) | |
24 horas | 72 horas | |
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona | 207 | 60 |
4,5-dihidroxi-2-pentenal | 232 | 119 |
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona | 132 | 67 |
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano | 267 | 68 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los grados de crecimiento celular después de 24 y
72 horas del control al que no se añadió muestra fueron 3,95 y
3,97, respectivamente.
Como tales, cuando se añadieron
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
o
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano
a células DSEK (modelo de reumatismo) in vitro, los casos a
los que se añadieron cada uno de los compuestos mostraron una
inhibición significativa del crecimiento de células de reumatismo
al compararlas con el caso en el que se añadió PBS. Además en
observaciones con un intervalo de tiempo se apreció que los
compuestos no solo mantenían su actividad inhibidora de crecimiento
sino que también tenían tendencia a potenciar la actividad con el
paso del tiempo.
A partir de los resultados anteriores se encontró
que
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
y
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano
tenían una potente actividad antirreumática y se espera que se
desarrollen como agentes terapéuticos y alimentos saludables útiles
para el reumatismo crónico. Además, otros compuestos de la presente
invención también mostraron la misma actividad antirreumática.
Ahora, en la incubación de células DSEK, se
recuperaron 150 \mul/pocillo de líquido sobrenadante del medio
cada 24 horas y se midió la influencia de
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
o
4,5-dihidroxi-2-pentenal
sobre la producción de citoquinas (TGF-\beta
humana, FGF-\beta humana, IL-1
\alpha humana y una IL-10 humana) usando un kit
ELISA específico para cada una de las citoquinas (el kit fabricado
por INTERGEN para FGF-\beta humana e
IL-10 humana; y el kit fabricado por Promega para
IL-1 \alpha humana y TGF-\beta
humana).
El resultado fue como sigue.
4-Hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
inhibió la producción de FGF-\beta humana e
IL-1 humana \alpha;
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
inhibió la producción de TGF-\beta humana y
FGF-\beta humana y activó la producción de
IL-1 \alpha humana;
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxalano
activó la producción de IL-1 \alpha humana; y
4,5-dihidroxi-2-pentenal
activó la producción de IL-1 \alpha humana e
IL-10 humana.
Se suspendieron células HepG2 (ACTT
HB-8065) que eran las cepas de células establecidas
de pacientes que sufrían hepatoblastoma primario en medio DMEM
(fabricado por Gibco) que contenía 10% de FBS (fabricado por
BioWhittaker) hasta 3,8 x 10^{3} células/ml, se colocaron 200
\mul de la suspensión en cada pocillo de una placa de
microvaloración de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC en presencia de
dióxido de carbono gaseoso al 5% hasta que las células se saturaron
en un incubador, se cambió el medio y luego se añadió
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
o
4,5-dihidroxi-2-pentenal
para que estuvieran en una cantidad de 25, 50, 100 ó 250 \muM, la
mezcla se incubó durante 24, 48 ó 72 horas, se añadieron 10 \mul
de Premix WST-1 (MK 400; fabricado por Takara Shuzo)
se hizo reaccionar la mezcla a 37ºC durante tres horas y se definió
el valor (A_{450-650}) obtenido restando la
absorbancia a 650 nm (A_{650}) de la absorbancia a 450 nm
(A_{450}) como el grado de crecimiento celular.
Los resultados se dan en la Tabla 10 y en la
Tabla 11.
