KR100459581B1 - 당뇨병 치료제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료제 또는 예방제에 관한 것이다.
화학식 1

Description

당뇨병 치료제{DIABETES REMEDIES}
당뇨병은 고혈당으로 인해 야기되는 복합 질환이며, 인슐린 결핍 때문에 그 보충을 필요로 하는 인슐린 의존형 당뇨병과 인슐린이 충분한 양으로 생산되어 있음에도 불구하고, 수용체나 당 수송 담체의 이상 등의 이유로 작용이 발현되지 않는 인슐린 비의존형 당뇨병으로 크게 구별된다.
본 발명은 당질 대사에 작용하는 의약 및 당질 대사의 이상에 기인하는 질병의 증상 개선용 또는 질병 예방용 식품 또는 음료에 관한 것이다.
도 1은 시클로펜텐온 투여량과 혈당치의 관계를 나타내는 도면이고,
도 2는 시클로펜텐온 투여량과 혈청 인슐린치의 관계를 나타내는 도면이며,
도 3은 시클로펜텐온 투여량과 혈청 트리글리세리드치의 관계를 나타내는 도면이고,
도 4는 시클로펜텐온 투여량과 혈청 유리 지방산치의 관계를 나타내는 도면이며,
도 5는 시클로펜텐온 농도와 종양 괴사 인자 생산량의 관계를 나타내는 도면이고,
도 6은 (-)체 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (-)체 시클로펜텐온의 입체 구조를 나타내는 도면이며,
도 7은 (+)체 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (+)체 시클로펜텐온의 입체 구조를 나타내는 도면이다.
발명의 실시 형태
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 사용되는 화학식 1로 표시되는 시클로펜텐온은 4 번 위치와 5 번 위치의 히드록실기의 입체 배치가 시스 이성체와 트랜스 이성체인 것 모두를 포함한다. 본 발명에 있어서는 시스체 시클로펜텐온을 사용할 수 있고, 트랜스체 시클로펜텐온을 사용할 수도 있으며, 시스체 시클로펜텐온과 트랜스체 시클로펜텐온의 혼합물을 사용할 수도 있다. 또한, 이들의 광학 활성체를 사용할 수도 있다.
시스체 시클로펜텐온은 화학 합성법에 의해서 얻을 수 있다[Helvetica Chimica Acta, 제55권, 제2838∼2844면(1972)]. 트랜스체 시클로펜텐온은 화학 합성법에 의해서도 얻을 수 있고[Carbohydrate Res., 제247권, 제217∼222면(1993)], 또한 우론산, 예컨대 글루쿠론산, 우론산 유도체, 예컨대 글루쿠로노락톤, 또는 이들의 함유물 등을 가열 처리함으로써도 얻을 수 있다(PCT/JP97/03052호 명세서 참조). 본 발명에서는 시클로펜텐온을 함유하는 이들의 가열 처리물, 그 부분 정제물 및 정제물도 사용할 수 있다.
예컨대, 우론산으로서 D-글루쿠론산를 사용하여, 그 1% 용액을 121℃에서 4시간 가열 처리함으로써 가열 처리물 중에 시클로펜텐온이 생성된다. 이 가열 처리물 중의 시클로펜텐온을 용매로 추출하여, 추출물을 농축시킨다. 다음에, 이 농축물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 용출되는 시클로펜텐온 분획을 농축시키고, 농축물로부터 시클로펜텐온을 클로로포름으로 추출하여, 추출 농축물의 순상(順相) 컬럼 크로마토그래피를 행함으로써 가열 처리물 중의 시클로펜텐온이 단리된다.
시클로펜텐온의 물성을 하기에 나타낸다. 또 시클로펜텐온의 질량 분석은 DX302 질량 분석계(니혼 덴시사 제품)를 사용하여 행하였다. 또한, 중클로로포름 용매를 사용한 NMR 스펙트럼의 측정은 JNM-A500(니혼 덴시사 제품)을 사용하였다. 비선광도는 DlP-370형 선광계(니혼 분코사 제품), UV 흡수 스펙트럼은 UV-2500 분광 광도계(시마즈 세이사쿠쇼 제품), 적외 흡수 스펙트럼(IR)은 FTIR- 8000 적외 분광 광도계(시마즈 세이사쿠쇼 제품)를 각각 사용하여 측정하였다.
MS m/z 115〔M+H〕+
1H-NMR(CDCl3)
δ4.20(1H, d, J = 2.4 Hz, 5-H), 4.83(1H, m, 4-H), 6.30(1H, dd, J = 1.2, 6.1 Hz, 2-H), 7.48(1H, dd, J = 2.1, 6.1 Hz, 3-H)
단,1H-NMR의 화학 시프트 값은 CHCl3의 화학 시프트 값을 7.26 ppm으로 하여 나타내었다.
