CN1633303A - 保护活体免受外部因子损害的方法及组合物 - Google Patents

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Abstract

目的是为了提供一种保护活体免受外部因子损害的组合物或一种食物，它包含来自蘑菇(Agaricus Blazei Murill)的提取物。该组合物通过免疫活性细胞来保护活体。该免疫活性细胞可以为巨噬细胞，任选还有T细胞。该免疫活性细胞可以是抗体生产细胞。该组合物可以通过增强体液免疫来保护活体。体液免疫的增强通过激活选自T细胞和巨噬细胞的淋巴细胞并且因此提高选自白介素－1β和白介素－6的白介素的表达而引起。外部因子可以得自抽烟，或者可以是一种抗原物质。

Description

保护活体免受外部因子损害的方法及组合物
技术领域
本发明涉及一种预防由外部因子引起的活体损害的方法及组合物，包括一种通过提取操作处理蘑菇而获得的物质。
背景技术
一个人总是被环境污染物这样的外部因子所包围。环境污染物包括如无数类型的病毒、细菌、霉菌、寄生虫等生物，以及为数众多的除这些生物之外的抗原物质、烟草烟中的致癌物质以及致癌作用促进物质。为了保持健康，应当消除这些外部因子的负面影响。
在这样的环境下，由于保持健康的期望在增强，通常，更多人倾向于摄入健康食物和健康补品。因此，几乎没有副作用并含有一种活性成分(特别地，具有抗肿瘤效果)的天然物质正受到注意以用于健康食品或健康补品。这是由于化学药剂和合成的成分随同抗肿瘤活性一起还显示了许多副作用。具有一种活性成分的天然物质的实例包括蘑菇、食用菌等。
许多具有抗肿瘤活性的多糖都分离自蘑菇(Hamuro J等(1978)，Cancer Res.38：3080-3085；Mizuno T等(1992)，Biosci.Biotechnol.Biochem.56：347-348)。通常叫作蘑菇的食用菌属于担子门(Basidiomycota)的菌蕈科(Agaricaceae)，并且植物学名称为(Agaricus blazei Murill)而日文名称为“kawariharatake”。Agaricus blazei Murill(下文，统称为ABM，或蘑菇)传统上已在巴西圣保罗的Piedade地区用作药剂。据称蘑菇具有多种免疫激活活性、防癌作用、肿瘤生长抑制作用等。当前，蘑菇作为健康食物供应国内使用。
来自蘑菇的多糖包括β-1，6-吡喃葡糖残基并具有抗肉瘤180的抗肿瘤活性(Ebina T等(1986)，Jpn.J.Cancer Res 77：1034-1042)。来自蘑菇的提取物包括具有(1→6)-β-分枝链，并具有天然的杀伤细胞激活活性以及通过细胞凋亡介异的选择性抗肿瘤活性的(1→4)-α-D-葡聚糖(Fujimiya Y等(1998)，Cancer Immunol Immunother46：147-159)。来自蘑菇的肽聚糖具有直接的在双重植入肿瘤系统中抗Meth A肿瘤细胞的细胞毒活性以及间接的在患肿瘤小鼠中的免疫增强活性。(Ebina T等(1998)，Biotherapy 11：259-265)。来自蘑菇的多糖改变在小鼠T细胞亚群中脾Thy1，2-，L3T4阳性细胞的百分率(Mizuno M等(1998)，Biosci.Biochem.62：434-437)。这些报告提示来自蘑菇的多糖具有通过免疫调节活性来对抗肿瘤细胞的细胞毒性活性。
曾有许多报告称多种自然物质，特别是蘑菇提取物具有免疫增强活性及抗肿瘤活性。但是，没有报告它们通过延迟的超敏感作用或抗体的生产来增强免疫活性。蘑菇提取物如何激活免疫系统的机制尚未得到解决。而且，几乎没有报告特别证实蘑菇提取物具有除免疫激活活性、致癌作用预防效果以及肿瘤生长抑制效果之外的一种生物活性。
发明内容
一个活体总是处于环境污染物这样的外部因子中。环境污染物包括如无数类型的病毒、细菌、霉菌、寄生虫等生物，以及为数众多的除这些生物之外的抗原物质、致癌物质以及抽烟中的致癌作用促进物质。据认为这些活体的外部因子或产生于活体中的异常的变异细胞(如，癌细胞)主要是通过活体的免疫系统的感染保护功能和免疫监测机制去除的。因而，增强活体的免疫系统以维持并增强个体的健康是重要的。真实地检验自然物质蘑菇的生物活性效果也是一个重要问题，其对于维持并增强个体的健康是必要的，比如多种免疫激活活性、致癌作用预防效果、肿瘤生长抑制效果、免疫激活效果等。
我们通过检验蘑菇提取物是否诱导抗体生产，并且研究其机制而完成了本发明。另外，我们通过让小鼠吸入初级烟草烟，确定肺中的DNA危害，并且进一步确定蘑菇提取物在防止这种危害中的效果而完成了本发明。
本发明涉及用于保护活体免受外部因子损害的组合物，并且该组合物包括来自蘑菇的提取物。
该组合物可以通过激活免疫活性细胞来保护活体。
该免疫活性细胞可以是巨噬细胞。
该免疫活性细胞可以是巨噬细胞或T细胞。
该免疫活性细胞可以是抗体生产细胞。
该组合物可以通过体液免疫的增强来保护活体。
该外部因子可以通过抽烟来获取。
该组合物可以通过降低遗传损害来保护活体。
