EA001607B1

EA001607B1 - Антивирусное средство

Info

Publication number: EA001607B1
Application number: EA199900834A
Authority: EA
Inventors: Хироаки Сагава; Нобуто Кояма; Хидето Чоно; Казутох Такесако; Икуносин Като
Original assignee: Такара Сузо Ко., Лтд.
Priority date: 1997-03-17
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 2001-06-25
Also published as: KR100485418B1; EP0974347A4; EP0974347B1; US20030149114A1; AU6117698A; EA199900834A1; KR20000076145A; WO1998041196A1; DE69825977D1; CA2285988A1; AU734118B2; JP3664735B2; ATE274903T1; TW500612B; EP0974347A1; CN1248164A; ES2226096T3; CN1138538C; US6518317B1; DE69825977T2

Abstract

Антивирусное средство, содержащее в качестве активного ингредиента, по крайней мере, одно соединение, выбранное из 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-она формулы [I], его оптически активного вещества и его соли.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, пищевым продуктам и напиткам, которые эффективно уничтожают патогенные микроорганизмы благодаря своему антивирусному действию.

Предпосылки изобретения

Антивирусное действие представляет собой действие, вызывающее резистентность к вирусу (способность сопротивления вирусу), в частности, ингибирование вирусной инфекции в клетках, ингибирование размножения вируса в инфицированных клетках и т.д., избирательное уничтожение вирусинфицированных клеток, инактивацию вируса (т.е. лишение его инфицирующей способности).

Известно нейтрализующее антитело, в качестве вещества, инактивирующего сам вирус, и существует вакцина, в качестве средства, индуцирующего такое антитело. Однако несмотря на то, что индукция антитела с помощью вакцины является эффективным способом профилактики вирусной инфекции, в настоящее время достаточно редко применяются методы лечения, в основе которых лежит использование такого антитела. Кроме того, не существует эффективного метода лечения, обеспечивающего инактивацию вируса непосредственно фармацевтическими средствами.

Что касается индуцирования резистентной способности к вирусу, то это представляет ингибирование репликации генома вируса, ингибирование транскрипции гена вируса, ингибирование синтеза белка вируса, ингибирование укладки белка вируса и т.д. Эти действия направлены на подавление активности или экспрессии фактора транскрипции в клетке, подавление активности или экспрессии фактора транскрипции, вырабатываемого вирусом, индукцию хитшоковых белков и т.д. Примером вещества, способного индуцировать такое действие, является простагландин.

Примерами агентов, которые избирательно уничтожают вирусинфицированные клетки, являются ацикловир, ганцикловир, соривудин и т. д., которые используют в качестве лекарственных средств против вируса герпеса.

Цели изобретения

Более действенным оружием против вируса является использование веществ, обладающих синергетическим действием. Например, даже при введении вещества, которое избирательно уничтожает вирусинфицированные клетки, очень трудно полностью уничтожить вирус, так как до тех пор, пока не будут убиты инфицированные клетки, новый вирус будет генерировать и поражать инфекцией другие клетки. С другой стороны, даже при введении вещества, вызывающего сопротивительную способность к вирусу, невозможно уничтожить инфицированные клетки. Объектом настоящего изобретения являются соединения, обладающие функцией индуцирования сопротивляемости к вирусу в клетках и избирательно уничтожающие вирусинфицированные клетки. Другим объектом данного изобретения являются фармацевтические средства, в частности, антивирусное средство, улучшающее печеночные функции, средства для индукции хитшоковых белков, средства для профилактики канцерогенеза, вызываемого онкогеном, средства для профилактики химического канцерогенеза и т.д., а также антивирусные пищевые продукты или напитки, содержащие вышеуказанное соединение.

Способы достижения целей изобретения

Авторы настоящего изобретения провели всестороннее исследование для достижения указанной цели, в результате которого было установлено, что при обработке клеток соединением, вызывающим резистентность (сопротивляемость) к вирусу и избирательно уничтожающим вирусинфицированные клетки, происходит избирательное уничтожение указанных клеток и уменьшается репликация вируса, так как неинфицированные клетки приобретают резистентную способность к данному вирусу, при этом подавляется рост вируса, даже если он инфицирует новые клетки. Другими словами, обнаружено, что соединение, которое вызывает резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожает вирусинфицированные клетки, является чрезвычайно эффективным для уничтожения таких вирусов, как вирус СПИДа человека и вирус гепатита С.

Функция соединения по настоящему изобретению - индуцировать резистентность к вирусу в клетках - можно определить путем обработки этим соединением клеток до их инфицирования вирусом с последующим ингибированием вирусной инфекции в клетках, ингибированием репликации генома вируса, ингибированием транскрипции гена вируса, ингибированием синтеза белка вируса, ингибированием уклада белка вируса и т.д., в качестве индексов или критериев сравнения.

Кроме того, функция избирательного уничтожения вирусинфицированных клеток, может быть определена сравнением степени выживаемости вирусинфицированных клеток с аналогичным показателем у неинфицированных клеток.

Практически не существует ограничений в отношении использования соединения, вызывающего резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающего вирусинфицированные клетки, поскольку данное соединение обладает обоими указанными действиями.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он формулы [I] (далее определяется как циклопентенон), его оптически активное соединение или соль индуцируют резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожают вирусинфицированные клетки.

Первым объектом настоящего изобретения является антивирусное средство, которое содержит в качестве активного компонента, по крайней мере, одно соединение, выбранное из группы, включающей 4,5-дигидрокси-2циклопентен-1-он формулы [I], его оптически активное вещество и его соль

Вторым объектом настоящего изобретения является антивирусный пищевой продукт или напиток, который содержит в качестве активного компонента, по крайней мере, одно соединение, выбранное из группы, включающей 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-он формулы [I], его оптически активное вещество и его соль.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве примеров вируса приведены вирус СПИДа человека и вирус гепатита С. Примерами антивирусных средств являются антивирусное средство для людей, антивирусное средство для животных помимо человека (например, антивирусное средство для домашних животных, домашней птицы, рыбы или креветок) и антивирусное средство для растений.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан график зависимости между концентрацией циклопентенона и степенью выживаемости при использовании клеток СЕМ88;

на фиг. 2 - график зависимости между концентрацией циклопентенона и степенью выживаемости при использовании клеток Н9;

на фиг. 3 - график зависимости между концентрацией циклопентенона и степенью выживаемости при использовании клеток СЕМ-3В;

на фиг. 4 - график зависимости между концентрацией циклопентенона и степенью выживаемости при использовании клеток Н9-3В;

на фиг. 5 - график, показывающий ингибирующее действие циклопентенона против канцерогенеза;

на фиг. 6 - круговой дихроизм пдиметиламинобензоильного производного (-)циклопентенона и стереоструктура (-)циклопентенона;

на фиг. 7 - круговой дихроизм пдиметиламинобензоильного производного (+)циклопентенона и стереоструктура (+)циклопентенона.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Циклопентенон формулы [I] по настоящему изобретению включает оба изомера, когда гидроксильные группы в 4- и 5-положениях имеют цис- и транс-конфигурации. В настоящем изобретении можно использовать любой цисциклопентенон, транс-циклопентенон и смесь цис- и транс-циклопентенонов. Кроме того, можно использовать его оптически активные вещества.

Цис-циклопентенон можно получить химическим синтезом |Нс1мс11са СНишса Ас1а. т. 55, с. 2838-2844 (1972)]. Транс-циклопентенон можно получить путем химического синтеза [СагЬойубга1е Век., т. 247, с. 217-222 (1993)] или нагреванием уроновой кислоты, такой как глюкуроновая кислота, производного уроновой кислоты, такого как глюкуронолактон, или вещества, содержащего указанное соединение (ссылка на заявку РСТ/1Р 97/03052). В настоящем изобретении можно также использовать термообработанный продукт, частично очищенный продукт или очищенный продукт.

Например, когда в качестве уроновой кислоты используют Ό-глюкуроновую кислоту, нагревая ее 1%-ный раствор при температуре 121°С в течение 4 ч, циклопентенон получают в виде термообработанного вещества. Циклопентенон экстрагируют из этого вещества растворителем и экстракт концентрируют. Затем концентрированный экстракт отделяют хроматографией на колонках из силикагеля, элюированную фракцию циклопентенона концентрируют, циклопентенон экстрагируют хлороформом из концентрата и экстракт концентрата подвергают хроматографии на колонке с нормальной фазой, после чего циклопентенон в термообработанном веществе выделяют.

Ниже приведены физические свойства циклопентенона. Масс-спектрометрический анализ циклопентенона выполнен в массспектрометре ΌΧ302 (фирма Νίρροη ИеизЫ). Измерение ЯМР-спектра с использованием тяжелого хлороформа в качестве растворителя выполнено в устройстве ΡΝΜ-Α 500 (фирма Νίρροη ИеикЫ). Удельное вращение измерено в поляриметре ΌΙΡ-370 (фирма Νίρροη Виико); ультрафиолетовый спектр поглощения измерен при помощи спектрофотометра ИУ-2500 (фирма 81ιίιη;·ιάζι.ι); и инфракрасный спектр поглощения (ΙΒ) измерен при помощи инфракрасного спектрофотометра ΕΤΙΒ-8000 (фирма 81ιίιη;·ιάζι.ι).

Масс-спектр т/ζ 115 [М+Н]⁺.

Спектр Ή ЯМР (СИС1₃): δ 4,20 (1Н, д, 1 =

2,4 Гц, 5-Н), 4,83 (1Н, м, 4-Н), 6,30 (1Н, дд, 1 =

1,2, 6,1 Гц, 2-Н), 7,48 (1Н, дд, 1 = 2,1, 6,1 Гц, 3Н).

Значение химического сдвига спектра ¹НЯМР приведено с учетом химического сдвига СНС1₃, равного 7,26 ч/млн.

Оптическое вращение: [а]_с ²⁰ 0° (с 1,3, вода).

Ультрафиолетовый спектр: Х_тах 215 нм (вода).