선광도: [α]D 200°(c1.3, 물)
UV: λmax 215 nm(물)
IR(KBr법): 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm-1에서 흡수를 나타낸다.
단리된 시클로펜텐온을 광학 분할함으로써, (-)-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 및 (+)-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온을 얻을 수 있다. 당연히, 합성 방법에 의해 생성된 시클로펜텐온도 광학 분할할 수 있다.
예컨대, 시클로펜텐온을 에탄올에 용해시킨다. 이 에탄올 용액에 헥산/에탄올(94/6)을 더 가하여, 시클로펜텐온 용액을 조제한다. 이 시료 용액을, 예컨대 키랄 팩 AS(다이셀 가가쿠 고교 제품) 컬럼을 사용하여 컬럼 온도: 40℃, 이동상: 헥산/에탄올(94/6)로 HPLC를 행함으로써 시클로펜텐온을 광학 분할할 수 있다.
분할된 (-)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온[이하, (-)체 시클로펜텐온이라고 함]의 선광도는 [α]D 20-105°(c0.30, 에탄올)이며, (+)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온[이하, (+)체 시클로펜텐온이라고 함]의 선광도는 [α]D 20+104°(c0.53, 에탄올)이다. 또한, 선광도는 상기 DIP-370형 선광계(니혼 분코사 제품)를 사용하여 측정하였다.
다음에, (-)체 시클로펜텐온 및 (+)체 시클로펜텐온의 각각의 질량 분석, 핵 자기 공명법(NMR)에 의한 구조 해석, UV 흡수 스펙트럼의 측정, 적외 흡수 스펙트럼의 측정을 상기 방법에 따라서 행한다. 그 결과, 양 광학 활성체는 광학 분할 전의 시클로펜텐온과 동일한 결과를 나타낸다.
광학 분할된 (-)체 시클로펜텐온 및 (+)체 시클로펜텐온을 각각 p-디메틸아미노벤조일 유도체로 하고, J-720형 원이색성 분산계(니혼 분코사 제품)를 사용하여, 원이색성 스펙트럼(CD)을 측정하고, 그 결과를 디벤조에이트 키랄성 룰에 적용하여[J. Am. Chem Soc., 제91권, 제3989∼399면(1969)], 그 입체 배치를 결정하였다.
(-)체 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (-)체 시클로펜텐온의 입체 구조를 도 6에 나타낸다. 도면 중, 종축은 몰 원이색성, 횡축은 파장(nm)을 나타낸다. 또한, 상기 입체 구조를 화학식 2로서 하기에 나타낸다:
(+)체 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (+)체 시클로펜텐온의 입체 구조를 도 7에 나타낸다. 도면 중, 종축은 몰 원이색성, 횡축은 파장(nm)을 나타낸다. 또한, 상기 입체 구조를 화학식 3으로 하기에 나타낸다.
도 6, 7 및 화학식 2, 화학식 3에 나타낸 바와 같이, (-)체 시클로펜텐온은 (-)-(4R,5S)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온, (+)체 시클로펜텐온은 (+)-(4S,5R)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온이다.
이상, 본 발명에 사용하는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체는 어떠한 방법으로도 제조할 수 있고, 명세서에서 개시한 방법으로 제조할 수도 있으며, 화학 합성방법으로 합성할 수도 있고, 시클로펜텐온의 트랜스체, 시스체, 이들의 혼합물 및 이들의 광학 활성체도 본 발명에 사용될 수 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체의 염으로는 의약적으로 허용되는 염이 있으며, 공지의 방법에 의해 변환시킬 수 있다.
시클로펜텐온은 생체 내에서, 예컨대 SH기 함유 화합물(예컨대, 시스테인, 글루타티온 등)과 반응하여, 의약으로서 유용한 대사 유도체를 생성한다. 따라서, 이 대사 유도체가 나타내는 약효는 시클로펜텐온을 투여한 경우에 있어서도 얻을 수 있다고 생각된다. 생체 내에서의 시클로펜텐온과 SH기 함유 화합물과의 반응 생성물은 대사 유효 물질의 하나로 추정된다.
즉 SH기 함유 화합물(R-SH)에 관해서 예시하면, 시클로펜텐온은 SH기 함유 화합물과 반응하여, 예컨대 하기 화학식 4 또는 하기 화학식 5로 표시되는 화합물이 된다. 또한 화학식 5로 표시되는 화합물은 화학식 4로 표시되는 화합물로 변환된다.
이와 같이, 시클로펜텐온은 SH기 함유 화합물(R-SH)의 존재 하에서, 각 대사 유도체로 변환되어, 생체 내에 있어서 생성되는 이들의 대사 유도체도 의약으로서의 효과를 발휘한다.
(단, R은 SH기 함유 화합물에서 SH기를 제거한 잔기이다).
(단, R은 SH기 함유 화합물에서 SH기를 제거한 잔기이다.)
