KR20000076145A - 항바이러스제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜테인-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스제에 관한 것이다.
화학식 1

Description

항바이러스제{ANTIVIRAL AGENTS}
항바이러스 작용으로는, 세포로의 바이러스 감염의 저해, 감염 세포에서의 바이러스 증식의 저해 등의 바이러스 저항력을 유도하는 작용, 바이러스 감염된 세포를 선택적으로 사멸시키는 작용 및 바이러스 자체를 불활성화시키는(감염력을 제거하는) 작용을 고려할 수 있다.
바이러스 자체를 불활성화시키는 작용을 갖는 것으로서 바이러스에 대한 중화 항체가 있다. 또한, 이러한 항체를 유도하는 방법으로는 백신이 있다. 그러나, 백신 투여에 의한 항체 유도는, 바이러스 감염의 예방에는 효과적이지만, 현시점에서는 항체를 이용하는 효과적인 치료법은 별로 없다. 더욱이, 바이러스를 직접 불활성화시키는 약제에 의한 효과적인 치료법도 없다.
바이러스 저항력을 유도하는 작용으로는 바이러스 게놈의 복제 저해, 바이러스 유전자의 전사 저해, 바이러스 단백질의 합성 저해, 바이러스 단백질의 홀딩 저해 등을 생각할 수 있다. 이러한 작용을 유도하기 위해서는 세포 내의 전사 인자의 활성 또는 발현의 억제, 바이러스 유래의 전사 인자의 활성 또는 발현의 억제, 열 쇼크 단백질의 유도 등이 있다. 이러한 작용을 유도하는 것으로서 프로스타글란딘을 들 수 있다.
또한, 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 것으로는 항핼퍼 바이러스제로서 사용되고 있는 아시클로버, 간시클로버, 소리부딘 등이 있다.
본 발명은 항바이러스 작용에 의해 병원성 생물에 유용하게 사용되는 의약 및 음식품에 관한 것이다.
도 1은 CEM-SS 세포를 사용한 경우의 시클로펜텐온 농도와 세포 생존율의 관계를 나타내는 도면이고,
도 2는 H9 세포를 사용한 경우의 시클로펜텐온 농도와 세포 생존율의 관계를 나타내는 도면이며,
도 3은 CEM-3B 세포를 사용한 경우의 시클로펜텐온 농도와 세포 생존율의 관계를 나타내는 도면이고,
도 4는 H9-3B 세포를 사용한 경우의 시클로펜텐온 농도와 세포 생존율의 관계를 나타내는 도면이며,
도 5는 시클로펜텐온의 발암 억제 작용을 나타내는 도면이고,
도 6은 (-)체 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (-)체 시클로펜텐온의 입체 구조를 나타내는 도면이며,
도 7은 (+)체 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (+)체 시클로펜텐온의 입체 구조를 나타내는 도면이다.
발명의 실시 형태
본 발명에서 사용되는 화학식 1로 표시되는 시클로펜텐온은 4 번 위치와 5 번 위치의 히드록실기의 입체 배치가 시스 이성체와 트랜스 이성체인 것 모두를 포함한다. 본 발명에 있어서는 시스체 시클로펜텐온을 사용할 수 있고, 트랜스체 시클로펜텐온을 사용할 수도 있으며, 시스체 시클로펜텐온과 트랜스체 시클로펜텐온의 혼합물을 사용할 수도 있다. 또한, 이들의 광학 활성체를 사용할 수도 있다.
시스체 시클로펜텐온은 화학 합성법에 의해서 얻을 수 있다[Helvetica Chimica Acta, 제55권, 제2838∼2844페이지(1972)]. 트랜스체 시클로펜텐온은 화학 합성법에 의해서도 얻을 수 있고[Carbohydrate Res., 제247권, 제217∼222페이지(1993)], 또한 우론산, 예컨대 글루쿠론산, 우론산 유도체, 예컨대 글루쿠로노락톤, 또는 이들의 함유물 등을 가열 처리함으로써도 얻을 수 있다(PCT/JP97/03052호 명세서 참조). 본 발명에서는 시클로펜텐온을 함유하는 이들의 가열 처리물, 그 부분 정제물 및 정제물을 사용할 수 있다.
예컨대, 우론산으로서 D-글루쿠론산를 사용하여, 그 1% 용액을 121℃에서 4 시간 가열 처리함으로써 가열 처리물 중에 시클로펜텐온이 생성된다. 이 가열 처리물 중의 시클로펜텐온을 용매로 추출하여 추출물을 농축시킨다. 다음에 이 농축물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 용출되는 시클로펜테논 분획을 농축시키고, 농축물로부터 시클로펜텐온을 클로로포름으로 추출하여, 추출 농축물의 순상(順相) 컬럼 크로마토그래피를 행함으로써, 가열 처리물 중의 시클로펜텐온이 단리된다.
시클로펜텐온의 물성을 하기에 나타낸다. 또 시클로펜텐온의 질량 분석은 DX302 질량 분석계(니혼 덴시사 제품)를 사용하여 행하였다. 또한, 중클로로포름 용매를 사용한 NMR 스펙트럼의 측정은 JNM-A500(니혼 덴시사 제품)을 사용하였다. 비선광도는 DlP-370형 선광계(니혼 분코사 제품), UV 흡수 스펙트럼은 UV-2500 분광 광도계(시마즈 세이사쿠쇼 제품), 적외 흡수 스펙트럼(IR)은 FTIR- 8000 적외 분광 광도계(시마즈 세이사쿠쇼 제품)를 각각 사용하여 측정하였다.
MS m/z 115〔M+H〕+
1H-NMR(CDCl3)
δ4.20(1H, d, J=2. 4Hz, 5-H), 4.83(1H, m, 4-H), 6.30(1H, dd, J=1. 2,6. 1Hz, 2-H), 7.48(1H, dd, J=2. 1,6. 1Hz, 3-H)
단,1H-NMR의 화학 시프트 값은 CHC13의 화학 시프트 값을 7.26 ppm으로 하여 나타내었다.
선광도 :[α]D 200°(c 1.3, 물)
UV : λmax 215 nm(물)
IR(KBr법) : 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm-1에서 흡수를 나타낸다.
단리된 시클로펜텐온을 광학 분할함으로써, (-)-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 및 (+)-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온을 얻을 수 있다. 당연히, 합성 방법에 의해 생성된 시클로펜텐온도 광학 분할할 수 있다.
예컨대, 시클로펜텐온을 에탄올에 용해시킨다. 이 에탄올 용액에 헥산/에탄올(94/6)을 더 가하여 시클로펜텐온 용액을 조제한다. 이 시료 용액을, 예컨대 키랄 팩 AS(다이셀 가가쿠 고교 제품) 컬럼을 사용하여 컬럼 온도: 40℃, 이동상: 헥산/에탄올(94/6)로 HPLC를 행함으로써 시클로펜텐온을 광학 분할할 수 있다.
분할된 (-)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온[이하, (-)체 시클로펜텐온이라고 함]의 선광도는 [α]D 20-105°(c 0.30, 에탄올)이며, (+)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온[이하, (+)체 시클로펜텐온이라고 함]의 선광도는 [α]D 20+104°(c 0.53, 에탄올)이다. 또한 선광도는 상기한 DIP-370형 선광계(니혼 분코사 제조)를 사용하여 측정하였다.
다음에 (-)체 시클로펜텐온 및 (+)체 시클로펜텐온의 각각의 질량 분석, 핵 자기 공명법(NMR)에 의한 구조 해석, UV 흡수 스펙트럼의 측정, 적외 흡수 스펙트럼의 측정을 상기한 방법에 따라서 행한다. 그 결과, 양 광학 활성체는 광학 분할 전의 시클로펜텐온과 동일한 결과를 나타낸다.
광학 분할된 (-)체 시클로펜텐온 및 (+)체 시클로펜텐온을 각각 p-디메틸아미노벤조일 유도체로 하여, J-720형 원이색성 분산계(니혼 분코사 제품)를 사용하여 원이색성 스펙트럼(CD)을 측정하고, 그 결과를 디벤조에이트 키랄성 룰에 적용하여[J. Am. Chem Soc., 제91권, 제3989∼3991페이지(1969)] 그 입체 배치를 결정하였다.
(-)체 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (-)체 시클로펜텐온의 입체 구조를 도 6에 나타낸다. 도면 중, 종축은 몰 원이색성, 횡축은 파장(nm)을 나타낸다. 또, 상기 입체 구조를 화학식 2로서 하기에 나타낸다:
(+)체 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (+)체 시클로펜텐온의 입체 구조를 도 7에 나타낸다. 도면 중, 종축은 몰 원이색성, 횡축은 파장(nm)을 나타낸다. 또, 상기 입체 구조를 화학식 3으로 하기에 나타낸다.
도 6, 도 7 및 화학식 2, 화학식 3에 나타낸 바와 같이 (-)체 시클로펜텐온은 (-)-(4R,5S)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온, (+)체 시클로펜텐온은 (+)-(4S,5R)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온이다.