Инфракрасный спектр (КВг): поглощение при 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 см^-1.

Подвергая выделенный циклопентенон оптическому разделению, получают (-)-4,5дигидрокси-2 -циклопентен- 1 -он и (+)-4,55 дигидрокси-2-циклопентен-1 -он. Совершенно очевидно, что циклопентенон, полученный синтетическим методом, можно также подвергнуть оптическому разделению.

Например, циклопентенон растворяют в этаноле. К полученному раствору в этаноле добавляют смесь гексана и этанола (94/6), что дает раствор циклопентенона. Циклопентенон можно оптически разделить, подвергая этот раствор жидкостной хроматографии высокого давления, например, С1пга1 Раск А8 (фирма Оаюе1 Сйеш1са1 ОПпЧпеЦ в следующих условиях: температура колонки 40°С; подвижная фаза состоит из смеси гексана и этанола (94/6).

Оптическое вращение оптически выделенного (-)-транс-4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1она [далее определяется как (-)-циклопентенон] равно [α]_Β ²⁰ -105° (с 0,30 этанол) и оптическое вращение оптически выделенного (+)-транс-4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-она [далее определяется как (+)-циклопентенон] равно [α]_Β ²⁰+104° (с 0,53, этанол). Оптическое вращение измерено вышеуказанным поляриметром типа ΌΙΡ-370 (фирма Νίρροη Випко).

Затем каждый из (-)-циклопентенона и (+)циклопентенона подвергают структурному анализу посредством анализа масс- и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), ультрафиолетовой абсорбционной спектроскопии и инфракрасной абсорбционной спектроскопии по вышеуказанному методу. Оба оптически активных вещества показывают такие же результаты, что и циклопентенон до оптического разделения.

Каждый из оптически расщепленного (-)циклопентенона и (+)-циклопентенона превращают в п-диметиламинобензоильное производное, измеряют спектр кругового дихроизма (СО) при помощи дисперсиметра кругового дихроизма типа 1-720 (фирма Νίρροη Випко) и полученный результат используют для определения конфигурации по правилу хиральности дибензоата [1. Ат. С1ет. 8ос., т. 91, с. 3989-3991 (1969)].

Круговой дихроизм п-диметиламинобензоильного производного (-)-циклопентенона и стереоструктура (-)-циклопентенона показаны на фиг. 6. На этом чертеже на оси ординат указаны значения молярного кругового дихроизма, а на оси абсцисс указаны значения длин волн (нм). Вышеуказанная стереоструктура показана ниже формулой [II]

Круговой дихроизм п-диметиламинобензоильного производного (+)-циклопентенона и стереоструктура (+)-циклопентенона показаны на фиг. 7. На этом чертеже на оси ординат указаны значения молярного кругового дихроизма, а на оси абсцисс указаны значения длин волн (нм). Вышеуказанная стереоструктура показана ниже формулой [III]

Как показано на фиг. 6 и 7, формулы [II] и [III], (-)-циклопентенон является (-)-(4К,58)транс-4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-оном и (+)-циклопентенон является (+)-(48,5К.)-транс4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-оном.

Вышеуказанные циклопентеноны или их оптически активные вещества можно получить любым путем, то есть их можно получить по методу, описанному в этом описании изобретения, или посредством химического синтеза; причем при осуществлении настоящего изобретения можно использовать как транс-, так и цисциклопентенон или их смесь. Оптически активное вещество циклопентенонов, полученных химическим синтезом, также входит в объем настоящего изобретения.

Примерами солей циклопентенона или его оптически активного вещества являются фармацевтически приемлемые соли, которые можно получить известными методами превращения.

Любое соединение по настоящему изобретению, вызывающее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, такое как циклопентенон, его оптически активное вещество или соль, обладает противовирусным действием, поэтому антивирусное средство можно получить, используя, по крайней мере, одно вышеуказанное соединение в качестве активного компонента.

То есть, соединение, вызывающее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, используют в качестве активного компонента в фармацевтическом препарате, который получают смешиванием с известными фармацевтическими носителями. По крайней мере, одно соединение, вызывающее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, например, такое как циклопентенон, или его оптически активное вещество, или его соль, смешивают с фармацевтически приемлемым жидким или твердым носителем и при необходимости с растворителем, диспергатором, эмульгатором, буфером, стабилизатором, наполнителем, связывающим веществом, дезинтегратором, смазывающим веществом и т.д., с получением антивирусного средства, которое может иметь твердую форму, такую как таблетки, гранулы, растворимые порошки, порошки, капсулы и т.д., или жидкую форму, такую как растворы, суспензии, эмульсии и т.д. Кроме того, указанное соединение может входить в состав сухого препарата, который перед применением превращают в жидкость путем добавления соответствующего носителя.

Фармацевтический носитель выбирают в зависимости от способа введения и формы препарата. В случае препаратов для перорального введения можно использовать крахмал, лактозу, сахар, маннит, карбоксиметилцеллюлозу, кукурузный крахмал, неорганические соли и т.д. При изготовлении препаратов для перорального введения в их состав могут входить связывающие вещества, дезинтеграторы, поверхностноактивные вещества, смазывающие вещества, усилители текучести, вкусовые добавки, красители, ароматизаторы и т.д.

С другой стороны, препараты для парентерального введения получают обычными методами, для чего, по крайней мере, одно соединение, вызывающее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, например, такое как циклопентенон, или его оптически активное вещество, или его соль, используемое в качестве активного компонента по настоящему изобретению, растворяют или суспендируют в разбавителе, таком как дистиллированная вода для инъекций, физиологический раствор, водный раствор глюкозы, растительное масло для инъекций, кунжутное масло, арахисовое масло, соевое масло, кукурузное масло, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.д., и при необходимости добавляют бактерициды, стабилизаторы, изотонические средства, анальгетики и т.д.

Антивирусное средство по настоящему изобретению вводят приемлемым способом в зависимости от формы препарата. Не существует каких-либо конкретных ограничений относительно способа введения, и полученный препарат можно использовать перорально, наружно и в виде инъекций. Препараты для инъекций вводят, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно и т.д., и препараты для наружного применения включают суппозитории и тому подобные.

Доза антивирусного средства конкретно не установлена, и может быть определена в зависимости от лекарственной формы, способа введения, назначения, возраста субъекта, массы тела, состояния здоровья и т.д. Однако количество, по крайней мере, одного соединения, вызывающего устойчивость к вирусу в клетках и избирательно уничтожающего вирусинфицированные клетки, например, такого как циклопентенон, его оптически активное вещество или соль, в лекарственном препарате для взрослого субъекта обычно составляет 0,1 мкг - 20 мг/кг в день. Доза лекарственного препарата может изменяться в зависимости от разных факторов, поэтому в одних случаях достаточна меньшая доза, а в других случаях необходима более высокая доза. Средство по настоящему изобретению можно вводить перорально в том виде, как оно есть, или добавлять ежедневно к обычным пищевым продуктам и/или напиткам. Кроме того, соединение, вызывающее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, например, такое как циклопентенон или его оптически активное вещество, или его соль, можно использовать в качестве вещества для получения антивирусного средства, антивирусного пищевого продукта или напитка.

Соединение, вызывающее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, например, такое как циклопентенон, или его оптически активное вещество, или его соль, обладает антивирусным действием против ДНК-вируса, РНКвируса, ретровируса и вироида.

Поэтому его можно использовать в качестве антивирусного средства для людей, антивирусного средства для животных помимо человека, подверженных вирусным заболеваниям (например, для домашних животных, домашней птицы и разводимых животных, таких как рыба и креветки), антивирусного средства для растений, в частности, для подверженных вирусным заболеваниям сельскохозяйственных и плодовых растений (например, цветов и овощей) и антивирусного средства для полезных живых существ.

Примерами ДНК-вируса, инфицирующего животных, являются покс-вирус, вирус герпеса, аденовирус, вирус гепатита В, вирус папилломы, вирус полиомы, вирус Эпштейна-Барра и бакуловирус; примером ДНК-вируса, инфицирующего растения, является вирус мозаики цветной капусты. Примерами РНК-вируса, инфицирующего животных, являются ротавирус, вирус краснухи, вирус японского энцефалита, вирус денге, вирус болезни Ньюкастла, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус чумы, вирус эпидемического гриппа, вирус везикулярного стоматита, вирус полиомиелита, вирус гепатита А и вирус гепатита С, и примерами РНК-вируса, инфицирующего растения, являются вирус мозаики табака, вирус карликовости пшеницы, вирус штриховатости риса и вирус кольцевой пятнистости табака. Примерами ретровируса являются вирус лейкоза Тклеток взрослых и вирус синдрома приобретенного иммунодефицита человека, и примером вироида является вироид клубней картофеля.

Циклопентенон, его оптически активное вещество или соль позволяют эффективно лечить и предупреждать вирусные заболевания у млекопитающих помимо человека и у птиц, таких как куры и индейки, а также у холоднокровных животных, таких как рыба. Кроме того, такое соединение обладает антивирусным действием против нижеследующих вирусов, не поражающих людей. Ими являются вирус герпеса 8с1гш6 типа 1, вирус герпеса Сауйб типа 1, вирус герпеса Ьадотогрй типа 1, вирус герпеса фазанов типа 1, вирус герпеса фазанов типа 2, вирус герпеса индеек типа 1, вирус герпеса Апайб типа 1, вирус герпеса сомов типа 1, вирус герпеса Ес.|шб типа 3, вирус герпеса крупного рогатого скота типа 1, вирус герпеса крупного рогатого скота типа 3, вирус герпеса крупного рогатого скота типа 4, вирус герпеса свиней типа 1, вирус герпеса свиней типа 2, вирус герпеса мышей типа 1, вирус герпеса СеЫб типа 1, вирус герпеса СеЬИ типа 2, вирус герпеса ТираШ типа 1, вирус герпеса собак типа 1, вирус герпеса кошачьих типа 1, вирус герпеса Ес.|ш<1 типа 1 и вирус герпеса Ес.|ш<1 типа 2.