따라서, 이들 생체 내에서 형성되는 반응 생성물, 즉 생체 내에서의 대사 유도체의 형성을 목적으로 하는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염의 사용도 본 발명에 포함되는 것이다.
최근, 당뇨병의 병리 연구 결과로부터, 정상적인 지방 세포는 전신에서의 인슐린 작용이 정상적으로 행해지기 위한 중요한 역할을 담당하며, 당 대사를 원활하게 진행시키기 위해서는 정상적인 지방 세포가 필요하게 된다는 것이 밝혀졌다[실험의학, 제14권, 제61∼68면(1996)].
시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 전구 지방 세포, 예컨대 섬유아 전구 세포의 분화 유도능을 가지며, 이 세포를 지방 세포로 분화 유도한다. 그래서, 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 화합물을 섭취함으로써 정상적인 지방 세포가 증가하여 당뇨병의 증상이 개선되는 것으로 추정된다.
시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 혈당 저하 작용을 가지며, 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 하는 당뇨병 치료제 또는 예방제를 제조할 수 있다.
즉, 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 하여, 이것을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화하면 당뇨병 치료제 또는 예방제를 제조할 수 있다. 상기 제제의 제조는 일반적으로는 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고형의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라서 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정화제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 윤활제 등을 첨가하여, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상의 용액, 현탁액, 에멀션 등의 액제로 할 수 있다. 또한, 이것을 사용 전에 적당한 담체를 첨가함으로써 액상이 될 수 있는 건조품으로 할 수 있다.
의약용 담체는 상기 투여 형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있으며, 경구제의 경우는, 예컨대 전분, 젖당, 백당, 만니톨, 카르복시메틸셀룰로스, 콘스타치, 무기염 등이 사용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 조미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.
한편, 비경구제의 경우는, 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효 성분인 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리 식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜, 필요에 따라서, 살균제, 안정화제, 등장화제, 무통화제 등을 첨가함으로써 조제된다.
본 발명의 당뇨병 치료제 또는 예방제는 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여된다. 투여 방법도 특별히 한정되지는 않으며, 내용, 외용 및 주사에 의한 것으로 할 수 있다. 주사제는 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있으며, 외용제에는 좌제 등도 포함된다.
당뇨병 치료제 또는 예방제로서의 투여량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 의해서 적절히 설정되며, 일정하지는 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물의 양이 성인 1일당 10 pg∼200 mg/kg이다. 물론 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동되기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 그 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 본 발명의 약제는 그대로 경구 투여하는 것 외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다.
또한, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 당뇨병 개선 또는 예방용 음식품의 원료로서 사용할 수도 있다. 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 함유물을 섭취함으로써 당뇨병이 개선되어, 요당량이 격감된다. 또한 성기능 저하 등의 합병 증상도 현저히 개선된다. 더욱이 고지혈증이 개선된다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 고지혈증 개선 작용, 즉 혈청 토탈 콜레스테롤 저하 작용, 혈청 트리글리세리드 저하 작용, 혈청 유리 지방산 저하 작용을 가지며, 이들 작용을 갖는 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 하여, 이것을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화하면 고지혈증 치료제 또는 고지혈증 예방제를 제조할 수 있다. 상기 제제의 제조는 상기 당뇨병 치료제 또는 예방제에 따라서 행하면 되며, 또 당뇨병 치료제 또는 예방제에 해당하는 방법으로 투여할 수 있다. 또한 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 고지혈증 개선 또는 예방용 음식품의 원료로서 사용할 수도 있다. 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염의 함유물을 섭취함으로써 고지혈증이 개선되어, 혈중 지질량이 격감된다.
또한, 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화 유도능을 갖는 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 유효 성분으로 하여, 이것을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화하면 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화 유도제를 제조할 수 있다. 상기 제제의 제조는 상기 당뇨병 치료제 또는 예방제에 따라서 행하면 되고, 또한 당뇨병 치료제 또는 예방제에 해당하는 방법으로 투여할 수 있다.
또한, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 종양 괴사 인자 생산 억제 작용을 보이며, 종양 괴사 인자가 원인이 되는 인슐린 비의존형 당뇨병[Nature, 제389권, 제610∼614면(1997)]의 치료, 예방에 유용하다.
시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 하는 약제는 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화 유도제로서, 그리고 종양 괴사 인자 생산 억제제로서 유용하다. 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 투여함으로써 혈당치의 개선, 인슐린치의 정상화가 관찰되며, 본 발명의 약제는 당뇨병의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다. 더욱이, 본 발명 약제의 투여에 의해 혈장 중의 트리글리세리드, 유리 지방산치도 정상화되어, 본 발명의 약제는 고지혈증 치료용 또는 예방용 약제로서 사용할 수 있다.