이상, 본 발명에 사용하는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체는 어떠한 방법으로도 제조할 수 있고, 명세서에서 개시한 방법으로 제조할 수도 있으며, 화학 합성 방법으로 합성할 수도 있고, 시클로펜텐온의 트랜스체, 시스체, 이들의 혼합물도 본 발명에 사용될 수 있다. 당연히, 화학 합성법으로 생성된 시클로펜텐온의 광학 활성체도 본 발명에 개시한 광학 활성체에 포함된다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체의 염으로는 의약적으로 허용되는 염이 있으며, 공지의 방법에 의해 변환시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 항바이러스 작용을 갖고, 이들의 화합물로부터 선택되는 하나의 화합물을 유효 성분으로 하여 항바이러스제를 제조할 수 있다.
즉, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물을 유효 성분으로 하여, 이것을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화하면 항바이러스제를 제조할 수 있다. 항바이러스제의 제조는 일반적으로는, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고형의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라서 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정화제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 윤활제 등을 첨가하여, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상의 용액, 현탁액, 에멀션 등의 액제로 할 수 있다. 또한, 이것을 사용 전에 적당한 담체를 첨가함으로써 액상이 될 수 있는 건조품으로 할 수 있다.
의약용 담체는 상기 투여 형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있으며, 경구제의 경우는, 예컨대 전분, 젖당, 백당, 만니톨, 카르복시메틸셀룰로스, 콘스타치, 무기염 등이 사용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 조미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.
한편, 비경구제의 경우는, 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효 성분인 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리 식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜, 필요에 따라서, 살균제, 안정화제, 등장화제, 무통화제 등을 첨가함으로써 조제된다.
본 발명의 항바이러스제는 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여된다. 투여 방법도 특별히 한정되지는 않고, 내용, 외용 및 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사제는 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있으며, 외용제에는 좌제 등도 포함된다.
항바이러스제로서의 투여량은, 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 의해서 적절히 설정되며, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 물질의 양은 성인 1 일당 0.1 ㎍∼20 mg/kg이다. 물론 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 그 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 본 발명의 약제는 그대로 경구 투여하는 것 외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다. 또한 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 항바이러스제, 항바이러스용 식품 또는 음료의 원료로서 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용하는, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은, DNA 바이러스, RNA 바이러스, 레트로바이러스, 및 비로이드에 대하여 항바이러스 활성을 나타낸다.
따라서, 사람용 항바이러스제, 비사람 동물용 항바이러스제, 예컨대 가축, 가금, 양식 동물, 예컨대 어류, 새우류 등의 바이러스병에 유효한 항바이러스제, 식물용 항바이러스제, 예컨대 화훼류, 야채류 등의 농원예 작물의 바이러스병에 유효한 항바이러스제 등, 유용 생물용 항바이러스제로서 사용할 수 있다.
동물에 감염되는 DNA 바이러스로는, 예컨대 폭스 바이러스, 핼퍼 바이러스, 아데노바이러스, B형 간염 바이러스, 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 바큘로바이러스를 들 수 있고, 식물에 감염되는 DNA 바이러스로서는 예컨대 칼리플라우어 모자이크 바이러스를 들 수 있다. 동물에 감염되는 RNA 바이러스로는, 예컨대 로타바이러스, 풍진 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅그열 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 디스템퍼 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 사람 폴리오바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스를 들 수 있고, 식물에 감염되는 RNA 바이러스로는, 예컨대 담배 모자이크 바이러스, 맥류 왜소 바이러스, 벼 줄무늬 잎마름 바이러스, 담배 윤점 바이러스를 들 수 있다. 레트로바이러스로는, 예컨대 성인 T 세포 백혈병 바이러스, 사람 후천성 면역 결핍 바이러스를 들 수 있고, 비로이드로는, 예컨대 감자 스핀들 튜버 비로이드를 들 수 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 비사람 포유 동물, 조류, 예컨대 닭 및 칠면조, 냉혈 동물, 예컨대 물고기의 바이러스병의 치료 및 예방에 유효하며, 이들의 화합물은 하기의 비사람 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타낸다. 사이루이드 헤르페스 바이러스 1형, 카블리드 헤르페스 1형, 라가모르프 헤르페스 바이러스 1형, 파시아니드 헤르페스 바이러스 1형, 파시아니드 헤르페스 바이러스 2형, 터키 헤르페스 바이러스 1형, 아나티드 헤르페스 바이러스 1형, 캣피쉬 헤르페스 바이러스 1형, 에퀴드 헤르페스 바이러스 3형, 보비드 헤르페스 바이러스 1형, 보비드 헤르페스 바이러스 3형, 보비드 헤르페스 바이러스 4형, 피그 헤르페스 바이러스 1형, 피그 헤르페스 바이러스 2형, 뮤리드 헤르페스 바이러스 1형, 세비드 헤르페스 바이러스 1형, 세비드 헤르페스 바이러스 2형, 투팔리드 헤르페스 바이러스 1형, 카닌 헤르페스 바이러스 1형, 펠린 헤르페스 바이러스 1형, 에퀴드 헤르페스 바이러스 1형, 에퀴드 헤르페스 바이러스 2형.
본 발명의 항바이러스제를 조류에 주사하거나 또는 사료 또는 음료수에 첨가하는 등의 수의술, 사육술에 있어서 주지의 방법에 의해서, 마렉씨병 등의 조류의 바이러스성 질환이 본 발명에 사용하는 화합물에 의해서 예방 및/또는 치료된다. 또한, 풀, 수조, 유지 탱크 또는 사육 영역의 물, 해수 등에 직접 본 발명에 사용하는 화합물을 첨가하거나, 또는 사료 중에 본 발명에 사용하는 화합물을 혼합하여, 헤르페스류 바이러스, 예컨대 펩티드 캣피쉬 바이러스, 헤르페스바이러스 솔로몬스, 네르카 바이러스 등의 바이러스 감염에 의한 풀, 수조, 보유 탱크 또는 사육 영역 중의 좁은 구역에 서식하는 물고기의 바이러스병, 예컨대 연어과 어류의 전염성 조혈기 괴사병, 헤르페스바이러스 감염증 또는 전염성 췌장 괴사병, 옥새 송어의 바이러스성 출혈성 패혈증, 잉어의 봄바이러스병, 여러 가지 물고기의 림프낭종, 해수어 및 담수어의 바이러스성 적혈구 괴사병, 넙치 등의 랍도바이러스병, 방어 치어 등의 바이러스성 췌간 괴사병, 자지복 등의 구백병(口白病) 등도 또한 예방 및/또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하는 화합물, 본 발명의 항바이러스제를 투여함에 있어서의 정확한 규제는 필연적으로 치료되고 있는 개개의 피검체에 관한 필요성, 치료의 종류 및 사육자의 판단 나름이다.
본 발명의 항바이러스제가 투여된 비사람 동물은 그 건강 유지에 따라서 생존율, 성장율, 산란율 등의 개선이 현저하다.
본 발명에서 사용하는, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 이들의 바이러스 단백질의 합성을 억제하고, 바이러스 게놈의 합성도 억제함으로써 강한 항바이러스 작용을 나타낸다. 또한 이들의 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시킨다.
예컨대, 사람의 후천성 면역 결핍 바이러스(이하 HIV라고 약기함) 감염 환자에 있어서도 모든 CD4 양성세포에 HIV가 감염되는 것은 아니고, 일부의 세포에만 감염된다. 본 발명의 항바이러스제는 이 감염 세포의 HIV 증식을 억제하면서 선택적으로 감염 세포를 사멸시키고, 미감염 세포에 바이러스 저항력을 유도하여 세포로부터의 HIV의 제거가 가능해진다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 상기 항바이러스 작용 외에도 간기능 개선 작용, 열 쇼크 단백질 유도 작용을 가지며, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 하는 간기능 개선제나 열 쇼크 단백질 유도제를 상기 항바이러스제에 따라서 제제화할 수 있고, 항바이러스제의 경우에 따른 방법으로 투여할 수 있다.
간기능 개선제나 열 쇼크 단백질 유도제로서의 투여량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라 적절히 설정되며, 일정하지는 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 양은 성인 1 일당 0.1 ㎍∼20 mg/kg이다. 물론 투여량은 여러 가지 조건에 의해서 변동되기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 그 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 본 발명의 약제는 그대로 경구 투여하는 것 외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다. 또한 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 간기능 개선용 음식품, 열 쇼크 단백질 유도용 음식품의 원료로서 사용할 수도 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 섭취함으로써 간기능 장해도 개선되어 GOT, GPT치가 정상화된다.
또한, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 70 kDa(HSP70) 등의 열 쇼크 단백질 유도 활성을 가지며, 간염 바이러스, 에이즈 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 헤르페스바이러스 등의 RNA 바이러스, DNA 바이러스에 대한 항바이러스 작용을 갖는다. 또한, 열 쇼크 단백질은 암 면역에 관여하며, 또한 생체 방어 작용도 갖는다. 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 섭취함으로써 인플루엔자 바이러스에 의한 감기 질환 등의 바이러스성 질환을 예방, 치료할 수 있다.