该遗传危害可以是肺部组织的氧化性DNA损害。
该外部因子可以是一种抗原物质。
体液免疫的增强可以通过激活选自可激活T细胞和巨噬细胞的淋巴细胞而引发。
体液免疫的增强可以通过选自白介素-1β和白介素-6的白介素的增强表达而引发。
该组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。
该组合物可以是选自粉末、液体、片剂、胶囊和药丸的形式。
本发明进一步涉及一种保护活体免受外部因子损害的方法，并且该方法包含对一个受试者施用包含来自蘑菇提取物的组合物的步骤。
该方法可以通过免疫活性细胞来保护活体。
该免疫活性细胞可以是巨噬细胞。
该免疫活性细胞可以是巨噬细胞或T细胞。
该免疫活性细胞可以是抗体生产细胞。
该方法可以通过体液免疫的增强来保护活体。
该外部因子可以通过抽烟获取。
该组合物可以通过降低遗传危害来保护活体。
该遗传危害可以是肺部组织的氧化性DNA的危害。
该外部因子可以是一种抗原物质。
体液免疫的增强可以通过激活选自可激活T细胞和巨噬细胞的淋巴细胞而引发。
体液免疫的增强可以通过选自白介素-1β和白介素-6的白介素的增强表达而引发。
本发明进一步涉及来自蘑菇的提取物在制备一种用于保护活体免受外部因子损害的组合物中的用途。
如此处所用的术语相对于活体的“外部因子”包括：如病毒、细菌、霉菌、寄生虫等的生物，除这些生物之外的抗原物质，烟草烟中的致癌物质以及致癌作用促进物质；甚至是产生于活体中的异常的变异细胞(例如，癌细胞)。如此处所用的术语“保护活体免受外部因子的损害”意指由“外部因子”引发的如病毒性疾病、过敏、活组织的氧化性损伤、肿瘤、癌等的综合病征的发生得到了预防或延迟，或该综合病征得到了减轻或消除。术语“免疫活性细胞”意指参与免疫反应的细胞，其对于本领域技术人员是公知的。免疫活性细胞可以大体分为介导体液免疫的B细胞和介异细胞免疫的T细胞。免疫活性细胞包括淋巴细胞；辅助细胞如巨噬细胞、朗格汉斯细胞、树突状细胞等；NK细胞(天然杀伤细胞)；LAK细胞(淋巴因子激活杀伤细胞)；以及诱导抗体依赖性细胞损伤的细胞等。T细胞包括控制免疫反应的辅助T细胞和抑制T细胞、摧毁靶细胞的杀伤T细胞，以及涉及延迟过敏反应的T细胞。B细胞包括通过抗原或T细胞的激活而从B细胞分化的抗体分泌细胞。
蘑菇提取物可以包括一种分子量为100到2000的色谱层析洗脱的主要馏分作为有效成分，它是通过用热水从蘑菇的子实体提取，透析提取液并对透析液进行色谱层析处理的步骤而获得的。
或者，蘑菇提取物可以包括一种透析液作为有效成分，它是通过用热水从蘑菇的子实体提取，将提取物与乙醇混合并离心以分离沉淀和上清液，将上清液与乙醇混合并离心以分离沉淀和上清液，以及将沉淀溶入稀释的水水以进行透析的步骤而获得的。蘑菇提取物可以适当地以与药学上可以接受的载体混合的形式存在。药学上可以接受的载体对于本领域的技术人员是公知的并且包括，例如如下的载体但并不限于这些：缓冲液如林格溶液、Hank’s平衡盐溶液或缓冲的生理盐水；脂肪酸如芝麻油；合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯；糖类如乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨糖醇；源自植物如玉米、小麦、大米或马铃薯的淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧基甲基纤维素钠；橡胶如阿拉伯树胶或黄蓍胶；蛋白质如明胶或胶原蛋白；交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐等。
附图简述
图1是显示在小鼠肺组织中免疫染色结果的照片。
图2为显示抽烟对于在肺组织中8-OHdG表达的影响的图。
图3为显示抽烟对于在肺组织中8-OHdG浓度的影响以及施用本发明组合物的效果的图。
图4为显示抽烟对于肺泡肺Mφ细胞中活性氧生产的影响的图。
图5为显示抽烟对于在肺泡肺MφDNA中8-OhdG浓度的影响以及施用本发明组合物的效果的图。
图6为显示抽烟对于在心脏组织中8-OHdG浓度的影响的图。
图7为显示抽烟对于在尿中8-OHdG浓度的影响以及施用本发明组合物的效果的图。
图8为汉堡II自动抽烟装置的照片。
图9为显示ABM提取物对于PFC s数量的影响的图。在第0天，将1×108SRBC和ABM提取物(25mg/kg)或将PBS作为对照进行腹内注射到小鼠。在第四天，收集小鼠的脾并利用PFC分析测量抗SRBC抗原的PFCs。(a)显示每106个脾细胞中PFCs的数量而(b)显示每个脾中PFCs的数量。结果以平均数±S.D.(n＝12)表示。**表示与对照相比统计学上显著的结果(p＜0.01)。