Вирусные заболевания птиц, такие как болезнь Марека, можно предотвратить и/или вылечить с помощью соединения по настоящему изобретению в соответствии с методами, хорошо известными в ветеринарии или в области разведения животных. В частности, антивирусное средство по настоящему изобретению можно вводить птицам в виде инъекций или добавлять в корм или питьевую воду. Кроме того, если соединение по настоящему изобретению вводить непосредственно в водоем, цистерну, бак, а также в пресную или морскую воду и т. д. в месте разведения животных или смешивать его с кормом, можно аналогичным образом предотвратить и/или вылечить нижеследующие заболевания, а именно, вирусные заболевания рыбы, обитающей в ограниченном водоеме, таком как пруд, цистерна или бак, либо на территории размножения, зараженной вирусом герпеса, таким как вирус сомов, вирус герпеса 8010топе и вирус Иегка. Примерами таких болезней являются смертельное инфекционное заболевание кроветворных органов, инфекционные заболевания, вызываемые вирусом герпеса, или смертельное инфекционное заболевание поджелудочной железы рыб семейства лососевых, вирусная геморрогическая септицемия радужной форели, весенняя виремия карпов, лимфоцистит разных рыб, смертельное вирусное заболевание эритроцитов морской и проходной рыбы, бешенство камбалообразных и подобных рыб, смертельное вирусное заболевание поджелудочной железы и печени мальков желтохвоста и подобных рыб, язвенное заболевание торафугу (разновидность перчаточной рыбы) и т.д. Используемое количество соединения и антивирусного средства по настоящему изобретению зависит от серьезности заболевания животных, способа лечения и решения специалиста.

Антивирусное средство по настоящему изобретению не причиняет вреда животным, при этом у них значительно повышается выживаемость, скорость роста, интенсивность нереста и т.д.

Соединение, вызывающее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, например, такое как циклопентенон, его оптически активное вещество или соль по настоящему изобретению, ингибирует синтез белков и генома вируса, а также оказывает сильное антивирусное действие. Кроме того, оно избирательно уничтожает клетки, инфицированные этим вирусом.

Например, даже у субъектов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (далее используется аббревиатура ВИЧ), ВИЧинфицированы не все СЭ4-положительные клетки, а лишь их часть. Антивирусное средство по настоящему изобретению ингибирует образование ВИЧ в инфицированных клетках, избирательно уничтожает инфицированные клетки и вызывает резистентность к вирусу в неинфицированных клетках, что позволяет вывести ВИЧ из этих клеток.

Циклопентенон, его оптически активное вещество или его соль помимо вышеуказанного антивирусного действия обладают способностью улучшать функцию печени и индуцировать хитшоковые белки. Средство, улучшающее функцию печени, и средство, индуцирующее хитшоковый белок, которое содержит, по крайней мере, одно соединение, выбранное из циклопентенона, его оптически активного вещества или соли, можно ввести в фармацевтический препарат аналогично тому, как это было описано выше для антивирусного средства, и аналогичным образом использовать для лечения нуждающегося субъекта.

Доза указанного соединения в качестве средства для улучшения функции печени и индукции хитшокового белка, конкретно не установлена и может быть определена в зависимости от лекарственной формы, способа введения, назначения, а также возраста субъекта, массы тела, состояния и т.д. Однако количество, по крайней мере, одного соединения, выбираемого из циклопентенона, его оптически активного вещества или соли, в лекарственном препарате для взрослого обычно составляет 0,1 мкг - 20 мг/кг в день. Эта доза может изменяться в зависимости от разных факторов, поэтому в одних случаях достаточна меньшая доза, а в других случаях необходима более высокая доза. Средство по настоящему изобретению можно вводить перорально в том виде, как оно есть, или ежедневно добавлять к обычным пищевым продуктам и/или напиткам. Кроме того, по крайней мере, одно соединение, выбираемое из циклопентенона, его оптически активного вещества или соли, можно вводить в пищевые продукты или напитки для улучшения функции печени или индукции хитшокового белка.

При введении нуждающемуся субъекту циклопентенона, его оптически активного вещества или соли, улучшается функция печени и нормализуются показатели аспартатаминотрансферазы (СОТ) и аламинаминотрансферазы (СРТ).

Кроме того, циклопентенон, его оптически активное вещество или соль индуцируют хитшоковые белки, в частности, хитшоковый белок с молекулярной массой 70 кДа (Н8Р70), и тому подобные, и оказывают антивирусное действие на РНК-вирус и ДНК-вирус, такой как вирус гепатита, вирус СПИДа, вирус эпидемического гриппа, вирус везикулярного стоматита и вирус герпеса. Хитшоковый белок определяет иммунитет к раковым заболеваниям и обладает биозащитным действием. Вводя субъекту циклопентенон, его оптически активное вещество или соль, можно предотвратить и вылечить такое вирусное заболевание как эпидемический грипп.

Хитшоковый белок - это общее название белка, синтез которого индуцируется; когда клетка или субъект подвергаются внезапной температурной перемене, которая выше нормальной температуры примерно на 5-10°С. Этот белок широко распространен в прокариотах и высших эукариотах. Примерами известных хитшоковых белков являются Н8Р90, Н8Р70, убихитин и Н8Р26. Н8Р70 является разновидно стью молекулярного компаньона, при этом он связан с белком с незавершенной складчатостью или незаконченной укладкой и способствует образованию стереоструктуры. Аминокислотная последовательность хитшокового белка осталась консервативной в процессе эволюции, и Н8Р70 идентичен белку ИпаК ЕксйепсЫа сой. У человека имеется примерно десять генов Н8Р70; некоторые из них структурно экспрессированы, а другие индуцируются разными стимуляторами. Помимо теплового воздействия синтез хитшоковых белков индуцируется разными химическими веществами и лизисом клеток, например, в результате окисления.

Амичи и др. [С. Аш1С1 е1 а1., 1оигпа1 о! VIго1оду, т. 68, с. 6890-6899 (1994)] установили, что инкубация животных клеток, инфицированных вирусом Сендаи, в присутствии простагландина А₁, имеющего α,β-ненасыщенную карбонильную группу, индуцирует синтез Н8Р70 и Н8Р90. В процессе индукции синтеза Н8Р70 ингибируется синтез белка вируса. Кроме того,

А.Росси и др. [А.Ко551, ТНе 1оигпа1 о! Вю1ощса1 Сйеш151гу, т. 271, с. 32192-32196 (1996)] открыли, что 2-циклопентен-1-он аналогично простагландину А! индуцирует синтез Н8Р70 и ингибирует синтез белка вируса везикулярного стоматита.

Способность циклопентенона по настоящему изобретению индуцировать Н8Р70 проявляется при концентрации 10 мкМ и достигает максимального значения при концентрации 2030 мкМ, причем следует отметить, что циклопентенон обладает очень сильной индуцирующей способностью с учетом того, что для индукции Н8Р70 необходима концентрация 2циклопентен-1 -она, равная нескольким сотным мкМ. По способности индуцировать Н8Р70 данное соединение эквивалентно простагландину А₁, так как молекулярная масса циклопентенона не превышает одной трети молекулярной массы простагландина А₁, причем с учетом концентрации по массе циклопентенон обладает более сильной индуцирующей способностью, чем простагландин А1.

Поскольку циклопентенон, его оптически активное вещество или соль по настоящему изобретению обладают высокой способностью индуцировать хитшоковые белки, они оказывают антивирусное действие на ДНК-вирус, РНКвирус, ретровирус и вироид. Примерами таких вирусов и вироидов являются вышеуказанные вирусы и вироиды.

Кроме того, циклопентенон, его оптически активное вещество или соль подавляют рост раковых клеток, трансформируемых раковым геном, и предотвращают канцерогенез, вызываемый раковым геном.

Например, вирус папилломы является ДНК-вирусом, относящимся к семейству Рароуаушбае и роду РарШотауник, причем в отношении вируса папилломы человека (НР'У) известна ΚΓν типа 16, которая вызывает цервикальный рак.

Циклопентенон, его оптически активное вещество или соль проявляется активность ингибирования роста клеток, пораженных раковым геном Е7 типа №ν16. Таким образом, при использовании в качестве активного компонента, по крайней мере, одного соединения, выбранного из циклопентенона, его оптически активного вещества и его соли, можно получить средство, подавляющее рост раковых клеток, зараженных вирусом, тем самым предотвращая поражение клеток раковым геном.

Циклопентенон, его оптически активное вещество или соль ингибируют обе стадии канцерогенеза, воздействуя как на его инициатор, так и на промотор. Поэтому при использовании в качестве активного компонента, по крайней мере, одного соединения, выбранного из циклопентенона, его оптически активного вещества и соли, можно получить ингибитор химического канцерогенеза.

Кроме того, можно получить пищевые продукты или напитки для профилактики канцерогенеза, которые содержат, по крайней мере, одно соединение, выбранное из циклопентенона, его оптически активного вещества или его соли.

Средство для профилактики канцерогенеза, вызываемого онкогеном, или средство подавления химического канцерогенеза, содержащее, по крайней мере, одно соединение, выбранное из циклопентенона, его оптически активного вещества и его соли, можно ввести в лекарственный препарат и использовать для лечения нуждающегося субъекта аналогично антивирусному средству.

При изготовлении антивирусных пищевых продуктов или напитков по настоящему изобретению можно использовать соединение, индуцирующее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, в частности, циклопентенон или его оптически активное вещество, или его соль. Помимо этого можно использовать термообработанный продукт уроновой кислоты, содержащий циклопентенон, а также частично очищенный или очищенный циклопентенон, полученный из указанного термообработанного вещества.

Кроме того, при изготовлении пищевых продуктов или напитков, улучшающих функцию печени, индуцирующих хитшоковые белки, предотвращающих канцерогенез и т.д., можно использовать циклопентенон или его оптически активное вещество, или его соль, термообработанный продукт уроновой кислоты, содержащий циклопентенон, а также частично очищенный или очищенный циклопентенон, полученный из указанного термообработанного вещества.