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona | Tiempo de incubación | ||
24 horas | 48 horas | 72 horas | |
Concentración (\muM) | Grado de crecimiento celular (A_{450-650}) | ||
0 | 3,47 | 2,96 | 2,57 |
25 | 1,30 | 0,70 | 0,49 |
50 | 1,38 | 0,81 | 0,47 |
100 | 1,31 | 0,56 | 0,35 |
150 | 1,23 | 0,43 | 0,30 |
Tiempo de incubación | |||
4,5-dihidroxi-2-pentenal | 24 horas | 48 horas | 72 horas |
Grado de crecimiento celular | |||
Concentración (\muM) | (A_{450-650}) | ||
0 | 3,47 | 2,96 | 2,57 |
25 | 3,39 | 2,69 | 1,70 |
50 | 1,97 | 2,96 | 1,70 |
100 | 1,81 | 2,70 | 0,89 |
150 | 1,40 | 0,79 | 0,35 |
Como tales,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
y
4,5-dihidroxi-2-pentenal
mostraron actividad para suprimir el crecimiento de células de
cáncer frente a células de hepatoblastoma HepG2. Otros compuestos
de la presente invención también mostraron la misma actividad.
(1) Se suspendieron células RAW 264.7 (ATCC TIB
71) hasta 3 x 10^{5} células/ml en un medio de Eagle modificado
por Dulbecco (fabricado por BioWhittaker; 12-917F)
que contenía 10% de suero bovino fetal (fabricado por Gibco), sin
Rojo Fenol y 2 mM de L-glutamina (fabricada por
Lifetech Oriental; 25030-149) y se añadieron 500
\mul de la suspensión a cada pocillo de una placa de
microvaloración de 48 pocillos y se incubó a 37ºC durante 12 horas
en presencia de dióxido de carbono gaseoso al 5%. Se añadieron al
pocillo 10 \mul de 50 \mug/ml de lipopolisacárido (LPS;
fabricado por Sigma, L-2012) o 10 \mul de una
solución 2,5 \mug/ml de LPS y 500 unidades/ml de interferón
\gamma (fabricado por Genzyme; código MG-IFN),
luego se añadieron 10 \mul de una solución acuosa 1000, 500 ó 250
\muM de
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
se incubó la mezcla durante 18 horas más y se midió la
concentración de NO_{2}^{-} generada por oxidación de NO en el
medio. A propósito, se prepararon como controles una sección a la
que no se añadieron LPS e interferón \gamma y una sección a la
que no se añadió
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
Después de la incubación anterior, se añadieron
100 \mul de reaccionante de Griess al 4% (fabricado por Sigma;
G4410) a 100 \mul de medio, se dejó reposar la mezcla a
temperatura ambiente durante 15 minutos y se midió la absorbancia a
490 nm. A partir de una curva de calibración preparada por
NaNO_{2} de concentraciones conocidas disueltas en el medio
anterior se calculó la concentración de NO_{2}^{-} en el medio.
Todas las medidas se llevaron a cabo por triplicado.
El resultado fue que
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-
formilvinil)-1,3-dioxolano inhibió
la inducción de la producción de NO por LPS e interferón de una
forma dependiente de la concentración.
El resultado se da en la Figura 14. Así, la
Figura 14 muestra la concentración de NO_{2}^{-} en el medio
cuando se añadió
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
seguido por incubación en cada una de las condiciones de
incubación. En la Figura 14, el eje de abscisas indica las
condiciones de incubación y el eje de ordenadas indica las
concentraciones de NO_{2}^{-} (\muM). En la figura se hace
referencia a
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
solo como "dioxolano".
Incluso a la concentración final de 10 \muM en
la que no se apreció ninguna inhibición del crecimiento celular,
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
mostró actividad inhibidora de la producción de NO en
aproximadamente 50%. Este resultado indica que la inhibición de la
producción de NO por
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
no está causada por inhibición del crecimiento celular por
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
Todos los demás compuestos de la presente invención mostraron
también la misma actividad.
Se colocaron 5 ml de un medio RPMI 1640 que
contenía 10% de FBS que contenía 2 x 10^{5} células/ml de
HL-60 (ATCC CCL-240) en cada uno de
los pocillos de una placa de seis pocillos, se incubaron a 37ºC
durante 24 horas en presencia de CO_{2} al 5%, luego se añadió
4,5-dihidroxi-2-pentenal
hasta que la concentración final fue 0, 12,5, 25, 50 ó 100 \muM o
se añadió
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
hasta que la concentración final fue 0, 2,5, 5, 10, 20, 40 ó 80
\muM y se incubó la mezcla durante seis horas más.
