ES2228078T3 - Remedios o preventivos que contienen compuestos de ciclopentenona como ingrediente activo. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que contiene como ingrediente activo al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona de la fórmula [I]: en donde R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes uno de otro, y son hidrógeno, un grupo alifático, un grupo aromático o un grupo aromático-alifático, o uno de sus isómeros ópticos, y una de sus sales, siendo dicha composición para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad que requiera inmunorregulación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera supresión de la inflamación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición del crecimiento de un hongo para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición de la adhesión celular para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera activación de las células NK para su tratamiento o prevención, o una enfermedad que requiera la inducción de proteínas de choque térmico para su tratamiento o prevención.

Description

Remedios o preventivos que contienen compuestos de ciclopentenona como ingrediente activo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un éster de ciclopentenona como ingrediente activo.

Técnica anterior

Una amplia variedad de fármacos incluyendo agentes alquilantes, antimetabolitos, carcinostáticos, tales como alcaloides vegetales, antibióticos, inmunopotenciadores e inmunorreguladores se emplean convencionalmente para terapias clínicas. Sin embargo, la farmacoterapia que usa tales fármacos todavía no se ha completado.

Entre estos fármacos, se han descrito las prostaglandinas de origen natural que tienen carbonilos \alpha,\beta-insaturados en sus anillos de cinco miembros, es decir, las prostaglandinas A y J, indicando que suprimían la síntesis del DNA, lo que sugería su posible uso como carcinostáticos de alta seguridad. Se sintetizaron diversos derivados de dichas prostaglandinas (véase el documento JP-A 62-96438).

Objetos de la invención

El principal objeto de la presente invención es desarrollar un derivado de ciclopentenona que tiene diversas actividades fisiológicas y proporcionar una composición farmacéutica que contiene el compuesto como ingrediente activo.

Estos y otros objetos así como las ventajas de la presente invención se explicarán a continuación con detalle con referencia a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el espectro de ^{1}H-RMN de 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona.

La Figura 2 ilustra el espectro de ^{1}H-RMN de 4,5-bis(metoxiacetiloxi)-2-ciclopentenona.

La Figura 3 ilustra el espectro de ^{1}H-RMN de 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona.

La Figura 4 ilustra el espectro de ^{1}H-RMN de 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona.

La Figura 5 ilustra la relación entre la cantidad de derivado de ciclopentenona administrado y el porcentaje de aumento en el edema en la pata del animal.

La Figura 6 ilustra la relación entre la cantidad de derivado de ciclopentenona administrado y el porcentaje de aumento en la hipersensibilidad retrasada.

La Figura 7 ilustra la relación entre la concentración de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona y la cantidad de captación de ^{3}H-timidina.

La Figura 8 ilustra la relación entre la concentración de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona y la cantidad de relación de ^{3}H-timidina.

Sumario de la invención

Los autores de la presente invención han estudiado intensivamente con el fin de conseguir los objetos de la invención y han encontrado que un derivado de ciclopentenona de la fórmula [I]:

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(en donde R_{1} y R_{2} pueden ser iguales o diferentes uno del otro, y son hidrógeno, un grupo alifático, un grupo aromático o un grupo aromático-alifático) se produce haciendo reaccionar 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona de la fórmula [II] (en lo sucesivo simplemente denominada dihidroxiciclopentenona):

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con un ácido carboxílico y/o uno de sus derivados reactivos, y porque el derivado de ciclopentenona tiene actividades fisiológicas fuertes, tales como una actividad inmunorreguladora, una actividad anti-inflamatoria, una actividad de inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral, una actividad antifúngica y una actividad de inhibición de la adhesión celular. Por tanto, el presente invento ha sido completado.

Consiguientemente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene como ingrediente activo al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona de la fórmula [I] o uno de sus isómeros ópticos, y una de sus sales, siendo dicha composición para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad que requiere inmunorregulación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiere supresión de la inflamación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiere inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiere inhibición de un hongo para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiere inhibición de la adhesión celular para su tratamiento o prevención, o una enfermedad que requiere la inducción de una proteína de choque térmico para su tratamiento o prevención.

Descripción detallada de la invención

Las dihidroxiciclopentenonas empleadas en la presente invención incluyen isómeros que tienen grupos hidroxilo en las posiciones 4 y 5 configurados en cis e isómeros que tienen los grupos hidroxilo configurados en trans. En la presente invención puede usarse un isómero cis o trans de dihidroxiciclopentenona o una mezcla de los isómeros cis y trans. También pueden usarse sus isómeros ópticos.

Un isómero cis de dihidroxiciclopentenona se obtiene de acuerdo con un método de síntesis química [Helvetica Chimica Acta, 55:2838-2844 (1972)]. Un isómero trans de dihidroxiciclopentenona se obtiene de acuerdo con un método de síntesis química [Carbohydrate Res., 247:217-222 (1993)] o por calentamiento de un ácido urónico (por ejemplo, ácido glucurónico), un derivado de un ácido urónico (por ejemplo, glucuronolactona) o similares (véase el documento WO 98/13328). En la presente invención pueden usarse estos productos de tratamiento térmico que contienen dihidroxiciclopentenona y productos parcialmente purificados o purificados a partir de los mismos.

Por ejemplo la dihidroxiciclopentenona se produce en un proceso de tratamiento térmico calentando una solución al 1% de ácido glucurónico como ácido urónico a 121ºC durante 4 horas. La dihidroxiciclopentenona en el producto de tratamiento térmico se extrae con un disolvente. El extracto se concentra. El concentrado se separa luego en una cromatografía en columna sobre gel de sílice. Las fracciones eluídas que contienen la dihidroxiciclopentenona se concentran. La dihidroxiciclopentenona se extrae del concentrado con cloroformo. El extracto concentrado se somete a una cromatografía en columna de fase normal, aislando con ello la dihidroxiciclopentenona del producto de tratamiento térmico.

Los isómeros ópticos, (-)-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona y (+)-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona pueden obtenerse resolviendo ópticamente la dihidroxiciclopentenona así aislada. Naturalmente, la dihidroxiciclopentenona sintetizada puede resolverse ópticamente.

Se produce un derivado de ciclopentenona de la fórmula [I]:

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o uno de sus isómeros ópticos usados en la presente invención en una mezcla de reacción haciendo reaccionar simultánea o secuencialmente dihidroxiciclopentenona y/o uno de sus isómeros ópticos con un ácido carboxílico que tiene hidrógeno, un grupo alifático, un grupo aromático o un grupo aromático-alifático y/o uno de sus derivados reactivos.

En la presente invención se usan los siguientes ácidos carboxílicos que tienen hidrógeno, un grupo alifático, un grupo aromático o un grupo aromático-alifático y que corresponden a R_{1} y R_{2} en el derivado de ciclopentenona de la fórmula [I] o uno de sus derivados reactivos.

El ácido fórmico puede usarse como ácido carboxílico que contiene hidrógeno.

Un ácido carboxílico que tiene un grupo alquilo y un ácido carboxílico que tiene un grupo alquenilo puede usarse como ácido carboxílico que tiene un grupo alifático.

Un ácido carboxílico que tiene un grupo alquilo lineal o ramificado puede usarse como ácido carboxílico que tiene un grupo alquilo. Aunque la longitud de la cadena alquílica puede adecuadamente seleccionarse dependiendo de la actividad biológica, la solubilidad o un parámetro similar del derivado de ciclopentenona, se prefiere usualmente un grupo de C_{1-30}. Ejemplos de ácidos carboxílicos que tienen grupos alquilo lineales que pueden usarse incluyen ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido n-octanoico, ácido pelargónico, ácido n-decanoico, ácido undecanoico, ácido láurico, ácido tridecanoico, ácido mirístico, ácido pentadecanoico, ácido palmítico; ácido heptadecanoico, ácido esteárico, ácido nonadecanoico, ácido icosanoico, ácido behénico, ácido lignocérico, ácido cerótico y ácido melísico.

Ejemplos de ácidos carboxílicos que tienen grupos alquilo ramificados que pueden usarse incluyen ácido isobutírico, ácido isovalérico, ácido 2-metilbutírico, ácido piválico, ácido 4-metilvalérico y ácido 1,2-dimetilvalérico.

Un ácido carboxílico que tiene un grupo alquenilo lineal o ramificado puede usarse como ácido carboxílico que tiene un grupo alquenilo. Aunque la longitud de la cadena, el grado de insaturación y la posición del enlace insaturado del grupo alquenilo pueden seleccionarse individualmente dependiendo de la actividad biológica, la solubilidad o un parámetro similar del derivado de ciclopentenona se prefiere usualmente un grupo de C_{2-30}.

Ejemplos de ácidos carboxílicos que tienen grupos alquenilo lineales que pueden usarse incluyen ácido acrílico, ácido vinilacético, ácido crotónico, ácido isocrotónico, ácido alilacético, ácido 2-hexenoico, ácido 3-hexenoico, ácido 3-octenoico, ácido obtusílico, ácido 10-undecenoico, ácido palmitoleico, ácido petroselínico, ácido elaídico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido \alpha-linolénico, ácido \gamma-linolénico, ácido eleosteárico, ácido icosatrienoico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido brasídico, ácido erúcico, ácido docosahexaenoico, ácido ximénico y ácido
21-triacontenoico.

Ejemplos de ácidos carboxílicos que tienen grupos alquenilo ramificados que pueden usarse incluyen ácido metacrílico, ácido tíglico, ácido angélico y ácido \alpha-etilcrotónico.

Como ácido carboxílico que tiene un grupo alifático sustituido puede usarse un ácido carboxílico que tiene un grupo alquilo que a su vez tiene un grupo alcoxi inferior de C_{1-4} como sustituyente, tal como ácido metoxiacético. Puede usarse un ácido carboxílico que tiene un grupo alquenilo que a su vez tiene un grupo alcoxicarbonilo inferior de C_{2-5} como sustituyente, tal como ácido metilmaleico.

Ejemplos de ácidos carboxílicos que tienen grupos aromáticos que pueden usarse incluyen ácido benzoico, ácido toluico, ácido clorobenzoico, ácido bromobenzoico, ácido nitrobenzoico, ácido ftálico, ácido isoftálico, ácido tereftálico, ácido salicílico, ácido acetilsalicílico, ácido acetilsalicilicosalicílico, ácido aminosalicílico, ácido p-hidroxibenzoico, ácido aminobenzoico, ácido metoxibenzoico, ácido acetamidobenzoico, ácido vaníllico, ácido orselínico, ácido naftoico, ácido cincomerónico, ácido xanturénico, ácido quínico y ácido quinureico. Un ácido carboxílico que tiene un grupo aromático puede seleccionarse dependiendo de la actividad biológica, la solubilidad o un parámetro similar del derivado de ciclopentenona que se va a producir.

Ejemplos de ácidos carboxílicos que tienen grupos alifáticos aromáticos que pueden usarse incluyen ácido fenilacético, ácido fenilpropiónico, ácido fenil-láctico, ácido fenilpirúvico, ácido cinámico, ácido atrópico y ácido naftilacético. Un ácido carboxílico que tiene un grupo aromático-alifático puede seleccionarse dependiendo de la actividad biológica, la solubilidad o un parámetro similar del derivado de ciclopentenona que se va a producir.

El grupo alifático, aromático o aromático-alifático puede tener un sustituyente, tal como un grupo funcional (por ejemplo un grupo amino, un grupo nitro, un grupo oxo, un grupo hidroxilo, un grupo tiol o un grupo sulfato) o un halógeno (por ejemplo flúor, cloro, bromo o yodo).

Así, R_{1} y R_{2} en la fórmula [I] pueden ser idénticos o diferentes unos de otros y sus ejemplos incluyen hidrógeno, un grupo alquilo de C_{1-30} lineal o ramificado, un grupo alquenilo de C_{2-30} lineal o ramificado, un grupo arilo de C_{6-10} y un grupo alquil de C_{1-30}-aril de C_{6-10}. Dichos grupos pueden estar opcionalmente sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo de C_{1-30}, un grupo alcoxi de C_{1-4}, un grupo alcoxi de
C_{2-5}-carbonilo, un grupo amino, un grupo nitro, un grupo oxo, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo sulfato y un halógeno (por ejemplo flúor, cloro, bromo o yodo).

Los derivados reactivos de los ácidos carboxílicos están ilustrados por un haluro de ácido, un anhídrido de ácido, un éster de ácido y una sal. El derivado reactivo del ácido carboxílico que se ha de usar puede producirse dependiendo de los objetivos.