图10为显示ABM提取物对于在脾细胞中白介素-1β和白介素-6mRNA表达的影响的电泳凝胶照片。给小鼠腹内注射ABM提取物(25mg/kg)(+)或不注射ABM提取物(-)。三或四天后，收集脾并利用AGPC法分离全RNA。接下来，对β-肌动蛋白进行26个循环的RT-PCR，对白介素-1β进行29个循环，而对白介素-6进行32个循环。对PCR产物进行30％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后利用溴化乙锭显色。
图11为显示ABM提取物对于在腹巨噬细胞中白介素-1β和白介素-6mRNA表达的影响的电泳凝胶照片。将腹部细胞分布在一个96孔平底培养板上(5×104细胞/0.1ml/孔)，有或无0.1或1mg/ml的ABM提取物。将细胞在5％CO2中于37℃培养24或48小时。随后，利用AGPC法分离全部的RNA。接下来，进行有关图2所述的RT-PCR。对PCR产物进行30％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后利用溴化乙锭显色。
实施发明的最佳方式
下文中，描述了一种生产能预防由本发明的外部因子所引起的损害的组合物的方法。
本发明所用的蘑菇可以为天然或人工培养的蘑菇的子实体或菌丝体部分。为了方便，也能够用商业上现有的干子实体。蘑菇可以如其原样、或切削、或粉碎使用并用来制备蘑菇提取物。
蘑菇提取物是一种蘑菇的提取物包括通过使用水、低级醇等作为溶剂获得的蘑菇源的成分。一般地，使用水、乙醇、含水乙醇等。可以使用任何溶剂只要它能够预防由外部因子引起的活体损害。通常，将干子实体或其粉末与2到10倍于其重量的溶剂混合以进行提取。溶剂的实例包括水、乙醇、丙醇、丁醇、1，3-丁二醇、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、甲醇或它们的混合物。
一般地，蘑菇提取物能够通过用水作为溶剂获得。优选它是通过用热水从蘑菇中提取制备的。可以通过将干子实体与5到10倍于其重量的水混合，并对提取物加热或将混合物加热回流1到3个小时来进行用热水从蘑菇中提取的操作。必要的话，可以通过重复进行热水提取或对先前用热水提取过的残渣进行加热回流来对蘑菇进行加热水提取。由此得到的用热水提取的溶液通过本领域公知的方法如冻干法、喷雾干燥等进行干燥以获得干燥的产品(下文中，称为干燥产品A)。将干燥产品A与5到20倍于其重量的水混合。随后，将溶液倒入透析管中并以几倍量的蒸馏水进行10到15小时的透析。将得到的透析液进行冷冻干燥以获得以热水提取的蘑菇的干燥产品(下文中，称为干燥产品C)。
随后，进一步以流水将在透析管中保留的溶液透析20到40小时并以蒸馏水透析两次，每次几小时，如上所述就获得了保留在透析管中溶液的干燥产品。这样，就能够获得预防由外部因子对活体引起损害的用热水提取的蘑菇的干燥产品(下文中，称为干燥产品B)。
接下来，将得到的干燥产品C溶入约10倍于其重量的蒸馏水中。以蒸馏水作为洗脱液进行色谱层析而获得20mL的各馏分。从获得的各馏分中，在由凝胶过滤而得的分子量为100-2000kDa的中间馏分中的主要成分为用热水提取的蘑菇的一种馏分，它能预防由外部因子引起的对活体的损害。
利用使用ODS(十八硅烷化硅胶)的反相色谱层析、使用DEAE-TOYOPEARL 650的离子交换色谱层析等进一步对这些馏分进行分析，并得以确认它包括一些成分如精氨酸、赖氨酸、甘露醇等。
将以上述方法获得的以热水提取的溶液与等量的乙醇混合。将混合物离心以分离沉淀和上清液。将得到的上清液进一步与1到3倍于其体积的乙醇混合。将混合物进一步离心以获得沉淀。将得到的沉淀溶于蒸馏水中并将得到的溶液进行透析。得到的透析液也是用热水提取的蘑菇的低分子量部分，它能预防根据本发明的由外部因子引起的对活体的损害。
如上所述获得的蘑菇提取物或其馏分本身或与多种载体组合能够用于药物生产。进一步地，蘑菇提取物或其馏分本身或与其它食品一起使用可以用作健康食品。
一般地，所要求的本发明的组合物能够与一种生物相容的药学载体(例如，生理盐水、加了缓冲剂的生理盐水、葡萄糖、水等)一起口服。本发明的组合物能够通过其本身或与其它药物或食物结合服用。
本发明的组合物可以包括药学上可以接受的载体。药学上可以接受的载体的实例包括，例如生理盐水、加了缓冲剂的生理盐水、葡萄糖、水等。通常，药学上可以接受的载体是药学上无活性的。
本发明的组合物也可以包括蘑菇提取物或其馏分、赋形剂、佐剂，以及药学上可以接受的载体。进一步地，该组合物可以在蘑菇提取物之外与其它药物组合并施用于患者。
本发明的组合物可以口服或注射施用。注射施用包括局部的、真皮的、动脉内的、肌肉内的、皮下的、髓质内的、潴泡内的、心室内的、静脉内的、腹内的和鼻内的施用。优选地，本发明的组合物通过静脉内或动脉内注射施用。药物组合物的制剂技术和给药技术对于本领域技术人员是公知的，如在一种本领域技术人员所公知的教科书，“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES”(Maack出版公司，EASTON，巴拿马)中所描述的。