Таким образом, пищевые продукты или напитки, изготовленные путем разведения и/или добавления циклопентенона, его оптически активного вещества или его соли, вещества, выбираемого из содержащего циклопентенон термообработанного продукта, частично очищенного циклопентенона и очищенного циклопентенона из термообработанного продукта, охватываются антивирусными пищевыми продуктами или напитками настоящего изобретения.

Не существует каких-либо конкретных ограничений относительно изготовления антивирусных пищевых продуктов или напитков по настоящему изобретению, поэтому можно использовать любые широко известные методы производства пищевых продуктов или напитков при условии, что полученные пищевые продукты или напитки содержат эффективное количество, по крайней мере, одного соединения, индуцирующего резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающего вирусинфицированные клетки, например, такого как циклопентенон, его оптически активное вещество или его соль.

Не существует каких-либо конкретных ограничений относительно формы антивирусных пищевых продуктов или напитков по настоящему изобретению при условии, что к ним добавляют и/или их разбавляют, по крайней мере, одним соединением, выбранным из соединений, индуцирующих резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающих вирусинфицированные клетки, например, таким как циклопентенон, его оптически активное вещество или соль. Таким образом, указанные продукты, предназначенные для перорального введения, могут иметь форму таблеток, гранул, капсул, геля и золя.

Не существует каких-либо конкретных ограничений относительно формы пищевых продуктов или напитков, улучшающих функцию печени, индуцирующих хитшоковые белки, предотвращающих канцерогенез, если они содержат, их разбавляют и/или к ним добавляют, по крайней мере, одно соединение, выбранное из циклопентенона, его оптически активного вещества или его соли, которое улучшает функцию печени, индуцирует хитшоковые белки и предотвращает канцерогенез. Таким образом, указанные продукты, предназначенные для перорального введения, могут иметь форму таблеток, гранул, капсул, геля и золя.

Пищевые продукты или напитки по настоящему изобретению, содержащие циклопентенон, его оптически активное вещество или соль, благодаря тому, что указанное соединение оказывает антивирусное действие, улучшает функцию печени, индуцирует хитшоковые белки, предотвращает канцерогенез и т.д., являются целебными пищевыми продуктами или напитками, предназначенными для профилактики и лечения вирусных заболеваний, улучшения функции печени, предотвращения канцерогенеза и т.д.; кроме того, эти пищевые продукты или напитки позволяют эффективно поддерживать гомеостаз живого организма.

Соединение по настоящему изобретению является нетоксичным при введении дозы, достаточной для достижения указанных физиологических действий. Не было зарегистрировано смертельных случаев среди крыс при пероральном введении циклопентенона, его оптически активного вещества или соли в виде однократной дозы, равной 100 мг/кг.

В заключение следует отметить, что фармацевтическое средство по настоящему изобретению можно использовать для лечения и профилактики вирусных заболеваний, заболеваний печени, рака и т.д., при этом оно является особенно полезным для лечения СПИДа, вызываемого ВИЧ, и для улучшения состояния субъекта, страдающего указанным синдромом.

Примеры

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые не ограничивают его объем. Проценты (%), используемые в примерах, являются вес.%.

Справочный пример 1.

Ό-глюкуроновую кислоту (С 5269; фирма 81дта) (10 г) растворяют в 1 л воды, нагревают при температуре 121°С в течение 4 ч и концентрируют в вакууме примерно до 10 мл. Полученное вещество смешивают с 40 мл верхнего слоя смеси бутилацетата, уксусной кислоты и воды (3:2:2), центрифугируют и полученный жидкий супернатант концентрируют в вакууме примерно до 10 мл.

Полученный выше экстракт вводят в колонку с силикагелем (В\У-3008Р; 2х28см; фирма Еир 811ус1а) для хроматографии на колонке и разделяют с помощью верхнего слоя смеси бутилацетата, уксусной кислоты и воды (3:2:2), используемой в качестве элюента, при скорости растекания около 5 мл/мин под давлением 0,2 кг/см², создаваемым компрессором. Полученный продукт фракционируют с получением фракций объемом 10 мл, и часть каждой фрак ции анализируют посредством тонкослойной хроматографии, результаты которой показывают, что циклопентенон с высокой степенью чистоты находится во фракциях с 61-й по 80-ю. Эти фракции собирают, концентрируют в вакууме, экстрагируют 40 мл хлороформа и экстракт концентрируют в вакууме с получением 100 мг циклопентенона.

Эту фракцию отделяют посредством жидкостной хроматографии высокого давления с нормальной фазой на колонке Ра1раск типа 8 (фирма Такага 81ιιιζο). Результаты ультрафиолетового поглощения при длине волны 215 нм показывают, что чистота продукта равна 98%.

Полученный выше циклопентенон (113,9 мг) растворяют в 2,85 мл этанола. К раствору в этаноле добавляют 3,85 мл смеси гексана и этанола (94/6) с получением раствора циклопентенона (17 мг/мл). Этот раствор фильтруют через фильтр 0,5 мкм, что дает образец раствора для выполнения жидкостной хроматографии высокого давления с оптическим разделением.

Этот раствор анализируют посредством жидкостной хроматографии высокого давления с оптическим разделением, все фракции (-)циклопентенона в раннем пике и (+)циклопентенона в позднем пике собирают и упаривают до сухого состояния в вакууме, что дает 43,2 мг (-)-циклопентенона и 43,0 мг (+)циклопентенона.

Условия выполнения жидкостной хроматографии высокого давления с оптическим разделением.

Колонки: СЫга1 Раск А8 (фирма Эа1сс1) 2,0х25,0 см.

Температура колонки 40°С.

Подвижная фаза: смесь гексана и этанола (94/6).

Скорость растекания 14,0 мл/мин.

Обнаружение: ультрафиолетовое поглощение при длине волны 210 нм.

Количество введенного образца: 150 мкл (2,55 мг).

Полученные (-)-циклопентенон и (+)циклопентенон содержат около 1% энантиомера, поэтому их снова подвергают оптическому разделению в вышеуказанных условиях. В результате этого из 30,0 мг (-)-циклопентенона раннего пика получают 19,7 мг (-)-циклопентенона без энантиомера и из 37,4 мг (+)-циклопентенона позднего пика получают 27,7 мг (+)-циклопентенона без энантиомера. Время элюирования (-)-циклопентенона и (+)циклопентанона при осуществлении жидкостной хроматографии высокого давления с оптическим разделением составляет соответственно 33 и 40 мин.

Пример 1.

(1) Среду ЯРМ1 1640 (5 мл), содержащую 10% сыворотки плода коровы и клетки НЬ-60 промиелоцитного лейкоза (АТСС ССЬ-240) в количестве 2х10⁵ клеток/мл, помещают во все лунки шестилуночного планшета, инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч в присут ствии 5% СО2, после чего добавляют циклопентенон, описанный в справочном примере 1, до конечной концентрации, равной 0, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 мкМ, и продолжают инкубацию в течение еще 8 ч.

После окончания инкубации подсчитывают количество клеток, затем отделяют клетки центрифугированием и промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8), что дает обработанные циклопентеноном клетки. Одновременно с этим другие клетки нагревают при температуре 45°С в течение 10 мин и инкубируют в соответствии с описанным выше способом.

Обработанные таким образом клетки анализируют посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8П8-РАОЕ) по методу, описанному в Мо1еси1аг С1оп1пд [Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, (1989)]. Обработанные клетки суспендируют в испытательном буфере для 8Э8-РА6Е до концентрации 2,5х10⁶ клеток/мл и полученную суспензию клеток обрабатывают при температуре 100°С в течение 10 мин, затем 5 мкл суспензии наносят на две пластины геля для 8Э8-РАОЕ (5% концентрирующего геля; 10% разделяющего геля) и анализируют посредством электрофореза. Один гель окрашивают кумассии, а другой гель блоттируют на поливинилидендифторидной блоттинг-мембране (1штоЬйоп™, фирма М1Шроге, номер по каталогу 1РУНООО-10). Эту мембрану блокируют при температуре 4°С в течение одной ночи при помощи В1оск Асе (фирма Эайпрроп РйагтасеиИса1; номер по каталогу ИК-В25).

Блокированную мембрану подвергают взаимодействию с моноклональным антителом Н8Р 72/73 (АЬ-1) (фирма Опсодепе Иекеагсй Ргобиск, номер по каталогу Н8Р01), которое специфически взаимодействует с индуцируемым в результате нагревания хитшоковым белком с молекулярной массой 70 кДа, и промывают ТВ8, содержащим 0,05% твина 20, после чего снова промывают ТВ8. Затем ее подвергают взаимодействию с вторичным антителом, связанным с пероксидазой, а именно иммуноглобулином [1дО (Н+Ь)] НЯР-кролик анти-мышь (фирма 2утеб ЬаЬога1ог1ек, номер по каталогу 61-6520), и промывают аналогично вышеописанной операции. Мембраны, обработанные первичным и вторичным антителом, подвергают взаимодействию с Иепаккапсе™ (хемолюминесцентный реагент фирмы Энроп1 ΝΕΝ, номер по каталогу ΝΕΕ-100) и фотосенсибилизируют рентгеновской пленкой для подтверждения индукции хитшокового белка с молекулярной массой 70 кДа.

Полученные результаты показывают, что при добавлении циклопентенона (20-30 мкМ) происходит практически такая же индукция хитшокового белка с молекулярной массой 70 кДа, что и при тепловой обработке при температуре

45°С в течение 10 мин. Значения интенсивности индукции приведены в табл. 1. Символ + в табл. 1 означает степень интенсивности индукции, и чем больше число +, тем выше интенсивность индукции. Символ - означает отсутствие индукции, и символ ± означает наличие незначительной индукции.

