CN1138538C - 抗病毒剂 - Google Patents

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Abstract

以含有有效成分——选自下述式〔I〕表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮或其光学活性体或它们的盐中至少一种以上的化合物——为特征的抗病毒剂。

Description

抗病毒剂
发明所属技术领域
本发明涉及通过抗病毒作用对病原生物有效的药物或饮食品。
背景技术
考虑抗病毒作用时，要考虑抑制细胞被病毒感染、抑制感染细胞中病毒的增殖等诱导产生抵抗病毒能力的作用、把已感染病毒的细胞选择性杀死的作用以及使病毒自身失活(丧失感染力)的作用。
作为具有使病毒自身失活作用的物质，有对于病毒的中和抗体。另外，诱导产生这种抗体的方法有疫苗。但是，虽然通过投给疫苗诱导产生抗体对于预防病毒感染是有效的，但目前还没有使用抗体进行有效治疗的方法。而且，使用能直接使病毒失活的药剂进行有效治疗的方法也还没有。
作为诱导产生抵抗病毒能力的作用，可以考虑抑制病毒基因组复制、抑制病毒基因的复制、抑制病毒蛋白的合成、抑制病毒蛋白的折叠等。这种作用的诱导包括抑制细胞内转录因子的活性或表达、抑制来源与病毒的转录因子的活性或表达、诱导产生热休克蛋白等。诱导产生这种作用的物质，例如前列腺素。
另外，选择性杀死病毒感染细胞的物质有作为抗疱疹病毒药使用的阿昔洛韦、更昔洛韦、索立夫定等。本发明所要解决的课题
对于病毒采用综合的作用处理比采用单独的作用处理更有效。例如，即使投给可以选择性杀死病毒感染细胞的物质，到感染细胞死亡的这一段时间内，由于病毒增殖感染其它细胞，将病毒完全除去是非常困难的。另一方面，即使投给具有诱导产生抵抗病毒能力作用的物质，也不能除去感染细胞。
本发明的目的在于开发一种具有诱导细胞产生抗病毒性的功能以及选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，提供一种以该物质为有效成分的抗病毒剂、肝功能改善剂、热休克蛋白诱导剂、癌基因致癌防止剂、化学致癌抑制剂等药物以及抗病毒用食品或饮料。解决课题的手段
本发明者为了达到上述目的进行了悉心的研究，结果发现如果使具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物发生作用，可以使病毒感染细胞选择性地受到伤害，同时在直到其死亡的这段时间内可以减少增殖的病毒量；同时，因此直到感染细胞死亡被增殖的病毒新感染的细胞减少；而且由于病毒未感染细胞也可以通过投给该化合物预先获得病毒抵抗能力，即使是新感染的也可以抑制病毒的增殖；也就是说，具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物可以非常有效地除去病毒，例如人类获得性免疫缺陷病毒或丙型肝炎病毒。
本发明中所使用的化合物诱导细胞产生病毒抵抗性的功能可以在化合物对病毒感染前的细胞进行作用后，以抑制病毒对细胞的感染、抑制病毒基因组的复制、抑制病毒基因的复制、抑制病毒蛋白的合成、抑制病毒蛋白的折叠等为指标进行测定。
另外，选择性杀死病毒感染细胞的功能可以通过比较病毒感染细胞与非病毒感染细胞的生存率来测定。
作为具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，只要这两种功能都优良即可，并没有什么限定。
而且，作为具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，本发明者发现了式〔I〕的化合物4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(以下简称为环戊烯酮)或其光学活性体或其盐，从而完成了本发明。
如果对本发明作一概述，本发明的第1个发明涉及抗病毒剂，其特征在于：含有选自下式〔I〕所表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮或其光学活性体或它们的盐中至少一种以上的化合物作为有效成分。
Figure C9880265400051
本发明的第2个发明涉及抗病毒用食品或抗病毒用饮料，其特征在于：含有选自式〔I〕所表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮或其光学活性体或它们的盐中至少一种以上的化合物。
在本发明的优选实施方案中，作为病毒例如人类获得性免疫缺陷病毒或丙型肝炎病毒。另外，作为抗病毒剂例如人类抗病毒剂、非人类动物用抗病毒剂(例如家畜、家禽、鱼类或虾类用抗病毒剂)、或植物用抗病毒剂。
图面说明
图1是表示使用CEM-SS细胞时环戊烯酮浓度与细胞生存率的关系的图。
图2表示使用H9细胞时环戊烯酮浓度与细胞生存率的关系的图。
图3是表示使用CEM-3B细胞时环戊烯酮浓度与细胞生存率的关系的图。
图4是表示使用H9-3B细胞时环戊烯酮浓度与细胞生存率的关系的图。
图5是表示环戊烯酮的致癌抑制作用的图。
图6是表示(-)体环戊烯酮的对二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD以及(-)体环戊烯酮的立体结构的图。
图7是表示(+)体环戊烯酮的对二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD以及(+)体环戊烯酮的立体结构的图。
发明的实施方式
本发明所使用的式〔I〕表示的环戊烯酮包含4位和5位羟基的立体构型为顺式的异构体和立体构型为反式的异构体两种。在本发明中可以使用顺式环戊烯酮，也可以使用反式环戊烯酮，还可以使用顺式环戊烯酮和反式环戊烯酮的混合物。另外，也可以使用它们的光学活性体。
顺式环戊烯酮可以采用化学合成法制得(《瑞士化学学报》Helvetica Chimica Acta，第55卷，第2838～2844页(1972))。反式环戊烯酮也可以采用化学合成法制得(《碳水化合物研究》Carbohydrate Res.，第247卷，第217～222页(1993))，另外也可以通过加热处理糖醛酸(例如葡萄糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡萄糖醛酸内酯)或含有它们的物质(参考PCT/JP97/03052号说明书)。在本发明中可以使用含有环戊烯酮的这些加热处理物、其部分精制物以及精制物。
例如，糖醛酸使用D-葡萄糖醛酸，通过将其1％的溶液在121℃条件下加热处理4小时，在加热处理物中可以生成环戊烯酮。用溶剂提取该加热处理物中的环戊烯酮，浓缩提取物。然后用硅胶柱层析法分离该浓缩物，将洗脱出的环戊烯酮部分浓缩，用氯仿从浓缩物中提取环戊烯酮，提取浓缩物通过正相柱层析法分离得到加热处理物中的环戊烯酮。
环戊烯酮的物理性质如下所示。另外，环戊烯酮的质量分析是采用DX302质量分析仪(日本电子社生产)进行的。另外，使用重氢氯仿溶剂的NMR波谱测定使用JNM-A500(日本电子社生产)。比旋光度使用DIP-370型旋光计(日本分光社生产)测定、UV吸收光谱使用UV-2500分光光度计(岛津制作所生产)测定、红外吸收光谱(IR)使用FTIR-8000红外分光光度计(岛津制作所生产)测定。MS m/z 115〔M+H〕+ 1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)
其中，1H-NMR的化学位移值以CHCl3的化学位移值7.26ppm为准。
旋光度：〔α〕D 20 0°(c1.3，水)
UV：λmax 215nm(水)
IR(KBr法)：在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1处有吸收。
分离得到的环戊烯酮通过光学拆分，可以得到(-)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。当然，通过合成方法得到的环戊烯酮也可以进行光学拆分。
例如，将环戊烯酮溶解于乙醇。在该乙醇溶液中再加入己烷/乙醇(94/6)，调制环戊烯酮溶液。可以将该试样溶液，例如使用Chiral PackAS(Daicel化学工业)柱，在柱温度：40℃、流动相：己烷/乙醇(94/6)的条件下进行HPLC，从而光学拆分环戊烯酮。