本发明的组合物包括能预防由外部因子引起的对活体的损害的药学上有效量的蘑菇提取物及其馏分。一般地，可以制备本发明的组合物用来施用，使得蘑菇提取物及其馏分的剂量为约5mg/体重kg到100mg/体重kg。术语“药学上有效量”可以被本领域技术人员充分认识，是指对于预防由外部因子引起的对活体的预期损害有效的量。因而，药学上有效量是一种足够用来缓和由外部因子引起的对活体损害的综合症状的量，否则就应该对该症状进行治疗。
一种对于确认“药学上有效量”有用的检测实例为测量活体受损害的程度，损害是由外部因子引起的，例如，在病人中的氧化性DNA损伤。实际上施用的蘑菇提取物及其馏分的量依赖于将提取物应用于其上的个体的健康状况等，并且可以对其进行优化从而能够取得期望的效果。对于本领域技术人员来说确定药学上有效量是一种常规方法。
药学上有效量能够首先通过利用细胞培养或合适的动物模型进行体外试验来评估。随后，在所得信息的基础上，一种在对人给药中有效的量和给药方式能够得以确定。
可以把用于口服给药的组合物配制成一种组合物，它包含以适于给药的处方形式存在的本领域公知的药学上可接受的载体。这种载体使得能够将该组合物配制为适于病人摄取的片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆、悬浮液等。
具有预防由外界因素引起的对活体的损害的活性的蘑菇提取物及其部分可以以足够发挥其功能的量与一种或多种经选择的食物混合。将一种或多种经选择的食物以本领域技术人员公知的形式，通常是粉末形式，与所述具有免疫活性的部分混合。这种混合物可以依赖其效用或偏好用作一种液体食物产品。或者，这种混合物也可以成形为胶囊如硬胶囊或较胶囊、片剂、丸剂，或可以成形为粉状的、粒状的、茶叶、茶袋或糖果的形式。
在下文中，通过实施例的方式对本发明进行进一步的描述。下面的实施例仅仅是说明性的，并不限制本发明。
实施例
(实施例1)蘑菇热水提取物对抽烟引起的DNA损害的影响
I.材料和方法
实施例1所用的材料和方法如下：
1.抽烟
通过使用图8所示汉堡II自动抽烟装置(来自Borgwaldt公司现有的)，使小鼠(8周龄C57BL/6小鼠)每天抽20只烟(CORESTA：每只烟包含15mg焦油和1.5mg尼古丁)持续10天。
2.蘑菇提取物
来自蘑菇的热水提取物(ABM)(上面提到的干燥产品A)由KyomaEngineering公司提供(东京，日本)。这是通过带有一些改进的Mizuno等(同上)所述的方法从AMB中提取而得的。特别地，利用沸水进行ABM干子实体的提取。将得到的溶液在1800×g离心10分钟并进行冻干以得到蘑菇热水提取物。随后，将产物再一次溶解于不含Ca++和Mg++的浓度为10mg/mL的Dulbecco’s缓冲生理盐水(PBS)中(NissuiPharmaceutical公司，东京，日本)。以0.45μm膜滤器(Millipore有限公司，Bedford，摩洛哥)过滤溶液。将所得的过滤液保存于4℃待用。在抽烟前在静脉内注射(i.p.)过滤液，使得给药量为25mg/体重kg。对照组仅给予不含蘑菇热水提取物的PBS。
3.肺泡肺巨噬细胞(Mφ)
在抽烟完成后的第一天，实施BAL(Broncho alveolar lavage)法收集BAL液。在BAL法中，重复用注射器将1mlPBS插入使用乙醚麻醉剂处死的小鼠的主支气管中并且吸出液体的操作10次。随后，以1000转/分将得到的BAL液离心10分钟。收集得到的沉淀作为Mφ。
4.在肺组织中8-OHdG(8-羟基脱氧鸟苷)的测量
在抽烟完成后的第一天，切除一个肺组织，随后以常规方法制备石腊切片。用OAB(二甲氨基偶氮苯)染料对切片进行免疫染色。在显微镜下观察染色的强度以测量8-OHdG(8-羟基脱氧鸟苷)。
5.在肺、肺泡肺Mφ和心脏的DNA中的8-OHdG
烟草烟包含许多致癌剂和致癌作用促进物质，如苯并芘。已报道抽烟与肺癌的发生相关并且8-OHdG参与致癌作用(Floyd，R.A.Carcinogenesis，11：1447-1450，1990)。
在抽烟完成和组织提取后的第一天，以常规方法提取DNA(Lu Wang等的方法)。随后，利用ELISA法进行检测，ELISA法使用抗8-OHdG抗体作为第一抗体而IgG酶标抗体作为第二抗体。通过对切下的肺的支气管肺泡肺进行洗涤来收集肺泡肺Mφ。进一步地，在抽烟完成后的第一天收集尿液。也通过ELISA法检测在尿液中的8-OHdG。
6.在肺、肺泡肺Mφ和心脏中O2 -和H2O2的产生
如上面第3部分所述，在抽烟完成后的第一天收集肺泡肺Mφ。随后，将2.5μg/ml氢化己啶(Hydroethidine)和20μg/mlDCFH-DA(二氯荧光素双乙酸盐)加入其中。将混合物在37℃摇动30分钟进行反应。通过离心洗涤反应液中的Mφ。利用FACSort(Bass，D.A.等，J.Immunol.139：1910-1917，1983)对得到的混合物进行检测。
II.结果
图1显示了在肺组织中免疫染色的结果。图1的上半区为显示在未抽烟小鼠肺组织中免疫染色结果的显微照片。图1的下半区为显示在抽烟小鼠肺组织中免疫染色结果的显微照片。如图1所示，与未抽烟的小鼠比较，在抽烟的小鼠中识别出强烈的染色。