La reacción entre un ácido carboxílico o uno de sus derivados reactivos y la dihidroxiciclopentenona puede llevarse a cabo de tal modo que R_{1} y R_{2} en el derivado de ciclopentenona lleguen a ser idénticos o diferentes entre sí. Específicamente, los ácidos carboxílicos que tienen grupos diferentes para R_{1} y R_{2} pueden hacerse reaccionar simultáneamente con la dihidroxiciclopentenona. Alternativamente pueden hacerse reaccionar secuencialmente. En este último caso, un derivado de ciclopentenona en el cual R_{1} y R_{2} son diferentes entre sí puede ser eficazmente producido protegiendo uno de los grupos hidroxilo de la dihidroxiciclopentenona.

Un derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos producidos haciendo reaccionar la dihidroxiciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos con ácido carboxílico tiene una actividad inmunorreguladora, una actividad anti-inflamatoria, una actividad de inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral, una actividad antifúngica, una actividad de inhibición de la adhesión celular o similar. El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticamente activos puede purificarse y aislarse de la mezcla de reacción utilizando una de estas actividades como un índice. Para la purificación y el aislamiento pueden usarse medios conocidos de purificación/aislamiento incluyendo medios químicos y medios físicos. Los medios de purificación convencionales tales como filtración por gel, fraccionamiento empleando una membrana de fraccionamiento por pesos moleculares, extracción con disolvente, destilación fraccionada y diversas cromatografías que emplean, por ejemplo, resinas de intercambio iónico pueden usarse en combinación para purificar y aislar el derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos a partir del producto de reacción.

Por ejemplo, un derivado de ciclopentenona usado en la presente invención se produce disolviendo dihidroxiciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, 4-dimetilaminopiridina y ácido carboxílico en diclorometano y añadiéndole N,N-diciclohexilcarbodiimida para la reacción al mismo tiempo que se enfría con hielo. El derivado de ciclopentenona de interés puede aislarse purificando el producto por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice.

Además, la 4,5-diacetoxi-2-ciclopentenona puede purificarse y aislarse a partir de un producto de reacción obtenido haciendo reaccionar dihidroxiciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos con anhídrido acético en piridina anhidra.

Los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona empleados en la presente invención pueden separarse por resolución mecánica de la mezcla racémica, cristalización preferencial, resolución por cristalización con una sal diastereoisómera o un compuesto de inclusión, resolución cinética empleando una enzima o un microorganismo, separación cromatográfica o similares.

Para la resolución cromatográfica pueden usarse la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos, la cromatografía en capa delgada o similares que emplean una fase estacionaria quiral apropiada.

Para la resolución óptica por cromatografía líquida puede emplearse un método en el cual se usa una fase estacionaria quiral, un método en el que se usa un eluyente quiral, separación como diastereoisómero o similares.

Como fase estacionaria quiral puede usarse una fase estacionaria de tipo amida, una fase estacionaria de tipo urea, una fase estacionaria de tipo intercambio de ligando, un polisacárido o una fase estacionaria de derivado de polisacárido, una fase estacionaria de proteína, una fase estacionaria de polimetacrilato, una fase estacionaria de polimetacrilamida o similares.

Como eluyente, dependiendo de la fase estacionaria usada, puede usarse apropiadamente un eluyente de tipo hexano, un eluyente de tipo alcohol, un eluyente acuoso (tampón) o similares.

Las sales de los derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos usados en la presente invención incluyen sales farmacéuticamente aceptables. Para la conversión se pueden usar métodos conocidos.

Ejemplos representativos de los derivados de ciclopentenona usados en la presente invención incluyen 4,5-diacetoxi-2-ciclopentenona, 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dibutiriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-divaleriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dioctanoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-didecanoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dimiristoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis-(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis-(3-octenoiloxi)-2-ciclopentenona y 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales usado en la presente invención tiene actividad inmunorreguladora, por ejemplo una actividad de inhibición de la blastogénesis linfocitaria, una actividad de inhibición de la reacción de los linfocitos mixtos, una actividad de activación de las células asesinas naturales, una actividad de activación de los linfocitos específicos de las células cancerosas, una actividad anti-inflamatoria, por ejemplo, una actividad de inhibición del edema inducido por carragenano, una actividad de inhibición de la hipersensibilidad retrasada, una actividad de la inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral, una actividad de la inhibición de la topoisomerasa, una actividad de inducción de la proteína de choque térmico, una actividad de inhibición de la adhesión celular, una actividad antifúngica o similares. Sobre la base de estas actividades, el compuesto es útil como producto farmacéutico para tratar o impedir una enfermedad que requiera inmunorregulación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera supresión de la inflamación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición de la topoisomerasa, una enfermedad que requiera inducción de la proteína de choque térmico para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición del crecimiento de hongos para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición de la adhesión celular para su tratamiento o prevención o similares. Por tanto, una composición inmunorreguladora, una composición anti-inflamatoria, una composición para inhibir la producción del factor de necrosis tumoral, una composición para inhibir la topoisomerasa, una composición para inducir la proteína de choque térmico, una composición antifúngica y una composición para inhibir la adhesión celular se pueden producir empleando al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, y una de sus sales en calidad de ingrediente activo.

El factor de necrosis tumoral se descubrió como un factor que induce la necrosis hemorrágica en los sitios del tumor. El factor de necrosis tumoral se reconoce corrientemente como una citoquina que está implicada ampliamente en los mecanismos inmunológicos y de defensa biológica sobre la base de la inflamación. El fallo en el mecanismo regulador de la producción del factor de necrosis tumoral acarrea diversos trastornos para el hospedante. La producción excesiva o la producción no regulada del factor de necrosis tumoral está implicada en cierto número de enfermedades. Tales enfermedades incluyen artritis reumatoide, mielitis reumática, osteoartritis, artritis gotosa, sepsis, choque séptico, choque endotoxínico, sepsis bacteriana Gram-negativa, síndrome de choque tóxico, malaria cerebral, neumonía crónica, reacción del injerto frente al hospedante, reacción de aloinjerto, pirexia y mialgia debida a una enfermedad infecciosa tal como gripe, caquexia secundaria a la infección o tumor maligno, caquexia secundaria al síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA), síndrome relacionado con el SIDA, formación queloide, colitis ulcerante, esclerosis múltiple, y enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes autoinmune y el lupus eritematoso sistémico [Molecular Medicine, 33: 1010-1020, 1182-1189 (1996)]. La composición para inhibir la producción del factor de necrosis tumoral de la presente invención es útil para tratar e prevenir estados morbosos mediados o empeorados por el factor de necrosis tumoral, por ejemplo, la diabetes mellitus dependiente de insulina causada por el factor de necrosis tumoral [Nature, 389: 610-614 (1997)].

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para regular la producción del factor de necrosis tumoral en la cual al menos se usa como ingrediente activo un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos y una de sus sales. Además, la presente invención proporciona un alimento o una bebida para mejorar estados morbosos de una enfermedad mediada o empeorada por el factor de necrosis tumoral o un alimento o bebida para prevenir dicha enfermedad, que contiene al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros y una de sus sales.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales tiene actividades inmunorreguladoras, tales como una actividad de inhibición de la blastogénesis linfocitaria y una actividad de inhibición de la reacción de los linfocitos mixtos. Una composición inmunorreguladora que contiene, como ingrediente activo, al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos es útil como composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad debido a una anormalidad en el sistema inmune o un factor inmunológico o una enfermedad que requiere inmunopotenciación para su tratamiento o prevención.

La blastogénesis linfocitaria es una reacción en la cual el mitógeno se une a un receptor en la superficie de un linfocito para activar dicho linfocito y promover su división y proliferación. La reacción de los linfocitos mixtos es una reacción en la que los linfocitos obtenidos de animales alogeneicos se mezclan y cultivan, induciendo con ello la activación de los linfocitos debido a la incompatibilidad de los antígenos de histocompatibilidad principal para promover la división y la proliferación de los linfocitos. La composición inmunorreguladora inhibe estas reacciones y es particularmente útil para tratar y prevenir las enfermedades autoinmunes causadas por un incremento anormal de los linfocitos, por ejemplo, enfermedades crónicas, tales como la nefritis crónica, la colitis crónica, la diabetes de tipo I y la artritis reumatoide y también es útil para la supresión del rechazo de los injertos.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales tiene actividad de inhibir el edema producido por carragenano en las patas de un animal. Así, una composición anti-inflamatoria que contiene, como ingrediente activo, al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos es útil en una composición farmacéutica para tratar o impedir una enfermedad que requiere supresión de la inflamación para su tratamiento o prevención.

El modelo del edema pedal inducido por carragenano es una reacción en la cual son inducidas células inflamatorias, tales como los macrófagos y los neutrófilos por una inyección subcutánea de carragenano como agente inflamatorio en la parte inferior de la pata, y los factores inflamatorios producidos por estas células aumentan la permeabilidad vascular, dando como resultado la producción del edema. La actividad de inhibición del edema de la composición anti-inflamatoria es útil para tratar o impedir una enfermedad que requiera la supresión del incremento en la permeabilidad vascular para su tratamiento o prevención, por ejemplo, artritis reumatoide.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos o una de sus sales tiene una actividad de inhibir la hipersensibilidad retardada. Así, una composición anti-inflamatoria que contiene, como ingrediente activo, al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos es útil como una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad que requiere inhibición de la hipersensibilidad retardada, lo cual es causado por una enfermedad infecciosa o similar, para su tratamiento o prevención.

La hipersensibilidad retrasada es una reacción inflamatoria dependiente de la inmunidad celular mediada por linfocitos, monocitos, macrófagos y similares activados. Las citoquinas producidas por estas células que se infiltran en los sitios de inflamación aumentan la permeabilidad vascular, dando como resultado edema, granuloma, fibrosis y necrosis causando trastornos graves. La dermatitis alérgica causada por la hipersensibilidad retardada da cuenta de la mayoría de las dermatitis de contacto. Además, la hipersensibilidad retardada causa alergia en la cual actúa como antígeno una bacteria, o un virus o un fármaco. para ensayar la hipersensibilidad retardada se usa generalmente un modelo de ratón que usa eritrocitos de oveja como antígeno. Un compuesto que es eficaz en este modelo se considera útil para tratar o impedir las enfermedades alérgicas antes mencionadas.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales tiene una actividad inhibidora sobre la topoisomerasa II. La topoisomerasa II se expresa transitoriamente sólo durante la fase de división en las células normales. Por otro lado, se expresa altamente en todo el ciclo celular cuando las células se transforman en cancerosas. Así, como un agente carcinostático puede emplearse una composición para inhibir la topoisomerasa, que contenga al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos como ingrediente activo. Además, para estudios bioquímicos, escrutinios de carcinostáticos y similares es útil una composición farmacéutica que inhiba la topoisomerasa usando al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos como ingrediente activo.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos o una de sus sales tiene una actividad de inhibición de la adhesión celular. Por tanto, se proporciona una composición para inhibir la adhesión celular que contiene al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos como ingrediente activo. La composición para inhibir la adhesión celular de la presente invención es útil como una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad que requiere inhibición de la adhesión celular para su tratamiento o prevención.

Por ejemplo, la metástasis del cáncer se establece por la liberación de células cancerosas, que crecen en la lesión primaria, en los vasos sanguíneos, migración a los sitios de metástasis e infiltración en los tejidos. Entre estas, para la migración de las células cancerosas desde el interior de los vasos sanguíneos a los sitios de metástasis se requiere la adhesión de las células cancerosas a las células endoteliales vasculares ICAM-1, VCAM-1 y ELAM-1 son conocidas como moléculas de adhesión que están implicadas en la metástasis del cáncer. Los ligandos correspondientes en las células cancerosas se han identificado como LFA-1, VLA-4 y sialil-Lewis X, respectivamente. Estas moléculas de adhesión frecuentemente se expresan en células leucémicas y se considera que están implicadas en la infiltración extravascular de células leucémicas. Por tanto, se espera que la composición de inhibición de la adhesión celular de la presente invención inhiba la adhesión de las células cancerosas mediadas por estas moléculas de adhesión para inhibir la metástasis del cáncer.

También tienen una actividad de inhibición de la adhesión de celulas cualquiera de una dihidroxiciclopentenona y un compuesto producido a partir de dihidroxiciclopentenona y un compuesto que contiene un grupo SH como se describe en el documento PCT/JP98/00815. Por tanto, se proporciona una composición para inhibir la adhesión celular que contiene al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos como ingrediente activo.

La composición para inhibir la adhesión celular proporcionada por la presente invención puede emplearse para inhibir la adhesión celular. Esta composición es útil para estudios bioquímicos referentes a la adhesión celular y para el escrutinio de inhibidores de la adhesión celular o agentes que tengan una actividad de células adherentes.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos o una de sus sales tiene una propiedad de activación de células asesinas (abreviadamente NK por sus iniciales en inglés natural killer) naturales. Por tanto, se proporciona una composición para activar células NK que contienen al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos como ingrediente activo. La composición para activar las células asesinas (NK) de la presente invención es útil como una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad que requiere la activación de las células NK para su tratamiento o prevención.

