CN1268350C - 压力负荷恢复促进用药物组合物以及新型松蕈株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含有松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松草的碱性溶液提取液或其干燥体以及药学上允许的载体的对于压力负荷促进恢复用的药物组合物，以及新型的松蕈FERM BP-7304株。

Description

压力负荷恢复促进用药物组合物 以及新型松蕈株
技术领域
本发明涉及压力负荷恢复促进用药物组合物以及新型松蕈株。本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物不仅能够作为药品给予，而且也能够以各种形态，例如作为功能性食品或健康食品(包括饮料)或者饲料以饮食品的形态给予。而且，也能够以口腔卫生用组合物，例如虽然暂时含在口中，但几乎将其全部从口中吐出的形态，如刷牙剂、漱口剂、口香糖或含嗽剂的形态给予，或者以由鼻腔吸入的吸入剂形态给予。
背景技术
已知松蕈中含有各种生理活性物质，例如在特公昭57-1230号公报和特许第2767521号说明书中公开了松蕈中含有的各种抗肿瘤性物质。上述特公昭57-1230号公报中公开了用热水或稀碱性溶液提取松蕈菌丝体的液体培养物，由得到的提取液分离纯化而成的エミタニン-5-A、エミタニン-5-B、エミタニン-5-C以及エミタニン-5-D具有抑制肉瘤180细胞增殖的作用。另外，上述特许第2767521号说明书中公开了由松蕈子实体的水提取物分离纯化得到的分子量20～21万的蛋白质(亚单位的分子量＝10～11万)具有抗肿瘤活性。
而且，本发明人已经发现松蕈热水提取液、松蕈的碱性溶液提取液或者松蕈热水提取液或松蕈碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附级分具有免疫增强活性(特愿2000-374号)。
另外，已知压力不仅会引起身心疾病等适应社会生活的障碍，而且也能够成为生活习惯病等发病和发展的诱因。对于处在压力之中时身心的变化，对症治疗地配制了抗焦虑药(安定药)或中药，但是对于压力所伴随的免疫功能变化的有效处置方法可以说现在仍处于摸索过程中。在本发明人了解的范围内，既不知道从压力负荷中解放出来后，显示促进免疫力自发恢复作用(即压力负荷恢复促进作用)的食品，也不知道食品中存在显示上述压力负荷恢复促进作用的物质。
本发明人对松蕈悉心探索了已知的上述抗肿瘤活性或免疫增强活性以外的其他生理活性，新发现松蕈中含有显示上述压力负荷恢复促进作用的活性成分。另外，悉心探索了本发明人发现的新型松蕈株的生理活性，发现了含有显示很强的上述压力负荷恢复促进作用的活性成分的新型松蕈株。本发明是基于这些发现完成的。
发明公开
因此，本发明涉及一种对于压力负荷促进恢复用的药物组合物，其中含有松蕈〔Tricholoma matsutake(S.Ito & Imai)Sing.〕、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体以及药学上允许的载体。
另外，本发明还涉及对于压力负荷促进恢复用的功能性食品，其中单独含有松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体，或者根据需要还含有1种或1种以上的食品成分。
另外，本发明还涉及对于压力负荷促进恢复用的口腔卫生用组合物，其中含有松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体以及口腔卫生用组合物的载体。
另外，本发明还涉及对于压力负荷的恢复促进方法，包括将松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体以有效量给予必需促进对压力负荷的恢复的对象。
另外，本发明还涉及松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体在制备对于压力负荷促进恢复用的药物组合物、对于压力负荷促进恢复用的功能性食品、或者对于压力负荷促进恢复用的口腔卫生用组合物中的用途。
另外，本发明还涉及松蕈FERM BP-7304株，或者其菌丝体、培养物或子实体。
而且，本发明还涉及松蕈FERM BP-7304株的热水提取液或其干燥体，或者松蕈FERM BP-7304株的碱性溶液提取液或其干燥体。
附图说明
图1涉及表1记载的菌编号1～6表示的公知松蕈株，是表示按照RAPD法得到的PCR产物的电泳结果的照片。
图2涉及表1记载的菌编号7～11表示的公知松蕈株，是表示按照RAPD法得到的PCR产物的电泳结果的照片。
图3涉及表1记载的菌编号12～13表示的公知松蕈株和本发明的松蕈FERM BP-7304株，是表示按照RAPD法得到的PCR产物的电泳结果的照片。
图4涉及本发明的松蕈FERM BP-7304株，是表示按照RAPD法得到的PCR产物的电泳结果的照片。
图5是表示本发明的松蕈FERM BP-7304株的热水提取液干燥物粉末与碱性溶液提取液干燥物粉末的比率为3.2∶5.1的混合物的压力负荷恢复促进活性的图。
图6是表示本发明的松蕈FERM BP-7304株和各种松蕈株的各干燥物粉末的压力负荷恢复促进活性的图。
图7是表示其它各种松蕈株的各干燥物粉末的压力负荷恢复促进活性的图。
图8是表示其它各种松蕈株的各干燥物粉末的压力负荷恢复促进活性的图。
图9是表示其它各种松蕈株的各干燥物粉末的压力负荷恢复促进活性的图。
发明的最佳实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物含有下述物质中的至少1种作为有效成分，
(1)松蕈〔例如，松蕈的菌丝体、培养物(Broth)或子实体〕，
(2)松蕈的热水提取液〔例如，松蕈的菌丝体、培养物(Broth)或子实体的热水提取液〕或其干燥体，或者
(3)松蕈的碱性溶液提取液〔例如，松蕈的菌丝体、培养物(Broth)或子实体的碱性溶液提取液〕或其干燥体，