接下来，随机选择各自小鼠的肺支气管上皮的6个位点(图1中方形所示的部分)。利用Image-Pro Plus(Planetron，Inc.)分析免疫染色的平均光学亮度。图2显示其结果。如图2所示，未抽烟组的平均光学亮度显著高于抽烟组的平均亮度。
图3显示在肺组织的DNA中8-OHdG的检测结果。如图3所示，识别出在抽烟组的肺组织DNA中的8-OHdG值显著高于未抽烟组。但是，通过给药蘑菇提取物(在图3和下面的图中以Ag表示)，该值明显地降低了。
图4显示在肺泡肺Mφ中O2 -和H2O2的检测结果。如图所示，在抽烟组的肺泡肺Mφ中生产O2 -的阳性细胞的百分比显著高于未抽烟组。识别出在抽烟组中产生H2O2的细胞倾向于多于未抽烟组。
图5、6和7分别显示了8-OhdG在肺胞肺MφDNA、心脏组织DNA以及尿液中的检测结果。如图中所示，在肺胞肺MφDNA、心脏组织DNA以及尿液中在抽烟组与未抽烟组的8-OhdG值之间没有观察到显著的区别。但是，认识到通过施用蘑菇热水提取物(在图5和7中表示为Ag)，在肺胞肺MφDNA和尿液中的8-OhdG值趋于降低。
基于上面提到的结果，随着由于抽烟引起的在肺胞肺Mφ中O2 -生产的增多，显示出一种氧化性的DNA损害在肺组织中得以引发并且蘑菇提取物的施用具有预防由抽烟引起的氧化性损害的效果。
(实施例2)蘑菇热水提取物对抗体产生的影响
I.材料和方法
实施例2中所用的材料和方法如下：
1.小鼠
使用8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠(Japan SLC Inc.，滨松，日本)。将12只小鼠分成一个蘑菇(Agaricus blazei Murill，下文中，简称为ABM)组和一个对照组。允许它们自由取食标准的非纯化的食物(8.7克水，25.2克粗蛋白质，4.6克粗脂，4.4克粗纤维，6.5克粗矿物质，50.7克NFE/100克食物：344.4千卡；Clea Japan，大阪，日本)和水。将小鼠圈养保持在25℃的房间内。根据京都Sangyo大学动物委员会的伦理指南对小鼠进行处理。
2.蘑菇提取物的制备
蘑菇的热水提取物由Kyowa Engineering Co.(东京日本)提供。其通过在Mizuno等(同上)所述的方法从蘑菇中进行提取。特别地，使用沸水进行干子实体的提取。将得到的溶液在1800×g离心10分钟并进行冻干以得到蘑菇的热水提取物。随后，将产物再一次溶解于不含Ca+和Mg++的浓度为10mg/mL的Dulbecco’s缓冲的生理盐水(PBS)中(Nissui Pharmaceutical公司，东京，日本)中。以0.45μm膜滤器(Millipore有限公司，Bedford，摩洛哥)对溶液进行过滤。将所得的过滤液保存于4℃待用。
3.空斑形成细胞(PFC)的分析
将来自Nikken Bio-medical laboratory Inc.(京都，日本)的绵羊红血细胞(SRBC)用作抗原。用生理盐水将SRBC洗涤三次。将1×108有AMB提取物(25mg/kg)的SRBC或作为对照的PBS经腹内注射入小鼠。四天后，将小鼠处死。根据在Cuunigham，A.J.等，Immunology 14：599-600，1968中所述的方法切除脾，在钢网上切碎，并让其通过纱布层以获得脾细胞的悬浮液。随后，以490×g将获得的悬浮液离心五分钟两次。将得到的沉淀物再次悬浮于10mL Eagle’s培养基(Nikken Bio-medical laboratory Inc.(京都，日本))的MEM培养基中。通过锥虫蓝清除测试来进行存活细胞的计数。通过Cuuninggham和Szenberg(Cuunigham，A.J.等，(1968)，Immunology.14(4)：599-600)的方法对与SRBC抗原相关的PFC的数量进行测定。特别地，将100μl份的脾细胞悬浮液与50μl的50％SRBC及24％补足物混合从而得到500μl终体积。将100μl样品于37℃在Cunnigham’s槽(商标)(76×26mm)中温育一小时。通过一个克隆计数器(Sekisui Chemical Corp.，大阪，日本)对SRBC的空斑进行计数。
4.白介素-1β和白介素-6mRNA的表达
4.1.RNA的提取
a)脾细胞
与上述对于PFC的方法相似，将AMB提取物(25mg/kg)或PBS经腹内注射入小鼠中。四天后，将脾切除，在钢网上切碎，并让其通过纱布层以获得脾细胞的悬浮液。通过使用一种硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)方法从脾细胞悬浮液中提取全细胞RNA。
b)腹膜细胞
从通过用10mL冷的PBS洗涤收集的滤液建立巨噬细胞的培养物。将滤液汇集于塑料管中并在250×g下离心10分钟。在滤液中的细胞成为沉淀。将沉淀物再次悬浮于补充了胎牛血清(FCS)(JRHBiosciences Inc.，Lenexa，KS)的RPMI(Nikken Bio-medicallaboratory Inc.，京都，日本)中。将一份腹膜细胞(5×105细胞/0.1ml/细胞)在平底96孔培养板(Becton Dickinson Co.Ltd，MA，美国)中进行培养，其中含有或不含有0.1或1mg/mL ABM提取物。在含5％CO2的加温的空气中进行培养。24和48小时后，通过用AGPC法进行全RNA的分离。