또한, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 유효 성분으로 하는 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화 유도제는 생화학 연구 등에 유용한 분화 유도제이며, 이 분화 유도제를 사용함으로써, 생화학 연구 등에 유용한 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화 유도 방법을 제공할 수 있고, 상기 방법을 사용함으로써 분화 유도의 저해제나 분화 유도제의 스크리닝을 행할 수 있다.
본 발명에서는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염, 시클로펜텐온을 함유하는 가열 처리물, 및 상기 가열 처리물로부터의 부분 정제 시클로펜텐온에서 선택되는 원료를 사용하여, 당뇨병 개선용 또는 예방용 식품 또는 음료, 고지혈증 개선용 또는 예방용 식품 또는 음료, 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화 유도용 식품 또는 음료를 제공할 수 있다.
즉, 시클로펜텐온을 함유하는 가열 처리물, 상기 가열 처리물로부터의 부분 정제 시클로펜텐온, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 원료를 희석 및/또는 첨가하여 제조되는 식품 또는 음료는 본 발명의 식품 또는 음료에 포함된다.
본 발명의 식품 또는 음료의 제조 방법은 특별히 한정되지는 않지만, 조리, 가공 및 일반적으로 사용되는 식품 또는 음료의 제조 방법에 의한 제조를 들 수 있고, 제조된 식품 또는 음료에 당뇨병 개선 작용 또는 예방 작용 등을 갖는 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물이 유효 성분으로 함유될 수 있다.
본 발명의 식품 또는 음료로서는 당뇨병 개선 작용 또는 예방 작용 등을 갖는 시클로펜텐온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물이 함유, 첨가 및/또는 희석되어 있으면 특히 그 형상에 대한 한정은 없고, 정제형, 과립형, 캡슐형, 겔형, 졸형 등의 형상의 경구적으로 섭취 가능한 형상물도 포함한다.
또한, 본 발명에서 사용하는 화합물은 그 생리 활성의 유효량의 투여를 하더라도 독성은 관찰되지 않으며, 예컨대 경구 투여의 경우 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중 어느 하나를 100 mg/kg으로 래트에게 단회 투여하더라도 사망예는 관찰되지 않는다.
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은 혈장 성분을 정상화하여, 당뇨병 등의 질환의 치료 또는 예방에 유효한 화합물을 개발하여, 상기 화합물을 유효 성분으로 하는 의약, 식품 및 음료를 제공하는 데 있다.
발명을 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해서 예의 검토한 결과, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 즉 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온(이하, 단순히 시클로펜텐온이라고 함), 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염이 전구 지방 세포, 예컨대 섬유 아세포의 지방 세포로의 분화 유도능, 종양 괴사 인자 생산 억제능을 가지며, 당뇨병의 치료 또는 예방에 유용하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명의 제1 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온, 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병의 치료제 또는 예방제에 관한 것이다.
본원의 제2 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온, 또는 그 유도체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 개선용 식품 음료, 또는 당뇨병 예방용 식품 음료에 관한 것이다.
이하, 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 하등 한정되는 것은 아니다. 또, 실시예에서의 %는 중량%를 의미한다.
참고예 1
10 g의 D-글루쿠론산(시그마사 제품 G 5269)을 1 리터의 물에 용해시켜, 121℃에서 4 시간 가열한 후 약 10 ㎖가 될 때까지 감압 하에서 농축하였다. 이것에 아세트산부틸:아세트산:물=3:2:2 혼합액의 상층 40 ㎖를 첨가하여 혼합한 후, 원심분리하여 얻은 상청액을 감압 하에서 약 10 ㎖까지 농축시켰다.
상기 추출액을 컬럼 크로마토그래피용 실리카겔 BW-30OSP(2 ×28 ㎝, 후지 실리시아 가가쿠사 제품)에 적용하여, 아세트산부틸:아세트산:물=3:2:2의 상층을 용리액으로서 압축기에 의해 0.2 kg/㎠로 가압하고, 매분 5 ㎖의 유속으로 분리하였다. 1 분획당 10 ㎖가 되도록 분획하고, 각 분획의 일부를 취하여 박층 크로마토그래피로 분석한 결과 61 번에서 80 번까지의 분획에 고순도 시클로펜텐온이 포함되어 있었다. 이들 분획을 모아 감압 하에서 농축시킨 후 40 ㎖의 클로로포름으로 추출하여, 추출액을 감압 하에서 농축시킴으로써 100 ㎎의 시클로펜텐온을 얻었다.
이 분획을 팔팩(Palpack) 타입 S 컬럼(다카라 슈조사 제품)을 사용한 순상 HPLC로 분리하여, 215 nm의 자외선 흡수로 검출한 결과, 순도는 98%였다.
상기 시클로펜텐온 113.9 ㎎을 에탄올 2.85 ㎖에 용해시켰다. 이 에탄올 용액에 헥산/에탄올(94/6) 3.85 ㎖를 더 첨가하여, 17 ㎎/㎖의 시클로펜텐온 용액을 조제하였다. 이 액을 0.5 ㎛의 필터로 여과하여, 광학 분할 HPLC 시료 용액으로 하였다.