而且还含有药剂学或兽医学上允许的通常的载体或稀释剂。
作为用于制备本发明的有效成分，即松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体的上述松蕈，例如天然松蕈的子实体或菌丝体，或者通过培养得到的松蕈的菌丝体(即培养菌丝体)、培养物(Broth)或子实体。从含有显示很强的压力负荷恢复促进作用的活性成分的观点来看，优选使用本发明的新型松蕈株，即松蕈FERM BP-7304株〔Tricholoma matsutake(S.Ito & Imai)Sing.CM6271〕。
作为可以用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分的松蕈菌丝体，在使用通过培养得到的菌丝体时，例如可以由通过培养得到的菌丝体(即培养菌丝体)和培养基的混合物，采用适当的除去方法(例如过滤)仅除去培养基后使用，或者也可以由除去培养基后的菌丝体，采用适当的方法(例如冷冻干燥)除去水分，以菌丝体干燥物的状态使用，而且还可以将上述菌丝体干燥物粉碎，以菌丝体干燥物粉末的状态使用。另外，使用天然菌丝体的场合，例如可以直接使用天然的菌丝体，或者也可以采用适当的方法(例如冷冻干燥)由天然的菌丝体除去水分，以菌丝体干燥物的状态使用，而且还可以将上述菌丝体干燥物粉碎，以菌丝体干燥物粉末的状态使用。
作为可以用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分的松蕈培养物(Broth)，例如能够以通过培养得到的菌丝体(即培养菌丝体)和培养基的混合物的状态直接使用，或者也能够采用适当的方法(例如冷冻干燥)从上述混合物除去水分，以培养物(Broth)干燥物的状态使用，而且还能够将上述培养物(Broth)干燥物粉碎，以培养物(Broth)干燥物粉末的状态使用。
作为可以用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分的松蕈子实体，例如可以直接使用天然的子实体或通过培养得到的子实体，或将上述子实体破碎后使用，或者也可以采用适当的方法(例如冷冻干燥)由上述子实体除去水分，以子实体干燥物的状态使用，而且还能够将上述子实体干燥物粉碎，以子实体干燥物粉末的状态使用。
松蕈的热水提取液例如可以通过用热水提取天然松蕈的子实体或菌丝体，或者通过培养得到的松蕈的菌丝体(即培养菌丝体)、培养物(Broth)或子实体得到。
热水提取时使用的热水温度只要是能够将松蕈中含有的显示压力负荷恢复促进作用的成分充分提取到热水提取液中的温度即可，并没有特别的限定，优选60～100℃，更优选80～98℃。
将菌丝体或子实体用于热水提取时，为了提高提取效率，优选加工成破碎物或粉体的状态。
另外，提取时，为了提高提取效率，优选在进行搅拌或振荡的同时实施。提取时间可以根据例如松蕈的状态(即，为子实体、菌丝体或培养物中的哪一种状态，或者在加工成破碎物或粉体的状态时其加工状态)、热水的温度、或者搅拌或振荡的有无或条件适当确定，通常为1～6小时，优选2～3小时。
得到的热水提取液能够以混有不溶物的状态直接用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分，或者也能够在除去不溶物后，或除去不溶物，并除去提取液中的低分子级分后，用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分。例如，可以通过将混有不溶物的热水提取液离心分离除去不溶物，仅将得到的上清液用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分。或者，也可以将混有不溶物的热水提取液离心分离，将得到的上述上清液透析，除去低分子级分(优选分子量3500以下的级分)后，用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分。而且，还可以采用适当的方法(例如冷冻干燥)由热水提取液(包括例如混有杂质的热水提取液、将上述热水提取液离心分离得到的上清液、或者上述上清液的透析物等)除去水分，以干燥体的状态作为本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分使用。
作为本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分的松蕈碱性溶液提取液或其干燥体的制备方法，可以按照以上说明的松蕈热水提取液的制备方法实施。也就是说，除了用碱性溶液代替热水以外，可以按照与松蕈的热水提取液的上述制备方法相同的方法进行制备。例如，可以通过周碱性溶液提取天然松蕈的子实体或菌丝体，或者通过培养得到的松蕈的菌丝体(即培养菌丝体)、培养物(Broth)或子实体得到。
作为碱性溶液提取时使用的碱性溶液，没有特别的限定，例如可以使用碱金属(例如钠或钾)的氢氧化物，特别是氢氧化钠的水溶液。上述碱性溶液的pH优选为8～13，更优选9～12。碱性溶液提取优选在0～30℃下实施，更优选在0～25℃下实施。得到的碱性溶液提取液可以在实施中和处理后用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分，或者也可以不实施中和处理，直接用作本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分。
本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物可以将松蕈〔例如松蕈的菌丝体、培养物(Broth)或子实体〕、松蕈的热水提取液〔例如松蕈的菌丝体、培养物(Broth)或子实体的热水提取液〕或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液〔例如松蕈的菌丝体、培养物(Broth)或子实体的碱性溶液提取液〕或其干燥体，与药剂学或兽医学上允许的通常的载体或稀释剂一起给予动物，优选哺乳动物(特别是人)。