Las células NK reconocen células infectadas con bacterias o virus y células cancerosas y eliminan estas células por ataque a la membrana celular. La activación de las células NK potencia el mecanismo de protección inmunológico en un cuerpo vivo. Por tanto, la composición para activar las células NK de la presente invención es útil para tratar o prevenir una enfermedad bacteriana o viral y cáncer.

También tienen una actividad de activación de las células NK B la dihidroxiciclopentenona y un compuesto producido a partir de dihidroxiciclopentenona y un compuesto que contiene un grupo SH como se describe en el documento PCT/JP98/00815. Por tanto, se proporciona una composición para activar células NK que contiene, como ingrediente activo, al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos.

La composición para activar células NK proporcionada por la presente invención puede emplearse para activar células NK. Esta composición es útil para estudios bioquímicos concernientes a mecanismos de protección inmunológica y el escrutinio de agentes inmunoprotectores.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticamente activos o una de sus sales tiene una actividad antifúngica. Por tanto, puede producirse una composición antifúngica empleando al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos como ingrediente activo y formulándolo con un vehículo farmacéutico conocido.

Se han empleado convencionalmente cierto número de agentes para tratar infecciones fúngicas, que incluyen anfotericina B, flucitosina, miconazol y fluconazol. Sin embargo, dichos productos tienen problemas referentes a la eficacia y la toxicidad o cepas resistentes a los mismos. En particular, son muy escasos los agentes eficaces menos tóxicos para las infecciones sistémicas, que recientemente tienden a incrementar. El componente antifúngico usado en la presente invención es útil como un nuevo tipo de agente antifúngico puesto que es menos tóxico.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales tiene una actividad de inducción de proteínas de choque térmico. Por tanto, una composición para inducir una proteína de choque térmico puede producirse empleando al menos un compuesto seleccionado de estos compuestos como ingrediente activo. La composición puede administrarse a través de una vía adecuada para una enfermedad que requiera la inducción de una proteína de choque térmico para su tratamiento o prevención.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales tiene una actividad de inducción de proteínas de choque térmico, tal como la proteína de choque térmico de 70-kDa (HSP70). Dichos compuestos tienen actividades antivirales contra virus de RNA y virus de DNA tales como el virus de la hepatitis, el virus del SIDA, el virus de la gripe, el virus de la estomatitis vesicular y el virus del herpes. Las proteínas de choque térmico están implicadas en la inmunidad tumoral. Por tanto, estos compuestos también tienen actividades de defensa biológica, tal como actividad anti-inflamatoria. Por tanto, las enfermedades virales tales como un enfriamiento debido al virus de la gripe pueden prevenirse o tratarse administrando una composición farmacéutica de la presente invención.

Proteínas de choque térmico es un nombre genérico de proteínas cuya síntesis es inducida cuando una célula o un individuo está sometido a un cambio rápido de temperatura a un valor superior en 5 a 10ºC al de la temperatura normal. Las proteínas de choque térmico se distribuyen en una amplia variedad de organismos incluyendo procariotas y eucariotas superiores. Se conocen como proteínas de choque térmico eucarióticas HSP90, HSP70, ubiquitina, HP26 y similares. Entre estas, la HSP70 es una de las chaperonas moleculares que se fijan a las proteínas que no se han plegado completamente o a las proteínas que se han plegado de modo incompleto y ayudan a la formación de su estructura tridimensional. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de choque térmico están bien conservadas en el curso de la evolución. La HSP70 es homóloga a la proteína K de DNA de Escherichia coli. Aproximadamente diez genes de HSP70 están presentes en el ser humano. Algunos de ellos se expresan constitutivamente, mientras que otros son inducidos por varios estímulos. La síntesis de las proteínas de choque térmico es inducida por diversas sustancias químicas y daños celulares, tales como estrés oxidante además de choque térmico.

C. Amici et al. [Journal of Virology, 68:6890-6899 (1994)] informan que el cultivo de células animales infectadas con virus de Sendai en presencia de prostaglandina A_{1} que tiene un carbonilo \alpha,\beta-insaturado induce la síntesis de HSP70 y HSP90 y que la síntesis de las proteínas virales se suprime al mismo tiempo que se induce la síntesis de HSP70. A. Rossi et al. [The Journal of Biological Chemistry, 271:32192-32196 (1996)] informan que la 2-ciclopenten-1-ona, análoga de la prostaglandina A_{1}, induce la síntesis de HSP70 y suprime la síntesis de proteínas del virus de la estomatitis vesicular.

Por ejemplo, la capacidad de la diisobutiriloxiciclopentenona, un derivado de la ciclopentenona, para inducir HSP70 se observa a una concentración de 1,25 \muM. Se maximiza a una concentración de 2,5 \muM. Esta capacidad de inducción es muy alta en comparación con la de 2-ciclopenten-1-ona, que se requiere para ser usada a una concentración de varios cientos de \muM para inducir HSP70.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales tiene actividades antivirales contra el virus de DNA, virus de RNA, retrovirus y viroides basándose en la alta actividad de inducir proteínas de choque térmico. Los virus y viroides se ilustran como ejemplo mediante los anteriormente mencionados.

Generalmente, la composición inmunorreguladora puede producirse empleando un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, y una de sus sales como ingrediente activo, y mezclándolo con un vehículo líquido o sólido farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, para formularla disolventes, agentes dispersantes, emulsificantes, agentes de tamponamiento, estabilizadores, excipientes, aglutinantes, disgregrantes, lubricante y similares. La formulación puede estar en una forma de una preparación sólida tal como comprimido, gránulo, polvo, epipástico y cápsula o una preparación líquida, tal como una solución normal, suspensión y emulsión. Además, la composición puede formularse en una preparación seca, que puede reconstituirse como una preparación líquida añadiendo antes de su uso el vehículo apropiado.

El vehículo farmacéutico puede seleccionarse de acuerdo con la ruta de administración particular antes mencionada y la forma de dosificación. Para una preparación oral, se utilizan por ejemplo almidón, lactosa, sacarosa, manitol, carboximetilcelulosa, almidón de maíz, sales inorgánicas y similares. También pueden incluirse en las preparaciones orales aglutinantes, desintegrantes, tensioactivos, lubricantes, agentes promotor de la fluidez, agentes de sabor, agentes colorantes, agente aromatizantes y similares.

Una preparación parenteral puede prepararse de acuerdo con métodos usuales disolviendo o poniendo en suspensión el ingrediente activo utilizado en la presente invención, es decir, un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, y una de sus sales, en un diluyente. Los diluyentes incluyen agua destilada inyectable, solución salina fisiológica, solución acuosa de glucosa, aceite vegetal inyectable, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de maíz, propilenglicol y polietilenglicol. Opcionalmente, puede añadirse a la solución o suspensión un esterilizante, un estabilizante, un regulador osmótico, un agente suavizante y similares.

La composición inmunorreguladora de la presente invención es para administrar a través de una ruta adecuada para la forma de dosificación de la composición. La ruta de administración no está limitada a una específica. La composición puede administrarse interna o externamente (o tópicamente) o por inyección. La preparación inyectable puede administrarse por ejemplo intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intradérmicamente y similares. Las preparaciones externas incluyen un supositorio.

Una dosificación de la composición inmunorreguladora se determina apropiadamente y varía dependiendo de la forma de dosificación particular, la ruta de administración y la finalidad, así como de la edad, peso y estados de un paciente al que se ha de tratar. En general, una dosis diaria para una persona adulta es 0,1 mg a 200 mg/kg en términos de la cantidad del compuesto seleccionado del grupo que consiste de un derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos y una de sus sales contenidas en la formulación. Naturalmente, la dosificación puede variar dependiendo de diversos factores. Por consiguiente, en algunos casos, una dosis menor que la anterior puede ser suficiente pero, en otros casos, pueden requerirse dosis mayores que la anterior. La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral tal cual, o puede ser ingerida diariamente añadiéndola a alimentos y bebidas seleccionados.

La composición para inhibir la producción del factor de necrosis tumoral, la composición anti-inflamatoria, la composición para inhibir la topoisomerasa, la composición para inhibir la adhesión celular, la composición para inducir proteínas de choque térmico y la composición antifúngica de la presente invención pueden formularse de acuerdo con el mismo modo que el que se ha descrito anteriormente con respecto a la composición inmunorreguladora. Dicha composición puede administrarse a través de una ruta adecuada para la enfermedad de interés. Naturalmente, la dosificación de la composición puede variar dependiendo de diversos factores. Por consiguiente, en algunos casos, una dosificación menor que la anterior puede ser suficiente pero, en otros casos, puede requerirse una dosificación mayor que la anterior. La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral tal cual, o puede tomarse diariamente añadiéndola a alimentos y bebidas seleccionados.

El derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales usadas en la presente invención puede producirse eficazmente a partir de dihidroxiciclopentenona y uno cualquiera de los ácidos carboxílicos o derivados reactivos de la misma.

De acuerdo con el método de producción antes mencionado se proporcionan 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona (un producto resultante de la reacción entre dihidroxiciclopentenona y anhídrido isobutírico), 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona (un producto de la reacción entre dihidroxiciclopentenona y ácido metoxiacético), 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona y 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona (productos de la reacción entre dihidroxiciclopentenona y ácido metilmaleico) de acuerdo con el método de producción antes mencionado.

Estos compuestos tienen una actividad carcinostática, una actividad inhibidora de la topoisomerasa y similares. Pueden producirse composiciones farmacéuticas, tales como una composición carcinostática empleando, en calidad de sus ingredientes activos, estos compuestos o sus isómeros ópticos, o sus sales.

El procedimiento para producir un alimento o una bebida que contiene el derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales usados en la presente invención como su ingrediente activo no está limitado a uno específico. Cualesquiera procesos que incluyan cocción, tratamiento y otros procedimientos generalmente empleados para producir un alimento o una bebida pueden emplearse siempre y cuando el alimento o la bebida resultante contengan una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos y una de sus sales. Por tanto, pueden producirse de este modo un alimento o bebida funcional, tal como un alimento o bebida inmunorregulador.

No se observa toxicidad cuando se administra una cantidad fisiológicamente eficaz del derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales usadas en la presente invención. Por ejemplo, no se observa muerte cuando se administra por vía oral a un ratón a una dosis única de 100 mg/kg uno cualquiera de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-bis-(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona, o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales.

Como se ha descrito anteriormente, el derivado de ciclopentenona o uno de sus isómeros ópticos, o una de sus sales puede producirse convenientemente y son muy útiles en una amplia variedad de campos incluyendo la medicina y alimentos basados en sus diversas funciones fisiológicas.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención con detalle, pero no han de entenderse como limitativos de su alcance. Los porcentajes (%) en los Ejemplos se refieren a porcentajes en peso.

Ejemplo 1

(1) 10 g de ácido D-glucurónico (Sigma, G 5269) se disolvió en 1 litro de agua. La solución se calentó a 121ºC durante 4 horas y luego se concentró hasta un volumen de aproximadamente 10 ml bajo presión reducida. Se le añadieron y mezclaron 40 ml de una capa superior de una mezcla de acetato de butilo:ácido acético:agua = 3:2:2. Centrifugando la mezcla se obtuvo un líquido sobrenadante y se concentró bajo presión reducida hasta un volumen de aproximadamente 10 ml.

El extracto se aplicó a gel de sílice BW-300SP para cromatografía en columna (2 x 28 cm, Fuji Sylysia). La separación se realizó empleando una capa superior de acetato de butilo:ácido acético:agua = 3:2:2 como eluyente a una presión de 0,2 kg/cm^{2} empleando un compresor y a un caudal de 5 ml/min. Cada fracción contenía 10 ml del eluato fraccionado. Una parte de cada fracción se analizó por cromatografía de capa delgada. Como resultado, las fracciones 61 a 80 contenían dihidroxiciclopentenona de alta pureza. Estas fracciones se enfriaron y concentraron bajo presión reducida. El concentrado se extrajo con 40 ml de cloroformo. El extracto se concentró bajo presión reducida para obtener 100 mg de dihidroxiciclopentenona.

La preparación se separó por HPLC de fase normal empleando una columna Palpack de tipo S y se detectó sobre la base de la absorbancia ultravioleta a 215 nm. Este procedimiento confirmó que la preparación tenía una pureza de 98%.

113,9 mg de la dihidroxiciclopentenona obtenida de acuerdo con el método que se ha descrito anteriormente se disolvió en 2,85 ml de etanol. Después se añadieron a la solución en etanol 3,85 ml de hexano/etanol (94/6) para preparar 17 mg/ml de solución de dihidroxiciclopentenona. Esta solución se filtró a través de un filtro de 0,5 \mum para obtener una solución de muestra para la HPLC de resolución óptica.