拆分得到的(-)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮〔以下称为(-)体环戊烯酮〕的旋光度为〔α〕D 20 -105°(c0.30，乙醇)，(+)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮〔以下称为(+)体环戊烯酮〕的旋光度为〔α〕D 20+104°(c0.53，乙醇)。另外，旋光度是使用上述DIP-370型旋光计(日本分光社生产)来测定的。
以下，按照上述记载的方法对(-)体环戊烯酮和(+)体环戊烯酮分别进行质量分析、通过核磁共振法(NMR)进行结构解析、测定UV吸收光谱、测定红外吸收光谱。其结果表明，两种光学活性体具有与光学拆分前的环戊烯酮相同的结果。
将光学拆分得到的(-)体环戊烯酮与(+)体环戊烯酮分别制成对二甲基氨基苯甲酰基衍生物，使用J-720型圆二色性分散计(日本分光社生产)测定圆二色谱(CD)，将其结果应用于二苯甲酸盐偏光力规则(J.Am.Chem.Soc.，第91卷，第3989～3991页(1996))，确定其立体构型。
(-)体环戊烯酮的对二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD及(-)体环戊烯酮的立体结构如图6所示。图中纵轴表示摩尔圆二色性，横轴表示波长(nm)。另外，上述立体结构如下式〔II〕所示：
(+)体环戊烯酮的对二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD及(+)体环戊烯酮的立体结构如图7所示。图中纵轴表示摩尔圆二色性，横轴表示波长(nm)。另外，上述立体结构如下式〔III〕所示：
如图6、7及式〔II〕、式〔III〕所示，(-)体环戊烯酮为(-)-(4R，5S)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮，(+)体环戊烯酮为(+)-(4S，5R)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
以上本发明所使用环戊烯酮或其光学活性体可以采用任何方法制备，可以采用说明书中描述的方法制备，也可以采用化学合成方法合成，本发明也可以使用环戊烯酮的反式体、顺式体及其混合物。当然，采用化学合成法得到的环戊烯酮的光学活性体也可以包含在本发明所描述的光学活性体中。
环戊烯酮或其光学活性体的盐为可药用盐，可以按照公知的方法进行变换。
本发明所使用的具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、并且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐，具有抗病毒作用，可以制造以选自这些化合物中的至少一种化合物作为有效成分的抗病毒剂。
也就是说，以具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、并且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物为有效成分，将其与公知的药用载体组合进行制剂化，可以制造抗病毒剂。
抗病毒剂的制造，一般可以将具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、并且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中至少1种以上的化合物，与可药用的液体或固体载体配合，而且在必要时加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体制剂；溶液剂、悬浊剂、乳剂等液体制剂。另外，可以将其制成干燥品，在使用前加入适当的载体可以成为液体。
药用载体可以根据上述给药方式及剂型进行选择，口服制剂的场合可以使用例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，制造口服制剂时还可以加入粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂、着色剂、香料等。
另一方面，非口服制剂的场合可以按照常规方法将本发明的有效成分——具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、并且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中的至少1种以上的化合物，溶解乃至悬浊于注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀释剂中，必要时加入杀菌剂、稳定剂、等渗剂、无痛化剂等而制得。
本发明的抗病毒剂可以相应于制剂形态采用适当的给药途径给药。给药方法也没有特别的限定，可以内用、外用和注射。注射剂可以静脉、肌肉、皮下、皮内给药，外用剂也包括栓剂等。
抗病毒剂的给药量可以根据其制剂形态、给药方式、使用目的及其所适用的患者的年龄、体重、症状适当设定，虽然并不是一定的，但是一般来说，制剂中含有的具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、并且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中至少一种以上的物质的量为成人每天0.1μg～20mg/kg。当然，给药量根据各种条件而有所变动，既有少于上述给药量就足够的场合，也有必需超范围的场合。本发明的药剂除可以直接口服之外，还可以添加到任意的饮食品中使之进行日常的摄取。另外，具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、并且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐，也可以用作抗病毒剂、抗病毒用食品或饮料的原料。
本发明所使用的具有诱导细胞产生病毒抗性的功能、并且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐，对于DNA病毒、RNA病毒、逆转录病毒、类病毒具有抗病毒活性。
因此，可以用作人类用抗病毒剂、非人类动物用抗病毒剂(例如对家畜、家禽、鱼类或虾类等养殖动物的病毒病有效的抗病毒剂)、植物用抗病毒剂(例如对花卉类、蔬菜类等农园艺作物的病毒病有效的抗病毒剂)等有用生物的抗病毒剂。
感染动物的DNA病毒例如有痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒、乳头状瘤病毒、多瘤病毒、埃-巴二氏病毒和杆状病毒，感染植物的DNA病毒例如有花椰菜花叶病毒。感染动物的RNA病毒例如有轮状病毒、风疹病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、瘟热病毒、流感病毒、水疱性口内炎病毒、人类脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒，感染植物的RNA病毒例如有烟草花叶病毒、麦类矮缩病毒、水稻条叶枯病毒、烟草环斑病毒。逆转录病毒例如有成人T细胞白血病病毒、人类获得性免疫缺陷病毒，类病毒例如有马铃薯纺锤块茎病类病毒。
环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐对于治疗和预防非人类哺乳动物、鸟(例如鸡、火鸡)、冷血动物(例如鱼)的病毒病是有效的，这些化合物对下述的非人类病毒具有抗病毒活性。sciruid疱疹病毒1型、cavlid疱疹病毒1型、兔疱疹病毒1型、雉疱疹病毒1型、雉疱疹病毒2型、火鸡疱疹病毒1型、鸭疱疹病毒1型、鲶鱼(catfish)疱疹病毒1型、马疱疹病毒3型、牛疱疹病毒1型、牛疱疹病毒3型、牛疱疹病毒4型、猪疱疹病毒1型、猪疱疹病毒2型、鼠(murid)疱疹病毒1型、蛛猴疱疹病毒1型、蛛猴疱疹病毒2型、tupalid疱疹病毒1型、犬疱疹病毒1型、猫疱疹病毒1型、马疱疹病毒1型和马疱疹病毒2型。