4.2.RT-PCR
用MLV反转录酶(Life Technologies Ltd.，MD，美国)将全RNA转录为cDNA。由发表过的白介素-1β(250bp)、白介素-6(290bp)和β-肌动蛋白(268)cDNA的管家基因来构建寡核苷酸引物。随后，使用下列引物对：β-肌动蛋白的有义链(5’-GCATTGTTACCAACTGGGAC-3’)和β-肌动蛋白的反义链(5’-TCTCCGGAGTCCATCACAAT-3’)；白介素-1β的有义链(5’-AGCTACCTGTGTCTTTCCCG-3’)和白介素-1β的反义链(5’-GTCGTTGCTTGGTTCTCCTT-3’)；白介素-6的有义链(5’-GATGCTACCAAACTGGAGATAATC-3’)和白介素-6的反义链(5’-GGTCCTTAGCCACTGCTTCTGTG-3’)对白介素-1β的PCR，进行30个循环，对白介素-6进行32个循环的PCR。由在94℃变性1分钟、在56℃将引物退火1分钟和在72℃延伸1分钟来建立扩增程序。在最后一个循环后，在72℃进一步延伸10分钟。随后将反应物冷却至4℃结束反应。将PCR产物进行30％聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用溴化乙锭进行显色。
5.对表面抗原的分析
通过直接的免疫荧光方法检测在脾细胞中表面抗原的表达。将获得的含有或不含有ABM提取物的脾细胞(5×105细胞/100μl)在4℃用0.5μg与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的或与藻红蛋白(PE)缀合的mAb的终产物进行染色。与FITC缀合的抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25、抗CD11b(Mac-1)mAb和与PE缀合的抗CD19 mAb得自CaltagInc.(旧金山，加利福尼亚)。将这些细胞温育，随后，用1mL PBS在490×g进行离心5分钟。其后，将所得的沉淀再次悬浮在含100μg/mL CaCl2/MgCl2、0.01％叠氮钠和1％FCS的0.5mL PBS中。接下来，利用FAC扫描流式细胞仪(Becton Dickenson Co.，MA，US)对所得的溶液进行分析。
6.统计分析
所有值都在平均数±S.D.的基础上表示。通过斯图登特t-检验进行ABM处理组和对照组之间的比较。将P值小于0.05定义为显著性的。
II.结果
1.ABM对抗体产生的影响
检测ABM对每106个脾细胞和每个脾的PFCs数目的影响。如表1所示，在ABM处理组(1.11±0.29×108细胞/脾)和对照组(0.98±0.20×108细胞/脾)小鼠的脾细胞数目上没有显著区别。对于对照组，每106脾细胞的PFCs数目为425±283个细胞，而对于ABM处理组的小鼠则为897±440个细胞(图9(a)，表1)。对于ABM处理组的小鼠，每个脾的PFCs数目为3.8±2.20×104细胞，而对于对照组则为10.5±5.63×104细胞(图9(b)，表1)。如从这些结果可以看出的，ABM引起了每106个脾细胞和每个脾的PFCs数目的显著增长(p＜0.01)。
                                   表1
                           ABM产品对PFCs数目的影响
                    PFCs数1)     脾细胞数(×108细胞)
  每106个脾细胞     每个脾(×104细胞)
  对照ABM2)   425.19±283.743)897.09±439.78*     3.86±2.2010.59±5.63*     0.98±0.201.11±0.29
1)用SRBC抗原免疫四天后进行PFC分析。
2)将SRBC抗原(×108)和ABM提取物(25mg/kg)进行腹内给药。
3)每个值代表平均数±S.D.(n＝12)。星号指示相对于对照组有显著性差异。*：p＜0.01
2.ABM提取物对在脾细胞或腹巨噬细胞中白介素-1β和白介素-6mRNA表达的影响
为了测试ABM提取物是如何增多PFCs的，对白介素-1β和白介素-6的mRNA表达进行了检测。在ABM提取物处理组中，脾中白介素-1β和白介素-6mRNA的表达在第三天和第四天得到了提高(图10)。特别地，在第四天在ABM提取物处理的组的小鼠中白介素-1βmRNA的表达得到了最大程度的提高。为了测试ABM提取物是否激活巨噬细胞，对白介素-1β和白介素-6mRNA的诱导表达进行了检测。结果，发现ABM提取物以依赖于服药的方式在24小时的培养后强烈地提高了白介素-1β和白介素-6的表达(图11)。