La solución de muestra se sometió a HPLC de resolución óptica en las condiciones que se describen a continuación. Las fracciones que contenían un isómero (-) y un isómero (+) de dihidroxiciclopentenona se recogieron separadamente del pico primero y del pico último, respectivamente. Las fracciones se evaporaron hasta sequedad bajo presión reducida para obtener 43,2 mg del isómero (-) y 43,0 mg del isómero (+) de la dihidroxiciclopentenona.

Condiciones para la HPLC de resolución óptica.

Columna: Chiralpack AS (Dicel Chemical industries) 2,0 cm x 25,0 cm;

Temperatura de la columna: 40ºC;

Fase móvil: hexano/etanol (94/6);

Caudal: 14,0 ml/min.;

Detección: UV 210 nm;

Cantidad de muestra inyectada: 150 \mul (2,55 mg).

Puesto que ambos isómeros resultantes, el isómero (-) y el isómero (+) de la dihidroxiciclopentenona contenían un enantiómero en una concentración de aproximadamente 1%, se resolvieron ópticamente de nuevo en las condiciones antes mencionadas. Como resultado se obtuvieron 19,7 mg del isómero (-) de dihidroxiciclopentenona exento de un enantiómero a partir de 30,0 mg del isómero (-) procedente del primer pico. 27,7 mg del isómero (+) de dihidroxiciclopentenona exento de un enantiómero se obtuvieron a partir de 37,4 mg del isómero (+) del último pico. El tiempo de elución en la HPLC de resolución óptica para el isómero (-) de dihidroxiciclopentenona fue 33 minutos y el del isómero (+) fue 40 minutos.

(2) Se añadieron 1 ml de piridina anhidra (Nacalai Tesque, 295-26) y 0,1 ml de anhídrido acético (Nacalai Tesque, 002-26) a 29,6 mg de la dihidroxiciclopentenona obtenida como se ha descrito en el Ejemplo 1-(1). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se extrajo con cloroformo para obtener 36 mg de
4,5-diacetoxi-2-ciclopentenona.

El análisis por espectrometría de masas de la 4,5-diacetoxi-2-ciclopentenona resultante se realizó usando un espectrómetro de masas DX302 (Nippon Denshi). Adicionalmente, se disolvió 4,5-diacetoxi-2-ciclopentenona en CDCl_{3} y se sometió a análisis estructural por RMN empleando un aparato de resonancia magnética nuclear JNM-A500 (Nippon Denshi). Los resultados se muestran a continuación. Los valores del desplazamiento químico en ^{1}H-RMN se expresan suponiendo que el valor del desplazamiento típico del cloroformo es 7,24 ppm.

MS m/z 199 (M+H)^{+}

^{1}H-RMN

\delta 2,12 (3H, S, -OCOCH_{3}), 2,16 (3H, S, -OCOCH_{3}), 5,16 (1H, d, J=3,0 Hz, H-5), 5,89 (1H, m, H-4), 6,4,0 (1H,
d-d, J=1,5, 6,5 Hz, H-2), 7,43 (1 H, d-d, J=2,5, 6,5 Hz, H-3).

(3) Se emplearon 15,9 mg del isómero (-) de la dihidroxiciclopentenona obtenida como se ha descrito en el Ejemplo 1-(1) para llevar a cabo la reacción como se describe en el Ejemplo 1-(2) para obtener 15,1 mg de un diacetil-isómero (-) de la dihidroxiciclopentenona. Se obtuvieron resultados similares a los del Ejemplo 1-(2) cuando el isómero se sometió a análisis estructural por espectrometría de masas y a resonancia magnética nuclear como se describe en el Ejemplo 1-(2).

(4) Se emplearon 16,7 mg del isómero (+) de la dihidroxiciclopentenona obtenida como se ha descrito en el Ejemplo 1-(1) para llevar a cabo la reacción como se describe en el Ejemplo 1-(2) para obtener 18,8 mg de un diacetil-isómero (+) de la dihidroxiciclopentenona. Se obtuvieron resultados similares a los del Ejemplo 1-(2) cuando el isómero se sometió a análisis estructural por espectrometría de masas y a resonancia magnética nuclear como se describe en el Ejemplo 1-(2).

(5) Se añadieron 44,3 mg de ácido benzoico (Nacalai Tesque, 041-20), 7,5 mg de dimetilaminopiridina (DMAP; Tokyo Kasei Kogyo, D1450), 51,0 mg de N',N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC: Peptide Institute, 1001) y 5 ml de cloroformo a 13,8 mg de dihidroxiciclopentenona. La mezcla se agitó en hielo durante 4 horas. Un filtrado obtenido mediante la filtración de la mezcla de reacción se aplicó a una columna de gel de sílice (75 ml) y se eluyó con cloroformo obteniéndose fracciones que contenían 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona. El disolvente de las fracciones se separó bajo presión reducida, el residuo se disolvió en etanol, y la solución se separó sobre cromatografía en capa delgada sobre gel de sílice empleando una mezcla 99:1 de cloroformo y metanol como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,45-0,55 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 3,2 mg de 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por espectrometría de masas y la resonancia magnética nuclear de la 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona así obtenida se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(2). Los resultados se muestran a continuación.

MS m/z 323 (M+H)^{+}

^{1}H-RMN

\delta 5,56 (1H, d, J=3,0 Hz, H-5), 6,30 (1H, m, H-4), 6,54 (1H, d-d, J=1,5, 6,5 Hz, H-2), 7,44 (4H, m, H de anillo aromático), 7,58 (2H, m, H de anillo aromático), 7,64 (1H, d-d, J=2,0, 6,5 Hz, H-3), 8,06 (4H, m, H de anillo aromático).

(6) Se emplearon 22,1 mg del isómero (-) de dihidroxiciclopentenona, 71,9 mg de ácido benzoico, 12,1 mg de DMAP y 80,3 mg de DCC para llevar a cabo la reacción como se describe en el Ejemplo 1-(5) para obtener 19,2 mg del (-) dibenzoil-isómero de dihidroxiciclopentenona. Se obtuvieron resultados similares a los del Ejemplo 1-(5) cuando el isómero se sometió a análisis estructural por espectrometría de masas y a resonancia magnética nuclear como se describe en el Ejemplo 1-(5).

(7) Se emplearon 20,4 mg del isómero (+) de dihidroxiciclopentenona, 65,6 mg de ácido benzoico, 11,0 mg de DMAP y 74,3 mg de DCC para llevar a cabo la reacción como se describe en el Ejemplo 1-(5) para obtener 21,4 mg del dibenzoil-isómero (+) de dihidroxiciclopentenona. Se obtuvieron resultados similares a los del Ejemplo 1-(5) cuando el isómero se sometió a análisis estructural por espectrometría de masas y a resonancia magnética nuclear como se describe en el Ejemplo 1-(5).

(8) Se disolvieron 30 mg de dihidroxiciclopentenona, 10 mg de DMAP y 153 mg de ácido hexanoico (Nacalai Tesque, 070-26) en 5,9 ml de diclorometano. Se le añadieron 108 mg de DCC mientras se enfriaba con hielo. Después de reaccionar durante 1 hora, la mezcla de reacción se separó y purificó por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando cloroformo como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,3-0,4 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 11 mg de 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona.

La 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona así obtenida se disolvió en CDCl_{3} para confirmación por resonancia magnética nuclear (RMN) empleando un aparato de resonancia magnética nuclear JNM-EX270 FT NMR System (Nippon Denshi). Los valores del desplazamiento químico en ^{1}H-RMN se expresan suponiendo que el valor del desplazamiento químico del tetrametilsilano es 0 ppm.

Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 7,44 (1H, dd, J_{2-3}=6,27 Hz, J_{3-4}=1,98 Hz, H-3), 6,42 (1 H, dd, J_{2-3}=6,27 Hz, J_{3-4}=1,32 Hz, H-2), 5,91 (1H, m,
H-4), 5,16 (1H, d, J_{4-5}=2,97 Hz, H-5), 2,42 (2H, t, J=7,26 Hz), 2,38 (2H, t, J=7,76 Hz), 1,65 (4H, m), 1,26 (8H, m), 0,88 (6H, t).

(9) Se disolvieron 30 mg de dihidroxiciclopentenona, 10 mg de DMAP y 301 mg de ácido mirístico (Tokyo Kasei Kogyo, M0476) en 5,9 ml de diclorometano. Se le añadieron 108 mg de DCC mientras se enfriaba con hielo. Después de reaccionar durante 1 hora, la mezcla de reacción se separó por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando cloroformo como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,45-0,55 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 53 mg de 4,5-dimiristoiloxi-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-dimiristoiloxi-2-ciclopentenona se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(8). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 7,45 (1H, dd, J_{2-3}=5,94 Hz, J_{3-4}=2,31 Hz, H-3), 6,42 (1H, dd, J_{2-3}=5,31 Hz, J_{3-4}=1,32 Hz, H-2), 5,92 (1H, m,
H-4), 5,16 (1H, d, J_{4-5}=2,64 Hz, H-5), 2,42 (2H, t, J=7,26 Hz), 2,38 (2H, t, J=7,91 Hz), 1,63 (4H, m), 1,26 (32H, m), 0,88 (6H, t).

(10) Se disolvieron 30 mg de dihidroxiciclopentenona, 10 mg de DMAP y 190 mg de ácido octanoico (Nacalai Tesque, 071-11) en 5,9 ml de diclorometano. Se le añadieron 108 mg de DCC mientras se enfriaba con hielo. Después de reaccionar durante 1 hora, la mezcla de reacción se separó por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando cloroformo como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,25-0,35 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 27 mg de 4,5-dioctanoiloxi-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-dioctanoiloxi-2-ciclopentenona se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(8). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 7,44 (1H, dd, J_{2-3}=6,1 Hz, J_{3-4}=2,16 Hz, H-3), 6,41 (1H, dd, J_{2-3}=6,1 Hz, J_{3-4}=1,48 Hz, H-2), 5,92 (1H, m, H-4), 5,16 (1H, d, J_{4-5}=2,97 Hz, H-5), 2,42 (2H, t, J=7,59 Hz), 2,38 (2H, t, J=7,91 Hz), 1,65 (4H, m), 1,29 (16H, m), 0,88 (6H, t).

(11) Se disolvieron 30 mg de dihidroxiciclopentenona, 10 mg de DMAP y 190 mg de ácido 3-octenoico (Tokyo Kasei Kogyo, 00070) en 5,9 ml de diclorometano. Se le añadieron 108 mg de DCC mientras se enfriaba con hielo. Después de reaccionar durante 1 hora, la mezcla de reacción se separó por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando cloroformo como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,25-0,35 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 25 mg de 4,5-bis(3-octenoiloxi)-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-bis(3-octenoiloxi)-2-ciclopentenona así obtenida se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(8). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 7,44 (1H, dd, J_{2-3}=6,27 Hz, J_{3-4}=2,32 Hz, H-3), 6,42 (1H, dd, J_{2-3}=6,27 Hz, J_{3-4}=1,49 Hz, H-2), 5,91 (1H, m,
H-4), 5,55 (4H, m), 5,16 (1H, d, J_{4-5}=2,97 Hz, H-5), 3,12 (4H, dd, J=12,85 Hz, J=6,59 Hz), 2,04 (4H, m), 1,33 (8H, m), 0,89 (6H, t).

(12) 30 mg de dihidroxiciclopentenona, 10 mg de DMAP y 115 mg de ácido n-butírico (Tokyo Kasei Kogyo, B0754) se disolvieron en 5,9 ml de diclorometano. Se le añadieron 108 mg de DCC mientras se enfriaba con hielo. Después de reaccionar durante 1 hora, la mezcla de reacción se separó por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando cloroformo como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,20-0,30 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 16 mg de 4,5-dibutiriloxi-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-dibutiriloxi-2-ciclopentenona así obtenida se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(8). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 7,45 (1H, dd, J_{2-3}=6,27 Hz, J_{3}-_{4}=2,13 Hz, H-3), 6,42 (1H, dd, J_{2-3}=6,27 Hz, J_{3-4}=1,65 Hz, H-2), 5,91 (1H, m,
H-4), 5,16 (1H, d, J_{4-5}=2,64 Hz, H-5).

(13) 30 mg de dihidroxiciclopentenona, 10 mg de DMAP y 226 mg de ácido n-decanoico (Tokyo Kasei Kogyo, D0017) se disolvieron en 5,9 ml de diclorometano. Se le añadieron 108 mg de DCC mientras se enfriaba con hielo. Después de reaccionar durante 1 hora, la mezcla de reacción se separó por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando cloroformo como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,35-0,45 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 35 mg de 4,5-didecanoiloxi-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-didecanoiloxi-2-ciclopentenona así obtenida se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(8). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 7,44 (1H, dd, J_{2-3}=6,27 Hz, J_{3-4}=1,97 Hz, H-3), 6,42 (1H, dd, J_{2-3}=6,27 Hz, J_{3-4}=1,3 Hz, H-2), 5,91 (1H, m,
H-4), 5,15 (1H, d, J_{4-5}=2,97 Hz, H-5), 2,42 (2H, t, J=7,24 Hz), 2,38 (2H, t, J=7,91 Hz), 1,65 (4H, m) 1,26 (24H, m), 0,88 (6H, t).