可以采用兽医和饲养中公知的方法，例如将本发明的抗病毒剂注射给鸟类或者添加到饲料或饮用水中，通过本发明中所使用的化合物预防和/或治疗马莱克氏病(Marek’s disease)等鸟类病毒性疾病。另外，直接将本发明所使用的化合物添加到池塘、水槽、存储槽或饲养区内的水、海水等中，或者将本发明所使用的化合物混合到饲料中，同样可以预防和/或治疗由于疱疹病毒例如小鲶鱼病毒(petitecatfish virus)、Herpesvirus solomons、nerka病毒等病毒感染引起生活在池塘、水槽、存储槽或饲养区等狭小区域中的鱼的病毒病，例如鲑科鱼类的传染性造血器官坏死病、疱疹病毒感染或传染性胰脏坏死病、鲑属的病毒性出血性败血症、鲤鱼春季病毒病、各种鱼的淋巴结病、海产鱼或溯河产卵鱼的病毒性红细胞坏死病、比目鱼等的杆状病毒病、鰤鱼苗等的病毒性胰脏肝脏坏死病、虎河豚(torafugu)等的口白病(snout ulcer)。另外，投给本发明所使用的化合物、本发明的抗病毒剂时，正确的管理必然要看对于被治疗的各个被测体的必要性、治疗的种类和饲养者的判断。
投给了本发明抗病毒剂的非人类动物，可以通过保持其健康，显著地改善生存率、成长率、产卵率等。
本发明所使用的具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐，可以通过抑制这些病毒蛋白的合成、抑制病毒基因组的合成，显示出很强的抗病毒活性。另外，可以选择性的杀死这些病毒感染细胞。
例如，对于感染了人类获得性免疫缺陷病毒(以下简称为HIV)的患者，并不是所有的CD4阳性细胞都被HIV感染，而仅是一部分细胞被感染。本发明的抗病毒剂可以在抑制该感染细胞中HIV增殖的同时选择性杀死感染细胞、诱导未感染细胞产生病毒抵抗能力、从而可以从细胞中除去HIV。
环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐除具有上述抗病毒作用之外还具有改善肝功能的作用、热休克蛋白诱导作用，以选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中的1种以上作为有效成分的肝功能改善剂或热休克蛋白诱导剂可以按照上述抗病毒剂进行制剂化，也可以按照抗病毒剂的方法给药。
作为肝功能改善剂或热休克蛋白诱导剂的给药量可以根据其制剂形态、给药方法、使用目的及其所适用的患者的年龄、体重、症状适当设定，并不是一定的，但一般制剂中含有的选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中1种以上的化合物的量为成人每天0.1μg～20mg/kg。当然，由于给药量根据各种条件发生变动，既有少于上述给药量就足够的场合，也有必须超范围的场合。本发明的药剂除可以直接经口给药之外，还可以添加到任意的饮食品中使之进行日常的摄取。另外，选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中1种以上的化合物也能用作肝功能改善用饮食品、热休克蛋白诱导用饮食品的原料。
通过摄取环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐，可以改善肝功能，使GOT、GPT值正常化。
另外，环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐具有70k道尔顿(HSP70)等热休克蛋白诱导活性，对于肝炎病毒、艾滋病病毒、流感病毒、水疱性口内炎病毒、疱疹病毒等RNA病毒、DNA病毒具有抗病毒作用。另外，热休克蛋白与癌免疫有关，同时具有生物体防御作用。通过摄取环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐，可以预防、治疗流感病毒引起的感冒等病毒性疾病。
另外，热休克蛋白是细胞或个体接受比平常温度高5～10℃的急剧温度变化时诱导产生的蛋白质的总称，广泛分布在原核生物直到高等真核生物中。真核生物的热休克蛋白，已知有HSP90、HSP70、遍在蛋白质、HSP26等。其中，HSP70是分子伴侣的一种，与折叠未完成或不完全折叠的蛋白结合，有助于立体结构的形成。热休克蛋白的氨基酸序列在进化过程中可以很好的保存，HSP70与大肠杆菌的DnaK蛋白相同。人类存在约10个HSP70基因，其中有的是自然表达的，有的是由于各种刺激诱导产生的。热休克蛋白的合成也可以通过热休克以外的各种化学物质、氧化应激反应等细胞障碍诱导产生。
C.Amici等〔《病毒学杂志》Journal of Virology，第68卷，第6890～6899页(1994)〕报告指出如果在具有α，β-不饱和羰基的前列腺素A1存在条件下，培养感染了仙台病毒(副流感病毒)的动物细胞，可以诱导HSP70和HSP90的合成，诱导HSP70合成期间可以抑制病毒蛋白的合成。另外，A.Rossi等〔《生物化学杂志》The Journalof Biological Chemistry，第271卷、第32192～32196页(1996)〕报告指出2-环戊烯-1-酮与前列腺素A1一样可以诱导HSP70的合成，抑制水疱性口内炎病毒蛋白的合成。
本发明所使用的环戊烯酮诱导HSP70的能力在10μM即可见到，20～30μM达到最大，而2-环戊烯-1-酮诱导HSP70时则需要数百μM的浓度，与之相比可以说诱导能力非常高。它可以与前列腺素A1的HSP70诱导能力相匹敌，由于环戊烯酮的分子量在前列腺素A1的1/3以下，如果用重量浓度比较的话，也可以说具有的诱导能力比前列腺素A1高。
本发明所使用的环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐由于具有这样高的热休克蛋白诱导作用，对于DNA病毒、RNA病毒、逆转录病毒和类病毒具有抗病毒活性。这些病毒、类病毒例如上述各种病毒、类病毒。
环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐对于癌基因转化生成的癌细胞也具有抑制增殖的活性，具有防止癌基因引起癌变的作用。
例如乳头瘤病毒是乳头多瘤空泡病毒科(papovaviridae)乳头瘤病毒属(papillomavirus)的DNA病毒，作为人乳头瘤病毒(HPV)，已知例如诱发子宫颈癌等的HPV16型。
环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐对于由HPV16型癌基因E7引起癌变的细胞具有抑制增殖的效果，可以提供以选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中的至少一种化合物为有效成分的病毒癌变细胞增殖抑制剂，可以防止癌基因引起的癌变。
另外，环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐对于引发剂和助催化剂引起的2阶段癌变具有抑制作用，可以提供一种以选自这些化合物中至少一种化合物作为有效成分的化学癌变抑制剂。
因此，可以提供一种含有选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中至少一种化合物的癌变预防用食品或癌变预防用饮料。
含有选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中至少一种化合物作为有效成分的癌基因癌变防止剂或化学癌变抑制剂，可以按照抗病毒剂进行制剂化，按照抗病毒剂的方法给药。
在本发明的抗病毒用食品或抗病毒用饮料的制造中，可以使用具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐。另外，也可以使用含有环戊烯酮的糖醛酸加热处理物、由该加热处理物得到的部分精制环戊烯酮和精制环戊烯酮。
另外，在具有肝功能改善作用、热休克蛋白诱导作用、癌变防止作用等的效力体现用食品或效力体现用饮料的制造中，也可以使用环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐、含有环戊烯酮的加热处理物、由该加热处理物得到的部分精制环戊烯酮和精制环戊烯酮。
也就是说，稀释和/或添加选自这些环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐、含有环戊烯酮的加热处理物、由该加热处理物得到的部分精制环戊烯酮和精制环戊烯酮的原料所制得的食品或饮料包括在本发明的抗病毒用食品或饮料中。