이 시료 용액을 이하의 조건에서 광학 분할 HPLC를 행하여, 전 피크의 (-)체 시클로펜텐온 및 후 피크의 (+)체 시클로펜텐온의 분획을 각각 모아, 감압 건조 고체화하여, (-)체 시클로펜텐온 43.2 ㎎, (+)체 시클로펜텐온 43.0 ㎎을 각각 얻었다.
광학 분할 HPLC 조건
컬럼 : 키랄 팩 AS(다이셀 가가쿠 고교) 2.0 cm ×25.0 cm
컬럼 온도 : 40℃
이동상 : 헥산/에탄올(94/6)
유속 : 14.0 ㎖/분
검출 : UV 210 nm
시료 주입량 : 150 ㎕(2.55 ㎎)
생성된 (-)체 시클로펜텐온 및 (+)체 시클로펜텐온은 양자 모두 약 1%의 거울상 이성체를 함유하고 있었기 때문에 상기 조건으로 다시 광학 분할하였다. 그 결과, 전 피크의 (-)체 시클로펜텐온 30.0 ㎎에서 19.7 ㎎의 거울상 이성체를 함유하지 않은 (-)체 시클로펜텐온을, 후 피크의 (+)체 시클로펜텐온 37.4 ㎎에서 27.7 ㎎의 거울상 이성체를 함유하지 않은 (+)체 시클로펜텐온을 각각 얻었다. 또한, (-)체 시클로펜텐온 및 (+)체 시클로펜텐온의 광학 분할 HPLC의 용출 시간은 각각 33 분, 40 분이었다.
실시예 1
소 태아 혈청(FCS)을 5% 포함하는 둘베코(Dulbecco) 개질 이글 배지(DMEM) 중에서 태아 마우스 유래 섬유아 전구 세포 3T3-L1 세포(ATCC CL-173)를 90% 콘플루언스(confluence)가 될 때까지 배양하였다. 한편, FCS를 분획 분자량 3만의 한외 여과막으로 한외 여과하여 생성된 고분자량 분획을 프로테이나제 K, 프로나제, 및 류신 아미노펩티다제 처리한 것(효소 처리 FCS라 함) 5%를 함유하는 DMEM에 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 또는 10-9㎍/㎖의 참고예 1에 기재된 방법으로 조제한 시클로펜텐온 또는 100, 50, 10, 5, 1, 또는 0.2 ㎍/㎖의 인슐린(다카라 슈조사 제품)을 첨가하여 9 일간 배양하였다. 또, 배양 3 일 후와 6 일 후에 각각의 농도의 시클로펜텐온 또는 인슐린을 포함하는 신선한 배지로 교환하였다. 배지 세포 중에 포함되는 지방을 오일 레드 O(시그마사 제품)로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 세포가 지방 세포로 분화되어 지방이 축적되면 적색으로 염색된다.
그 결과를 표 1에 나타낸다. 또한, 표 1에서, -는 지방의 축적이 보이지 않는 것을, ±는 지방의 축적이 세포의 25% 미만으로 보이는 것을, +는 지방의 축적이 세포의 25% 이상 50% 미만으로 보이는 것을, ++는 지방의 축적이 세포의 50% 이상 75% 미만으로 보이는 것을, +++는 지방의 축적이 세포의 75% 이상으로 보이는 것을 나타낸다.
시클로펜텐온(㎍/㎖) 지방 축적의 정도
10-1 ±
10-2 +
10-3 ++
10-4 ++
10-5 +++
10-6 +++
10-7 ++
10-8 ±
10-9 -
0 -
인슐린(㎍/㎖) 지방 축적의 정도
100 ++
50 +++
10 +++
5 ++
1 +
0.2 +
0 -
표 1에 나타낸 바와 같이, 10∼50 ㎍/㎖의 인슐린을 첨가하였을 때 지방 축적의 정도가 +++가 된 것에 반해, 10-5∼10-6㎍/㎖의 시클로펜텐온을 첨가하였을 때에는 지방 축적의 정도가 +++가 되었다. 시클로펜텐온은 저농도에서 지방 세포로의 분화 유도 활성을 나타내었다.
또한, (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온에 관해서도 같은 결과를 얻었다.