(14) Se disolvieron 30 mg de dihidroxiciclopentenona, 16 mg de DMAP y 66 mg de trietilamina (Tokyo Kasei Kogyo, T0424) y 122 mg de anhídrido n-valérico (Tokyo Kasei Kogyo, V0006) en 5,9 ml de diclorometano. La mezcla se hizo reaccionar enfriándola con hielo durante 1 hora. La mezcla de reacción se desarrolló por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando cloroformo:metanol = 200:1 como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,7-0,8 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 39 mg de 4,5-divaleriloxi-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-divaleriloxi-2-ciclopentenona así obtenida se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(8). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 7,45 (1H, dd, J2-3=6,11 Hz, J3-4=1,66 Hz, H-3), 6,42 (1H, dd, J2-3=6,11 Hz, J3-4=1,66 Hz, H-2), 5,91 (1H, m, H-4), 5,16 (1H, d, J4-5=2,97 Hz, H-5), 2,43 (2H, dd, J=7,59, 7,59 Hz), 2,39 (2H, dd, J=7,59, 7,59 Hz), 1,65 (4H, m), 1,38 (4H, m), 0,93 (6H, dd, J=7,26, 7,26 Hz).

(15) Se disolvieron 30 mg de dihidroxiciclopentenona, 16 mg de DMAP y 66 mg de trietilamina y 86 mg de anhídrido propiónico (Tokyo Kasei Kogyo, P0513) en 5,9 ml de diclorometano. La mezcla se hizo reaccionar enfriándola con hielo durante 1 hora. La mezcla de reacción se desarrolló por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando cloroformo:metanol = 200:1 como disolvente de desarrollo. El gel de sílice a Rf = 0,5-0,6 se separó por rascado de la capa delgada y se sometió a extracción con cloroformo para obtener 31 mg de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona así obtenida se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(8). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 7,45 (1H, dd, J2-3=6,27 Hz, J3-4=2,15 Hz, H-3), 6,42 (1H, dd, J2-3=6,27 Hz, J3-4=1,49 Hz, H-2), 5,91 (1H, m, H-4), 5,16 (1H, d, J4-5=2,97 Hz, H-5), 2,46 (2H, dd, J=15,01, 7,59 Hz), 2,42 (2H, dd, J=15,01, 7,59 Hz), 1,18 (6H, dd, J=7,59, 7,59 Hz).

(16) Se disolvieron 2 g de dihidroxiciclopentenona, 733 mg de DMAP, 4,1 ml de ácido trans-2-hexenoico (Tokyo Kasei Kogyo, H0383) y 5,57 g de DCC en 200 ml de diclorometano. La mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice empleando hexano:acetato de etilo = 8:1 como disolvente para obtener una fracción que da como resultado una sola mancha en la cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice. La fracción se concentró bajo presión reducida para obtener aproximadamente 900 mg de aceite de 4,5-bis(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-bis(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona así obtenida se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(8). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 0,92 (6H, m, 11-H+11'-H), 1,48 (4H, m, 10-H+10'-H), 2,18 (4H, m, 9-H, 9'-H), 5,22 (1H, d, J=3,0 Hz, 5-H), 5,85 (2H, m, 7-H+7'-H), 5,98 (1H, m, 4-H), 6,41 (1H, dd, J=1,0, 6,0 Hz, 2-H), 7,04 (2H, m, 8-H+8'-H), 7,47 (1 H, dd, J=2,0, 6,0 Hz, 3-H).

Las posiciones de los carbonos en el grupo 2-hexenoilo unidos en la posición 5 de dihidroxiciclopentenona se definieron como la posición 6 hasta la posición 11 partiendo del grupo carbonilo. Las posiciones de los carbonos en el grupo 2-hexenoilo unidos en la posición 4 de la dihidroxiciclopentenona se definieron como la posición 6' hasta la posición 11' partiendo del grupo carbonilo.

(17) Se disolvieron 1,2 g de la dihidroxiciclopentenona en 200 ml de diclorometano. Se le añadieron 1,7 ml de anhídrido isobutírico (Nacalai Tesque), 427 mg de DMAP y 1,46 ml de trietilamina (Nacalai Tesque). La mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con ácido cítrico al 10% y solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio. La solución se concentró bajo presión reducida. El concentrado se separó por cromatografía en columna sobre gel de sílice empleando hexano:acetato de etilo = 8:1 como disolvente de desarrollo para obtener una fracción que da como resultado una mancha a Rf = 0,2 en la cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando hexano:acetato de etilo = 6:1 como disolvente de desarrollo. El disolvente de la fracción se separó por evaporación bajo presión reducida para obtener 470 mg de aceite que contenía 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona de alta pureza.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona así obtenida disuelta en cloroformo pesado se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(2). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 1,18 (12H, m, 7-H, 8-H, 10-H, 11-H), 2,61 (2H, m, 6-H, 9-H), 5,10 (1H, d, J=3,0 Hz, 5-H), 5,88 (1H, m, 4-H), 6,39 (1H, dd, J=1,5, 6,0 Hz, 2-H), 7,41 (1H, dd, J=2,5, 6,0 Hz, 3-H).

Los resultados se expresan suponiendo que el valor del desplazamiento químico del protón residual del cloroformo pesado es 7,24 ppm.

El espectro de ^{1}H-RMN de la 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona se ilustra en la Figura 1. En la Figura 1, el eje horizontal representa el valor del desplazamiento químico (ppm) y el eje vertical representa la intensidad de la señal.

Los números para la identificación de señales en ^{1}H-RMN son como se indican en la fórmula [III] siguiente.

4

(18) Se disolvieron 1,5 g de la dihidroxiciclopentenona en 200 ml de diclorometano. Se le añadieron 2,7 ml de anhídrido metoxiacético (Nacalai Tesque), 794 mg de DMAP y 5,36 ml de diciclohexilcarbodiimida (DCC; Nacalai Tesque). La mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con ácido cítrico al 10% y una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio. La solución se concentró bajo presión reducida. El concentrado se separó por cromatografía en columna sobre gel de sílice empleando hexano:acetato de etilo = 2:3 como disolvente de desarrollo para obtener una fracción que da como resultado una mancha a Rf = 0,34 en la cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando hexano:acetato de etilo = 1:1 como disolvente de desarrollo. El disolvente de la fracción se separó por evaporación bajo presión reducida para obtener 300 mg de aceite que contenía 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona de alta pureza.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de la 4,5-bis(metoxiacetiloxi)-2-ciclopentenona así obtenida disuelta en cloroformo pesado se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(2). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 3,45 (6H, s, 7-H, 9-H), 4,13 (4H, m, 6-H, 8-H), 5,30 (1H, d, J=3,0 Hz, 5-H), 5,99 (1H, m, 4-H), 6,44 (1H, dd, J=1,5, 6,5 Hz, 2-H), 7,46 (1H, dd, J=2,0, 6,5 Hz, 3-H).

Los resultados se expresan suponiendo que el valor del desplazamiento químico del protón residual del cloroformo pesado es 7,24 ppm.

El espectro de ^{1}H-RMN de la 4,5-bis(metoxiacetiloxi)-2-ciclopentenona se ilustra en la Figura 2. En la Figura 2, el eje horizontal representa el valor del desplazamiento químico (ppm) y el eje vertical representa la intensidad de la señal.

Los números para la identificación de señales en ^{1}H-RMN son como se indican en la fórmula [IV] siguiente.

5

(19) Se disolvieron 1,1 g de la dihidroxiciclopentenona en 200 ml de diclorometano. Se le añadieron 3,4 g de ácido metilmaleico, 610 mg de DMAP y 4,12 ml de diciclohexilcarbodiimida. La mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con ácido cítrico al 10% y solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio. La solución se concentró bajo presión reducida. El concentrado se separó por cromatografía en columna sobre gel de sílice empleando hexano:acetato de etilo = 3:2 como disolvente de desarrollo para obtener una fracción que dio como resultado una mancha a Rf = 0,6 y una fracción que dio como resultado una mancha a Rf = 0,45 en la cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice empleando hexano:acetato de etilo = 1:1 como disolvente de desarrollo.

El disolvente de las fracciones se separó por evaporación bajo presión reducida para obtener 300 mg de un sólido que contenía 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona de alta pureza a partir de la fracción de Rf = 0,6 y 300 mg de un aceite que contenía 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona de alta pureza a partir de la fracción de Rf = 0,45.

El análisis estructural por resonancia magnética nuclear de los productos disueltos en cloroformo pesado se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1-(2). Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

4,5-bis(metilfumaroiloxi)ciclopentenona

\delta 3,80 (6H, s, 10-H, 15-H), 5,31 (1H, d, J=3,0 Hz, 5-H), 6,03 (1H, m, 4-H), 6,48 (1H, dd, J=1,0, 6,0 Hz, 2-H), 6,90 (4H, m, 7-H, 8-H, 12-H, 13-H), 7,50 (1H, dd, J=2,0, 6,0 Hz, 3-H).

4,5-bis(metilmaleoiloxi)ciclopentenona

\delta 3,76 (6H, s, 10-H, 15-H), 5,31 (1H, d, J=3,0 Hz, 5-H), 6,07 (1H, m, 4-H), 6,31 (4H, m, 7-H, 8-H, 12-H, 13-H), 6,44 (1 H, dd, J=1,5, 6,0 Hz, 2-H), 7,58 (1H, dd, J=2,0, 6,0 Hz, 3-H).

Los resultados se expresan suponiendo que el valor del desplazamiento químico para el protón residual del cloroformo pesado es 7,24 ppm.

El espectro de ^{1}H-RMN de la 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona se ilustra en la Figura 3. El espectro de ^{1}H-RMN de la 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona se ilustra en la Figura 4. En las Figuras 3 y 4, los ejes horizontales representan el valor del desplazamiento químico (ppm) y los ejes verticales representan la intensidad de la señal.

Los números para la identificación de señal en ^{1}H-RMN para la 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona son como se indican en la fórmula [V] siguiente.

6

Los números para la identificación de señal en ^{1}H-RMN para la 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona son como se indican en la fórmula [VI] siguiente.

7

(20) Se mezclaron 100 \mul de una solución acuosa 1 M de dihidroxiciclopentenona y 500 \mul de una solución acuosa 200 mM de glutation (reducido; Nacalai Tesque, 170-10) (pH 3,0). La mezcla se hizo reaccionar a 60ºC durante 5 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro Cosmonice de 0,5 \mum y se separó por HPLC en las condiciones siguientes.

Columna: gel de TSK ODS-80Ts (5 \mum) 20 mm x 25 cm;

Fase Móvil A: solución acuosa de TFA al 0,1%;

\hskip1.7cm

B: solución acuosa que contiene TFA al 0,1%/acetonitrilo al 50%;

Caudal: 7,5 ml/min.;

Gradiente: Fase Móvil A (10 min.) Fase Móvil A a A:B = 1:1 (55 min.) A:B = 1:1 a Fase Móvil B (15 min.);

Detección: absorbancia a 220 nm.

200 \mul de la mezcla de reacción se sometieron a HPLC. Los picos en el tiempo de retención de 35,7 min. y 36,1 min. se recogieron y evaporaron hasta sequedad bajo presión reducida para obtener 5,5 mg de sólido seco.

La estructura del sólido seco se analizó. Las medidas se llevaron a cabo empleando un dispositivo JNM-A500 (Nippon Denshi) para el espectro de resonancia magnética nuclear (RMN), un espectrómetro de masas DX302 (Nippon Denshi) para el espectro de masas (EM), un espectrofotómetro UV-2500 (Shimadzu) para el espectro de absorción ultravioleta (UV) y el espectrómetro infrarrojo FTIR-8000PC (Shimadzu) para el espectro de absorción infrarroja (IR), respectivamente. Los resultados se muestran a continuación.

^{1}H-RMN

\delta 2,09 (2H, m, 5'-H), 2,28 (1H, dd, J=13,0, 20,0 Hz, 5-H), 2,44 (2H, m, 4'-H), 2,78 (1H, dd, J=8,5, 14,0, 1'-H), 2,85 o 2,89 (1H, dd, J=3,0, 6,0 Hz, 5-H), 2,92 o 2,95 (1H, dd, J=1,0, 5,5 Hz, 1'-H), 3,86 (2H, S, 9'-H), 3,95 (2H, m, 4-H, 6'-H), 4,46 (1H, m, 2'-H), 6,47 o 6,49 (1H, d, J=3,0 Hz, 3-H).