本发明的抗病毒用食品或抗病毒用饮料的制造方法没有特别的限定，例如可以采用烹调、加工以及通常所使用的食品或饮料的制造方法来制造，制得的食品或饮料中优选含有有效量的具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中至少一种以上的化合物。
作为本发明的抗病毒用食品或抗病毒用饮料，只要含有、添加和/或稀释了具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中1种以上的化合物，其形状并无特别的限定，包括片状、颗粒状、胶囊状、凝胶状、溶胶状等可以经口摄取的形状。
另外，作为肝功能改善用、热休克蛋白诱导用、癌变预防用食品或肝功能改善用、热休克蛋白诱导用、癌变预防用饮料，只要含有、添加和/或稀释了具有肝功能改善作用、热休克蛋白诱导作用、癌变预防作用的环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中至少一种化合物，其形状并无特别的限定，包括片状、颗粒状、胶囊状、凝胶状、溶胶状等可以经口摄取的形状。
本发明的食品或饮料含有具有生理活性的环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐，由于这些化合物所具有的各种生理活性如抗病毒作用、肝功能改善作用、热休克蛋白诱导作用、癌变预防作用等，是通过对其的摄取具有预防、治疗病毒性疾病、肝功能改善效果、癌变预防效果等的健康食品或饮料，是对于维持生物体的内环境稳定有用的食品或饮料。
本发明所使用的化合物即使按其生理活性的有效量给药也没有毒性，例如经口给药时，即使将环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐中任意一种按照100mg/kg一次投给大白鼠，确认也没有死亡例。
以上，本发明的药剂可以用作病毒性疾病、肝疾病、癌等的治疗剂或预防剂，特别是对于HIV引起的获得性免疫缺陷综合症的治疗、症状的改善是很有用的。
实施例
以下结合实施例更具体的说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。另外，实施例中的％是指重量％。参考例1
将D-葡萄糖醛酸(Sigma生产G5269)10g溶解于1升水中，在121℃加热4小时后，在减压条件下浓缩至约10ml。将醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2混合液的上层40ml加入到其中混合后，将离心分离得到的上清液在减压条件下浓缩至约10ml。
将上述提取液于采用柱层析法的硅胶BW-300SP(2×28cm，富士Silycia化学社生产)中上样，以醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2的上层为洗脱液，用压缩机加压至0.2kg/cm2，以每分钟5ml的流速进行分离。分出流分，使每1流分为10ml，取各流分的一部分采用薄层色谱法进行分析，第61-80号流分中含有高纯度的环戊烯酮。集中这些流分，在减压条件下浓缩后用40ml氯仿提取，将提取液在减压条件下浓缩，从而得到100mg环戊烯酮。
用使用Palpack型S柱的正相HPLC分离该成分，用215nm紫外线吸收检测，纯度为98％。
将上述环戊烯酮113.9mg溶于乙醇2.85ml中。再在该乙醇溶液中加入己烷/乙醇(94/6)3.85ml，调制成17mg/ml的环戊烯酮溶液。用0.5μm的过滤器过滤该溶液，得到光学拆分HPLC的试样溶液。
在以下条件下，对该试样溶液进行光学拆分HPLC，分别收集前峰的(-)体环戊烯酮和后峰的(+)体环戊烯酮，减压干燥，分别得到(-)体环戊烯酮43.2mg，(+)体环戊烯酮43.0mg。
光学拆分HPLC条件
柱：Chiral Pack AS(Daicel化学工业生产)2.0cm×25.0cm
柱温：40℃
流动相：己烷/乙醇(94/6)
流速：14.0ml/min
检测：UV210nm
进样量：150μl(2.55mg)
由于得到的(-)体环戊烯酮与(+)体环戊烯酮两者均含有约1％的对映体，在上述条件下再度进行光学拆分。其结果分别从前峰的(-)体环戊烯酮30.0mg得到不含有对映体的(-)体环戊烯酮19.7mg，从后峰的(+)体环戊烯酮37.4mg得到不含有对映体的(+)体环戊烯酮27.7mg。另外，(-)体环戊烯酮、(+)环戊烯酮的光学拆分HPLC的洗脱时间分别为33分、40分。
实施例1
(1)在6孔板的各个孔中加入含有2×105细胞/ml的人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60(ATCC CLL-240)的含胎牛血清10％的RPMIl640培养基5ml，在37℃、5％CO2存在条件下培养24小时后，加入参考例1所述的环戊烯酮使最终浓度为0、10、20、30、40、50、100μM，再继续培养8小时。
培养结束后测定细胞数，然后通过离心分离回收细胞，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗净，制得环戊烯酮处理的细胞。另外，还制得在45℃热处理10分钟后同样培养的细胞。
使用这些处理细胞，按照《分子克隆》Molecular Cloning〔冷泉港实验室出版社Cold Spring Harb or Laboratory Press(1989)〕记载的方法进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将处理细胞悬浊在SDS-PAGE试样缓冲液(SDS-PAGE sample buffer)中，使之达到2.5×106细胞/ml，将该细胞悬浊液在100℃条件下处理10分钟后，分别取5μl涂于2片SDS-PAGE凝胶(5％堆积胶、10％分离胶)，进行电泳。一片凝胶进行考马斯(coomassie)染色，另一片凝胶被转印至聚二氟乙烯转移膜(ImmobilonTM：MILLPORE公司生产Cat.#IPVH000-10)。在4℃条件下用Block Ace(大日本制药株式会社Cat.#UK-B25)封闭该薄膜1夜。
使该被封闭的薄膜与单克隆抗体HSP 72/73(Ab-1)〔OncogeneResearch Products公司生产Cat.#HSP01〕进行反应，该单克隆抗体HSP72/73(Ab-1)可以与热诱导的70kDa的热休克蛋白进行特异的反应，然后用含有0.05％Tween 20的Tris-缓冲盐溶液(TBS)洗涤，再用TBS洗涤。然后与结合过氧化物酶的二次抗体HRP兔抗鼠IgG(H+L)(ZYMED Laboratolies，Inc.生产Cat.#61-6520)进行反应，采用与前面相同的操作进行洗涤。使这种与一次抗体、二次抗体进行了反应后的薄膜再与化学发光试剂RENAISSANCETM(Dupont NEN公司生产Cat.#NEL-100)进行反应，使X射线胶片感光，确认70kDa的热休克蛋白的诱导。
其结果确认通过添加环戊烯酮20-30μM诱导产生70kDa的热休克蛋白与在45℃条件下热处理10分钟诱导产生70kDa的热休克蛋白几乎是相同的。其诱导的强度如表1所示。另外，在表1中，+表示诱导的强度，+越多表示诱导越强。另外，-表示没有诱导，±表示轻微诱导。表1
    处理细胞   热休克蛋白的诱导
  45℃条件下处理10分钟0μM环戊烯酮10μM环戊烯酮20μM环戊烯酮30μM环戊烯酮40μM环戊烯酮50μM环戊烯酮100μM环戊烯酮     +++-++++++++++±
另外，(-)体环戊烯酮、(+)体环戊烯酮均得到同样的结果。
实施例2
(1)使用10cm培养皿，在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基(DMEM，日水公司生产)中，在5％二氧化碳存在条件下、37℃培养HeLa细胞，使之达到80％铺满，然后加入环戊烯酮使最终浓度达到0、5、10、20或40μM，在上述条件下再培养6小时。弃去培养基，在各个孔中加入1ml10％三氯醋酸后，通过刮刀回收细胞。
采用实施例1的方法对上述得到的细胞进行SDS-PAGE和显影，检测到70kd热休克蛋白的出现。
其结果发现添加环戊烯酮至5μM～40μM的部分出现70kd热休克蛋白的诱导。其结果如表2所示。另外，在表2中，+表示通过显影观察得到的70kd热休克蛋白的信号的强度，+越多表示信号越强。另外，±表示信号非常弱。表2
    处理细胞   70kd热休克蛋白