Después de completarse la incubación, se realizó
el recuento de células y luego se recuperaron las células por
centrifugación y lavado con PBS para preparar las células tratadas
con cada una de las muestras. Además, se prepararon así células que
se calentaron a 45ºC durante cinco minutos seguido por someterlas a
la misma incubación.
Las células tratadas como tales se sometieron
seguidamente a SDS-PAGE según el procedimiento
citado en "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989). De este modo, se suspendieron las células en tampón de
muestra de SDS-PAGE hasta una concentración de 2,5
x 10^{6} células/ml, se trató la suspensión de células resultante
a 100ºC durante diez minutos, se aplicaron 5 \mul de cada una de
dos láminas de gel de SDS-PAGE (un gel de apilado
al 5% y un gel de separación al 10%) y se llevó a cabo una
electroforesis. Uno de los geles se tiñió con Comassie mientras que
el otro se sometió a transferencia en una membrana de transferencia
de poli(difluoruro de vinilideno) (Immobilon™ fabricado por
MILLIPORE; número de catálogo IPVH000-10). Esta
membrana se sometió a un bloqueo durante la noche a 4ºC usando Block
Ace (fabricado por Dainippon Pharmaceutical; número de catálogo
UK-B25).
La membrana que se sometió a bloqueo como tal se
hizo reaccionar con anticuerpo monoclonal HSP 72/73
(Ab-1) (fabricado por Oncogene Research Products;
número de catálogo HSP01) que se hizo reaccionar específicamente con
proteína de choque térmico termoinducida de 70 kDa, se lavó con TBS
que contenía 0,05% de Tween 20 y se lavó después con TBS. Después
de esto, se hizo reaccionar con anticuerpo secundario mezclado con
peroxidasa HRP - IgG de conejo antirratón (H + L) (fabricado por ZYM
ED Laboratories; número de catálogo 61-6520) y se
lavó como en la operación anterior. La membrana que se hizo
reaccionar con el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario
como tal se hizo reaccionar con RENAISSANCE™ (un reaccionante de
quimioluminol fabricado por Dupont NEN, número de catálogo
NEL-100) y luego se expuso a una película de rayos X
para confirmar la inducción de la proteína de choque térmico de 70
kDa.
Como resultado, se confirmó la inducción de la
proteína de choque térmico por
4,5-dihidroxi-2-pentenal
y por
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
En la Tabla 12 y en la Tabla 13 se muestra el grado de intensidad
de la inducción. En las Tablas 12 y 13, "+" muestra la
intensidad de inducción y, a más símbolos "+", mayor es la
inducción. A propósito, "-" significa que no hay inducción y
"\pm" significa poca inducción. El resto de compuestos de la
presente invención mostró también la misma actividad inductora de
la proteína de choque térmico.
Concentración (\muM) | ||||
1,25 | 25 | 50 | 100 | |
4,5-dihidroxi-2-pentenal | - | \pm | +++ | - |
Concentración (\muM) | ||||||
2,5 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | |
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona | - | \pm | + | +++ | ++ | \pm |
A propósito, la suspensión de células sin tratar
presentó "-" (sin inducción) y la suspensión de células que se
había calentado a 45ºC durante 5 minutos presentó "++".
Se concentró y se secó el producto de
neutralización de D-ribosa termotratada que se
describe en el Ejemplo 1. Seguidamente se disolvió el producto
resultante en agua destilada para inyección para preparar una
solución al 1%. Esta solución se envasó en viales para
liofilización en una cantidad de 10 mg en base a la fracción
sobrenadante y luego se liofilizó. Como disolvente para disolución
se unió por separado a la misma una solución salina fisiológica (2
ml).