또한 열 쇼크 단백질은 세포나 개체가 평상시의 온도보다도 5∼10℃ 정도 높은 온도 변화를 급격히 받았을 때 합성이 유도되는 단백질의 총칭이며, 원핵 생물에서부터 고등 진핵 생물까지 폭넓게 분포한다. 진핵 생물의 열 쇼크 단백질로서는 HSP90, HSP70, 유비퀴틴, HSP26 등이 알려져 있다. 그 중에서 HSP70는 분자 샤페론의 일종이며, 폴딩이 완료되지 않거나, 또는 불완전하게 폴딩된 단백질에 결합하여 입체 구조의 형성을 돕는다. 열 쇼크 단백질의 아미노산 배열은 진화의 과정에서 잘 보존되어 있고, HSP70은 대장균의 DnaK 단백질과 상동이다. 사람에게는 약 10 개의 HSP70 유전자가 존재하고 있는데, 이들 중 어떤 것은 구성적으로 발현하며, 어떤 것은 여러 가지 자극에 의해서 유도된다. 열 쇼크 단백질의 합성은 열 쇼크 이외에 여러 가지 화학 물질, 산화 스트레스 등의 세포 장해에 의해서도 유도된다.
C. 아미치 등(C. Amici) 등[Journal of Virology, 제68권, 제6890∼6899페이지(1994)]은 α,β-불포화카르보닐을 갖는 프로스타글란딘 A1의 존재 하에서 센다이 바이러스를 감염시킨 동물 세포를 배양하면 HSP70과 HSP90의 합성이 유도되고, HSP70의 합성이 유도되는 동안에는 바이러스 단백질의 합성이 억제된다고 보고하였다. 또한, A. 로시(A. Rossi) 등[The Journal of Biological Chemistry, 제271권, 제32192∼32196페이지(1996)]은 2-시클로펜텐-1-온이 프로스타글란딘 A1과 동일하게 HSP70의 합성을 유도하여, 수포성 구내염 바이러스 단백의 합성을 억제한다고 보고하였다.
본 발명에서 사용하는 시클로펜텐온에 의한 HSP70 유도능은 10 μM에서 볼 수 있으며, 20∼30 μM에서 최대가 되는데, 이것은 2-시클로펜텐-l-온이 HSP70을 유도하기 위해서 수백 μM의 농도가 필요한 것과 비교하면 매우 높은 유도능이라고 할 수 있다. 이것은 프로스타글란딘 A1에 의한 HSP70 유도 능력에 필적하는 것으로, 시클로펜텐온의 분자량이 프로스타글란딘 A1의 3분의 1 이하이기 때문에 중량 농도로 비교하면 프로스타글란딘 A1보다도 높은 유도능을 가진다고 할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 이와 같이 높은 열 쇼크 단백질 유도 작용을 가지므로, DNA 바이러스, RNA 바이러스, 레트로바이러스, 및 비로이드에 대하여 항바이러스 활성을 나타낸다. 이들 바이러스, 비로이드에는 상기의 각 바이러스, 비로이드를 예로 들 수 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 암 유전자로 형질 전환된 암 세포에 대하여도 증식 억제 활성을 가지며, 암 유전자에 의한 발암을 방지하는 작용을 갖는다.
예컨대, 파필로마 바이러스는 파포바바이러스과(papovaviridae), 파필로마바이러스속(papillomavirus)의 DNA 바이러스이며, 사람 파필로마바이러스(HPV)로는, 예컨대 자궁경암 등의 원인이 되는 HPV16 형이 알려져 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 HPV16 형의 암 유전자 E7에 의해서 암화(癌化)된 세포에 대하여 증식 억제 효과를 가지며, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 하여 바이러스 발암 세포 증식 억제제를 제공할 수 있으므로, 암 유전자에 의한 발암을 방지할 수 있다.
또한 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들 염은 개시제와 촉진제에 의한 2단계 발암의 억제 작용을 가지며, 이들 화합물에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 하는 화학 발암 억제제를 제공할 수 있다.
따라서 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유하는 발암 예방용 식품 또는 발암 예방용 음료를 제공할 수 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 암 유전자 발암 방지제 또는 화학 발암 억제제는 항바이러스제에 따라서 제제화할 수 있고, 항바이러스제에 해당하는 방법으로 투여할 수 있다.
본 발명의 항바이러스용 식품 또는 항바이러스용 음료의 제조에 있어서는 세포에 바이러스 저항을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 사용할 수 있다. 또한 시클로펜텐온을 함유하는 우론산의 가열 처리물, 상기 가열 처리물로부터의 부분 정제 시클로펜텐온 및 정제 시클로펜텐온을 사용할 수 있다.
또한, 간 기능 개선 작용, 열 쇼크 단백질 유도 작용, 발암 예방 작용 등을 갖는 작용 발현용 식품 또는 작용 발현용 음료의 제조에 있어서도, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염, 시클로펜텐온을 함유하는 가열 처리물, 이 가열 처리물로부터의 부분 정제 시클로펜텐온 및 정제 시클로펜텐온을 사용할 수 있다.
즉, 이들 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염, 시클로펜텐온을 함유하는 가열 처리물, 이 가열 처리물로부터의 부분 정제 시클로펜텐온 및 정제 시클로펜텐온에서 선택되는 원료를 희석 및/또는 첨가하여 제조되는 식품 또는 음료는 본 발명의 항바이러스용 식품 또는 음료에 포함된다
본 발명의 항바이러스용 식품 또는 항바이러스용 음료의 제조법은 특별히 한정되진 않지만, 조리, 가공 및 일반적으로 사용되고 있는 식품 또는 음료의 제조법에 의한 제조를 예로 들 수 있으며, 제조된 식품 또는 음료에, 세포에 바이러스 저항을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 유효량이 함유되어 있으면 된다.
본 발명의 항바이러스용 식품 또는 항바이러스용 음료로는 세포에 바이러스 저항을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물이 함유, 첨가 및/또는 희석되어 있으면 특별히 그 형상에 대한 한정은 없고, 정제형, 과립형, 캡슐형, 겔형, 졸형 등의 형상의 경구적으로 섭취 가능한 형상물도 포함한다.
또한, 간 기능 개선용, 열 쇼크 단백질 유도용, 발암 예방용 식품 또는 간 기능 개선용, 열 쇼크 단백질 유도용, 발암 예방용 음료로서는 간 기능 개선 작용, 열 쇼크 단백질 유도 작용, 발암 예방 작용을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물이 함유, 첨가 및/또는 희석되어 있으면 특별히 그 형상에 대한 한정은 없고, 정제형, 과립형, 캡슐형, 겔형, 졸형 등의 형상의 경구적으로 섭취가능한 형상물도 포함한다.
본 발명의 식품 또는 음료는 생리 활성을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 함유하여, 이들 화합물이 갖는 여러 가지 생리 활성, 항바이러스 작용, 간 기능 개선 작용, 열 쇼크 단백질 유도 작용, 발암 예방 작용 등에 의해서 이들을 섭취함으로써 바이러스성 질환 예방, 치료, 간 기능 개선 효과, 발암 예방 효과 등을 갖는 건강 식품 또는 음료이며, 생체의 항상성 유지에 유용한 식품 또는 음료이다.
본 발명에서 사용하는 화합물은 그 생리 활성의 유효량을 투여하더라도 독성은 관찰되지 않으며, 예컨대 경구 투여의 경우, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들 염 중 어느 하나를 100 mg/kg로 래트에게 단회 투여하여도 사망예는 관찰되지 않는다.
이상, 본 발명의 약제는 바이러스성 질환, 간질환, 암 등의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있고, 특히 HIV에 의해 야기되는 후천성 면역 결핍 증후군의 치료, 증상 개선에 유용하다.
발명이 해결하고자 하는 과제
바이러스에 대해서는, 단독 작용으로 대처하는 것보다 복합적 작용으로 대처하는 쪽이 효과적이다. 예컨대, 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 물질을 투여하더라도 감염 세포가 사멸에 이르기까지의 동안에 바이러스가 생산되어 다른 세포에 감염되기 때문에, 바이러스를 완전히 제거하는 것은 매우 곤란하다. 한편, 바이러스 저항력을 유도하는 작용을 가진 물질을 투여하더라도 감염 세포를 제거할 수는 없다.
본 발명의 목적은 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능, 및 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물을 개발하여 그 물질을 유효 성분으로 하는 항바이러스제, 간기능 개선제, 열 쇼크 단백질 유도제, 암 유전자 발암 방지제, 화학 발암 억제제 등의 의약품 및 항바이러스용 식품 또는 음료를 제공하는 데 있다.
발명을 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 이러한 목적을 달성하기 위해서 예의 검토한 결과, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물을 작용시키면, 바이러스 감염 세포가 선택적으로 손상을 입고, 또 사멸될 때까지 생산되는 바이러스의 양이 감소되며, 또한 그 때문에, 감염 세포가 사멸될 때까지 생산된 바이러스에 새롭게 감염되는 세포도 감소하고, 더욱이, 바이러스 미감염의 세포도 이 화합물의 투여에 의해 미리 바이러스 저항력을 얻기 때문에, 새롭게 감염되더라도 바이러스의 증식이 억제되며, 즉 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물은, 바이러스의 제거, 예컨대 사람의 후천성 면역 결핍 바이러스 또는 C형 간염 바이러스의 제거에 매우 효과적이라는 것을 발견하였다.