실시예 2
(1) 인슐린 비의존형 당뇨병 자연 발증 마우스의 KK-Ay마우스(수컷, 10주령, 체중 약 40 g)은 니혼 구레아사로부터 구입하였다. CE-2(니혼 구레아사)를 먹이로 주어, 약 일주일의 단독 예비 사육후, 11 주령일 때 시험에 사용하였다. 1 군 8∼9 마리의 마우스에게, 참고예 1에 기재된 방법으로 조제한 시클로펜텐온을 체중 1kg당 0.1 mg, 1 mg, 10 mg을 각각 1 일 1 회, 4 일 째까지 합계 5 회 연일 강제 경구 투여하여, 4 일째에 안저(眼底) 정맥에서부터 채혈하였다. 대조군에는 시클로펜텐온 대신에 물을 주고, 마우스로부터 같은 식으로 채혈하여, 혈장 분리후, 글루코스 측정 시약(GLU 네오 시노테스트; 시노테스트사)으로 혈장 중의 글루코스량을 측정하였다.
그 결과를 표 2에 나타낸다. 혈장 중의 혈당량은 시클로펜텐온 투여군에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 강하 작용이 관찰되며, 특히 10 mg/kg/일, 5회 투여군의 혈장 중의 혈당치는 대조군의 그것에 비하여, 혈당량의 강하 작용이 관찰되었다. 또한, 시클로펜텐온 투여군과 대조군에 있어서 체중 증감의 차는 관찰되지 않았다.
시클로펜텐온 투여량(mg/kg/일) 마리수 혈장 글루코스(mg/dl)(4 일째 채혈)
-(대조군) 9 432.3 ±45.4
0.1 8 411.9 ±44.0
1 9 327.9 ±25.4
10 9 269.8 ±28.5
(2) KK-Ay마우스(수컷, 4주령)를 니혼 구레아사로부터 구입하여, 10 주령까지 사육한 후, 참고예 1에 기재된 방법으로 조제한 시클로펜텐온을 14 일간 경구 투여하여, 혈당, 혈중 인슐린 및 지질에 미치는 영향을 검토하였다. 시클로펜텐온은 13 mg/kg의 용량을 사용하였다. 혈당치는 13 mg/kg의 시클로펜텐온 투여군에서 저하되었다(도 1). 혈청 인슐린치는 13 mg/kg의 시클로펜텐온 투여군에서 저하되었다(도 2). 혈청 지질에 대하여, 트리글리세리드치는 13 mg/kg의 시클로펜텐온 투여군에서 저하되고(도 3), 유리 지방산은 13 mg/kg의 시클로펜텐온 투여군에서 저하되었다(도 4).
즉, 도 1은 시클로펜텐온 투여량과 혈당치의 관계를 나타내는 도면이며, 도면 중 종축은 혈청 글루코스치(mg/dl), 횡축은 시클로펜텐온 투여량(mg/kg)을 나타낸다. 도 2는 시클로펜텐온 투여량과 혈청 인슐린치의 관계를 나타내는 도면이며, 도면 중 종축은 혈청 인슐린치(μU/㎖), 횡축은 시클로펜텐온 투여량(mg/kg)을 나타낸다. 도 3은 시클로펜텐온 투여량과 혈청 트리글리세리드치의 관계를 나타내는 도면이며, 도면 중 종축은 혈청 트리글리세리드치(mg/dl), 횡축은 시클로펜텐온 투여량(mg/kg)을 나타낸다. 도 4는 시클로펜텐온 투여량과 혈청 유리 지방산치의 관계를 나타낸 도면이며, 도면 중 종축은 혈청 유리 지방산치(μEq/리터), 횡축은 시클로펜텐온 투여량(mg/kg)을 나타낸다. 또한, 도면 중 *은 당네트 멀티플 비교 시험에 의해 시클로펜텐온 무투여군에 대한 유의적 차 p＜0.05를, **은 p＜0.01을 의미한다.
또한, 동물은 생리 식염수(5 ㎖/kg) 또는 시클로펜텐온 13 mg/5 ㎖/kg을 투여하는 2 군으로 구성하고, 각 군은 10 마리로 하였다. 각 시험 물질은 1 일 1 회 14 일간 경구 투여하고, 최종 투여일에는 시험 물질 투여 4 시간후 에테르 마취하여, 하복부 대정맥에서 채혈하였다.
혈청 인슐린은 효소-면역법(시판 키트: 글라짐 인슐린-EIATEST, 와코 쥰쿠사 제품)으로 측정하였다. 혈청 중의 당, 트리글리세리드 및 유리 지방산은 각각 헥소키나아제-G6PDH법, GPO·DAOS법 및 ACS·ACOD법으로 자동 분석 장치(7070형: 히타치 세이사쿠쇼 제품)를 사용하여 측정하였다.
이상의 결과로부터 시클로펜텐온에 혈당, 인슐린 및 지질 저하 효과가 확인되었다.
또한, (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온에 관해서도 같은 결과를 얻었다.
실시예 3
(1) 20 주령 암컷 CDF1계 마우스에게 생리 식염수에 용해시킨 살모넬라 아보타스 이퀴(Salmonella abortus equi) 유래의 LPS(리포폴리사카라이드: 시그마사 제품)를 복강내 투여(0.1 mg/kg)하여, 내독소 쇼크 모델을 제작하였다.