Del mismo modo, para preparar una inyección se
usó
2-desoxi-D-ribosa
termotratada que se describe en el Ejemplo 2.
Del mismo modo, para preparar una inyección se
usaron
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolanol
o
5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
Se prepararon comprimidos conforme a la siguiente
formulación.
Sal sódica de ADN termotratada | 10 mg |
Almidón de maíz | 65 mg |
Carboximetilcelulosa | 20 mg |
Polivinilpirrolidona | \; 3 mg |
Estearato de magnesio | \; 2 mg |
Total | \hskip2,1cm 100 mg por comprimido |
Se usó el producto liofilizado de la sal sódica
termotratada de ADN que se describe en el Ejemplo 4.
Del mismo modo, para preparar comprimidos se
usaron
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolanol
o
5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
La presente invención ofrece el producto
termotratado de la presente invención y/o uno de sus productos
parcialmente purificados que tiene capacidad para inducir apóptosis
que induce apóptosis frente a células de cáncer en cáncer y es
eficaz para la prevención y tratamiento de cáncer y también ofrece
el compuesto de la presente invención que es una sustancia que
tiene capacidad para inducir apóptosis. La presente invención
también ofrece un procedimiento para fabricar
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
a partir de otros compuestos además del grupo ácido urónico. En
cánceres digestivos tales como cáncer de colon y cáncer gástrico,
en particular, se puede inducir apóptosis de las células de cáncer
tomando oralmente un compuesto que se selecciona del producto
termotratado de la presente invención y/o uno de sus productos
parcialmente purificados o el compuesto que tiene capacidad para
inducir apóptosis como alimento o bebida. Así, el alimento o bebida
que contiene, se le ha añadido y/o tiene diluido en el mismo un
compuesto seleccionado del producto termotratado de la presente
invención y/o uno de sus productos parcialmente purificados o el
compuesto que tiene capacidad para inducir apóptosis, es bastante
eficaz para la prevención y tratamiento de cánceres digestivos. Los
agentes farmacéuticos que contienen un compuesto que se selecciona
del producto termotratado de la presente invención y/o uno de sus
productos parcialmente purificados o el compuesto que tiene
capacidad para inducir apóptosis como componente efectivo tiene
actividad supresora de crecimiento celular frente a células
cancerígenas y del crecimiento anómalo de células sinoviales y, son
muy eficaces para mantener la homeostasis del cuerpo humano. Debido
a la capacidad para inducir la producción de hlGF, dichos agentes
farmacéuticos también son eficaces para el tratamiento y prevención
de enfermedades que requieren la inducción de la producción de
hlGF-1. Dichos agentes farmacéuticos también son
eficaces para el tratamiento y prevención de enfermedades que
requieren la supresión de oxígeno activo, por ejemplo la supresión
de la producción de NO. Además, debido a la capacidad de inducir
proteína de choque térmico, dichos agentes farmacéuticos son
eficaces para el tratamiento y prevención de enfermedades que
requieren la inducción de proteína de choque térmico, por ejemplo,
una enfermedad viral.
Es posible suministrar el producto termotratado
de la presente invención y/o uno de sus productos parcialmente
purificados o el compuesto que tiene capacidad para inducir
apóptosis a bajo precio en grandes cantidades usando alimentos como
material. Además, la presente invención ofrece un procedimiento
para inducir convenientemente apóptosis usando el producto
termotratado de la presente invención y/o uno de sus productos
parcialmente purificados o el compuesto que tiene capacidad para
inducir apóptosis como componente efectivo, tras lo cual se puede
llevar a cabo usando dicho procedimiento el estudio del mecanismo
de apóptosis y el desarrollo de un inhibidor de la inducción de
apóptosis.
Además, la presente invención ofrece los agentes
farmacéuticos que usan un compuesto seleccionado del compuesto de la
presente invención. Dichos agentes farmacéuticos son muy eficaces
para el tratamiento y prevención de enfermedades incurables tales
como cáncer, patologías reumáticas, diabetes mellitus y enfermedades
virales.