본 발명에서 사용되는 화합물의 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능은 바이러스 감염 전의 세포에 화합물을 작용시킨 후, 바이러스의 세포에의 감염 저해, 바이러스 게놈의 복제 저해, 바이러스 유전자의 전사 저해, 바이러스 단백질의 합성 저해, 바이러스 단백질의 홀딩 저해 등을 지표로 하여 측정할 수 있다.
또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능은 바이러스 감염 세포와 비감염 세포의 생존율을 비교함으로써 측정할 수 있다.
세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물로서는 상기 양 기능을 가지면 되며 어떠한 한정도 없다.
그리고, 본 발명자들은, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물로서, 화학식 1로 표시되는 화합물, 즉 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온(이하, 간단히 시클로펜텐온이라고 함) 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명의 제1 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-l-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스제에 관한 것이다.
본 발명의 제2 발명은 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스용 식품 또는 항바이러스용 음료에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 바이러스로는 사람의 후천성 면역 결핍 바이러스 또는 C형 간염 바이러스를 예로 들 수 있다. 또한, 항바이러스제로는 사람용 항바이러스제, 비사람 동물용 항바이러스제(예컨대, 가축, 가금, 어류 또는 새우류용 항바이러스제) 또는 식물용 항바이러스제를 예로 들 수 있다.
이하, 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또, 실시예에 있어서의 %는 중량%를 의미한다.
참고예 1
10 g의 D-글루쿠론산(시그마사 제품 G 5269)을 1 리터의 물에 용해시켜, 121℃에서 4 시간 가열한 후 약 10 ㎖가 될 때까지 감압 하에서 농축시켰다. 이것에 아세트산부틸:아세트산:물=3:2:2 혼합액의 상층 40 ㎖를 첨가하여 혼합한 후, 원심에 의해 얻은 상청액을 감압 하에 약 10 ㎖까지 농축하였다.
상기 추출액을 컬럼 크로마토그래피용 실리카겔 BW-300 SP(2×28 cm, 후지 실리시아 가가쿠사 제품)에 적용하여, 아세트산부틸:아세트산:물=3:2:2의 상층액을 용리액으로서 압축기로 0.2 kg/㎠로 가압하여, 매분 5 ㎖의 유속으로 분리를 행하였다. 1 분획당 10 ㎖가 되도록 분획하고, 각 분획의 일부를 채취하여 박층 크로마토그래피로 분석한 결과 61 번에서 80 번까지의 분획에 고순도 시클로펜텐온이 포함되어 있었다. 이들 분획을 모아 감압 하에서 농축시킨 후 40 ㎖의 클로로포름으로 추출하여, 추출액을 감압 하에서 농축시킴으로써 100 mg의 시클로펜텐온을 얻었다.
이 분획을 팔팩(Palpack) 타입 S 컬럼을 사용한 순상 HPLC로 분리하여, 215 nm의 자외선 흡수로 검출한 결과 순도는 98%였다.
상기 시클로펜텐온 113.9 ㎎을 에탄올 2.85 ㎖에 용해시켰다. 이 에탄올 용액에 헥산/에탄올(94/6) 3.85 ㎖을 더 첨가하여, 17 ㎎/㎖의 시클로펜텐온 용액을 조제하였다. 이 액을 0.5 μm의 필터로 여과하여, 광학 분할 HPLC 시료 용액으로 하였다.
이 시료 용액을 이하의 조건에서 광학 분할 HPLC를 행하여, 전 피크의 (-)체 시클로펜텐온 및 후 피크의 (+)체 시클로펜텐온의 분획을 각각 모아, 감압 건조 고체화하여, (-)체 시클로펜텐온 43.2 ㎎, (+)체 시클로펜텐온 43.0 ㎎을 각각 얻었다.
광학 분할 HPLC 조건
컬럼 : 키랄 팩 AS(다이셀 가가쿠 고교) 2.0 cm ×25.0 cm
컬럼 온도 : 40℃
이동상 : 헥산/에탄올(94/6)
유속 : 14.0 ㎖/분
검출 : UV 210 nm
시료 주입량 : 150 ㎕(2.55 ㎎)
생성된 (-)체 시클로펜텐온 및 (+)체 시클로펜텐온은 양자 모두 약 1%의 거울상 이성체를 함유하고 있었기 때문에 상기 조건으로 다시 광학 분할하였다. 그 결과, 전 피크의 (-)체 시클로펜텐온 30.0 ㎎에서 197 ㎎의 거울상 이성체를 함유하지 않은 (-)체 시클로펜텐온을, 후 피크의 (+)체 시클로펜텐온 37.4 ㎎에서 27.7 ㎎의 거울상 이성체를 함유하지 않은 (+)체 시클로펜텐온을 각각 얻었다. 또 (-)체 시클로펜텐온 및 (+)체 시클로펜텐온의 광학 분할 HPLC의 용출 시간은 각각 33 분, 40 분이었다.
실시예 1
(1) 2×105세포/㎖의 사람 전골수성 백혈병 세포 HL-60(ATCC CCL-240)을 함유하는 10% 소 태아 혈청 함유 RPMI1640 배지 5 ㎖를 6 웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 37℃ 5% CO2존재 하에서 24시간 배양한 후, 최종 농도가, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 100 μM가 되도록 참고예 1에 기재된 시클로펜텐온을 첨가하고, 8 시간 더 배양을 계속하였다.
배양 종료후, 세포 수를 계측한 후, 세포를 원심 분리로 회수하고, 인산 완충식염수(PBS)로 세정하여 시클로펜텐온 처리 세포를 조제하였다. 또한, 45℃ 10분간 열 처리를 행한 후, 동일하게 배양한 세포도 조제하였다.
이들 처리 세포를 사용하여 문헌[Molecular Cloning, 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)]에 기재된 방법에 따라서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 행하였다. 처리 세포는 2.5 ×106세포/㎖가 되도록 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 현탁하고, 이 세포 현탁액을 100℃에서 10 분간 처리한 후, 5 ㎕씩을 2 장의 SDS-PAGE 겔(5% 스태킹 겔, 10% 세퍼레이션 겔)에 적용하여, 전기 영동을 행하였다. 한쪽의 겔은 쿠마시 염색하고, 다른 쪽 겔은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 트랜스퍼 멤브레인[ImmobilonTM; 밀리포어 (MILLIPORE)사 제조 Cat.#IPVHO0O-10]에 블로팅하였다. 이 멤브레인을 Block Ace(다이니폰 세이야쿠 가부시키가이샤 Cat.#UK-B25)로 4℃에서 하룻밤 블로킹하였다.
이 블로킹한 멤브레인에 열 유도되는 70 kDa의 열 쇼크 단백질에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체 HSP 72/73(Ab-1)[온코진 리서치 프로덕트(Oncogene Research Products)사 제품 Cat.#HSPO1]을 반응시킨 후, 0.05% Tween 20를 포함하는 트리스 완충 식염수(TBS)로 세정한 후, TBS로 세정하였다. 계속해서, 퍼옥시다제 복합 이차 항체 HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)[ZYMED 래버러토리스사(ZYMED Laboratories, Inc.) 제품 Cat.#61-6520]을 반응시키고, 상기 조작과 같이 세정하였다. 이와 같이 일차 항체, 이차 항체와 반응시킨 멤브레인에 케미루미놀 시약 RENAISSANCETM[듀퐁 NEN(Dupont NEN)사 제품 Cat.#NEL-100]을 반응시킨 후, X-선 필름을 감광하여 70 kDa의 열 쇼크 단백질 유도를 확인하였다.
그 결과, 20∼30 μM의 시클로펜텐온의 첨가로, 45℃ 10 분간 열 처리와 같은 정도의 70 kDa의 열 쇼크 단백질 유도가 확인되었다. 그 유도의 강약은 표 1에 나타내었다. 또 표 1 중, +는 유도가 강하다는 것을 나타내고, +가 많을수록 유도가 강한 것을 의미한다. 또한 - 는 유도가 관찰되지 않은 것, ±는 유도가 약간인 것을 의미한다.
처리 세포 열 쇼크 단백질 유도
45℃10 분 열 처리 +++
0 μM 시클로펜텐온 -
10 μM 시클로펜텐온 +
20 μM 시클로펜텐온 +++
30 μM 시클로펜텐온 +++
40 μM 시클로펜텐온 ++
50 μM 시클로펜텐온 +
100 μM 시클로펜텐온 ±
또한, (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온에 관해서도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 2
(1) HeLa 세포(ATCC CCL-2)를 10 cm 플레이트 중의 10% 소 태아 혈청 함유 둘베코(Dulbecco) 개질 이글 배지(DMEM; 닛수이사 제품)에서 80% 콘플루언스가 될 때까지 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양한 후, 최종 농도가 0, 5, 10, 20 또는 40 μM이 되도록 시클로펜텐온을 첨가하고, 상기 조건으로 6 시간 더 배양을 계속하였다. 배지를 버리고, 각 웰에 1 ㎖의 10% 트리클로로아세트산을 가한 후, 스크레퍼로 세포를 회수하였다.