Таблица 1

Обработанные клетки	Индукция хитшоковых белков
Обработка при температуре 45°С в течение 10 мин	+++
0 мкМ циклопентенона	-
10 мкМ циклопентенона	+
20 мкМ циклопентенона	+++
30 мкМ циклопентенона	+++
40 мкМ циклопеитеиоиа	++
50 мкМ циклопеитеиоиа	+
100 мкМ цшсюнентенона	±

Аналогичные результаты получены при использовании (-)-циклопентенона и (+)циклопентенона.

Пример 2.

(1) Клетки НеЬа (АТСС ССЬ-2) инкубируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ; фирма Мззшзка), содержащей 10% сыворотки плода коровы, на 10 см шланшете при температуре 37°С в присутствии 5% газообразной двуокиси углерода до достижения 80% слияния, после чего добавляют циклопентенон до конечной концентрации, равной 0, 5, 10, 20 или 40 мкМ, и продолжают инкубировать в течение еще 6 ч в вышеуказанных условиях. Среду удаляют, во все лунки добавляют 1 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты и удаляют клетки скребком.

Полученные таким образом клетки анализируют посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и блоттируют по методу, описанному в примере 1, с целью обнаружения экспрессии хитшоковых белков с молекулярной массой 70 кДа.

Индукция хитшоковых белков с молекулярной массой 70 кДа обнаружена в срезах, к которым добавляли циклопентенон в количестве от 5 до 40 мкМ. Результаты приведены в табл. 2. Символ + в табл. 2 означает силу сигналов хитшоковых белков с молекулярной массой 70 кДа, обнаруженных в процессе блоттинга, и чем больше число +, тем сильнее сигналы. Символ ± означает, что сигнал является очень слабым.

Таблица 2

Обработанные клетки	Количество хитшоковых белков с молекулярной массой 70 кДа
0 мкМ циклопеитеиоиа	±
5 мкМ циклопеитеиоиа	+
10 мкМ циклопеитеиоиа	++
20 мкМ циклопеитеиоиа	+++
40 мкМ циклопеитеиоиа	+++

(2) Клетки НеЬа инкубируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 10% сыворотки плода коровы, на 10 см планшете при температуре 37°С в присутствии 5% газообразной двуокиси углерода до достижения 80% слияния, после чего добавляют циклопентенон до конечной концентрации, равной 0, 5, 10, 20 или 40 мкМ, и продолжают инкубацию в течение еще 6 ч в вышеуказанных условиях. Затем клетки промывают модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, содержащей 5% сыворотки плода коровы, и добавляют к клеткам модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержащую аденовирус А65 6ΙΧ [8аИо е1 а1.; 1оигпа1 о£ У1го1о§у, т. 54, с. 711-719 (1985)], в результате чего указанный аденовирус инфицирует клетки, и продолжают инкубацию в течение 20 ч. Множественность заражения доводят до 50. Среду сливают, в каждую лунку добавляют 1 мл 1 0%-ной трихлоруксусной кислоты и удаляют клетки скребком.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и блоттинг обработанных клеток осуществляют по методу, описанному в примере 1, с целью обнаружения экспрессии гексоновых белков аденовируса. В качестве первичного антитела используют антитело против аденовирусного генсона (АВ 1056; фирма СНеннсоп 1п1егпа1юпа1 1пс.).

В срезе, к которому добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, количество гексоновых белков значительно меньше по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон. В срезах, к которым добавляли 20 мкМ или меньше циклопентенона, рост клеток аналогичен этому показателю в срезе, к которому не добавляли циклопентенон.

(3) Вирусную ДНК экстрагируют по методу, описанному в Рго1осок £ог ЕхрептепЕ о£ Упиз (с. 24-25; изд-во МеФса1 У1ете), из клеток НеЬа, которые обрабатывают циклопентеноном, инфицируют аденовирусом и инкубируют так же, как в примере 2-(2).

Вирусинфицированные клетки промывают физиологическим раствором, забуференным фосфорной кислотой, суспендируют в 1 мл водного раствора 0,6% додецилсульфата натрия (8Ό8) и 10 мМ ΕΌΤΑ и добавляют 3,0 мл 5 М водного раствора хлорида натрия. Смесь оставляют при 0°С в течение 1 ч, центрифугируют, к полученному жидкому супернатанту добавляют 3 мл этанола и смешивают. Осадок, образовавшийся в результате центрифугирования, растворяют в 0,2 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС1 с рН 8,0 и 1 мМ ΕΌΤΑ), добавляют 2 мкл 10% додецилсульфата натрия и 4 мкл 10 мг/мл протеиназы К (фирма Такага 81шхо) и выдерживают смесь при температуре 37°С в течение 1ч. Полученный продукт дважды экстрагируют смесью фенола и хлороформа, которые используют в равных количествах, к водному слою добав ляют 20 мкл 3 М раствора ацетата натрия и 400 мкл этанола, смесь центрифугируют и осадок растворяют в 50 мкл ТЕ-буфера с получением раствора ДНК. Раствор ДНК (10 мкл) гидролизуют 10 единицами ЕсоТ221 (фирма Такага 81ш/о) и 1 мкл 10 мг/мл рибонуклеазы А и анализируют по методу электрофореза в агарозном геле с целью определения количества вирусной ДНК. Полученные результаты указывают на значительное уменьшение количества вирусной ДНК в срезах, к которым добавляли 5 мкМ или больше циклопентенона, по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон.

(4) Клетки НеЬа инкубируют так же, как в примере 2-(2), и добавляют к ним модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержащую 5% сыворотки плода коровы с аденовирусом типа 5 (Абепо1б 75; АТСС УК-5), без введения циклопентенона, в результате чего происходит заражение клеток. Множественность заражения доводят до 50. Затем к клеткам добавляют циклопентенон до конечной концентрации 0, 5, 10, 20 или 40 мкМ и инкубируют в течение 20 ч. После окончания инкубации выполняют анализ на наличие гексоновых белков аденовируса, по методу, описанному в примере 2-(2). Полученные результаты указывают на значительное уменьшение количества гексоновых белков в срезах, к которым добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон. Рост клеток в срезах, к которым добавляли 20 мкМ или больше циклопентенона, аналогичен этому показателю в срезах, к которым не добавляли циклопентенон.

(5) Клетки НеЬа инкубируют так же, как в примере 2-(2), и обрабатывают циклопентеноном. Затем клетки заражают аденовирусом типа 5 (Абепо1б 75; АТСС УК-5) в соответствии с процедурой, описанной в примере 2-(4), и инкубируют в среде, к которой добавляют циклопентенон. После окончания инкубации выполняют анализ на наличие гексонов, являющихся белками аденовируса, по методу, описанному в примере 2-(2). Полученные результаты указывают на значительное уменьшение количества гексонов в срезах, к которым добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон. Рост клеток в срезах, к которым добавляли 20 мкМ или меньше циклопентенона, аналогичен этому показателю в срезе, к которому не добавляли циклопентенон.

(6) Количество вирусной ДНК измеряют так же, как в примере 2-(3), используя клетки НеЬа, которые обрабатывают циклопентеноном, заражают аденовирусом типа 5 (Абепо1б 75; АТСС УК-5) и инкубируют так же, как в примере 2-(5). Полученные результаты указывают на значительное уменьшение количества вирусной ДНК в срезах, к которым добавляли 5 мкМ или больше циклопентенона, по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон.

Результаты, полученные в приведенных выше примерах 2-(2) ~ (6), показывают, что введение циклопентенона до, после или до и после заражения клеток вызывает антивирусное действие против аденовируса. Аналогичные результаты получены при использовании (-)циклопентенона и (+)-циклопентенона.

Пример 3.

(1) Вектор ВАС на основе рекомбинантного ретровируса, содержащий ген βгалактозидазы и устойчивый к неомицину ген в качестве генов-репортеров, как это описано в Ргосеебтдк о! Ле Иа1юпа1 Асабету о! 8с1епсе5 о! Ле и.8.А., т. 84, с. 156-160 (1987), расщепляют рестрикционным ферментом ВатН1, в результате чего происходит аутолигирование и образование ООЬ-плазмиды, из которой удален ген β-галактозидазы.

(2) Векторную ООЬ-плазмиду, описанную в примере 3-(1), переносят в Е.со11 НВ 101, инкубируют в среде, содержащей Ь-бульон, экстрагируют из собранных клеток и очищают посредством ультрацентрифугирования с градиентом плотности хлорида цезия.

Очищенную ООЬ-плазмиду (10 мкг) вводят в ретровирусупаковывающую клетку ψ СК1Р [РгосеебЛдк о! Ле Иа1юпа1 Асабету о! 8с1епсе5 о! Ле И.8.А., т. 85, с. 6460-6464 (1988)], используя катионную липосому (Тгапз 2Т ЬТ-1; фирма Такага 81шхо).

Клетки культивируют в течение двух недель при температуре 37°С в присутствии 5% СО₂ в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки и 0,4 мг/мл С418 (С1Ьсо), отбирают 20 колоний, которые клонируют и промульгируют на планшете диаметром 100 мм, среду заменяют в условиях полуслияния, жидкий супернатант удаляют через 24 ч и фильтруют через фильтр с порами 0,45 мкм (М11ех НУ; фирма М1Шроге) с получением жидкого супернатанта вируса. Одновременно клетки снимают трипсином и хранят в жидком азоте.

Титр жидкого супернатанта вируса, полученный из каждой колонии, определяют по методу, описанному в следующем примере 3-(3), и клон, в котором раствор вируса имеет самый высокий титр, используют в качестве продуцирующих клеток рекомбинантного ретровируса ψ СКГР/ЭОЬ. Титр жидкого супернатанта вируса, полученный из продуцирующих клеток во время анализа, равен 1х10⁶ колониеобразующим единицам (КОЕ)/мл. Продуцирующие клетки помещают в модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержащую 10% телячьей сыворотки и 0,2 мг/мл С418.