La presente invención ofrece además un alimento o
bebida en el que está contenido, se ha añadido y/o se ha diluido
con el mismo un compuesto seleccionado del compuesto de la presente
invención. Dicho alimento o bebida es un alimento o bebida funcional
tal como un alimento o bebida que induce apóptosis, carcinostática,
antirreumática, contra la diabetes mellitus e inductora de la
proteína de choque térmico que es eficaz para la prevención y
mejora de enfermedades incurables tales como cáncer, patologías
reumáticas, diabetes mellitus y enfermedades virales.
La presente invención ofrece además un
procedimiento convencional para la fabricación de
4,5-dihidroxi-2-pentenal
y
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Por otro lado, la presente invención ofrece el nuevo compuesto que
tiene actividad fisiológica tal como
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
y
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
Claims (13)
1. Un procedimiento para la fabricación de un
compuesto seleccionado del grupo consistente en
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
y
4-5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
caracterizado por incluir una etapa que consiste en someter
al menos un compuesto seleccionado de los siguientes (a), (b), (c) y
(d) a un tratamiento térmico:
- a)
- pentosa seleccionada del grupo consistente en xilosa y ribosa;
- b)
- derivados de pentosa en el punto (a) anterior;
- c)
- compuestos que contienen pentosa en el punto (a) anterior;
- d)
- compuestos que contienen derivados en el punto (b) anterior.
2. Un procedimiento de fabricación según la
reivindicación 1, en el que los derivados de pentosa son
desoxipentosa.
3. Un procedimiento de fabricación según la
reivindicación 1, en el que los derivados de pentosa son
desoxirribosa.
4. Un procedimiento de fabricación según la
reivindicación 1, en el que los compuestos que contienen pentosa
son ribonucleósidos, ribonucleótidos o ácido ribonucleico.
5. Un procedimiento de fabricación según la
reivindicación 1, en el que los compuestos que contienen pentosa
son pentosa en la que está unido en posición 5 un grupo que puede
tener una carga negativa.
6. Un procedimiento de fabricación según la
reivindicación 1, en el que los derivados de pentosa son derivados
de pentosa en la que está unido en posición 5 un grupo que puede
tener una carga negativa.
7. Un procedimiento de fabricación según las
reivindicaciones 5 ó 6, en el que el grupo que puede tener una
carga negativa es grupo ácido fosfórico o grupo ácido
sulfúrico.
8. Un procedimiento de fabricación según la
reivindicación 1, en el que los compuestos que contienen derivados
de pentosa son desoxirribonucleósidos, desoxirribonucleótidos y
ácido desoxirribonucleico.
9. Un compuesto que induce apóptosis seleccionado
de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
10. Un agente farmacéutico para terapia o
prevención de una enfermedad que tiene sensibilidad a un compuesto
seleccionado de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil))-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona,
caracterizado porque, dicho agente farmacéutico contiene un
compuesto seleccionado de
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
como componente efectivo.
11. El uso de un agente farmacéutico según la
reivindicación 10 en la fabricación de un agente para el
tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo consistente en
cáncer, reumatismo, diabetes mellitus de tipo II, enanismo, una
enfermedad inflamatoria, arteriosclerosis, una enfermedad nerviosa,
lesión por reperfusión isquémica y una enfermedad viral.
12. Alimento o bebida que contiene un compuesto
seleccionado del grupo consistente en
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil))-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
13. El uso de un compuesto seleccionado del grupo
consistente en
4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil))-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona,
2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano,
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona,
en la fabricación de un alimento o bebida para el tratamiento de un
trastorno seleccionado del grupo consistente en cáncer, reumatismo,
diabetes mellitus de tipo II, enanismo, una enfermedad
inflamatoria, arteriosclerosis, una enfermedad nerviosa, lesión por
reperfusión isquémica y una enfermedad viral.
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