이렇게 해서 얻어진 세포의 SDS-PAGE와 블로팅을 실시예 1의 방법으로 행하여, 70 kd 열 쇼크 단백질의 발현을 검출하였다.
그 결과, 5 μM∼40 μM 시클로펜텐온 첨가 구분에서 70 kd 열 쇼크 단백질 유도가 나타났다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 표 2 중에서, +는 블로팅에 의해 관찰된 70 kd 열쇼크 단백질의 시그널 세기를 나타내고, +가 많을수록 시그널이 강한 것을 의미한다. 또한, ±는 시그널이 매우 약한 것을 의미한다.
처리 세포 70 kd 열 쇼크 단백질량
0 μM 시클로펜텐온 ±
5 μM 시클로펜텐온 +
10 μM 시클로펜텐온 ++
20 μM 시클로펜텐온 +++
40 μM 시클로펜텐온 +++
(2) HeLa 세포를 10 cm 플레이트 중의 10% 소 태아 혈청 함유 DMEM에서 80% 콘플루언스가 될 때까지 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양한 후, 최종 농도가 0, 5, 10, 20 또는 40 μM이 되도록 시클로펜텐온을 첨가하고, 상기 조건으로 6 시간 더 배양을 계속하였다. 그 후, 5% 소 태아 혈청 함유 DMEM로 세포를 세정하고, 아데노바이러스인 Ad5 dlX[사이토(Saito) 등, 저널 오브 비롤로지, 제54권, 제711∼719페이지(1985)]를 포함하는 5% 소 태아 혈청 함유 DMEM을 세포에 가하여 감염시켜 20시간 배양하였다. 단, 감염 다중도(m.o.i.)를 50으로 설정하였다. 배지를 버리고, 각 웰에 1 ㎖의 1O% 트리클로로아세트산을 가한 후, 스크랩퍼로 세포를 회수하였다.
이렇게 해서 얻어진 세포의 SDS-PAGE와 블로팅을 실시예 1의 방법으로 행하고, 아데노바이러스의 헥손 단백질의 발현을 검출하였다. 단, 일차 항체는 항아데노바이러스 헥손 항체[케미콘 인터내쇼날사(Chemicon International Inc.) 제품, AB1056]를 사용하였다.
10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 헥손 단백질량이 감소하였다. 또한, 20 μM 이하의 시클로펜텐온 첨가 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 구분과 같은 세포 증식이 나타났다.
(3) 실시예 2-(2)와 동일한 방식으로 시클로펜텐온 처리 후에 아데노바이러스를 감염시켜 배양한 HeLa 세포로부터 「바이러스 실험 프로토콜」(메디컬뷰사 발행) 24∼25페이지에 기재된 방법에 따라서 바이러스 DNA를 추출하였다.
즉, 바이러스 감염 세포를 인산 완충 식염수로 세정하고, 1 ㎖의 0.6% 라우릴황산나트륨 (SDS)/10 mM EDTA 수용액에 현탁한 후, 3.0 ㎖의 5M NaCl 수용액을 첨가하였다. 0℃에서 1시간 방치하고, 원심에 의해 얻은 상청액에 3 ㎖의 에탄올을 첨가하여 혼합하였다. 원심에 의해서 얻은 침전물을 0.2 ㎖의 TE 완충액[10 mM 트리스(Tris)-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA]에 용해시키고, 2 ㎕의 10% SDS와 4 ㎕의 10 mg/㎖ 프로테이나제 K(다카라츠조사 제품)를 가하여 37℃에서 1시간 보온하였다. 페놀과 클로로포름의 등량 혼합액으로 2회 추출하고, 수층에 20 ㎕의 3M 아세트산나트륨과 400 ㎕의 에탄올을 첨가하여 원심하고, 침전물을 50 ㎕의 TE 완충액에 용해시켜 DNA 용액을 얻었다. 10 ㎕의 DNA 용액에 10 단위의 EcoT22I(다카라츠조사 제품)와 1 ㎕의 10 mg/㎖ 리보뉴클레아제 A를 가하여 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동을 행하여 바이러스 DNA량을 측정하였다. 그 결과, 5 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스 DNA량이 감소하였다.
(4) 실시예 2-(2)와 동일한 방식으로 HeLa 세포를 배양한 후, 시클로펜텐온을 첨가하지 않고서, 5형 아데노바이러스(Adenoid 75 ATCC VR-5)를 함유하는 5% 소 태아 혈청 함유 DMEM을 세포에 가하여 감염시켰다. 단, 감염 다중도(m.o.i.)를 50으로 설정하였다. 그 후, 최종 농도가 0, 5, 10, 20 또는 40 μM이 되도록 시클로펜텐온을 첨가하여 20시간 배양하였다. 배양 후에는 실시예 2-(2)와 동일한 방식으로 아데노바이러스의 헥손 단백질의 검출을 행하였다. 그 결과, 10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 헥손 단백질량이 감소하였다. 또한, 20 μM 이하의 시클로펜텐온 첨가 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 구분과 같은 세포 증식이 나타났다.
(5) 실시예 2-(2)와 동일한 방식으로 HeLa 세포를 배양하여, 시클로펜텐온으로 처리하였다. 그 후, 실시예 2-(4)와 동일한 방식으로 5형 아데노바이러스 (Adenoid 75 ATCC VR-5)를 감염시키고, 시클로펜텐온을 첨가한 배지로 배양하였다. 배양 후에는 실시예 2-(2)와 동일한 방식으로 아데노바이러스의 헥손 단백질의 검출을 행하였다. 그 결과, 10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 헥손 단백량이 감소하였다. 또한, 20 μM 이하의 시클로펜텐온 첨가 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 구분과 같은 세포 증식이 나타났다.
(6) 실시예 2-(5)과 동일한 방식으로 시클로펜텐온 처리 후에 5형 아데노바이러스(Adenoid 75 ATCC VR-5)를 감염시켜 배양한 HeLa 세포로부터 실시예 2-(3)와 동일한 방법으로 바이러스 DNA량을 측정하였다. 그 결과, 5 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스 DNA량이 감소하였다.
이상, 실시예 2-(2)∼(6)의 결과로부터, 시클로펜텐온은 감염 전, 감염 후 또는 감염 전후의 투여에 의해 아데노바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 가진다는 것이 분명해졌다. 또한 (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온에 관해서도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 3
(1) 문헌[Proc. Natl. Acad. Scl. USA., 제84권, 제156∼160페이지(1987)]에 기재된 β-갈락토시다제 유전자와 네오마이신 내성 유전자를 리포터 유전자로서 갖는 재조합 레트로바이러스 벡터 BAG를 제한 효소 BamHI로 소화시키고, 셀프라이게이션시킴으로써 β-갈락토시다아제 유전자를 제거한 DOL 벡터를 구성하였다.
(2) 실시예 3-(1)에 기재된 D0L 벡터 플라스미드를 대장균(E.coli) HB101로 형질 전환시키고, L-브로스 배지에서 배양하고, 채집한 균체로부터 플라스미드를 추출하여 염화세슘 밀도 구배 초원심으로 DOL 플라스미드를 정제하였다.
정제된 DOL 플라스미드 10 ㎍를 재조합하여 레트로바이러스 패키징 세포 ΨCRIP[Proc. Natl. Acad. Scl. USA., 제85권, 제6460∼6464페이지(1988)]에 양이온성 리보솜[Trans 2T LT-1(다카라츠조사)]을 사용하여 도입하였다.
도입한 세포를 37℃, 5% CO2조건 하에서 G418(기부코사)를 0.4 mg/㎖ 함유하는 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지로 2 주간 선택하여 얻어진 콜로니를 20 개 클로닝하고, 직경 100 mm 플레이트로 증대시켜서 세미콘플루언스 상태에서 배지를 교환하고, 24 시간 후에 상청액을 회수하고, 0.45 μM 필터(Milex HV; 밀리포어사)로 여과하여 바이러스 상청액을 얻었다. 또한 세포는 트립신으로 떼어내어서 액체 질소 중에 보존하였다.
각 콜로니로부터 얻은 바이러스 상청액의 역가는 하기 실시예 3-(3)에 나타내는 방법으로 측정하여 가장 역가가 높은 바이러스액를 얻을 수 있었던 클론을 재조합하여 레트로바이러스 프로듀서 세포 ΨCRIP/DOL로서 수립하였다. 수립 시의 프로듀서 세포로부터 얻어진 바이러스 상청액의 역가는 1×106콜로니 형성 유니트(cfu)/㎖였다. 수립된 프로듀서 세포는 G418을 0.2 mg/㎖ 함유하는 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지로 유지시켰다.