3.ABM提取物对脾细胞表面抗原的影响
在ABM提取物处理组的小鼠中Mac-1、B7-1或CD25抗原阳性细胞的百分率分别是25.4±1.4、42.0±2.0或26.9±2.5。在对照组小鼠中，它们分别是17.0±3.6、42.0±2.9或13.1±2.2。与对照组小鼠相比，在ABM处理组小鼠中有显著的增长(分别地为p＜0.01，p＜0.01，p＜0.001)。但是，在这两组中没有发现CD3、CD4、CD8、CD19或第二类抗原阳性细胞的百分率有显著的差别(表2)。
                                                       表2
                                 在ABM提取物腹内给药后第四天脾细胞亚群的细胞种群
             阳性细胞的百分率(％)
             CD3              CD4            CD8            CD19          Mac-1        第二类             B7              CD25
对照     28.94±1.322)    18.67±1.73    12.24±0.87    52.20±3.33    16.97±3.55     35.92±9.64    11.92±2.89     13.13±2.23
ABM1)    28.03±1.21      18.98±0.49    14.39±1.84    53.79±5.28    25.44±1.35*   42.03±2.02    18.68±2.04*   26.90±2.46**
1)在FACs分析前四天对ABM提取物(25mg/kg)进行腹内给药。
2)每个值代表平均数±S.D.(n＝5)。星号指示相对于对照组有显著性差异。*：p＜0.01，**：p＜0.001
4.讨论
ABM被广泛认识到具有抗肿瘤活性(Fujimiya Y等，同上；EbinaT等，同上；以及Mizuno M等，同上)。还没有报道ABM对抗体产生的影响。本发明显示ABM提取物可以提高免疫系统的反应性。将PFC分析用于确认ABM提取物对抗体生产的影响。PFC分析是检测体液免疫反应的一种典型方法(Cunningham AJ等，同上)。
在ABM处理组的小鼠中，脾内抗SRBC抗原的PFCs数较对照组小鼠增长了约三倍。但是，在B细胞和脾细胞的种群数上没有区别。在免疫后第四天的小鼠脾中，ABM处理组的小鼠中的Mac-1或CD25抗原阳性细胞的百分率较对照组小鼠显著提高。但是，在两组间CD19抗原阳性细胞的种群上没有显著区别。Mac-1存在于分化的单核细胞/巨噬细胞、粒细胞和激活的T淋巴细胞上。CD25抗原存在于激活的或分化的T/B淋巴细胞和分化的单核细胞/巨噬细胞的表面膜上。CD19抗原存在于未激活的B淋巴细胞的表面膜上。相应地，这些结果提示ABM提取物主要刺激巨噬细胞和T细胞，并在没有B细胞数目增加时引起B细胞分化。Mizuno等(同上)显示在口服可溶性的ABM馏分的小鼠中Thy-1、2、CD4和CD8阳性细胞群较对照显著增多，但是，本发明人未能发现CD4和CD8阳性细胞的百分率之间存在显著的差别。这些不一致可以归因于在提取ABM提取物的方法、给药途径以及浓度上的不同。
B细胞的分化需要从巨噬细胞或T细胞分泌的多种细胞因子的协同效应(Mitsuzumi H等，Jpn.J.Pharmacol.78(2)：169-79)。已报道抗SRBC抗原的抗体生产由于白介素-1激活引发抗体生产的T细胞而在白介素1-1-小鼠中得以降低(Nakae S等(2001)，J.Immunol.167(1)，90-7)。据显示GM-CSF对成熟的功能性的APC具有影响并且也通过白介素-1的分泌和Ia抗原的表达而导致体外免疫系统的增强反应(Morrissey PJ等(1987)，J.Immunol.15；139(4)：1113-1119)。据显示白介素-6加速B细胞的末期分化以形成抗体分泌细胞，而主要的生产者为单核细胞和T细胞(Morgan EL等(1990)，J.Immunol.1；144(7)：2499-505)。本申请已经显示ABM提取物增强来自腹部巨噬细胞白介素-6和白介素-1βmRNA的表达。另外，同样的结果也在ABM处理组的小鼠的脾细胞白介素-1β和白介素-6的mRNA表达中得以显示。这些结果已显示，由ABM提取物引起的抗体生产的增强是由激活的T细胞和巨噬细胞生产的IL-1β和IL-6诱导的，并且B细胞得以分化。如上所述，证明了来自ABM的热水提取物对于免疫系统的增强和多种疾病的预防是一种重要物质。
5.结论