  0μM环戊烯酮5μM环戊烯酮10μM环戊烯酮20μM环戊烯酮40μM环戊烯酮      ±+++++++++
(2)使用10cm培养皿，在含有10％胎牛血清的DMEM中在5％二氧化碳存在条件下、37℃培养HeLa细胞，使之达到80％的铺满，加入环戊烯酮使最终浓度达到0、5、10、20或40μM，在上述条件下再培养6小时。之后，用含有5％胎牛血清的DMEM将细胞洗净，将含有腺病毒Ad5 dlX〔Saito等，《病毒学杂志》Journal of Virology，第54卷，第711～719页(1985)〕的含5％胎牛血清的DMEM加入到细胞中使之感染，培养20小时。其中感染多重度(m.o.i.)设定为50。弃去培养基，在各个孔中加入1ml 10％三氯醋酸后，用刮刀回收细胞。
采用实施例1的方法对这样得到的细胞进行SDS-PAGE和显影，检测腺病毒异己酮蛋白(hexon proteins)的出现。其中一次抗体使用抗腺病毒异己酮抗体(anti-adenovirus hexon antibody)〔ChemiconInternational Inc.生产，AB1056〕。
添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的部分相比，异己酮蛋白的量显著减少。另外，发现添加环戊烯酮至20μM以下的部分与未添加环戊烯酮部分的细胞增殖相同。
(3)按照“病毒试验草案”〔Medical View公司发行〕24～25页记载的方法，从与实施例2-(2)相同经环戊烯酮处理后使之感染腺病毒进行培养得到的Hela细胞中提取出病毒DNA。
也就是说，用磷酸缓冲盐水将病毒感染细胞洗净，在1ml 0.6％月桂基硫酸钠(SDS)/10mM EDTA水溶液中悬浮后，加入3.0ml的5M NaCl水溶液。在0℃放置1小时，在离心分离得到的上清液中加入3ml乙醇，混合。将离心得到的沉淀溶解于0.2ml TE缓冲液〔10mMTris-HCl pH8.0、1mM EDTA〕，加入2μl 10％SDS和4μl 10mg/ml蛋白酶K(宝酒造公司生产)，在37℃保温1小时。用苯酚和氯仿的等量混合液提取2次，在水层中加入20μl 3M醋酸钠和400μl乙醇后离心分离，将沉淀溶解于50μl TE缓冲液中，得到DNA溶液。在10μl  DNA溶液中加入10单位的EcoT22I(宝酒造公司生产)和1μl 10mg/ml核糖核酸酶A进行消化，通过琼脂糖胶电泳测定病毒DNA量。其结果是，添加环戊烯酮至5μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒DNA的量显著减少。
(4)与实施例2-(2)同样培养HeLa细胞，不添加环戊烯酮，在细胞中加入含有5型腺病毒(Adenoid 75 ATCC VR-5)的含有5％胎牛血清的DMEM使之感染。其中，感染多重度(m.o.i.)设定为50。之后，加入环戊烯酮使最终浓度达到0、5、10、20或40μM，培养20小时。培养后，与实施例2-(2)相同的方法进行腺病毒的异己酮蛋白检测。其结果，添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，异己酮蛋白的量显著减少。另外，添加环戊烯酮在20μM以下的部分与未添加环戊烯酮部分可以见到同样的细胞增殖。
(5)与实施例2-(2)同样培养HeLa细胞，用环戊烯酮处理。之后，与实施例2-(4)相同，使之感染5型腺病毒(Adenoid 75 ATCCvR-5)，用添加了环戊烯酮的培养基培养。培养后，与实施例2-(2)相同的方法检测腺病毒的异己酮蛋白。其结果，添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，异己酮蛋白的量显著减少。另外，在20μM以下添加环戊烯酮的部分与未添加环戊烯酮的部分可以见到同样的细胞增殖。
(6)采用与实施例2-(3)相同的方法，从与实施例2-(5)同样经环戊烯酮处理后使之感染5型腺病毒(Adenoid 75 ATCC VR-5)进行培养得到的细胞中测定病毒DNA的量。其结果是，添加环戊烯酮达到5μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒DNA的量显著减少。
从上述实施例2-(2)～(6)的结果可以看出，通过在感染前、感染后或感染前后投给环戊烯酮，对腺病毒具有抗病毒活性。另外，(-)体环戊烯酮、(+)体环戊烯酮也得到了同样的结果。
实施例3
(1)用限制性内切酶BamHI消化具有报告基因——《美国科学院院刊》Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of theU.S.A.，第84卷，第156～160页(1987)记载的β-半乳糖苷酶基因和新霉素抵抗基因的重组逆转录病毒载体BAG，通过使其自身络合形成除去了β-半乳糖苷酶基因的DOL载体。
(2)将实施例3-(1)记载的DOL载体质粒转染大肠杆菌(E.coli)HB101，用L-肉汤培养基培养，从收集的菌体中提取出质粒，采用氯化铯密度梯度超速离心分离的方法纯化DOL质粒。
通过使用阳离子脂质体〔Tran 2T LT-1(宝酒造公司生产)〕将纯化的DOL质粒10μg引入逆转录病毒包装细胞ΨCRIP〔《美国科学院院刊》Proceedings of the National Academy of Sciences of theU.S.A.，第85卷，第6460-6464页(1988)〕。
在37℃、5％CO2条件下用含有0.4mg/ml G418(Gibco公司)的含10％小牛血清Dulbecco改良Eagle’s培养基经过2周对引入后的细胞进行选择，将20个得到的克隆纯株培养，在直径为100mm的培养皿中进行繁殖，在半铺满状态下交换培养基，24小时后回收上清液并用0.45μm滤器(Milex HV，Millipore公司)过滤，得到病毒上清液。另外，用胰蛋白酶剥离细胞，在液氮中保存。
采用下述实施例3-(3)所示的方法测定由各克隆得到的病毒上清液的效价，将得到最高效价病毒液的克隆确定为重组逆转录病毒生产者细胞ΨCRIP/DOL。确定由生产者细胞得到的病毒上清液的效价为1×106克隆形成单位(cfu)/ml。确定的生产细胞保存在含有G4180.2mg/ml的含10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基中。
(3)病毒效价的测定使用NIH3T3细胞(ATCC CRL-1658)。将在含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基中培养后的NIH3T3细胞按照50000个/孔的比例移植到6孔板(岩城硝子)上，第2天用含有8μg/ml聚凝胺(Sigma公司)的病毒稀释液1ml使NIH3T3细胞感染3小时。病毒稀释使用的是含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基。感染结束后，为了稀释聚凝胺，再加入2ml含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基。从第2天开始换成含有G418 0.4mg/ml的含10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基，每3-4天换一次培养基，进行2周的选择，使之形成菌落。采用常规方法用Giemsa染色液(Gibco公司)使得到的菌落染色，计数。以得到的菌落数乘以稀释倍率得到的值作为cfu并做为病毒效价。
(4)将实施例3-(2)所述的重组逆转录病毒生产者细胞ΨCRIP/DOL移植到6孔板中，在达到半铺满状态时换成含有环戊烯酮0～20μM的含10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基，24小时后回收上清液1.5ml。采用实施例2-(3)所述的方法测定回收上清液的病毒效价，考察通过添加环戊烯酮对重组逆转录病毒生产者细胞的病毒产生能力的影响。
由未添加环戊烯酮的对照试验部分得到的病毒液的效价为9.5×104cfu/ml，与此相对，在0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20μM环戊烯酮存在条件下，病毒液的效价分别为8.3×104、6.4×104、6.1×104、3.8×104、5.6×104、5.1×104、4.1×104cfu/ml，确认通过添加环戊烯酮可以降低从生产者细胞得到的病毒液的效价。也就是说，环戊烯酮对重组逆转录病毒生产者细胞的病毒产生能力具有抑制作用。