(3) 바이러스 역가의 측정에는 NIH3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 사용하였다. 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지로 배양한 NIH3T3 세포를 6 웰 플레이트(이와키 글라스사)에 50000 개/웰로 이식하고, 다음날, 8 ㎍/㎖의 폴리브렌(시그마사)을 함유하는 1 ㎖의 바이러스 희석액으로 NIH3T3 세포에 3 시간 감염시켰다. 바이러스의 희석에는 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지를 사용하였다. 감염 종료후, 폴리브렌을 희석하기 위해서, 2 ㎖의 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지를 더 첨가하였다. 그 다음 날부터 G418를 0.4 mg/㎖ 함유하는 10% 송아지 혈청 함유 달베코 개질 이글 배지로 교환하고, 3∼4일마다 배지를 교환하면서 2주간 선택하여 콜로니를 형성시켰다. 얻어진 콜로니를 김자 염색액(기부코사)을 사용하여 통상의 방법에 따라서 염색하여 계수하였다. 얻어진 콜로니 수에 희석 배율을 곱한 값을 cfu로서 바이러스 역가로 하였다.
(4) 실시예 3-(2)에 기재된 재조합 레트로바이러스 프로듀서 세포 ΨCRIP/DOL을 6웰 플레이트에 이식하고, 세미콘플루언스 상태가 되었을 때 시클로펜텐온을 0∼20 μM 함유하는 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지 1.5 ㎖로 교환하고, 24 시간 후에 상청액을 회수하였다. 회수된 상청액의 바이러스 역가를 실시예 2-(3)에 기재된 방법으로 측정하고, 시클로펜텐온의 첨가에 의한 재조합 레트로바이러스프로듀서 세포의 바이러스 생산능에 대한 영향을 검토하였다.
시클로펜텐온을 첨가하지 않는 대조 실험구로부터 얻은 바이러스액의 역가는 9.5×104cfu/㎖이었던 것에 반해, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 20 μM의 시클로펜텐온 존재 하에서의 바이러스액의 역가는 각각 8.3×104, 6.4×104, 6.1×104, 3.8×104, 5.6×104, 5.1×104, 4.1×104cfu/㎖이며, 시클로펜텐온의 첨가에 의해 프로듀서 세포로부터 얻어지는 바이러스액의 역가의 저하가 확인되었다. 즉 시클로펜텐온에 의한 재조합 레트로바이러스 프로듀서 세포의 바이러스 생산능의 억제 작용이 관찰되었다.
(5) G418 내성 유전자를 발현하는 컨트롤 플라스미드 pcD2-Y[Mol. Cell. Biol., 제7권, 제2745∼2752페이지(1987)], 및 HPV16형 E7와 G418 내성 유전자 양쪽을 발현할 수 있는 플라스미드 pcD2-16E7[Jpn. J. Cancer Res., 제82권, 제1340∼1343페이지(1991)]을 대장균 E.coli HB101로 형질 전환시키고, L-브로스 배지로 배양하고, 채집한 균체로부터 플라스미드를 추출하고, 염화세슘 밀도 구배 초원심 에 의해 정제하여 유전자 도입용 벡터 플라스미드를 얻었다.
NIH3T3 세포는 37℃, 5% CO2조건 하에서 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지 중에서 배양하였다.
정제한 플러스미드 10 ㎍를 NIH3T3 세포에 양이온성 리보솜(TransIT LT-1, 다카라츠조사 제품)을 사용하여 도입하고, 세포를 37℃, 5% CO2조건 하에서 G418 (GIBCO)을 0.4 mg/㎖ 함유하는 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지로 2 주간 선택하여 얻어진 콜로니를 클로닝하여, φ100 mm의 조직 배양 플레이트에서 증식시킨 후, 액체 질소로 보존하였다.
이에 따라, 컨트롤 벡터를 도입한 NIH3T3 세포 및 HPV16형 E7에 의해서 암 화시킨 NIH3T3 세포를 각각 9 주씩 수립하였다.
컨트롤 벡터를 도입한 세포주를 NIH3T3/Y-1, NIH3T3/Y-2, NIH3T3/Y-3, NIH3T3/Y-4, NIH3T3/Y-5, NIH3T3/Y-6, NIH3T3/Y-7, NIH3T3/Y-8 및 NIH3T3/Y-9로 하였다.
E7를 도입한 세포주를 NIH3T3/E7-1, NIH3T3/E7-2, NIH3T3/E7-3, NIH3T3/E7-4, NIH3T3/E7-5, NIH3T3/E7-6, NIH3T3/E7-7, NIH3T3/E7-8 및 NIH3T3/E7-9로 하였다.
(6) NIH3T3 세포, 컨트롤 벡터를 도입한 세포주, 및 E7를 도입한 세포주를 100 mm의 조직 배양 플레이트에서 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지로 50∼70% 콘플루언스 정도로 증대시키고, PBS로 세정한 후, 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 세포를 박리하고, 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지 5 ㎖에 현탁시켰다.
현탁액의 일부를 채취하고, 노이바우어형 혈구 계산판으로 세포 밀도를 계산하였다. 얻어진 데이타에 기초하여 10% 송아지 혈청 함유 돌베코 개질 이글 배지로 희석하고, 직경 60 mm의 조직 배양 플레이트에 200 세포/플레이트가 되도록 이식하고, 3 ㎖의 배지 중에서 배양을 시작하였다. 배양 개시에서부터 24 시간 후, 시클로펜텐온을 5 μM이 되도록 첨가하였다. 또 24 시간 후, 새로운 배지와 교환하여 시클로펜텐온을 5 μM이 되도록 첨가하였다.
그 후에는 2∼3일마다 배지를 교환하여 시클로펜텐온을 5 μM이 되도록 첨가하였다. 대조 실험구로서, 시클로펜텐온을 첨가하지 않는 플레이트를 준비하여, 동일하게 배지 교환하였다. 배양은 각각 세 벌로 행하였다. 9 일간 배양한 후, 메탄올로 고정하여 김자액(GIBCO)으로 콜로니를 염색하였다.
또 NIH3T3, NIH3T3/Y-1 및 NIH3T3/E7-2를 사용하여 평가하였다.
염색한 콜로니를 계수한 결과를 표 3에 나타낸다. E7을 도입한 세포는 컨트롤 세포에 비해서 시클로펜텐온에의 감수성이 높고, 시클로펜텐온은 암 유전자 형질 전환 세포에 선택적으로 작용하였다.
세포 콜로니 수(평균 ±SD)
대조 시클로펜텐온 처리
NIH3T3 91.7 ±11.9 85.3 ±4.0
NIH3T3/Y-1 83.3 ±8.4 71.3 ±2.3
NIH3T3/E7-2 67.3 ±3.2 22.3 ±3.5
실시예 3-(5)의 다른 세포주를 사용한 경우도 동일한 결과를 얻었다. 또한, (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온에서도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 4
(1) 24 웰 마이크로플레이트 중에서 10% 소 태아 혈청 함유 Eagle-MEM을 사용하여 단층이 될 때까지 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양한 MDCK 세포(오사카 부립 공중 위생 연구소 보존주)에 최종 농도가 0, 5, 10, 20 또는 40 μM이 되도록 시클로펜텐온을 첨가하여 상기 조건으로 6 시간 더 배양을 계속하였다.
그 후, PBS로 세포를 세정하고, 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34주(오사카 부립 공중 위생 연구소 보존주)를 세포에 가하여 감염시키고, 30 분간 37℃에서 인큐베이트하였다. 또한, 감염 다중도(m.o.i.)를 0.01로 설정하였다. 인큐베이트후, 세포를 PBS로 세정하고, 10 ㎍/㎖ 트립신을 함유하는 Eagle-MEM에서 배양하였다.
감염 세포 상청액을 0, 1, 2, 3일 후에 채취하고, 바이러스의 역가를 PAP법에 의한 포커스 계수법[J. Clin. Microbiol., 제28권, 제1308∼1313페이지(1990)]으로 결정하였다.
그 결과, 10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스의 역가가 저하되었다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 또한 각 시클로펜텐온 첨가 구분에서도 세포가 박리되지 않고 접착되었다.
감염 후일수 시클로펜텐온 농도(μM)
0 5 10 20 40
pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
1 3.6 ×105 4.0 ×105 2.0 ×105 2.2 ×103 4.0 ×102
2 1.0 ×106 8.0 ×105 7.2 ×105 2.6 ×105 1.9 ×105
3 1.5 ×105 9.6 ×104 2.4 ×105 3.8 ×105 5.6 ×105
(2) 실시예 4-(1)과 동일한 절차로 시클로펜텐온 비존재 하에서 단층으로 배양한 MDCK 세포에 실시예 4-(1)과 동일한 방식으로 인플루엔자 바이러스를 세포에 가하여 감염시키고, 최종 농도가 0, 5, 10, 20 또는 40 μM이 되도록 시클로펜텐온을 첨가한 10 ㎍/㎖ 트립신을 함유하는 Eagle-MEM에서 배양하였다. 그 후, 실시예 4-(1)과 동일하게 바이러스의 역가를 구하였다. 그 결과, 10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스의 역가가 저하되었다. 그 결과를 표 5에 나타낸다. 또한, 각 시클로펜텐온 첨가 구분에서, 세포는 박리되지 않고 접착되었다.