시클로펜텐온은 LPS 투여 30 분 전에 30 mg/kg의 용량으로 복강내 투여 또는 경구 투여하였다. 한편, 대조군은 무처치로 하였다. LPS 투여 90 분 후에 마우스로부터 혈액을 채취하여, 혈청을 분리하였다. 다음에, 혈청 중의 종양 괴사 인자량을 TNF-α·ELISA 키트(젠자임사 제품)로 측정하여 시클로펜텐온 투여에 의한 종양 괴사 인자 생산 억제 효과를 측정하였다.
그 결과를 표 3에 나타낸다. 즉, 대조군에 대해, 시클로펜텐온 투여군에서는 복강내 투여군, 경구 투여군 중 어느 쪽의 군에서도, 혈청 중의 종양 괴사 인자의 농도는 낮은 값이었으며, 시클로펜텐온 투여에 의해, 종양 괴사 인자의 생산이 유의 수준으로 억제되고 있었다.
군 마리수 혈청중 TNF-α(ng/ml)평균 ±SE
대조군 5 3.96 ±0.52
시클로펜텐온 복강내 투여군 5 0.58 ±0.08**
시클로펜텐온 경구 투여군 5 1.80 ±0.30*
** p < 0.001에서 대조군에 대해 유의함
* p < 0.01에서 대조군에 대해 유의함
(2) 8 주령 암컷 CDF1계 마우스를 사용하여 LPS를 복강내 투여(10㎍/마우스)하여, 내독소 쇼크 모델을 제작하였다. 시클로펜텐온은 LPS 투여 15 분 전에, 0.03, 0.3, 3, 30 mg/kg의 용량으로 피하 투여하였다(1 군 4 마리). LPS 투여 1 시간 후에 마우스로부터 채혈하여, 혈청을 분리하고, 혈청 중 종양 괴사 인자-α량을 시판 ELISA 키트(엔도젠사 제품)로 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 즉, LPS 투여에 의한 혈청 중의 종양 괴사 인자-α 농도의 상승은 시클로펜텐온에 의해 용량 의존적으로 억제되었다.
투여량(mg/kg) 종양 괴사 인자량(ng/ml)평균 ±SD
대조군 3.00 ±0.30
시클로펜탄온투여군 30 0.24 ±0.08
3 1.41 ±0.45
0.3 2.30 ±0.24
0.03 2.68 ±0.28
(3) 8 주령 암컷 CDF1계 마우스의 복강 내에 파라핀 오일(코스모 바이오사) 2 ㎖를 투여하여, 복강 마크로 파지(Mφ)를 유도하였다. 파라핀 오일 투여 일주일후 마우스의 복강내에 RPMI-1640 배지(기부코사) 4 ㎖를 주입하여 잘 마사지한 후 회수하여, 복강 세포를 얻었다.
복강 세포는 RPMI-1640 배지에서 2회 세정한 후, 10% 소 태아 혈청(FCS: 하이크론사)을 포함한 RPMI-1640 배지에 현탁하여, 세포 농도를 1 ×106세포/㎖로 조정하였다. 조정한 세포액 1 ㎖를 24 웰 플레이트에 채취하고, 37℃ C02인큐베이터에서 2 시간 배양하였다. 배양 후 상청액에 포함되는 비접착 세포를 제거하여, 접착 세포를 복강 Mφ로서 사용하였다.
플레이트의 각 웰에 10% FCS를 포함한 RPMI-l640 배지 800 ㎕를 가한 후, 생리 식염수(오츠카 세이야쿠사 제품)에 용해시킨 1, 10, 100, 1000 μM의 시클로펜텐온 100 ㎕를 첨가하여, 37℃ C02인큐베이터에서 1 시간 배양하였다.
배양 후 100 ng/㎖의 리포폴리사카라이드(시그마사 제품) 100 ㎕ 를 첨가하여, 또다시 24 시간 배양하였다. 배양 종료후, 배양 상청액을 회수하여 생성된 종양 괴사 인자-α량을 시판되는 ELISA 키트(엔도젠사 제품)를 사용하여 정량하였다.
그 결과를 도 5에 나타낸다. 즉, 도 5는 시클로펜텐온 농도와 종양 괴사 인자 생산량의 관계를 나타낸 도면이며, 종축은 종양 괴사 인자량(pg/㎖), 횡축은 각 시료의 시클로펜텐온 농도(μM)를 나타낸다.
시클로펜텐온은 10 μM 이상의 농도에서 리포폴리사카라이드가 유발하는 마우스 복강 대식세포로부터의 종양 괴사 인자 생산을 현저히 억제하였다.
이상, 시클로펜텐온은 종양 괴사 인자 생산 억제 작용을 나타내었다. 또한 (-)체 시클로펜텐온, (+)체 시클로펜텐온에 관해서도 같은 결과를 얻었다.