(5)将可以表达G418抵抗基因的对照质粒pcD2-Y〔《分子细胞生物学》Mol.Cell.Biol.第7卷，第2745～2752页(1987)〕，以及可以表达HPV16型E7和G418抵抗基因两者的质粒pcD2-16E7〔《日本癌研究杂志》Jpn.J.Cancer Res.第82卷，第1340～1343页(1991)〕转染大肠杆菌E.coli HB101，用L-肉汤培养基培养，从收集的菌体提取出质粒，通过氯化铯密度梯度超离心分离进行纯化，得到用于引入基因的载体质粒。
在37℃，5％CO2存在的条件下，在含10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基中培养NIH3T3细胞。
通过使用阳离子脂质体〔Tran 2T LT-1，宝酒造公司生产〕将纯化的质粒10μg引入NIH3T3细胞。在37℃、5％CO2条件下用含有0.4mg/ml G418(GIBCO公司)的含10％小牛血清Dulbecco改良Eagle’s培养基进行2周的选择，将得到的菌落克隆培养，在直径为100mm的组织培养皿中培养，然后在液氮中保存。
这样，分别得到了9株引入了对照质粒的NIH3T3细胞、以及由HPV16型E7使之癌变的NIH3T3细胞。
把引入了对照质粒的NIH3T3细胞株命名为NIH3T3/Y-1、NIH3T3/Y-2、NIH3T3/Y-3、NIH3T3/Y-4、NIH3T3/Y-5、NIH3T3/Y-6、NIH3T3/Y-7、NIH3T3/Y-8和NIH3T3/Y-9。
把引入E7的细胞株命名为NIH3T3/E7-1、NIH3T3/E7-2、NIH3T3/E7-3、NIH3T3/E7-4、NIH3T3/E7-5、NIH3T3/E7-6、NIH3T3/E7-7、NIH3T3/E7-8和NIH3T3/E7-9。
(6)使用100mm的组织培养皿在含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基中培养NIH3T3细胞、引入了对照质粒的细胞株以及引入了E7的细胞株，使之达到50～70％铺满，用PBS洗净后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液剥离细胞，悬浊于5ml含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基中。
取悬浊液的一部分，用Newbauer型血细胞计数器计算细胞密度。以得到的数据为基础，用含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基稀释悬浊液，散布在直径为60mm的组织培养皿中使之达到200细胞/培养皿，在3ml的培养基中开始培养。培养开始24小时后，换成新的培养基，加入环戊烯酮使之达到5μM。
以后每2～3天换一次培养基，加入环戊烯酮使之达到5μM。作为对照试验，准备未添加环戊烯酮的培养皿，同样的变换培养基。培养分别进行3次。培养9天后，用甲醇固定，用Giemsa液(GIBCO)将菌落染色。
另外，使用NIH3T3、NIH3T3/Y-1以及NIH3T3/E7-2进行评价。
对染色菌落计数的结果如表3所示。引入了E7的细胞与对照细胞相比，对环戊烯酮的敏感度高，环戊烯酮可以选择性的作用于癌基因转化细胞。表3
  细胞     菌落数(平均±SD)对照    环戊烯酮处理
    NIH3T3NIH3T3/Y-1NIH3T3/E7-2  91.7±11.9   85.3±4.083.3±8.4    71.3±2.367.3±3.2    22.3±3.5
使用实施例3-(5)以外的其它细胞株时，得到相同的结果。另外，(-)体环戊烯酮、(+)体环戊烯酮也得到相同的结果。
实施例4
(1)在24孔微孔板中使用含有10％胎牛血清的Eagle’s MEM在5％二氧化碳存在下、37℃条件下培养单层MDCK细胞(大阪府立公众卫生研究所保存株)中添加环戊烯酮使最终浓度达到0、5、10、20或40μM，在上述条件下再继续培养6小时。
之后，用PBS将细胞洗净，在细胞中加入流感病毒A/PR/8/34株(大阪府立公众卫生研究所保存株)使之感染，在37℃条件下恒温培养30分钟。其中，将感染多重度(m.o.i.)设定为0.01。培养后，用PBS将细胞洗净，用含有10μg/ml胰蛋白酶的Eagle’s MEM培养。
0、1、2、3天后提取感染细胞上清液，通过采用PAP法的焦点计数法(focus counting method)〔《临床微生物学杂志》J.Clin.Microbiol.第28卷，第1308～1313页(1990)〕求出病毒效价。
其结果是，添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒效价显著降低。其结果如表4所示。另外，在各添加了环戊烯酮的部分中，细胞都没有游离而是粘附的。表4
  感染后的天数                          环戊烯酮浓度(μM)0             5          10           20              40
    pfu/ml        pfu/ml      pfu/ml       pfu/ml         pfu/ml
    0123   ＜1.0×102   ＜1.0×102  ＜1.0×102  ＜1.0×102   ＜1.0×1023.6×105     4.0×105    2.0×105    2.2×103     4.0×1021.0×106     8.0×105    7.2×105    2.6×105     1.9×1051.5×105     9.6×104    2.4×105    3.8×105     5.6×105
(2)在按照与实施例4-(1)相同的操作在无环戊烯酮存在的条件下培养成单层的MDCK细胞中与实施例4同样加入流感病毒使细胞感染，用添加了环戊烯酮使最终浓度达到0、5、10、20或40μM的含有胰蛋白酶10μg/ml的Eagle-MEM进行培养。之后，与实施例4-(1)相同，求出病毒效价。其结果是，添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒效价显著降低。其结果如表5所示。另外，在各添加了环戊烯酮的部分，细胞没有剥离而是粘着的。表5
  感染后的天数                           环戊烯酮浓度(μM)0               5            10            20             40
  pfu/ml          pfu/ml        pfu/ml       pfu/ml         pfu/ml
    0123   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×1024.2×106     2.4×105     1.9×105     1.2×1 05    ＜1.0×1021.6×106     1.5×106     3.4×105     1.0×106     ＜1.0×1024.8×105     1.9×105     1.7×105     7.2×105     ＜1.0×102
(3)使按照与实施例4-(1)相同的操作单层培养并用最终浓度为0、20或40μM的环戊烯酮处理6小时后的DMCK细胞与实施例4-(1)同样被流感病毒感染，然后用含有与感染相同浓度环戊烯酮的含10μg/ml胰蛋白酶的Eagle’sMEM培养基继续培养。之后，与实施例4-(1)同样，求出病毒效价。其结果是，添加环戊烯酮至20μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒效价显著降低。其结果如表6所示。另外，在各添加了环戊烯酮的部分，细胞没有剥离而是粘附的。表6
 感染后的天数              环戊烯酮浓度(μM)0           20            40