감염 후일수 시클로펜텐온 농도(μM)
0 5 10 20 40
pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
1 4.2 ×106 2.4 ×105 1.9 ×105 1.2 ×105 〈1.0 ×102
2 1.6 ×106 1.5 ×106 3.4 ×105 1.0 ×106 〈1.0 ×102
3 4.8 ×105 1.9 ×105 1.7 ×105 7.2 ×105 〈1.0 ×102
(3) 실시예 4-(1)과 동일한 절차로 단층으로 배양하고, 최종 농도가 0, 20 또는 40 μM인 시클로펜텐온으로 6 시간 처리한 MDCK 세포를 실시예 4-(1)과 동일한 방식으로 인플루엔자 바이러스를 감염시키고, 감염 전과 같은 농도의 시클로펜텐온을 함유하는 10 ㎍/㎖ 트립신 함유 Eagle-MEM 배지로 배양을 계속하였다. 그 후, 실시예 4-(1)과 동일하게 바이러스의 역가를 구하였다. 그 결과, 20 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스의 역가가 저하되었다. 그 결과를 표 6에 나타낸다. 또한, 각 시클로펜텐온 첨가 구분에서도 세포는 박리되지 않고 접착되었다.
감염 후일수 시클로펜텐온 농도(μM)
0 20 40
pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
1 4.6 ×105 9.8 ×105 〈1.0 ×102
2 6.6 ×105 1.6 ×105 〈1.0 ×102
3 1.0 ×105 1.3 ×105 〈1.0 ×102
(4) 실시예 4-(1)과 동일한 실험을 감염 다중도(m.o.i.)를 0.001로 설정하여 행하였다. 그 결과, 10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스의 역가가 저하되었다. 그 결과를 표 7에 나타낸다. 또한, 각 시클로펜텐온 첨가 구분에서도, 세포는 박리되지 않고 접착되었다.
감염 후일수 시클로펜텐온 농도(μM)
0 5 10 20 40
pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
1 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
2 3.6 ×105 5.2 ×105 6.2 ×105 5.0 ×105 4.4 ×103
3 3.8 ×104 4.0 ×104 8.6 ×104 1.1 ×105 8.0 ×103
(5) 실시예 4-(2)와 동일한 실험을 감염 다중도(m.o.i.)를 0.001로 설정하여 행하였다. 그 결과, 10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스의 역가가 저하되었다. 그 결과를 표 8에 나타낸다. 또한, 각 시클로펜텐온 첨가 구분에서도 세포는 박리되지 않고 접착되었다.
감염 후일수 시클로펜텐온 농도(μM)
0 5 10 20 40
pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
1 6.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
2 3.6 ×105 8.8 ×104 2.0 ×105 1.8 ×105 〈1.0 ×102
3 3.8 ×104 2.6 ×104 1.8 ×104 1.2 ×104 〈1.0 ×102
(6) 실시예 4-(3)으로 같은 실험을 감염 다중도(m.o.i.)를 0.001로 설정하여 행하였다. 그 결과, 10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스의 역가가 저하되었다. 그 결과를 표 9에 나타낸다. 또한, 각 시클로펜텐온 첨가 구분에서도 세포는 박리되지 않고 접착되었다.
감염 후일수 시클로펜텐온 농도(μM)
0 5 10 20 40
pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
1 6.0 ×103 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102 〈1.0 ×102
2 6.2 ×105 4.4 ×105 4.8 ×105 3.2 ×104 〈1.0 ×102
3 3.6 ×104 5.6 ×104 2.8 ×104 2.8 ×104 〈1.0 ×102
이상, 실시예 4-(1)∼(6)의 결과로부터, 시클로펜텐온은 인플루엔자 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 갖는 것으로 분명히 나타났다. 또한 (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온에서도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 5
(1) 사람 T 세포에 대한 시클로펜텐온의 작용
2×105개/㎖의 CEM-SS 세포(ATCC CCL-119) 또는 H9 세포(ATCC HTB-176)에 0.5∼5 μM 시클로펜텐온을 첨가하여 3 일간 배양하고, 살아 있는 세포 수와 죽은 세포 수를 계수하여 세포 생존율을 산출하였다.
그 결과, 어느 쪽 세포에 있어서도 시클로펜텐온 첨가에 의한 세포 생존율의 현저한 감소는 나타나지 않았다. 그 결과를 도 1과 도 2에 나타낸다. 즉, 도 1과 도 2는 첨가된 시클로펜텐온 농도와 세포 생존율의 관계를 나타내는 도면이며, 횡축은 첨가한 시클로펜텐온 농도(μM), 종축은 3 일간 배양 후의 세포 생존율(%)을 나타낸다. 도 1은 CEM-SS 세포를 사용한 경우의 결과이며, 도 2는 H9 세포를 사용한 경우의 결과이다.
(2) HIV 감염 T 세포에 대한 시클로펜텐온의 작용
HIV-1111B에 감염된 CEM-SS 세포(CEM-3B이라 약칭함) 또는 HIV-1111B에 감염된 H9 세포(H9-3B라 약칭함)에 1∼5 μM 시클로펜텐온을 첨가하여 3 일간 배양하였다. 양 세포의 90% 이상이 HIV-1111B에 감염되었다. 살아 있는 세포 수와 죽은 세포 수를 계수하여 세포 생존율을 산출하였다.
그 결과, 어느 쪽의 세포에 있어서도 3 μM 시클로펜텐온 첨가에 의해서 세포 생존율이 현저히 감소하고, 5 μM 시클로펜텐온 첨가에서는 더욱 세포 생존율이 저하되었다. 즉 실시예 5-(1)과 비교하여, 시클로펜텐온은 항HIV 작용을 나타내었다. 그 결과를 도 3과 도 4에 나타낸다. 즉, 도 3과 도 4는 첨가된 시클로펜텐온 농도와 세포 생존율의 관계를 나타내는 도면이며, 횡축은 첨가한 시클로펜텐온 농도(μM), 종축은 3 일간 배양 후의 세포 생존율(%)을 나타낸다. 도 3은 CEM-3B를 사용한 경우의 결과이며, 도 4는 H9-3B를 사용한 경우의 결과이다.
실시예 6
실시예 5-(2)의 3 일간 배양한 후의 배양 상청액 중에 함유되는 p24 항원의 농도를 측정하였다. 그 결과, 첨가된 시클로펜텐온 농도에 따라서 p24 농도가 감소되어 항HIV 작용이 관찰되었다. 그 결과를 표 10에 나타낸다. 단, 표 10에 있어서 괄호 안의 숫자는 시클로펜텐온 비첨가 시 각각의 세포 배양 상청액의 p24 농도에 대한 비를 %로 나타낸 것이다.
시클로펜텐온 농도(μM) 배양 상청액 중의 p24 농도(ng/ml)
CEM-3B H9-3B
0 280 (100%) 210 (100%)
1 232 (83%) 203 (97%)
3 176 (63%) 157 (75%)
5 175 (63%) 148 (70%)
실시예 7
Vero 세포(ATCC CCL-81)를 10% 소 태아 혈청 함유 Eagle-MEM에 5×104cells/100 ㎕의 세포 농도가 되도록 현탁하고, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 1 웰당 100 ㎕의 세포 현탁액을 넣고, 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 하룻밤 배양하여 단층이 된 Vero 세포를 조제하였다.
이 세포에, 최종 농도가 0, 5, 10, 20, 또는 40 μM이 되도록 시클로펜텐온을 첨가한 Eagle-MEM 배지를 첨가하여 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 7 시간 배양하였다.
배양 종료후, 배지를 제거하고, PBS로 2회 세정한 후, 일본 뇌염 바이러스 (JEV JaOAr-363-70주)를 4.9×102pfu/㎖가 되도록 접종하고, 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 30 시간 배양한 후, 세포를 에탄올 고정하여, PAP법에 의한 포커스 계수법[Arch. Virol., 제86권, 제129∼135페이지(1985)]로 포커스 계수를 행하였다.
그 결과, 40 μM의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가의 대조에 비해서 명확히 포커스의 수가 저하되었다. 그 결과를 표 11에 나타낸다. 또한 각 시클로펜텐온 첨가 구분에서, 세포는 박리되지 않고 접착되었다.
시클로펜텐온 농도(μM) pfu/ml
0 3.0 ×107
10 1.6 ×107
20 2.1 ×107
40 4.9 ×107
(2) 24 웰 마이크로플레이트 중에서 10% 소 태아 혈청 함유 Eagle-MEM을 사용하여 단층이 될 때까지 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 배양한 Vero 세포를 PBS로 세정하고, 4.9×102pfu/㎖의 일본 뇌염 바이러스(JEV JaOAr-363-70주)를 세포에 가하여 감염시키고, 90 분간 37℃에서 인큐베이트하였다.
인큐베이트후, 세포를 PBS로 세정하고, 최종 농도가 0, 5, 10, 20 또는 40 μM이 되도록 시클로펜텐온을 첨가한 MEM에서 배양하였다.
감염 세포 상청액을 0, 1, 2, 3일 후에 채취하여, 바이러스의 역가를 Vero 세포를 사용한 PAP법에 의한 포커스 계수법[J. Clin. Microbiol., 제28권, 제1308∼1313페이지(1990)]으로 구하였다.