La muestra se disolvió en solución de DCl 0,1 N en agua pesada. Los resultados se expresan suponiendo que el valor del desplazamiento químico de la HOD es 4,65 ppm.

^{13}C-RMN

\delta 26,3 (5'-C), 31,7 (4'-C), 31,9 o 32,1 (1'-C), 39,3 (4-C), 41,9 (9'-C), 42,2 o 42,3 (5-C), 53,3 (6'-C), 54,1 (2'-C), 133,5 (3-C), 154,4 (2-C), alrededor de 173 (3'-C, 7'-C, 8'-C, 10'-C), 205,8 (1-C).

La muestra se disolvió en solución de DCl 0,1 N en agua pesada. Los resultados se expresan suponiendo que el valor del desplazamiento químico del dioxano es 67,4 ppm.

Los números para la identificación de los picos en ^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN son como se indica en la fórmula [VII] siguiente.

8

\vskip1.000000\baselineskip

FAB-MS

m/z 404 (M+H)^{+}, 426 (M+Na)^{+}

Se utilizó glicerol para la matriz.

UV \lambda_{max} 251 nm (agua)

IR v^{KBr}_{max} cm^{-1} 2949, 1710, 1660, 1539, 1404, 1203

Las medidas se realizaron de acuerdo con el método de reflectancia difusa.

Estos resultados revelaron que el sólido seco era 2-hidroxi-4-glutation-S-il-2-ciclopenten-1-ona (en lo sucesivo denominado simplemente GM).

Ejemplo 2

Células HL-60 (ATCC CCL-240) se cultivaron a 37ºC en un medio RPMI 1640 (Bio Whittaker) que contenía suero de ternera fetal al 10% (FCS; JRH) que había sido tratado a 56ºC durante 30 minutos y puesto en suspensión en medio RPMI 1640 a una concentración de 2,5 x 10^{5} células/5 ml.

Se añadieron 10 \mul de cada una de las soluciones de 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona o 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona en etanol al 70% en agua diluida a concentraciones variables a 5 ml de la suspensión. Las mezclas se incubaron a 37ºC durante 24 horas en presencia de CO_{2} al 5%. En lugar de la muestra se usaron 10 \mul de una solución acuosa de actinomicina D (Sigma) (0,5 mg/ml), que es un reactivo conocido que induce apoptosis, y la mezcla se incubó en las mismas condiciones para confirmación.

Las células cultivadas se examinaron bajo un microscopio óptico. Para las células cultivadas con la adición de las muestras y actinomicina D se observaron condensación de los núcleos, encogimiento de las células y formación de cuerpos apoptóticos No se observó dicho fenómeno para las células control cultivadas con la adición de 10 \mul de solución acuosa de etanol al 70%.

Además, una parte de las células cultivadas como se ha descrito anteriormente se tiñó con azul Trypan al 0,4% y se examinó bajo microscopio óptico. Se contaron los números de células viables que no estaban teñidas y los números de células muertas que estaban teñidas de azul. Se determinó la concentración de cada una de las muestras que da como resultado una viabilidad del 50% (viabilidad_{50} \muM). Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

Muestra	Viabilidad_{50} (\muM)
4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona,	8,8
4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona,	14
4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona	2,9
4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona	3,4

Como se ha descrito anteriormente, cada compuesto exhibió una actividad antiproliferación contra células tumorales y una actividad inductora de la apoptosis. Además, los isómeros ópticos de los respectivos compuestos y sus sales exhibían actividades similares.

Ejemplo 3

(1) Se mezclaron entre sí a concentraciones variables 2 \mul de topoisomerasa II (TopoGEN; 2 unidades/\mul), 2 \mul de tampón concentrado 10 veces [Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), KCl 1,2 M, MgCl_{2} 0,1 M, trifosfato de adenosina 2,5 mM, ditiotreitol 5 mM], 2 \mul de seroalbúmina bovina al 0,1% (Takara Shuzo), 11 \mul de agua destilada y 2 \mul de agua destilada (control) o 2 \mul de una de las soluciones acuosas de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dihexenoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-bis-(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona, o 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona,. Se le añadió 1 \mul de DNA pBR322 de una concentración de 0,25 \mug/\mul (Takara Shuzo). La mezcla resultante se hizo reaccionar a 37ºC. Después de hacer reaccionar durante 30 minutos, se le añadió para detener la reacción 2 \mul de una solución acuosa que contenía dodecilsulfato sódico al 1%, glicerol al 50% y azul de bromofenol al 0,02%.

20 \mul de la mezcla de reacción se aplicó a un gel de agarosa al 1% preparado utilizando agarosa L03 (Takara Shuzo) y tampón TAE [Tris 40 mM, acetato sódico 5 mM, sal disódica del ácido etilendiamintetraacético (EDTA) 1 mM; ajustada a pH 7,8 empleando ácido acético] y se sometió a electroforesis en tampón TAE. Después de la electroforesis el gel se impregnó en una solución acuosa de bromuro de etidio de una concentración de 1 \mug/ml. El gel se expuso a rayos ultravioletas para visualizar el modelo electroforético de DNA. La forma del DNA fue cambiada completamente desde el tipo superhelicoidal al tipo relajado para un control al que se ha añadido agua, mientras que el cambio de tipo superhelicoidal a tipo relajado es parcial o completamente inhibido si está inhibida la actividad de topoisomerasa II.

Como resultado de lo anterior, la forma del DNA fue completamente cambiada desde el tipo superhelicoidal al tipo relajado para un control al que se añadió agua. Por otra parte, el cambio en la forma del DNA del tipo superhelicoidal al tipo relajado fue parcial o completamente inhibido por 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona a una concentración de 0,1 \muM o más, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona a una concentración de 1 \muM o más, 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona a una concentración de 1 \muM o más, 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona a una concentración de 10 \muM o más, 4,5-bis-(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona a una concentración de 10 \muM o más, 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona a una concentración de 50 \muM o más, 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona a una concentración de 10 \muM o más, o 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona a una concentración de 5 \muM o más, confirmando la actividad de inhibir la topoisomerasa II de cada uno de los derivados de la ciclopentenona.

(2) La actividad o inhibición de la topoisomerasa I de cada uno de los derivados de ciclopentenona se determinó como se describe en el Ejemplo 3-(1) excepto en que se usó topoisomerasa I (TopoGEN; 0,01 unidad/\mul) en lugar de topoisomerasa II y una solución que contenía Tris-HCl 100 mM (pH 7,9), EDTA 10 mM, espermidina 1 mM y glicerol al 50% como tampón concentrado 10 veces.

Como resultado la forma del DNA fue cambiada completamente desde el tipo superhelicoidal al tipo relajado para un control al que se añadió agua. Por otra parte, el cambio en la forma del DNA del tipo superhelicoidal a tipo relajado fue parcial o completamente inhibida por 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona a una concentración de 1000 \muM o más, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona a una concentración de 500 \muM o más, 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona a una concentración de 50 \muM o más, 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona a una concentración de 1000 \muM o más,
4,5-bis-(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona a una concentración de 500 \muM o más, 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona a una concentración de 1000 \muM o más, 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona a una concentración de 1000 \muM o más, o 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona a una concentración de 1000 \muM o más, confirmando la actividad de inhibición de la topoisomerasa I de cada uno de los derivados de la ciclopentenona.

Como se ha descrito anteriormente, cada uno de los derivados de ciclopentenona así como otros derivados de ciclopentenona tales como los descritos en el Ejemplo 1 exhibían una actividad inhibidora de la topoisomerasa II. La topoisomerasa II se expresa transitoriamente sólo durante la fase de división en las células normales, mientras que, cuando se trata de células cancerosas, se expresa altamente en todo el ciclo celular. La actividad inhibidora de la topoisomerasa II fue más intensa que la de la topoisomerasa I cuyo nivel de expresión y actividad se aumenta por el fenómeno de la cancerización.

Además, los isómeros ópticos de los compuestos respectivos y sus sales exhibían actividades inhibidoras similares específicas para la topoisomerasa II.

Ejemplo 4

(1) Se colocaron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos 5 ml de medio RPMI 1640 que contenía suero de ternera fetal al 10% y células HL-60 (ATCC CCL-240) a una concentración de 2 x 10^{5} células/ml. La placa se incubó a 37ºC durante 24 horas en presencia de CO_{2} al 5%. Se añadieron a dicha placa 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona o 4,5-bis(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona a una concentración final de 0, 0,63, 1,3, 2,5, 5, 10 ó 20 \muM. La incubación se continuó durante 6 horas adicionales.

Después de la incubación, se contó el número de células. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con PBS para preparar células tratadas con una de las muestras. También se prepararon células que se cultivaron del mismo modo después de ser calentadas a 45ºC durante 10 minutos.

Estas células tratadas se usaron para SDS-PAGE de acuerdo con el método que se describe en Molecular Cloning [Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Las células tratadas se pusieron en suspensión en un tampón de muestra de SDS-PAGE a una concentración de 2,5 x 10^{6} células/ml. Las suspensiones celulares se trataron a 100ºC durante 10 minutos. 5 \mul de cada una de las suspensiones celulares se aplicaron a dos geles de SDS-PAGE (gel apilado al 5%, gel de separación al 10%) y se sometieron a electroforesis. Uno de los geles se sometió a tinción de Coomassie. El otro gel se sometió a transferencia sobre una membrana de transferencia de poli(fluoruro de vinilideno) (Immobilon^{TM}, Millipore, nº de catálogo PVH000-10). La membrana se bloqueó a 4ºC durante una noche empleando Block Ace (Dainippon Pharmaceutical, nº de catálogo UK-B25).

La membrana bloqueada se hizo reaccionar con un anticuerpo monoclonal HSP72/73(Ab-1) (Oncogene Research Products, nº de catálogo HSP01), que específicamente reacciona con una proteína de choque térmico de 70-kDa inducible por calor. La membrana se lavó con TBS que contenía Tween 20 al 0,05% seguido por TBS. La membrana se hizo reaccionar luego con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa, concretamente la IgG anti-ratón HRP-conejo (H+L) (Zymed Laboratories, Inc., nº de catálogo 61-6520), y luego se lavó como se ha descrito anteriormente. La membrana que había reaccionado con los anticuerpos primarios y secundarios se hizo reaccionar con el reactivo chemiluminol de marca Renaissance^{R} (Dupont NEN, nº de catálogo NEL-100). La membrana se expuso luego a una película de rayos X para confirmar la inducción de la proteína de choque térmico de 70 kDa.

Como resultado, se observó la inducción de la proteína de choque térmico de 70 kDa. El grado de la inducción se muestra en la Tabla 2. En la Tabla 2, + representa el nivel de inducción. Números crecientes de + significan inducción aumentada. - significa que no se observó inducción. \pm significa que se observó una ligera inducción.

TABLA 2

9

El resultado para un testigo no tratado fue -, y el resultado para las células cultivadas después de ser calentadas a 45ºC durante 10 minutos fue ++. Como se ha descrito anteriormente, cada uno de los compuestos antes mencionados presentó una actividad de inducción de una proteína de choque térmico a una baja concentración. Además los isómeros ópticos de los respectivos compuestos y sus sales presentaron actividades similares. Además otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos o sus sales presentaron actividades similares.

Ejemplo 5

Se emplearon 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona y 4,5-bis(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona para examinar sus actividades antifúngicas contra Candida albicans TIMM0136.

Las células de Candida albicans se cultivaron durante una noche en un medio YNBG que contenía 0,67% de base nitrogenada de levadura (Difco) y glucosa al 1,0% (cultivo de siembra). El cultivo se diluyó luego con medio de base nitrogenada de levadura reciente hasta una concentración de 1 x 10^{6} células/ml. En cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos se introdujeron 100 \mul de la dilución.

Se añadieron a cada pocillo 10 \mul de cada una de las soluciones de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona o 4,5-bis(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona en etanol al 70% a una concentración de 100 \mug/ml o 500 \mug/ml, o 10 \mul de solución de etanol al 70%. La placa se incubó sin agitación a 30ºC durante 48 horas (cultivo principal).

Los compuestos 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona o 4,5-bis(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona suprimían el crecimiento de Candida albicans a una concentración de 500 \mug/ml. La concentración inhibidora del crecimiento mínima de cada compuesto fue 500 \mug/ml. Por tanto, estos compuestos son útiles como ingredientes activos para composiciones antifúngicas. Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales presentaban actividades similares.