(3) Для измерения титра вируса используют клетки И1Н3Т3 (АТСС СКЬ-1658). Клетки

ΝΙΗ3Τ3 инкубируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки, переносят на шестилуночный планшет (ΙχνηΕί 61акк) в количестве 50000 клеток/лунку и на следующий день в течение 3 ч инфицируют 1 мл разведенного раствора вируса, содержащего 8 мкг/мл полибрена (81дта). Вирус разводят модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки. К инфицированным клеткам добавляют еще 2 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки, для разбавления полибрена. На следующий день вышеуказанную среду заменяют модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки и 0,4 мг/мл 6418. Колонии отбирают в течение двух недель, заменяя среду через каждые три-четыре дня, как это указывалось выше. Полученные колонии окрашивают обычным способом, используя для подсчета колоний окрашивающую жидкость 61етка (61Ьсо). Значение, полученное путем умножения количества колоний на степень разведения, определяют в КОЕ и используют в качестве титра вируса.

(4) Продуцирующие клетки рекомбинантного ретровируса ψ СВГР/ПОЬ, описанные в примере 3-(2), переносят на шестилуночный планшет, доводят до состояния полуслияния и заменяют среду 1,5 мл модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки и 0-20 мкМ циклопентенона. Через 24 ч удаляют жидкий супернатант. Титр вируса в полученном жидком супернатанте измеряют по методу, описанному в примере 2-(3), и исследуют влияние продуцирующих клеток рекомбинантного ретровируса на вирусообразование в результате добавления циклопентенона.

Титр раствора вируса, полученный из контрольного среза, к которому не добавляли циклопентенон, равен 9,5х10⁴ КОЕ/мл, в то время как титры растворов вируса в присутствии 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10 и 20 мкМ циклопентенона, равны соответственно 8,3х10⁴, 6,4х10⁴, 6,1х10⁴, 3,8х10⁴, 5,6х10⁴, 5,1х10⁴ и 4,1х10⁴ КОЕ/мл, из чего следует, что титр растворов вируса, полученный из продуцирующих клеток, уменьшается при добавлении циклопентенона. Таким образом, совершенно очевидно, что циклопентенон подавляет вирусообразование продуцирующих клеток рекомбинантного ретровируса.

(5) Контрольную плазмиду рсЭ2-У. экспрессирующую 6418-устойчивые гены [Мо1. Се11. ΒίοΙ., т. 7, с. 2745-2752 (1987)], и плазмиду рсЭ2-16Е7. экспрессирующую НРУ16 типа Е7 и 6418-устойчивые гены |1ρη. 1. Сапсег Век., т. 82, с. 1340-1343 (1981)], вводят в Ε-соП ΗΒ 101, инкубируют в среде, содержащий Б-бульон, экстрагируют из собранных клеток и очищают ультрцентрифугированием с градиентом плот ности хлорида цезия, что дает векторную плазмиду для введения генов.

Клетки ΝΙΗ3Τ3 инкубируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки, при температуре 37°С в присутствии 5% СО₂.

Очищенную плазмиду (10 мкг) вводят в клетки ΝΙΗ3Τ3, используя катионную липосому (1гапкГТ БТ-1; фирма Такага δίκιζο), клетки культивируют в течение двух недель в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки и 0,4 мг/мл 6418 (61Ьсо) , в присутствии 5% СО₂, полученные колонии клонируют, культивируют на культуральном планшете диаметром 100 мм и хранят в жидком азоте.

В результате этого получено по девять штаммов клеток ΝΙΗ3Τ3, в которые были введены контрольные векторы, и клеток ΝΙΗ3Τ3, онкогенно трансформированных НРУ 16 типа Е7.

Клеточные штаммы, в которые введены контрольные

ΝΙΗ3Τ3/Υ-1,

ΝΙΗ3Τ3/Υ-4, векторы, получили названия

ΝΙΗ3Τ3/Υ-2, ΝΙΗ3Τ3/Υ-3,

ΝΙΗ3Τ3/Υ-5, ΝΙΗ3Τ3/Υ-6,

ΝΙΗ3Τ3/Υ-7, ΝΓΗ3Τ3/Υ-8 и ΝΙΗ3Τ3/Υ-9.

Клеточные штаммы, в которые введен вектор Е7, получили названия ΝΙΗ3Τ3/Ε7-1, ΝΙΗ3Τ3/Ε7-2, ΝΙΗ3Τ3/Ε7-3, ΝΙΗ3Τ3/Ε7-4, ΝΙΗ3Τ3/Ε7-5, ΝΙΗ3Τ3/Ε7-6, ΝΙΗ3Τ3/Ε7-7, ΝΙΗ3Τ3/Ε7-8 и ΝΙΗ3Τ3/Ε7-9.

(6) Клетки ΝΙΗ3Τ3, клеточные штаммы, в которые введены контрольные векторы, и клеточные штаммы, в которые введен вектор Е7, культивируют до 50-70% слияния на 100 мм культуральном планшете, используя модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержащую 10% телячьей сыворотки, и промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором, после чего клетки удаляют раствором 0,25% трипсина и ΕΌΤΆ и суспендируют в 5 мл модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки.

Часть суспензии удаляют и подсчитывают в ней плотность клеток при помощи счетчика форменных элементов крови Ньюбауэра. С учетом полученных данных суспензию разводят модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, содержащей 10% телячьей сыворотки, высевают на культуральный планшет диаметром 60 мм в количестве 200 клеток/планшет, и начинают инкубацию в 3 мл среды. Через 24 ч после начала инкубации добавляют 5 мкМ циклопентенона. Еще через 24 ч среду заменяют свежей средой и добавляют 5 мкМ циклопентенона.

Затем среду заменяют и через каждые дватри дня добавляют 5 мкМ циклопентенона. Для контрольного эксперимента используют планшет с культурой клеток, к которой не добавляют циклопентенон, при этом среду меняют так же, как описывалось выше. Все культуры инкубируют в виде трех параллельных серий. Культуры инкубируют в течение девяти дней, фиксируют метанолом и окрашивают колонии раствором 61ет§а (61Ьсо).

Оценку производят с использованием клеточных штаммов ΝΙΗ3Τ3, ΝΙΗ3Τ3/Υ-1 и ΝΙΗ3Τ3/Ε7-2.

Результаты подсчета окрашенных колоний приведены в табл. 3. Клетки, в которые введен вектор Е7, характеризуются более высокой чувствительностью к циклопентенону по сравнению с контрольными клетками. Из этого следует, что циклопентенон избирательно воздействует на клетки, трансформированные онкогенами.

Таблица 3

Используе-мые клетки	Количество колоний (среднее значение + стандартное отклонение)
	Контрольные клетки	Клетки, обработанные циклопентеноном
ΝΙΗ3Τ3	91,7 ± 11,9	85,3 ± 4,0
ΝΙΗ3Τ3/Υ-1	83,3 ± 8,4	71,3 ± 2,3
ΝΙΗ3Τ3/Ε7-2	67,3 ± 3,2	22,3 ± 3,5

Такие же результаты получены при использовании других клеточных штаммов по примеру 3-(5). Кроме того, аналогичные результаты получены для (-)-циклопентенона и (+)циклопентенона.

Пример 4.

(1) К клеткам МОСК (предоставлены общественной лабораторией по проблемам гигиены, префектура г.Осака), которые инкубируют на 24-луночном планшете в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей 10% сыворотки плода коровы, в присутствии 5% газообразного диоксида углерода до образования монослоев, добавляют циклопентенон до конечной концентрации 0, 5, 10, 20 или 40 мкМ и инкубируют еще в течение 6 ч в вышеуказанных условиях.

Затем клетки промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8), инфицируют штаммом вируса эпидемического гриппа Л/РР/8/34 (предоставлен общественной лабораторией по проблемам гигиены, префектура г.Осака) и инкубируют при температуре 37°С в течение 30 мин. Множественность заражения доводят до 0,01. После инкубации клетки промывают РВ8 и инкубируют в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей 10 мкг/мл трипсина.

Жидкий супернатант инфицированных клеток собирают на 0, 1, 2 и 3 день и титр вируса определяют по методу РАР, производя подсчет в фокусе [1. С11П. МюгоЬю1., т. 28, с. 13081313 (1990)].

Полученные результаты показывают, что в срезах, к которым добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, титр вируса значительно меньше по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон. Ре зультаты приведены в табл. 4. Кроме того, клетки не были элиминированы; произошла их адгезия к срезам, к которым добавляли циклопентенон.

Таблица 4

Кол-во дней после зараж.	Концентрация циклопентенона, мкМ
0	5	10	20	40
	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл
0	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²
1	3,6х10⁵	4,0х10⁵	2,0х10⁵	2,2х10³	4,0х10²
2	1,0х10⁶	8,0х10⁵	7,2х10⁵	2,6х10⁵	1,9х10⁵
3	1,5х10⁵	9,6х10⁴	2,4х10⁵	3,8х10⁵	5,6х10⁵

(2) В соответствии с методом, описанным в примере 4-(1 ), вирус эпидемического гриппа добавляют к клеткам МОСК, которые инкубируют до образования монослоев без циклопентенона, после чего указанные клетки инфицируют указанным вирусом так же, как в примере 4-(1), и инкубируют в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей 10 мкг/мл трипсина, к которой добавляют циклопентенон до конечной концентрации 0, 5, 10, 20 или 40 мкМ. Затем определяют титр вируса так же, как в примере 4-(1 ). Полученные результаты показывают, что в срезах, к которым добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, титр вируса значительно меньше по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон. Результаты приведены в табл. 5. Кроме того, клетки не были элиминированы; произошла их адгезия к срезам, к которым добавляли циклопентенон.