실시예 4
5 년 전에 인슐린 비의존형 당뇨병이라고 진단되어, 치료약으로서 유글루콘(야마노우치 세이야쿠사 판매)을 하루 1 정 복용하여 당뇨병의 치료를 받아 왔지만, 마일스 산쿄사 제품의 요당 시험지를 사용하여 측정한 요당이 공복 시에 (+++)로 당뇨병의 개선이 보이지 않았던 남성(55 세)이 하기 실시예 7-(2)에서 얻어진 음료를 매일 50 ㎖(시클로펜텐온 2 mg 함유)씩 3 개월 음용한 결과, 공복 시의 요당의 측정에서 (-)가 되어, 현저한 인슐린 비의존형 당뇨병의 치유가 관찰되었다. 또한, 인슐린 비의존형 당뇨병의 치유와 함께, 성기능의 현저한 회복이 관찰되었다.
실시예 5
주사제
(1) 생리 식염액(일본약국방 수록품)에 시클로펜텐온을 1% 농도로 가하여 주사제를 제조하였다.
(2) 생리 식염수(상기와 동일)에 (-)체 시클로펜텐온 및 글리시리진산을 각각 0.5% 및 0.1% 농도로 가하여, 주사제를 제조하였다.
실시예 6
정제
(1) 시클로펜텐온 100 mg과 미결정성 셀룰로스의 적정량을 함유하는 정제를 조제하고, 당의정을 제조하였다.
(2) (+)체 시클로펜텐온 0.1 mg, 글리시리진산디칼륨 10 mg 및 미결정 셀룰로오스의 적정량을 함유하는 정제를 조제하고, 당의정을 제조하였다.
실시예 7
(1) 펙틴(포모신 펙틴 LM-l3CG : 허큘리스사 제품) 5 kg을 수도물 100 리터에 첨가하여, 액 온도 28℃에서 액 온도 120℃가 될 때까지 수증기 취입에 의해 35 분간 승온시키고, 이어서, 교반 하에서 120℃, 5 시간 보온하고, 계속해서 냉각시켜서 냉각수 135 리터를 조제하였다. 그 다음, 냉각수에 여과 조제로서 셀라이트 #545(셀라이트사 제품) 1.35 kg, 및 실리카 #600-S(쥬오 실리카사 제품) 1.35 kg을 첨가한 후, 셀라이트 #545 0.1 kg, 및 실리카 #600-S 0.1 kg로 프리 코트한 컴팩트 필터(6인치 16단 여과지 : ADVANTEC #327)로 여과하였다. 얻어진 여과액은 플레이트 히터(히사카 세이사쿠쇼 제품)에 의한 연속 순간 가열 처리(98℃, 60 초)를 행한 후 냉각시켜서, 150 리터의 시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액을 조제하였다.
시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액의 pH는 약 3.5, 산도는 6.2 ㎖, 당도는 58 Brix%였다. 또한, pH는 pH 미터로 측정하고, 산도는 시료 10 ㎖를 pH 7.0로 중화시키는 데 필요한 0.1 N NaOH량(㎖)으로 나타내었다. 또한, 당도는 브릭스 당도계로 측정하였다.
(2) 하기 조성으로 음료를 조제하였다.
과당-포도당-액당 5.00%
설탕 4.00%
산미료 1.20%
향료 0.30%
시클로펜텐온 함유물 0.5%
정제수 적당량
계 100.00%
또한 시클로펜텐온 함유물로는 실시예 7-(1)에 기재된 시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액을 사용하여 그 고형물 환산량을 첨가하였다. 이 음료 100 ㎖ 중에는 4 ㎎의 시클로펜텐온이 함유되어 있다.
본 발명에 의해 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화 유도 작용, 종양 괴사 인자 생산 억제 작용을 가지며, 당뇨병 특히 인슐린 비의존형 당뇨병의 치료, 개선 또는 예방 작용을 갖는 의약이 제공된다. 또한 고지혈증의 치료, 예방에 유용한 의약이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 식품 또는 음료 중에 생리 활성을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들 염의 적정량을 함유시키는 것이 가능하게 되었다. 이들 화합물이 가진 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화 유도 작용, 종양 괴사 인자 생산 억제 작용에 의해, 본 발명의 식품 또는 음료는 당뇨병, 특히 인슐린 비의존형 당뇨병 개선용 또는 예방용, 고지혈증의 증상 개선용 또는 예방용 식품 또는 음료로서 유용하며, 당뇨병에 동반하는 합병증, 녹내장, 성기능 저하, 고지혈증 등의 증상의 개선 또는 예방에도 매우 유용하다.

Claims (2)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료제 또는 예방제:
    화학식 1
  2. 하기 화학식 1로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 개선용 식품 또는 음료, 또는 당뇨병 예방용 식품 또는 음료:
    화학식 1
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