本发明检测了来自干蘑菇(ABM)的热水提取物的免疫增强活性。通过关于绵羊红血细胞(SRBC)抗原的空斑形成细胞(PFC)方法检测了ABM对抗体生产的影响。与对照组相比，ABM提取物以25mg/kg的腹内给药剂量显著地提高了脾内PFCs的数量。利用流式细胞仪分析这些脾细胞上的表面抗原。与对照组小鼠相比，Mac-1或CD25阳性细胞种群增多了，但是在CD19阳性细胞方面没有区别。通过RT-PCR对白介素-6和白介素-1βmRNA的表达进行了分析。ABM提取物增强了在腹巨噬细胞和脾细胞二者中的表达。这些结果提示，ABM提取物是一种T细胞和巨噬细胞释放白介素-1β和白介素-6的有效刺激因子，并且能提高抗SRBC抗原抗体的生产。
工业实用性
根据本发明，通过用热水进行蘑菇的提取，提供了一种预防由外部因子引起的对活体的损害的组合物以及包括该组合物的健康食品。蘑菇热水提取物包括一种用于T细胞和巨噬细胞释放白介素-1β和白介素-6的有效的刺激因子。因而，提供了一种增强生产抗外源抗体能力的一种组合物或健康食品。
序列表
<110>Sundory Co.Ltd.，and Kyowa Engineering Co.Ltd.
<120>保护活体免受外部因子损害的方法及组合物。
<130>
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：β肌动蛋白的有义链
<300>
<400>1
gcattgttac caactgggac    20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：β肌动蛋白的反义链
<400>2
tctccggagt ccatcacaat..20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：白介素-1β的有义链
<400>3
agctacctgt gtctttcccg    20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：白介素-1β的反义链
<400>4
gtcgttgctt ggttctcctt    20
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：白介素-6的有义链
<400>5
gatgctacca aactggagat aatc    24
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：白介素-6的反义链
<400>6
ggtccttagc cactgcttct gtg    23

Claims (27)

1.一种保护活体免受外部因子损害的组合物，它包括一种来自蘑菇的提取物。
2.一种根据权利要求1的组合物，它通过免疫活性细胞来保护活体。
3.一种根据权利要求2的组合物，其中所述的免疫活性细胞为巨噬细胞。
4.一种根据权利要求2的组合物，其中所述的免疫活性细胞为巨噬细胞或T细胞。
5.一种根据权利要求2的组合物，其中所述的免疫活性细胞为抗体生产细胞。
6.一种根据权利要求2的组合物，它通过体液免疫的增强来保护活体。
7.一种根据权利要求1的组合物，其中所述的外部因子得自抽烟。
8.一种根据权利要求7的组合物，它通过降低遗传损害来保护活体。
9.一种根据权利要求8的组合物，其中所述的遗传损害为肺组织的氧化性DNA损害。
10.一种根据权利要求1的组合物，其中所述的外部因子为一种抗原物质。
11.一种根据权利要求6的组合物，其中所述的体液免疫的增强是通过激活选自T细胞和巨噬细胞的淋巴细胞而引起的。
12.一种根据权利要求11的组合物，其中所述的体液免疫的增强是通过提高选自白介素-1β和白介素-6的白介素的表达而引起的。
13.一种根据权利要求1的组合物，它进一步包含一种药学上可接受的载体。
14.一种根据权利要求1的组合物，它是选自粉末、液体、片剂、胶囊和药丸的形式。
15.种保护活体免受外部因子损害的方法，它包含向被试者施用一种包括来自蘑菇的提取物的步骤。
16.一种根据权利要求15的方法，它通过免疫活性细胞来保护活体。
17.一种根据权利要求1 6的方法，其中所述的免疫活性细胞为巨噬细胞。
18.一种根据权利要求16的方法，其中所述的免疫活性细胞为巨噬细胞或T细胞。
19.一种根据权利要求16的方法，其中所述的免疫活性细胞为抗体生产细胞。
20.一种根据权利要求16的方法，它通过体液免疫的增强来保护活体。
21.一种根据权利要求15的方法，其中所述的外部因子得自抽烟。
22.一种根据权利要求21的方法，它通过降低遗传损害来保护活体。
23.一种根据权利要求22的方法，其中所述的遗传损害为肺组织的氧化性DNA损害。
24.一种根据权利要求15的方法，其中所述的外部因子为一种抗原物质。
25.一种根据权利要求20的方法，其中所述的体液免疫的增强是通过激活选自T细胞和巨噬细胞的淋巴细胞而引起的。
26.一种根据权利要求25的方法，其中所述的体液免疫的增强是通过提高选自白介素-1β和白介素-6的白介素的表达而引起的。
27.一种来自蘑菇的提取物在制备一种保护活体免受外部因子损害的组合物中的应用。
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