Ejemplo 6

Células endoteliales vasculares humanas (vendidas por Sanko Junyaku) se suspendieron en medio RPMI-1640 (Gibco) que contenían FCS al 10% (HyClone) a una concentración de 1 x 10^{5} células/ml. En una placa de microtitulación de 96 pocillos se sembraron 100 \mul/pocillo de la suspensión.

A la monocapa de células endoteliales vasculares se añadieron 100 U/ml de FNT-\alpha (factor de necrosis tumoral alfa) recombinante humano (Promega) después de la incubación a 37ºC durante 2 días en un incubador de CO_{2} al 5%. La placa se incubó a 37ºC durante 6 horas en un incubador con CO_{2} al 5% para preparar células endoteliales vasculares estimuladas con FNT-\alpha.

Por otra parte, se añadió dihidroxiciclopentenona, GM o 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona en una concentración variable a células HL-60 suspendidas en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml. Las células se cultivaron a 37ºC durante 3 horas en un incubador con CO_{2} al 5%. Después del cultivo, se añadieron 5 \muM de 5(-y-)6-diacetato de carboxifluoresceína, éster de succinimida (Molecular Probe) como agente fluorescente y se hizo reaccionar a 37ºC durante 10 minutos. Las células se lavaron dos veces con medio RPMI-1640 y se pusieron en suspensión en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% para preparar una suspensión de células HL-60 marcadas por fluorescencia a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml.

100 \mul/pocillo de las células HL-60 marcadas por fluorescencia se extendieron sobre las células endoteliales vasculares estimuladas con FNT-\alpha. Se le añadieron dihidroxiciclopentenona, GM o 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona a una concentración variable. La placa se incubó a 37ºC durante 20 minutos en un incubador con CO_{2} al 5% para la reacción de adhesión entre las células endoteliales vasculares y las células HL-60.

Después de la reacción de adhesión, las placas se lavaron para eliminar las células no adhesivas. Para destruir las células adhesivas se le añadió Tritón X al 1% (Nacalai Tesque). La intensidad de la fluorescencia se midió empleando filtros para 485/22 nm (excitación) y 530/25 nm (emisión).

El porcentaje de adhesión que representa la relación de células adheridas a células endoteliales vasculares se determinó definiendo la intensidad de fluorescencia para 1 x 10^{5} células marcadas por fluorescencia como 100%.

Los resultados se muestran en la Tabla 3. La tasa de adhesión de células endoteliales vasculares a HL-60 fue aumentada cuando se estimularon con FNT-\alpha. Este aumento en la tasa de adhesión se suprimió por dihidroxiciclopentenona, GM o 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona a una concentración que variaba desde 10^{-7} a 10^{-4} M en un modo dependiente de la dosis. Por tanto cada uno de dihidroxiciclopentenona, GM y 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona exhibían una actividad de inhibición de la adhesión entre células cancerosas y células endoteliales vasculares, que se requiere para la inhibición de la metástasis del cáncer. Además, los isómeros ópticos de los respectivos compuestos y sus sales exhibieron actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos o sus sales exhibieron actividades similares.

TABLA 3

10

Ejemplo 7

Se compraron ratones ddY (hembras, de 7 semanas) a Japan SLC y se prepararon durante 1 semana antes de los experimentos.

En cada ratón se inocularon intraperitonealmente 1 x 10^{6} células de carcinoma de ascites de Ehrlich. Se administraron intraperitonealmente a cada ratón el día después de la inoculación 10 mg/kg de dihidroxiciclopentenona, 30 mg/kg de GM o 10 mg/kg de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona. A un ratón de control se le administró solución salina.

Se extirpó el bazo del ratón 10 días después de la inoculación con células cancerosas, se cortó finamente y se puso en suspensión en medio RPMI-1640 (Gibco) que contenía FCS al 10% (HyClone) para obtener una única suspensión de células. Las células adherentes en la suspensión de células adheridas a una placa de Petri de plástico se retiraron y las células no adherentes se usaron como linfocitos del bazo.

Los linfocitos del bazo se pusieron en suspensión en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% a una concentración de 2 x 10^{6}/ml. 100 \mul/pocillo de la suspensión se sembraron en una placa de microvaloración.

Las células estimuladas se prepararon como sigue. Se añadió Mitomicina C (Kyowa Hakko Kogyo) a una concentración de 50 \mug/ml de células de carcinoma de ascites de Ehrlich puestas en suspensión en un medio RPMI-1640 a una concentración de 2 x 10^{6} células/ml. Las células se trataron a 37ºC durante 30 minutos, se lavaron dos veces y luego se pusieron en suspensión en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% para preparar células estimuladas a una concentración de 2 x 10^{6} células/ml.

100 \mul de las células estimuladas así preparadas se depositaron sobre cada pocillo de la placa a las cuales se había añadido 100 \mul/pocillo de los linfocitos del bazo. La placa se incubó a 37ºC durante 5 días en un incubador con CO_{2} al 5%. Se añadieron 37 kBq de ^{3}H-timidina (Daiichi Pure Chemicals) al pocillo para marcar por impulso las células el día antes de que se completara el cultivo. Después del cultivo las células se recogieron en un filtro de vidrio para medir la radioactividad.

Los resultados se muestran en la Tabla 4. El crecimiento de los linfocitos del bazo obtenidos de los ratones a los que se había administrado la dihidroxiciclopentenona, GM o 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona estaban significativamente potenciados por estimulación con células cancerosas sugiriendo que habían sido inducidos linfocitos específicamente reactivos con las células cancerosas. Además, isómeros ópticos de los compuestos respectivos y sus sales exhibieron actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibieron actividades similares.

TABLA 4

11

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Ejemplo 8

Se compraron ratones ddY (hembras, de 7 semanas) a la firma Japan SLC y se precriaron durante 1 semana antes de los experimentos.

En cada ratón se inocularon intraperitonealmente 1 x 10^{6} células de carcinoma de ascites de Ehrlich. El día después de la inoculación se administraron intraperitonealmente en el ratón 10 mg/kg de dihidroxiciclopentenona, 30 mg/kg de GM o 10 mg/kg de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona. A un ratón de control se le administró solución salina

Se extirpó el bazo del ratón 10 días después de la inoculación con las células cancerosas, se cortó finamente y se puso en suspensión en un medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% (HyClone) para obtener una única suspensión de células. Las células adhesivas adheridas a la cápsula de Petri de plástico se retiraron de la suspensión de las células y las células no adhesivas se usaron como células asesinas naturales (NK).

Las células NK se pusieron en suspensión en un medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% a una concentración de 6 x 10^{6} células/ml. En una placa de microtitulación se sembraron 100 \mul/pocillo de la suspensión.

Las células diana se prepararon como sigue. 3700 kBq de ^{51}Cr (Amersham) se añadieron a 1 x 10^{6} de células YAC-1 (Dainippon Pharmaceutical). Las células se cultivaron a 37ºC durante 1 hora para su marcado. Las células marcadas se lavaron dos veces y luego se pusieron en suspensión en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% a una concentración de 2 x 10^{5} células/ml.

100 \mul de las células diana así preparadas se depositaron en cada pocillo de la placa en el cual se habían añadido células NK. La placa se incubó a 37ºC durante 5 horas en un incubador con CO_{2} al 5%. Después de la incubación, la placa se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos. 100 \mul del líquido sobrenadante se recogieron en un tubo de un contador gamma. La radioactividad (valor experimental) se midió empleando un contador gamma automático.

100 \mul del medio de cultivo se añadieron al sistema de reacción en lugar de las células NK y se midió la radioactividad para medir la radioactividad liberada espontáneamente de las células dianas (valor de control).

Además, se midió la radioactividad liberada en el líquido sobrenadante cuando se añadió Tritón al 1% (Nacalai Tesque) para lisar las células YAC-1 marcadas con ^{51}Cr para medir la radioactividad total contenida en el sistema de reacción (valor de la radioactividad total).

La citotoxicidad (%) específicamente mediada por las células NK puede determinarse de acuerdo con la siguiente ecuación.

Citotoxicidad (%) = [(valor experimental - valor de control)/(valor de la radioactividad total - valor de control)] x 100

Los resultados se muestran en la Tabla 5. La activación de las células NK se observó en ratones cuando se les administró dihidroxiciclopentenona, GM o 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona. La administración de estos compuestos aumentó el mecanismo de protección inmunológica en un cuerpo vivo y la actividad citotóxica contra las células cancerosas. Además, isómeros ópticos de los compuestos respectivos y sus sales exhibieron actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibieron actividades similares.

TABLA 5

12

Ejemplo 9

Se compraron ratas Lewis (machos, de 9 semanas, que pesaban aproximadamente 250 g) a la firma Seac Yoshitomi.

Las ratas se dejaron en ayunas durante 18 horas antes del comienzo de los experimentos. Los siguientes compuestos: 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-bis-(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona o 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona disueltos en aceite de oliva (Nacalai Tesque) se administraron por vía oral a 4 ratas por grupo a 1 ó 10 mg/ml/kg.

100 \mul de una suspensión al 1% de \lambda-carragenano (Wako Pure Chemical Industries) en solución salina (Otsuka Pharmaceutical) se inyectaron en la suela de la pata derecha de una rata 0,5 horas después de la administración de la sustancia de ensayo para inducir un edema pedal. El volumen de la pata derecha de la rata se midió empleando un instrumento para medir el volumen pedal (Ugo Basile) 3 horas después de la inyección con carragenano. Las medidas se expresaron como proporción de aumento calculada sobre la base del volumen de la pata derecha de cada rata medida antes de la administración del carragenano.

Los resultados se muestran en la Figura 5. La Figura 5 ilustra la relación entre la cantidad de derivado de ciclopentenona administrado y la proporción de aumento en el edema de la pata. El eje horizontal representa la dosis (mg/ml) y el eje vertical representa la proporción de aumento (%).

La tendencia a suprimir el edema en la pata se observó cuando la 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona se administró a 1 mg/kg. La administración a 10 mg/kg dio como resultado una supresión significativa. La administración de 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona o 4,5-bis-(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona a 1 ó 10 mg/kg dio como resultado una supresión significativa. La tendencia de la supresión se observó cuando la 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona o la 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona se administró a 1 mg/kg. La administración a 10 mg/kg dio como resultado una supresión significativa. Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibían actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibían actividades similares.

En la Figura 5, las marcas * y ** representan diferencias significativas de p < 0,05 y p < 0,01 en comparación con el grupo de control, respectivamente.

Ejemplo 10

Se compraron ratones C57BL/6 (machos, de 7 semanas, que pesaban aproximadamente 25 g) a la firma Japan SLC y se precriaron durante 1 semana antes de usarlos en experimentos.

Eritrocitos de oveja (Shimizu Laboratory Supplies) como antígenos de sensibilización se lavaron tres veces con solución salina (Otsuka Pharmaceutical) y se pusieron en suspensión en solución salina a una concentración de
1 x 10^{9} células/ml. 200 \mul de la suspensión se inyectaron intraperitonealmente en el ratón para sensibilización con el antígeno. 40 \mul del antígeno similarmente preparado se inyectaron en la suela de la pata derecha 5 días después de la sensibilización para la inducción antigénica de un edema pedal.

La 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona disuelta en solución salina a una concentración variable se administró intraperitonealmente u oralmente a 5 ratones por grupo una vez al día durante 3 días a partir del día de la sensibilización con el antígeno. El volumen de la pata derecha del ratón se midió empleando un instrumento para medir el volumen del edema pedal (Ugo Basile) 2 días después de la inducción antigénica y se utilizó como un índice de DTH. Las medidas se expresaron como la proporción de aumento calculada de acuerdo con la ecuación siguiente basada en el volumen de la pata derecha de cada ratón medido antes de la inducción antigénica.

Proporción de aumento = (volumen de la pata derecha después de la inducción antigénica - volumen de la pata derecha antes de la inducción antigénica)/volumen de la pata derecha antes de la inducción antigénica

Los resultados se muestran en la Figura 6. En la Figura 6, el eje vertical representa la proporción de aumento en el volumen de la pata por la inducción antigénica. La tendencia a suprimir el edema en la pata se observó cuando la
4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona se administró intraperitonealmente a 1 mg/kg. La administración intraperitoneal de 10 mg/kg o la administración oral a 30 mg/kg dio como resultado una supresión significativa. Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibieron actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibieron actividades similares.

En la Figura 6, las marcas * y ** representan diferencias significativas de p < 0,05 y p < 0,01 en comparación con el grupo de control, respectivamente.