    pfu/ml       pfu/ml        pfu/ml
    0123   ＜1.0×102   ＜1.0×102 ＜1.0×1024.6×105     9.8×104   ＜1.0×1026.6×105     1.6×105   ＜1.0×1021.0×105     1.3×105   ＜1.0×102
(4)将感染多重度(m.o.i.)设定为0.001进行与实施例4-(1)相同的试验。其结果是，添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒效价显著降低。其结果如表7所示。另外，在各添加了环戊烯酮的部分，细胞没有剥离而是粘附的。表7
  感染后的天数                               环戊烯酮浓度(μM)0              5            10            20              40
    pfu/ml         pfu/ml        pfu/ml        pfu/ml          pfu/ml
    0123   ＜1.0×102    ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102     ＜1.0×102＜1.0×102    ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102    ＜1.0×1023.6×105      5.2×105     6.2×105     5.0×105      4.4×1033.8×104      4.0×104     8.6×104     1.1×105      8.0×103
(5)将感染多重度(m.o.i.)设定为0.001进行与实施例4-(2)相同的试验。其结果是，添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒效价显著降低。其结果如表8所示。另外，在各添加了环戊烯酮的部分，细胞没有剥离而是粘附的。表8
  感染后的天数                            环戊烯酮浓度(μM)0              5             10            20           40
   pfu/ml         pfu/ml        pfu/ml        pfu/ml       pfu/ml
    0123   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×1026.0×102     ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×1023.6×105     8.8×104      2.0×105    1.8×104     ＜1.0×1023.8×104     2.6×104      1.8×104    1.2×104     ＜1.0×102
(6)将感染多重度(m.o.i.)设定为0.001进行与实施例4-(3)相同的试验。其结果是，添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒效价显著降低。其结果如表9所示。另外，在各添加了环戊烯酮的部分，细胞没有剥离而是粘附的。表9
  感染后的天数                            环戊烯酮浓度(μM)0              5             10           20             40
    pfu/ml         pfu/ml        pfu/ml        pfu/ml        pfu/ml
    0123    ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×1026.0×103     ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×102   ＜1.0×1026.2×105     4.4×105     4.8×105     3.2×104     ＜1.0×1023.6×104     5.6×104     2.8×104     2.8×104     ＜1.0×102
从以上实施例4-(1)～(6)的结果可以看出，环戊烯酮对流感病毒具有抗病毒活性。另外，(-)体环戊烯酮、(+)体环戊烯酮也得到同样的结果。
实施例5
(1)环戊烯酮对人T细胞的作用
在2×105个/ml的CEM-SS细胞(ATCC CCL-119)或H9细胞(ATCCHTB-176)中加入0.5～5μM环戊烯酮，培养3天，计算出活细胞数和死细胞数，求出细胞存活率。
其结果发现，任何一种细胞都没有由于添加了环戊烯酮造成细胞存活率的显著减少。其结果如图1和图2所示。也就是说，图1与图2表示添加的环戊烯酮浓度与细胞存活率的关系，横轴表示添加的环戊烯酮浓度(μM)，纵轴表示培养3天后的细胞存活率(％)。图1是使用CEM-SS细胞时的结果，图2是使用H9细胞时的结果。
(2)环戊烯酮对HIV感染的T细胞的作用
在被HIV-1IIIB感染的CEM-SS细胞(简称为CEM-3B)或被HIV-1IIIB感染的H9细胞(简称为H9-3B)中加入1～5μM环戊烯酮，培养3天。两种细胞90％以上被HIV-1IIIB感染。计算出活细胞数和死细胞数，求出细胞存活率。
其结果发现，对于任何一种细胞均由于添加了3μM环戊烯酮使细胞存活率的显著减少，添加5μM环戊烯酮可以进一步降低细胞存活率。也就是说与实施例5-(1)相比，环戊烯酮具有抗HIV作用。其结果如图3和图4所示。也就是说，图3与图4表示添加的环戊烯酮浓度与细胞存活率的关系，横轴表示添加的环戊烯酮浓度(μM)，纵轴表示培养3天后的细胞存活率(％)。图3是使用CEM-3B细胞时的结果，图4是使用H9-3B细胞时的结果。
实施例6
测定实施例5-(2)培养3天后的培养上清液中含有的p24抗原的浓度。其结果发现，相应于添加的环戊烯酮的浓度p24浓度减少，确认有抗HIV病毒作用。其结果如表10所示。其中，表10中括号内的数字表示相对于未添加环戊烯酮时各细胞培养上清液中p24浓度的比。表10
  环戊烯酮浓度(μM)     培养上清液中的p24浓度(ng/ml)CEM-3B         H9-3B
    0135     280(100％)    210(100％)232(83％)     203(97％)176(63％)     157(75％)175(63％)     148(70％)
实施例7
将Vero细胞(ATCC CCL-81)悬浊于含有10％胎牛血清的Eagle’sMEM中，使细胞浓度达到5×104细胞/100μl，在96孔微孔效价板中每1孔装入100μl细胞悬浊液，在5％二氧化碳存在下、37℃培养一夜，制得形成单层的Vero细胞。
将添加了环戊烯酮使最终浓度达到0、5、10、20或40μM的Eagle’sMEM培养基加入到该细胞中，在5％二氧化碳存在下、37℃培养7小时。
培养结束后，除去培养基，用PBS洗涤2次，接种日本脑炎病毒(JEV JaOAr-363-70株)使之达到4.9×102pfu/ml，在5％二氧化碳存在下、37℃培养30小时后，用乙醇将细胞固定，通过采用PAP法的焦点计数法〔Arch.Virol.第86卷，第129～135页(1985)〕进行焦点计数。
其结果，添加环戊烯酮至40μM的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，定点(focus)数显著降低。其结果如表11所示。另外，在各添加了环戊烯酮的部分，细胞没有剥离而是粘附的。表11
环戊烯酮浓度(μM)     pfu/ml
    0102040     3.0×1071.6×1072.1×1074.9×106
(2)将在24孔微孔板中使用含有10％胎牛血清的Eagle’s MEM在5％二氧化碳存在下、37℃培养成单层的Vero细胞用PBS洗净后，在细胞中加入4.9×102pfu/ml的日本脑炎病毒(JEV JaOAr-363-70株)使之感染，在37℃恒温培养90分钟。
培养后用PBS将细胞洗净，用添加了环戊烯酮使最终达到0、5、10、20或40μM的MEM培养。