Таблица 5

Кол-во дней после зараж.	Концентрация циклопентенона, мкМ
0	5	10	20	40
	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл
0	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²
1	4,2х10⁶	2,4х10⁵	1,9х10⁵	1,2х10⁵	<1,0х10²
2	1,6х10⁶	1,5х10⁶	3,4х10⁵	1,0х10⁶	<1,0х10²
3	4,8х10⁵	1,9х10⁵	1,7х10⁵	7,2х10⁵	<1,0х10²

(3) В соответствии с методом, описанным в примере 4-(1), клетки МОСК, которые инкубируют до образования монослоев, в течение 6 ч обрабатывают циклопентеноном с конечной концентрацией, равной 0, 20 или 40 мкМ, инфицируют вирусом эпидемического гриппа аналогично примеру 4-(1 ) и продолжают инкубировать в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей 10 мкг/мл трипсина, к которой добавляют циклопентенон в такой концентрации, что и до заражения. Затем определяют титр вируса так же, как в примере 4-(1 ). Полученные результаты показывают, что в срезах, к которым добавляли 20 мкМ или больше циклопентенона, титр вируса значительно меньше по сравнению с контрольными клетками, к которым не добавляли циклопентенон. Результаты приведены в табл. 6. Кроме того, клетки не были элиминированы; произошла их адгезия к срезам, к которым добавляли циклопентенон.

Таблица 6

Кол-во дней после зараж.	Концентрация циклопентенона, мкМ
0	20	40
	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл
0	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²
1	4,6х10⁵	9,8х10⁴	<1,0х10²
2	6,6х10⁵	1,6х10⁵	<1,0х10²
3	1,0х10⁵	1,3х10⁵	<1,0х10²

Таблица 9

Кол-во дней после зараж.	Концентрация циклопентенона, мкМ
0	5	10	20	40
	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл
0	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²
1	6,0х10³	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²
2	6,2х10⁵	4,4х10⁵	4,8х10⁵	3,2х10⁴	<1,0х10²
3	3,6х10⁴	5,6х10⁴	2,8х10⁴	2,8х10⁴	<1,0х10²

(4) Выполняют эксперимент, описанный в примере 4-(1), в котором множественность заражения доводят до 0,001. Полученные результаты показывают, что в срезах, к которым добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, титр вируса значительно меньше по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон. Результаты приведены в табл. 7. Кроме того, клетки не были элиминированы; произошла их адгезия к срезам, к которым добавляли циклопентенон.

Таблица 7

Кол-во дней после зараж.	Концентрация циклопентенона, мкМ
0	5	10	20	40
	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл
0	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²
1	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	1,0х10²
2	3,6х10⁵	5,2х10⁵	6,5х10⁵	5,0х10⁵	4,4х10³
3	3,8х10⁴	4,0х10⁴	8,6х10⁴	1,1х10⁵	8,0х10³

(5) Выполняют эксперимент, описанный в примере 4-(2), в котором множественность заражения доводят до 0,001. Полученные результаты показывают, что в срезах, к которым добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, титр вируса значительно меньше по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон. Результаты приведены в табл. 8. Кроме того, клетки не были элиминированы; произошла их адгезия к срезам, к которым добавляли циклопентенон.

Таблица 8

Кол-во дней после заражения	Концентрация циклопентенона, мкМ
0	5	10	20	40
	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл
0	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²
1	6,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²	<1,0х10²
2	3,6х10⁵	8,8х10⁴	2,0х10⁵	1,8х10⁴	<1,0х10²
3	3,8х10⁴	2,6х10⁴	1,8х10⁴	1,2х10⁴	<1,0х10²

(6) Выполняют эксперимент, описанный в примере 4-(3), в котором множественность заражения доводят до 0,001. Полученные результаты показывают, что в срезах, к которым добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, титр вируса значительно меньше по сравнению с контрольными срезами, к которым не добавляли циклопентенон. Результаты приведены в табл. 9. Кроме того, клетки не были элиминированы; произошла их адгезия к срезам, к которым добавляли циклопентенон.

На основании результатов, полученных в приведенных выше примерах 4-(1) ~ (6), можно сделать вывод о том, что циклопентенон оказывает антивирусное действие против вируса гриппа. Кроме того, аналогичные результаты получены для (-)-циклопентенона и (+)циклопентенона.

Пример 5.

(1) Воздействие циклопентенона на Тклетки человека.

Циклопентенон (0,5-5,0 мкМ) добавляют к клеткам СЕМ-88 (ДТСС ССЬ-119) или к клеткам Н9 (АТСС НВТ-176) в количестве 2х10⁵клеток/мл, инкубируют в течение трех дней, после чего подсчитывают количество живых и мертвых клеток и на основании полученных данных высчитывают степень выживаемости клеток.

Результаты, полученные для клеток обоих типов, показывают, что при добавлении циклопентенона степень выживаемости клеток существенно не снижается. Результаты исследования представлены на фиг. 1 и 2, где изображены графики зависимости между концентрацией добавляемого циклопентенона и степенью выживаемости клеток. На оси абсцисс указаны значения концентрации (мкМ) добавляемого циклопентенона, а на оси ординат указаны значения выживаемости (%) клеток после инкубации в течение трех дней. На фиг. 1 приведены результаты, полученные при использовании клеток СЕМ-88, и на фиг. 2 приведены результаты, полученные при использовании клеток Н9.

(2) Воздействие циклопентенона на ВИЧинфицированные Т-клетки.

Циклопентенон (1-5 мкМ) добавляют к клеткам СЕМ-88, инфицированным ВИЧ-1_111В(сокращенное название СЕМ-3Н) , или к клеткам Н9, инфицированным ВИЧ-1_ШВ (сокращенное название Н9-3В), и инкубируют клетки в течение трех дней. 90% или более процентов клеток обоих типов инфицированы ВИЧ-1_ШВ. Затем подсчитывают количество живых и мертвых клеток и на основании полученных данных высчитывают степень выживаемости клеток.

Полученные результаты показывают, что степень выживаемости клеток обоих типов значительно снижается при добавлении 3 мкМ циклопентенона и при добавлении 5 мкМ циклопентенона происходит дальнейшее снижение степени выживания клеток. Таким образом, сравнение с примером 5-(1) показывает, что циклопентенон обладает активностью против ВИЧ. Результаты исследования представлены на фиг. 3 и 4, где изображены графики зависимости между концентрацией добавляемого циклопентенона и степенью выживания клеток. На оси абсцисс указаны значения концентрации (мкМ) добавляемого циклопентенона, а на оси ординат указаны значения степени выживания (%) клеток после инкубации в течение трех дней. На фиг. 3 приведены результаты, полученные при использовании клеток СЕМ-3В, и на фиг. 4 приведены результаты, полученные при использовании клеток Н9-3В.

Пример 6.

В жидком супернатанте культуры, которую предварительно инкубируют в течение трех дней аналогично примеру 5-(2), измеряют концентрацию антигена р24. Полученные результаты показывают, что концентрация антигена р24 уменьшается в зависимости от количества добавляемого циклопентенона, что свидетельствует о действии против ВИЧ. Результаты приведены в табл. 10, где величины, указанные в скобках, означают отношение каждого жидкого супернатанта клеточных культур (без циклопентенона) к концентрации антигена р24, выраженной в %.

Таблица 10

Концентрация циклопентенона, мкМ	Концентрация (нг/мл) антигена р24 в жидком супернатанте клеточных культур
	СЕМ-3В	Н9-3В
0	280 (100%)	210 (100%)
1	232 (83%)	203 (97%)
3	176 (63%)	157 (75%)
5	175 (63%)	148 (70%)

Пример 7.

Клетки Уего (АТСС ССЬ-81) суспендируют в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей 10% сыворотки плода коровы, до достижения концентрации клеток, равной 5х10⁴ клеток/100 мкл, затем суспензию помещают на 96-луночный титрационный микропланшет, выливая в каждую лунку 100 мкл клеточной суспензии, и инкубируют в течение ночи при температуре 37°С в присутствии 5% газообразного диоксида углерода, что дает клетки Уего в виде монослоев.

К клеткам добавляют минимальную поддерживающую среду Игла, содержащую циклопентенон с конечной концентрацией 0, 5, 10, 20 или 40 мкМ, и инкубируют при температуре 37°С в течение 7 ч в присутствии 5% газообразной двуокиси углерода.

После окончания инкубации среду удаляют, дважды промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8) и инокулируют вирус японского энцефалита (штамм 1ЕУ 1аОАг-363-70) в количестве 4,9х10²ПОЕ/мл. Клетки инкубируют при температуре 37°С в течение 30 ч в присутствии 5% газообразной двуокиси углерода, фиксируют этанолом и производят подсчет в фокусе по методу РАР [Атсй. У1го1., т. 86, с. 129-135 (1985)].

Полученные результаты показывают, что в срезах, к которым добавляли 40 мкМ циклопентенона, количество вирусов в фокусе значительно меньше по сравнению с контрольным срезом, к которому не добавляли циклопентенон. Результаты приведены в табл. 11. Клетки не были элиминированы, произошла их адгезия к срезам, к которым добавляли циклопентенон.

Таблица 11

Концентрация циклопентенона, мкМ	ПОЕ/мл
0	3,0х10⁷
10	1,6х10⁷
20	2,1х10⁷
40	4,9х10⁶

(2) Клетки Уего, которые инкубируют на 24-луночном титрационном микропланшете в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей 10% сыворотки плода коровы, в присутствии 5% газообразного диоксида углерода при температуре 37°С до образования монослоев, промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором, инфицируют вирусом японского энцефалита (штамм 1ЕУ 1аОАг-363-70) в количестве 4,9х10² ПОЕ/мл и инкубируют при температуре 37°С в течение 90 мин.

После окончания инкубации клетки промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором и инкубируют в минимальной подерживающей среде, к которой добавляют циклопентенон до конечной концентрации, равной 0, 5, 10, 20 и 40 мкМ.

Жидкий супернатант инфицированных клеток собирают через 0, 1, 2 и 3 дня и определяют титр вируса путем подсчета в фокусе по методу РАР [1. С1т. МюгоЬю1., т. 28, с. 13081313 (1990)].

Полученные результаты показывают, что в срезах, к которым добавляли 10 мкМ или больше циклопентенона, количество вирусов в фокусе значительно меньше по сравнению с контрольным срезом, к которому не добавляли циклопентенон. Результаты приведены в табл. 12. Клетки не были элиминированы; произошла их адгезия к срезам, к которым добавляли циклопентенон.