Ejemplo 11

(1) Se extirpó el bazo de un ratón ddY (macho, de 7 semanas, comprado a Japan SLC), se cortó en láminas delgadas y se puso en suspensión en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10% (HyClone) para obtener una única suspensión de células. La suspensión de células se sembró en una cápsula Petri de plástico y se cultivó a 37ºC durante 2 horas en un incubador con CO_{2} para separar las células adhesivas adheridas a la cápsula. Las células no adhesivas se usaron como linfocitos del bazo. En cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos se sembraron 200 \mul de una suspensión de los linfocitos del bazo a una concentración de células de 2 x 10^{6}/ml Se añadió a cada pocillo distinto del pocillo de control 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona a una concentración variable. Además se añadió a cada pocillo 5 \mug de Con A (Nacalai Tesque). La placa se incubó a 37ºC durante 1 día en un incubador con CO_{2}. Después de la incubación, se añadió a cada pocillo 1 \muCi de ^{3}H-timidina. Después de cultivar durante 1 día más, la captación por parte de las células se midió empleando un contador de centelleo de líquidos.

Los resultados se muestran en la Figura 7. Dicha Figura 7 ilustra la relación entre la concentración de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona y la cantidad de captación de ^{3}H-timidina. El eje horizontal representa la concentración de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona (\muM) y el eje vertical representa la captación de ^{3}H-timidina (cpm). La barra en blanco representa la captación de ^{3}H-timidina sin estimulación. La barra sombreada representa la captación de
^{3}H-timidina cuando las células fueron estimuladas con Con A. Como puede verse en la Figura 7, la 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona exhibió una actividad inhibidora contra la proliferación de linfocitos de ratón estimulados con un agente mitógeno de un modo dependiente de la dosis. La proliferación se inhibió casi completamente a una concentración de 10 \muM. Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibían actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibían actividades similares.

(2) Se extirparon los bazos de ratones BALB/c (machos, de 6 semanas, comprados a Japan SLC) y un ratón C57BL/6 (macho, de 6 semanas, comprado a Japan SLC) y se obtuvieron linfocitos de bazo de acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 11-(1). La concentración de cada una de las suspensiones celulares se ajustó a 2 x 10^{6} células/ml, y porciones de 100 \mul de las respectivas suspensiones se mezclaron y se sembraron en una placa de microtitulación de 96 pocillos. A cada uno de los pocillos se le añadió 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona en una concentración variable distinta de la del pocillo de control, y la placa se incubó a 37ºC durante 4 días en un incubador con CO_{2}. Después de la incubación, a cada uno de los pocillos se le añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina y la placa se incubó durante 1 día más. Se midió la captación por las células empleando un contador de centelleo de líquidos.

Los resultados se muestran en la Figura 8. Dicha Figura 8 ilustra la relación entre la concentración de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona y la cantidad de captación de ^{3}H-timidina. El eje horizontal representa la concentración de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona (\muM) y el eje vertical representa la captación de ^{3}H-timidina (cpm). La barra en blanco representa la captación de ^{3}H-timidina cuando las células de una de las líneas se usaron independientemente. La barra sombreada representa la captación de ^{3}H-timidina cuando las células de ambas de las líneas se mezclaron. Como puede verse en la Figura 8, la 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona exhibió una actividad inhibidora contra los linfocitos activados por estimulación con un aloantígeno en un modo dependiente de la dosis. La reacción se inhibió casi por completo a una concentración de 1 \muM. Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibieron actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibieron actividades similares.

Ejemplo 12

(1) Se construyó un modelo de choque endotoxínico empleando ratones DCF1 (de 8 semanas, hembras, comprados a Japan SLC). Se añadió agua destilada (control), o 10 mg/kg de 4,5-diisopropioniloxi-2-ciclopentenona o
4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona y se administró subcutáneamente a un ratón. Se administraron intraperitonealmente 20 \mug de lipopolisacárido (LPS; Sigma) a cada ratón 30 minutos después de la administración. Se recogió sangre del ratón 1,5 horas después de la administración del LPS. Se midió la cantidad de factor de necrosis tumoral (FNT)-\alpha en un suero preparado de la sangre recogida empleando un kit ELISA (R&D) comercialmente disponible. Cada grupo consistía en 4 ratones.

Los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

13

La producción de FNT-\alpha se suprimió significativamente en los grupos a los que se les administraron 10 mg/kg de 4,5-diisopropioniloxi-2-ciclopentenona o 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona en comparación con el grupo de control al que se le administró agua destilada. En la Tabla 6, las marcas ** y *** representan diferencias significativas de p < 0,01 y p < 0,001 en comparación con el grupo de control, respectivamente. Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibían actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibían actividades similares.

(2) Se construyó un modelo de choque endotoxínico administrando intraperitonealmente 20 \mug de LPS a un ratón CDF1 (de 8 semanas, hembra). Se administraron por vía oral, 30 minutos antes de la administración del LPS, 30 ó 100 mg/kg de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona o 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona. Se recogió sangre del ratón 1,5 horas después de la administración del LPS. La cantidad de FNT-\alpha en un suero separado de la sangre recogida se midió empleando un kit ELISA. Cada grupo consistía en 4 ratones.

Los resultados se muestran en la Tabla 7. La administración oral de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona o 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona suprimió la producción de FNT de un modo dependiente de la dosis en comparación con el grupo de control. Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibían actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibían actividades similares.

TABLA 7

14

Ejemplo 13

(1) Un ratón DBA/2 hembra de 7 semanas se infectó con leucemia del ratón por administración intraperitoneal de células P-388 (1,1 x 10^{6} células/ratón). Inmediatamente después de la administración, se administró intraperitonealmente una sola dosis de 10 mg/kg de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona. Por otro lado, se administró intraperitonealmente de un modo similar solución salina a un grupo de control. El número de ratones supervivientes, los días medios de supervivencia y la proporción de prolongación se calcularon para los 2 grupos, cada uno de los cuales consistía en 8 ratones.

Como resultado, los días medios de supervivencia fueron 10,1 días para el grupo de control. Los días medios de supervivencia fueron 13,9 días para el grupo al que se le había administrado 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona. La proporción de prolongación se calculó como 137,0%. Por tanto, se observó un efecto de prolongación significativo.

De un modo similar, se llevó a cabo un examen empleando un sistema de células tumorales Meth A:ratón BALB/c. Como resultado, los días medios de supervivencia fueron 13,4 días para el grupo de control. Los días medios de supervivencia fueron 16,9 días para el grupo al que se le había administrado 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona. La proporción de prolongación se calculo como 126,2% indicando un efecto de prolongación significativo.

Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibían actividades similares.

Por otro lado, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibían actividades similares.

(2) El tumor sólido de ratón Meth A (2 x 10^{6} células/ratón) se inyectó subcutáneamente en el lomo de un ratón BALB/c hembra de 8 semanas. Posteriormente, se le inyectó por vía subcutánea 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona en el mismo sitio durante 5 días sucesivos. Se inyectó subcutáneamente solución salina a un grupo de control de un modo similar. Cada grupo consistía en 8 ratones.

Después de 2 semanas, se extirpó el tejido canceroso formado en el lomo del ratón y se midió el peso del tejido.

Los resultados se muestran en la Tabla 8. El peso medio del cáncer fue 0,61 g para el grupo de control. El peso medio fue de 0,05 g para el grupo al que se le había administrado 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona. La proporción de inhibición se calculó como 92,3%. No se formó tejido canceroso en 5 de los 8 ratones. Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibieron actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibieron actividades similares.

TABLA 8

15

(3) Las actividades carcinostáticas de 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona y 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona contra diversos cánceres ascíticos se examinaron empleando dos tipos de células cancerosas, carcinoma de ascites de Ehrlich (EAC) y Meth A, administrado por vía intraperitoneal u oral a una dosis variable. El número de células transplantadas intraperitonealmente y los animales hospedantes se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9

16

4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona o 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona se administró por vía intraperitoneal u oral durante 5 días sucesivos desde el día después del transplante de células cancerosas. Se administró agua destilada inyectable a un grupo de control de un modo similar. Se calcularon los días medios de supervivencia, la proporción de prolongación y el número de supervivientes a los 30 días por grupos que consistían cada uno en 8 ratones.

Los resultados se muestran en las Tablas 10 a 13. La Tabla 10 muestra los efectos de prolongación cuando las sustancias de ensayo respectivas se administraron intraperitonealmente a ratones transplantados con EAC. La Tabla 11 muestra el efecto de prolongación cuando las sustancias de ensayo respectivas se administraron intraperitonealmente a ratones transplantados con Meth A. La Tabla 12 muestra los efectos de prolongación cuando las sustancias de ensayo respectivas se administraron por vía oral a ratones transplantados con EAC. La Tabla 13 muestra los efectos de prolongación cuando las sustancias de ensayo respectivas se administraron por vía oral a ratones transplantados con Meth A.

La 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona y la 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona exhibieron excelentes efectos de prolongación en los ratones transplantados con EAC. En particular se observaron ratones con una supervivencia de 30 días en ambos grupos de administración intraperitoneal. La 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona exhibió fuertes efectos incluso si se administraba por vía oral.

Además, el efecto de prolongación se observó para el grupo tratado por administración intraperitoneal entre los ratones transplantados con Meth A. Se observaron ratones con 30 días de supervivencia en el grupo de administración oral con 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona.

Además, los isómeros ópticos de los derivados de ciclopentenona y sus sales exhibieron actividades similares.

Además, otros derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales exhibieron actividades similares.

TABLA 10

17

TABLA 11

18

TABLA 12

19

TABLA 13

20

Ejemplo 14 Preparación inyectable

(1) Para obtener preparaciones inyectables se añadieron 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona o 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona a una solución salina a una concentración de 1%.

(2) Para obtener preparaciones inyectables se añadieron 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona o 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona y ácido glicirrícico a una solución salina de 0,5% y 0,1%, respectivamente.

Ejemplo 15 Comprimidos

(1) Se prepararon comprimidos que contenían cada uno 100 mg de 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona o
4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona y una cantidad adecuada de celulosa cristalina y se revistieron con azúcar.

(2) Se prepararon comprimidos que contenían cada uno 0,1 mg de 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona, 10 mg de la sal potásica del ácido glicirrícico y una cantidad adecuada de celulosa cristalina y se revistieron con azúcar.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen derivados de ciclopentenona o sus isómeros ópticos, o sus sales que tienen actividades fisiológicas, tales como actividad inmunorreguladora, actividad anti-inflamatoria, actividad de inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral y una actividad antifúngica. Las composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos como sus ingredientes activos son útiles para mantener la homeostasis en un cuerpo vivo, como composiciones farmacéuticas para tratar o impedir una enfermedad que requiera inmunorregulación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera supresión de la inflamación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición del crecimiento de microorganismos patológicos para su tratamiento o prevención y similares.

Claims (5)

1. Una composición farmacéutica que contiene como ingrediente activo al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de ciclopentenona de la fórmula [I]:

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en donde R_{1} y R_{2} pueden ser iguales o diferentes uno de otro, y son hidrógeno, un grupo alifático, un grupo aromático o un grupo aromático-alifático, o uno de sus isómeros ópticos, y una de sus sales,

siendo dicha composición para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad que requiera inmunorregulación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera supresión de la inflamación para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición del crecimiento de un hongo para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera inhibición de la adhesión celular para su tratamiento o prevención, una enfermedad que requiera activación de las células NK para su tratamiento o prevención, o una enfermedad que requiera la inducción de proteínas de choque térmico para su tratamiento o prevención.

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R_{1} y R_{2} pueden ser idénticos o diferentes entre sí, y son hidrógeno, un grupo alquilo lineal o ramificado de C_{1-30}, un grupo alquenilo lineal o ramificado de C_{2-30}, un grupo arilo de C_{6-10} o un grupo alquilo de C_{1-30}-arilo de C_{6-10}, sustituidos opcionalmente con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo de C_{1-30}, un grupo alcoxi de C_{1-4}, un grupo alcoxi de C_{2-}5-carbonilo, un grupo amino, un grupo nitro, un grupo oxo, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo sulfato y un halógeno.

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el derivado de ciclopentenona de fórmula [I] es 4,5-diacetoxi-2-ciclopentenona, 4,5-dipropioniloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dibutiriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-diisobutiriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-divaleriloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dihexanoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dioctanoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-didecanoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-dimiristoiloxi-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metoxiacetoxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metilfumaroiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis(metilmaleoiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis-(2-hexenoiloxi)-2-ciclopentenona, 4,5-bis-(3-octenoiloxi)-2-ciclopentenona y 4,5-dibenzoiloxi-2-ciclopentenona.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, que es una composición inmunorreguladora, una composición antiinflamatoria, una composición para inhibir la producción del factor de necrosis tumoral, una composición antifúngica, una composición para inhibir la adhesión celular, una composición para activar las células NK o una composición para inducir proteínas de choque térmico.

5. Uso de un compuesto (I) como se ha definido en la reivindicación 1, uno de sus isómeros ópticos o una de sus sales para la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.