0、1、2、3天后收集感染细胞上清液，通过采用PAP法的焦点计数法〔《临床微生物学杂志》(J.Clin.Microbiol.)第28卷，第1308～1313页(1990)〕求出病毒效价。
其结果，添加环戊烯酮至10μM以上的部分与未添加环戊烯酮的对照试验相比，病毒效价显著降低。其结果如表12所示。另外，各添加了环戊烯酮的部分，细胞没有剥离而是粘着的。表12
环戊烯酮浓度(μM)                病毒接种天数1天          2天         3天
    pfu/ml       pfu/ml      pfu/ml
    0102040     6.0×103   5.6×106   1.1×1076.0×103   2.4×106   4.4×1066.4×103   1.9×106   3.0×1060            0           0
从上述实施例7-(1)、(2)的结果可以看出，环戊烯酮对日本脑炎病毒具有明显的抗病毒活性。而且，  日本脑炎病毒与丙型肝炎病毒是同一类型，  目前由于丙型肝炎病毒体外培养系统还没有确立，用日本脑炎病毒作为丙性肝炎病毒的模型。因此，环戊烯酮作为丙型肝炎的治疗药也是有效的。
另外，(-)体环戊烯酮、(+)环戊烯酮也得到了相同的结果。
实施例8
五年前在诊断为丙型肝炎后使用干扰素、强力碳酸精氨酸(minofagen)注射液进行治疗，但GOT、GPT均在150左右未见肝功能改善的女性每日饮用下述实施例13得到的饮料50ml(含环戊烯酮2mg)，饮用2个月后GOT、GPT均改善到80。再继续同样饮用1个月后，GOT、GPT均为30，肝功能得到显著改善。
实施例9
将ICR系小鼠(由日本SLC购入，7周龄，雌性)背部的毛剃去后，涂敷引发剂DMBA(二甲基苯并蒽，dimethylbenzanthracene)的丙酮溶液，DMBA的剂量为50μg/小鼠，经过1周之后，在涂敷引发剂的部位涂敷促进剂TPA(12-o-Tetrasecanoylphorbol 13-acetate)的丙酮溶液，TPA的量为1μg/小鼠，每周2次直至试验结束之后，在每次涂敷TPA  1小时前涂敷环戊烯酮的80％乙醇溶液或作为对照的80％乙醇溶液，观察对于2阶段癌变的皮肤癌变抑制作用20周。
对照组(涂敷赋形剂的组)15周以后显示出100％(12只/12只)的癌变率，与此相对，环戊烯酮有强的抑制癌变作用，2.5mg/小鼠所显示出的癌变抑制作用为15周以后的癌变率是8.3％(12只中1只癌变)，19周以后的癌变率是25％(12只中3只癌变)。结果如图5所示。也就是说，图5表示环戊烯酮的癌变抑制作用，纵轴表示癌变率，横轴表示时间(周)。图中白三角表示环戊烯酮2.5mg/小鼠处理组(12只)，黑三角表示环戊烯酮0.8mg/小鼠处理组(11只)，白圆圈表示对照组(12只)。
另外，在小鼠外耳的TPA炎症试验中，按2.5mg/小鼠将环戊烯酮涂敷于小鼠的外耳，不显示抗炎症活性。
以上，环戊烯酮对2阶段化学癌变显示出了抗促进剂作用。含有环戊烯酮的葡萄糖醛酸的加热处理物、(-)体环戊烯酮、(+)体环戊烯酮也显示出相同的结果。
实施例10
注射剂
(1)在生理盐水(日本药典收载品)中以1％的浓度加入环戊烯酮，制得注射剂。
(2)在生理盐水(与上述相同)中分别以0.5％和0.1％的浓度加入(-)体环戊烯酮和甘草酸，制得注射剂。
实施例11
片剂
(1)调制含有环戊烯酮10mg和微晶纤维素适量的片剂，包上糖衣，制成片剂。
(2)调制含有(+)体环戊烯酮0.1mg、甘草酸二钾10mg和微晶纤维素适量的片剂，包上糖衣，制成片剂。
实施例12
软膏
环戊烯酮                   1g
吸水软膏(日本药典收载)    99g
先将环戊烯酮与少量的吸水软膏充分混合，再慢慢加入余下的吸水软膏，使之混合均匀，制成软膏。
该软膏1日4～5次涂于患部。
实施例13
(1)将果胶(Pomosin Pectin LM-13CG，Hercules公司生产)5kg添加到自来水100升中，通过通入水蒸气使液体温度由28℃经35分钟升高到液体温度120℃，然后在搅拌条件下于120℃保温5小时，然后冷却，制得冷却物135升。然后在冷却物中加入过滤助剂硅藻土#545(Celite公司生产)1.35kg以及二氧化硅#600-S(中央二氧化硅公司生产)1.35kg，然后使用预先涂有硅藻土#545 0.1kg以及二氧化硅#600-S 0.1kg的致密滤器(6英寸16级滤纸，ADVANTEC#327)进行过滤。使用金属板加热器(日阪制作所生产)将得到的滤液连续瞬间加热处理(98℃，60秒)后冷却，制得150升含有环戊烯酮的果胶加热处理液。
含有环戊烯酮的果胶加热处理液的pH为约3.5，酸度为6.2ml，糖度为5.8Brix％。另外，pH是用pH计测定的，酸度是用将试样10ml中和到pH7.0所需要的0.1N NaOH的量(ml)表示的。而且糖度的从测定是用白利糖度计(Brix saccharomter)测定的。
(2)按照下述组成调制饮料
果糖葡萄糖液糖        5.00％
砂糖                  4.00％
酸味成分              1.20％
香料                  0.30％
含有环戊烯酮的物质    0.5％
精制水            余量
合计              100.00％
含有环戊烯酮的物质使用的是实施例13-(1)所述的含有环戊烯酮的果胶加热处理物，添加其固体物质换算量。该饮料100ml中含有4mg环戊烯酮。
发明的效果
按照本发明可以提供一种以具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、而且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如选自环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐的化合物为有效成分的抗病毒剂。本发明的抗病毒剂可以选择性的杀死病毒感染细胞，并对未感染病毒的正常细胞赋予病毒抵抗性，通过其协同作用对难治性病毒疾病例如ADIS、丙型肝炎等的治疗以及症状的改善是非常有用的。另外，按照本发明还可以提供一种含有具有肝功能改善作用、热休克蛋白诱导作用、病毒癌变预防作用、抗促癌剂作用等生理活性的环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐的医药品，该医药品对于维持生物体的内环境稳定，特别是保持胃肠健康是很有用的。
另外，按照本发明还可以提供一种以具有诱导细胞产生病毒抵抗性的功能、并且具有选择性杀死病毒感染细胞的功能的化合物，例如环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐为有效成分的抗病毒用食品或抗病毒用饮料，这些饮食品作为病毒引起的各种疾病的症状改善用饮食品或预防用饮食品是很有用的。另外，按照本发明还可以提供一种含有具有肝功能改善作用、热休克蛋白诱导作用、病毒癌变预防作用、抗促癌剂作用等生理活性的环戊烯酮或其光学活性体或它们的盐的饮食品，该饮食品对于维持生物体的内环境稳定，特别是保持胃肠健康是很有用的。

Claims (5)

1.选自下述式〔I〕表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮及其光学活性体及它们的盐中至少一种的化合物在制备抗病毒剂中的应用。
Figure C9880265400021
2.如权利要求1所述的应用，所述抗病毒剂为用于人艾滋病毒或丙型肝炎病毒的抗病毒剂。
3.如权利要求1所述的应用，所述抗病毒剂为用于感染人类的病毒的抗病毒剂、用于感染非人类动物的病毒抗病毒剂或用于感染植物的病毒的抗病毒剂。
4.如权利要求3所述的应用，所述抗病毒剂为用于感染家畜、家禽、鱼类或虾类的病毒的抗病毒剂。
5.选自下述式〔I〕表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮及其光学活性体及它们的盐中至少一种的化合物在制备抗病毒用食品或抗病毒用饮料中的应用。
Figure C9880265400022
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