Таблица 12

Концентрация	Кол-во дней после инокуляции вируса
циклопентенона,
мкМ	1	2	3
	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл	ПОЕ/мл
0	6,0х10³	5,6х10⁶	1,1х10⁷
10	6,0х10³	2,4х10⁶	4,4х10⁶
20	6,4х10³	1,9х10⁶	3,0х10⁶
40	0	0	0

На основании результатов, полученных в примере 7-(1) и (2), можно сделать вывод о том, что циклопентенон обладает антивирусным действием против вируса японского энцефалита. Вирус японского энцефалита относится к тому же виду, что и вирус гепатита С, и с учетом условий исследования, которые не предполагают инкубацию ίη νίίτο вируса гепатита С, вирус японского энцефалита использован в качестве модели вируса гепатита С. Из этого следует, что циклопентенон является эффективным лекарственным средством для лечения гепатита С.

Аналогичные результаты получены для (-)циклопентенона и (+)-циклопентенона.

Пример 8.

Пять лет назад женщине был поставлен диагноз гепатит С. Ей было назначено лечение интерфероном, но это не привело к улучшению функции печени, при этом содержание аспартатаминотрансферазы (СОТ) и аламинаминотрансферазы (СРТ) было повышено примерно до 150. В связи с этим Минофаген Стронг был выписан напиток по примеру 13 (содержащий 2 мг циклопентенона), который она принимала по 50 мл в течение двух месяцев, в результате чего уровни СОТ и СРТ снизились до 80. Пациентка продолжала принимать указанный напиток еще один месяц, при этом уровни СОТ и СРТ достигли 30, и было отмечено значительное улучшение функции печени.

Пример 9.

На спине мышей линии 1С.'Р (приобретены в фирме Νίρροη 8ЬС; в возрасте семи недель; самки) сбривали шерсть и в качестве инициатора наносили на это место раствор диметилбензантрацена (ΌΜΒΑ) в ацетоне в количестве 50 мкг/мышь. Через одну неделю на участок кожи, обработанный инициатором, дважды в неделю до окончания испытания наносили раствор 12-отетрасеканоилфорбол-13-ацетата (ТРА) в ацетоне в количестве 1 мкг/мышь, который использовали в качестве промотора. За один час до каждой обработки ТРА на указанные участки кожи наносили 80% раствор циклопентенона в этаноле или 80% этанол (контрольная группа) и в течение 20 недель исследовали антиканцерогенное действие испытуемого соединения на двухстадийный канцерогенез кожи.

В контрольной группе (группа, получавшая только носитель) в течение 15 недель был обнаружен канцерогенез у 100% животных (12 мышей из 12). В подопытной группе циклопентенон эффективно подавлял развитие канцерогенеза, и у мышей, получавших 2,5 мг указанного соединения, по истечение 15 недель канцерогенез был обнаружен у 8,3% мышей (1 мышь из 12) и через 19 недель - у 25% мышей (3 мыши из 12). Результаты антиканцерогенного действия циклопентенона представлены на фиг. 5. На оси ординат указаны значения поражения канцерогенезом, а на оси абсцисс указано время (недели). На этом графике контурные треугольники, закрашенные треугольники и контурные кружки служат для обозначения соответственно группы подопытных животных, в которой каждая мышь получала 2,5 мг циклопентенона (всего 12 мышей), и группы, в которой каждая мышь полу чала 0,8 мг циклопентенона (всего 11 мышей), и контрольной группы (всего 12 мышей).

Циклопентенон испытывали на противовоспалительное действие, вызываемое ТРА в ушных раковинах мышей. Установлено, что циклопентенон не оказывает противовоспалительного действия при введении 2,5 мг (на мышь) в ушную раковину мыши.

Из вышеизложенного следует, что циклопентенон оказывает антипромоторное действие в случае двухстадийного химического канцерогенеза. Аналогичные результаты получены при использовании термообработанного продукта глюкуроновой кислоты, содержащего циклопентенон, в частности (-)-циклопентенон и (+)циклопентенон.

Пример 10.

Препараты для инъекций.

(1) Циклопентенон добавляют к физиологическому раствору (фармакопея Японии) в количестве 1% с получением препарата для инъекций.

(2) (-)-Циклопентенон и глицирризиновую кислоту добавляют к физиологическому раствору (аналогичному вышеуказанному) в количестве соответственно 0,5% и 0,1% с получением препарата для инъекций.

Пример 11.

Таблетки.

(1) Таблетку, содержащую 10 мг циклопентенона и соответствующее количество микрокристаллической целлюлозы, покрывают сахаром с получением препарата в виде таблетки.

(2) Таблетку, содержащую 0,1 мг (+)циклопентенона, 10 мг вторичного кислого глицирризината калия и соответствующее количество микрокристаллической целлюлозы, покрывают сахаром с получением препарата в виде таблетки.

Пример 12.

Мазь.

Циклопентенон 1 г, абсорбирующая мазь (фармакопея Японии) 99 г.

Циклопентенон смешивают с небольшим количеством абсорбирующей мази, после чего постепенно добавляют остальную часть абсорбирующей мази, продолжая перемешивать до однородного состояния с получением препарата в виде мази.

Эту мазь наносят на пораженный участок четыре-пять раз в день.

Пример 13.

(1) К 100 л водопроводной воды добавляют пектин (Ротомп РесОп ЬМ-13СС; фирма Негси1с5) (5 кг) . Полученную смесь нагревают от температуры жидкости, равной 28°С, до 120°С, пропуская через нее пар в течение 35 мин, перемешивают при температуре 120°С в течение 5 ч и охлаждают с получением 135 л охлажденной смеси. К полученной смеси добавляют 1,35 кг целита № 545 (фирма Се1йе) и 1,35 кг диоксида кремния № 600-8 (фирма Ошо 8Шса) в качестве ускорителя фильтрования и фильтруют через плотный фильтр (16 слоев 15 см фильтровальной бумаги; АЭУАЫТЕС # 327), который предварительно покрывают 0,1 кг целита № 545 и 0,1 кг диоксида кремния № 600-8. Полученный фильтрат сразу же подвергают термообработке (при температуре 98°С в течение 60 с) при помощи пластинчатого нагревателя (фирма №с1иНа η 8е15акикЬо) с последующим охлаждением, что дает 150 л термообработанного раствора пектина, содержащего циклопентенон.

Указанный термообработанный раствор пектина, содержащий циклопентенон, имеет показатель рН около 3,5, кислотность 6,2 мл и содержание сахара 5,8% по Бриксу. Показатель рН измеряют при помощи измерителя рН, кислотность выражена в виде количества (мл) 0,1 н. раствора №ОН, используемого для нейтрализации раствора до рН 7,0, и содержание сахара измеряют сахариметром Брикса.

(2) Напиток получают по следующей рецептуре, %:

Фруктоза-глюкоза-жидкий сахар5,00

Сахар4,00

Кислотный агент1,20

Ароматизаторы0,30

Вещество, содержащее циклопентенон0,5

Чистая вода До 100

Всего 100,00

Термообработанный раствор пектина, содержащий циклопентенон по примеру 13-(1), используют в качестве содержащего циклопентенон вещества и его количество высчитывают на твердой основе. Этот напиток (100 мл) содержит 4 мг циклопентенона.

Достоинство изобретения

Настоящее изобретение относится к антивирусному средству, которое содержит в качестве активного компонента соединение, индуцирующее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, такое как циклопентенон, его оптически активное вещество или его соль. Благодаря своему синергетическому действию антивирусное средство по настоящему изобретению избирательно уничтожает вирусинфицированные клетки и сообщает резистентность к вирусу нормальным клеткам, которые не инфицированы вирусом. Это антивирусное средство позволяет эффективно лечить такие вирусные заболевания как СПИД и гепатит С, и ослаблять характерные для них симптомы. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическому средству, содержащему циклопентенон, или его оптически активное вещество, или его соль, которое обладает разносторонним физиологическим действием, в частности, оно улучшает функцию печени, индуцирует хитшоковые белки, предотвращает вирусный канцерогенез и оказывает антипромоторное действие.

Указанное фармацевтическое средство является основой для получения лекарственного препарата, который поддерживает гомеостаз живого организма, в частности, сохраняет в здоровом состоянии желудок и кишечник.

Настоящее изобретение далее относится к антивирусным пищевым продуктам и напиткам, которые содержат в качестве активного компонента соединение, индуцирующее резистентность к вирусу в клетках и избирательно уничтожающее вирусинфицированные клетки, такое как циклопентенон, его оптически активное вещество или соль. Такие пищевые продукты и напитки полезны для ослабления симптомов разных вирусных заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение относится к пищевым продуктам и напиткам, содержащим циклопентенон или его оптически активное вещество, или его соль, которые оказывают полезное физиологическое действие, а именно, улучшают функцию печени, индуцируют хитшоковые белки, предотвращают вирусный канцерогенез и оказывают антипромоторное действие, причем указанные пищевые продукты и напитки являются полезными для поддержания гомеостаза живого организма, сохраняя в здоровом состоянии желудок и кишечник.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Антивирусное средство, которое содержит в качестве активного компонента, по крайней мере, одно соединение, выбранное из группы, включающей 4,5-дигидрокси-2-циклопентен-1-он формулы [I], его оптически активное вещество и соль соединения формулы [I]
2. Антивирусное средство по п.1, в котором антивирусным агентом является агент против вируса СПИД или агент против вируса гепатита типа С.
3. Антивирусное средство по п. 1 , которое является антивирусным средством для человека, антивирусным средством для животных или антивирусным средством для растений.
4. Антивирусное средство по п.3, которое является антивирусным средством для домашних животных, домашней птицы, рыбы или креветок.
5. Антивирусный пищевой продукт или напиток, который содержит в качестве активного компонента, по крайней мере, одно соединение, выбранное из группы, включающей 4,5дигидрокси-2-циклопентен-1-он формулы [1], его оптически активное вещество и соль соединения формулы [I]