그 결과, 10 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 시클로펜텐온 비첨가 대조에 비해서 명확히 바이러스의 역가가 저하되었다. 그 결과를 표 12에 나타낸다. 또 각 시클로펜텐온 첨가 구분에서, 세포는 박리되지 않고 접착되었다.
시클로펜텐온 농도(μM) 바이러스 접종 후 일수
1일 2일 3일
pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 6.0 ×103 5.6 ×106 1.1 ×107
10 6.0 ×103 2.4 ×106 4.4 ×106
20 6.4 ×103 1.9 ×106 3.0 ×106
40 0 0 0
상기 실시예 7-(1), (2)의 결과로부터, 시클로펜텐온이 일본 뇌염 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 갖는 것으로 분명하게 나타났다. 또한, 일본 뇌염 바이러스는 C형 간염 바이러스와 동계의 종이며, C형 간염 바이러스의 시험관내 배양이 확립하지 않는 현재에서는 C형 간염 바이러스의 모델로서 일본 뇌염 바이러스가 사용되고 있다. 이들로부터, 시클로펜텐온은 C형 간염의 치료약으로서도 유효하다.
또한 (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온에 관해서도 같은 결과를 얻었다.
실시예 8
5년전에 C형 간염 바이러스 감염증이라고 진단되어, 인터페론, 강력 미노파겐에 의한 치료를 받아 왔지만, GOT, GPT가 모두 150 전후로 간기능의 개선이 보이지 않은 여성이 하기 실시예 13에서 얻어진 음료를 매일 50 ㎖(시클로펜텐온 2 mg 함유)씩 2 개월 음용한 결과, GOT, GPT가 모두 80으로 개선되었다. 또한, 동일하게 1 개월 음용을 계속한 결과, GOT, GPT 모두 30으로 현저한 간기능의 개선이 나타났다.
실시예 9
ICR계 마우스(일본 에스엘씨로부터 구입, 7 주령, 암컷) 등부분의 털을 면도한 후, 개시제로서 DMBA(디메틸벤즈안트라센)의 아세톤 용액을 50 ㎍/마우스가 되도록 도포하고, 그 1주일 후에, 촉진제로서 TPA(12-o-테트라세카노일포르볼 13-아세테이트)의 아세톤 용액을 1 ㎍/마우스가 되도록 개시제 도포부에 매주 2 회 시험 종료까지 도포하고, 시클로펜텐온의 80% 에탄올 용액 또는 대조의 80% 에탄올 용액을 각 TPA 도포 1 시간 전에 도포하여, 2 단계 피부 발암에 있어서의 발암 억제 작용을 20 주간 관찰했다.
대조군(부형제 도포군)은 15 주 이후는 100%(12 마리 중 12 마리)의 발암율을 나타낸 데에 비해, 시클로펜텐온은 강력하게 발암을 억제하여, 2.5 mg/마우스는 15 주 이후에 8.3%(12 마리 중 1 마리), 19 주 이후에 25%(12 마리 중 3 마리)의 발암율을 나타내는 발암 억제를 보였다. 결과를 도 5에 나타낸다. 즉 도 5는 시클로펜텐온의 발암 억제 작용을 나타내는 도면이며, 종축은 발암율, 횡축은 시간(주)를 나타낸다. 도면 중 하얀 삼각형은 시클로펜텐온 2.5 mg/마우스 처리군(12마리), 검은 삼각형은 시클로펜텐온 0.8 mg/마우스 처리군(11마리), 하얀 동그라미는 대조군(12마리)를 나타낸다.
또 마우스 외이의 TPA 염증 시험에 있어서 시클로펜텐온은 2.5 mg/마우스의 마우스 외이 도포에 의한 항염증 활성을 나타나지 않았다.
이상 시클로펜텐온은 2 단계 화학 발암에 있어서 항프로모터 작용을 나타내었다. 시클로펜텐온을 함유하는 글루쿠론산의 가열 처리물, (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온도 같은 결과를 나타내었다.
실시예 10
주사제
(1) 생리 식염액(일본 약국방 수록품)에 시클로펜텐온을 1% 농도로 가하여 주사제를 제조하였다.
(2) 생리 식염수(상기와 동일함)에 (-)체 시클로펜텐온 및 글리시리진산을 각각 0.5% 및 0.1% 농도로 가함으로써 주사제를 제조하였다.
실시예 11
정제
(1) 시클로펜텐온 10 mg과 미결정성 셀룰로스의 적정량을 함유하는 정제를 조제하고, 당의를 행함으로써 정제를 제조하였다.
(2) (+)체 시클로펜텐온 0.1 mg, 글리시리진산디칼륨 10 mg 및 미결정 셀룰로스의 적정량을 함유하는 정제를 조제하고, 당의를 행함으로써 정제를 제조하였다.
실시예 12
연고
시클로펜텐온 1g
흡수 연고(일본 약국방 수록) 99g
시클로펜텐온을 우선 소량의 흡수 연고와 충분히 반죽하고, 이어서 남은 흡수 연고를 서서히 가하여 균일하게 될 때까지 반죽하여 연고를 제조하였다.
이 연고는 하루 4∼5 회 환부에 도포한다.
실시예 13
(1) 펙틴(포모신 펙틴 LM-13CG : 허큘리스사 제품) 5 kg을 수도물 100 리터에 첨가하고, 액 온도 28℃에서 액 온도 120℃가 될 때까지 수증기 취입에 의해 35 분간 승온시킨 후, 교반 하에 120℃, 5시간 보온하고, 이어서 냉각하여 냉각물 135 리터를 조제하였다. 다음에 냉각물에 여과 조제로서, 셀라이트 #545(셀라이트사 제품) 1.35 kg 및 실리카 #600-S(쥬오 실리카사 제품) 1.35 kg을 첨가한 후, 셀라이트 #545 0.1 kg 및 실리카 #600-S 0.1 kg으로 프리코트한 컴팩트 필터(6인치 16단 여과지: ADVANTEC#327)로 여과하였다. 얻어진 여과액은 플레이트 히터(히사카 세이사쿠쇼 제품)에 의한 연속 순간 가열 처리(98℃, 60 초)를 행한 후 냉각하여 150리터의 시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액을 조제하였다.
시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액의 pH는 약 3.5, 산도는 6.2 ㎖, 당도는 58 Brix%였다. 또 pH는 pH 미터로 측정하고, 산도는 시료 10 ㎖를 pH 7.0으로 중화시키는 데 필요한 0.1N NaOH량(㎖)으로 표시하였다. 또한 당도는 브릭스 당도계로 측정하였다.
(2) 하기 조성으로 음료를 조제하였다.
과당-포도당-액당 5.00%
설탕 4.00%
산미료 1.20%
향료 0.30%
시클로펜텐온 함유물 0.5%
정제수 적당량
계 100.00%
또한 시클로펜텐온 함유물로는 실시예 13-(1)에 기재된 시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액을 사용하여 그 고형물 환산량을 첨가하였다. 이 음료 100 ㎖ 중에는 4 ㎎의 시클로펜텐온이 함유되어 있다.
본 발명에 따르면, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 화합물을 유효 성분으로 하는 항바이러스제가 제공된다. 본 발명의 항바이러스제는 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키고, 또한 바이러스 미감염의 정상 세포에 바이러스 저항성을 부여하고, 그 상승 작용에 의해 난치료성의 바이러스 질환, 예컨대 AIDS, C형 간염 등의 치료 및 증상 개선에 매우 유용한 항바이러스제이다. 또한 본 발명에 따르면, 간기능 개선 작용, 열 쇼크 단백질 유도 작용, 바이러스 발암 예방 작용, 항프로모터 작용 등의 생리 활성을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 함유하는 의약품이 제공되며, 이 의약품은 생체의 항상성 유지, 특히 위장 건강 유지에 유용한 의약품이 된다.
또한 본 발명에 따르면, 세포에 바이러스 저항성을 유도하는 기능을 가지며, 또한 바이러스 감염 세포를 선택적으로 사멸시키는 기능을 갖는 화합물, 예컨대 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들 염 중에서 선택되는 화합물을 유효 성분으로 하는 항바이러스용 식품 또는 항바이러스용 음료가 제공되며, 이들 음식품은 바이러스가 원인이 되는 여러 가지 질병의 증상 개선용 음식품 또는 예방용 음식품으로서 유용하다. 또한 본 발명에 따르면, 간기능 개선 작용, 열 쇼크 단백질 유도 작용, 바이러스 발암 예방 작용, 항프로모터 작용 등의 생리 활성을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 함유하는 음식품이 제공되며, 이 음식품은 생체의 항상성 유지, 특히 위장 건강 유지에 유용한 음식품이 된다.

Claims (5)

  1. 하기식 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스제:
    화학식 1
  2. 제1항에 있어서, 바이러스가 사람의 후천성 면역 결핍 바이러스 또는 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
  3. 제1항에 있어서, 사람용 항바이러스제, 비사람 동물용 항바이러스제 또는 식물용 항바이러스제인 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
  4. 제3항에 있어서, 가축, 가금, 어류 또는 새우류용 항바이러스제인 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스용 식품 또는 항바이러스용 음료:
    화학식 1
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