本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分，即松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体对压力负荷具有促进恢复的活性。
因此，本发明的有效成分，即松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体可以单独，或者优选与药剂学或兽医学上允许的通常的载体或稀释剂一起，以有效量给予必需促进对压力负荷的恢复的对象。
另外，本发明的有效成分，即松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体，可以用于制备对于压力负荷促进恢复用的药物组合物、对于压力负荷促进恢复用的功能性食品、或者对于压力负荷促进恢复用的口腔卫生用组合物。
一般，如果对于动物给予单发性的或者经过某一期间的压力，通常该动物的免疫能力降低，如果从上述压力负荷中解放出来，则免疫力自发地恢复。本说明书中的“对压力负荷促进恢复的活性(压力负荷恢复促进活性)”是指，由压力负荷中解放出来后，与自发恢复相比，促进免疫力恢复期的免疫力恢复的活性。
本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的给药时间只要通过给予该药物组合物能够促进由于压力负荷导致暂时降低的免疫力恢复即可，没有特别的限定，例如可以在承受压力前、承受压力时和/或从压力负荷中解放出来后的免疫力恢复期给药。
另外，本发明的上述“压力负荷恢复促进活性”与本发明人以前发现的上述单纯的“免疫增强活性”不同。也就是说，“免疫增强活性”一般是指给予具有这种活性的有效成分时，与给药前的状态(可以是没有压力负荷，免疫力为通常的状态，或者也可以是由于压力负荷，免疫力降低的状态)相比，可见免疫力提高的活性，因此是提高免疫力自身的活性。另一方面，本发明的“压力负荷恢复促进活性”如上所述是指促进免疫力恢复期的免疫力恢复的活性，因此是提高免疫力恢复速度的活性。如果给予本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物，与不给予本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的场合相比，免疫力的恢复速度上升。
而且，在“免疫增强活性”中，如果给予具有这种活性的有效成分，直接可见免疫力的提高，与此相对，如果在承受压力之前预先将本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的有效成分，即松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体给予对象动物，则在承受压力时和免疫力恢复期中，即使不给予松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体，也能在免疫力恢复期促进免疫力的恢复。在这一点上，“免疫增强活性”与本发明的“压力负荷恢复促进活性”是不同的活性。
作为本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物的给药剂型，没有特别的限定，例如散剂、细粒剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆剂、浸膏剂或丸剂等口服剂，或注射剂、外用液体制剂、软膏剂、栓剂、局部给药的霜剂或滴眼药等非口服剂。
这些口服剂可以使用例如明胶、海藻酸钠、淀粉、玉米淀粉、白糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羧甲基纤维素、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、结晶纤维素、大豆卵磷脂、蔗糖、脂肪酸酯、滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇、硅酸镁、硅酸酐或合成硅酸铝等赋形剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、稀释剂、保存剂、着色剂、香料、矫味剂、稳定剂、保湿剂、防腐剂或抗氧化剂等，按照常规方法进行制备。
作为非口服给药方法，例如注射(皮下、静脉等)或者直肠给药等。其中最优选使用注射剂。
在注射剂的制备中，除有效成分以外，可以任意使用例如生理盐水或林格溶液等水溶性溶剂、植物油或脂肪酸酯等非水溶性溶剂、葡萄糖或氯化钠等等渗剂、溶解助剂、稳定剂、防腐剂、悬浮剂或乳化剂等。
另外，本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物也可以使用缓释性聚合物等，采用缓释性制剂的方法进行给药。例如，可以将本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物固定在乙烯醋酸乙烯酯聚合物的颗粒中，将该颗粒外科移植到需要治疗或预防的组织中。
本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物可以合有松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体0.01～99重量％，优选0.1～80重量％，但是并不限于此。
使用本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物时的给药量可以根据疾病的种类、患者的年龄、性别、体重、症状的程度或给药方法等适当确定，能够口服给药或非口服给药。
另外，给药方式也不限定于药品，也能够以各种形态，例如作为功能性食品或健康食品(包括饮料)或者饲料以饮食品的形态给予。而且，也能够以口腔卫生用组合物，例如虽然暂时含在口中，但几乎将其全部从口中吐出的形态，如刷牙剂、漱口剂、口香糖或含嗽剂的形态给予，或者以由鼻腔吸入的吸入剂的形态给予。例如，可以将松蕈、松蕈的热水提取液或其干燥体、或者松蕈的碱性溶液提取液或其干燥体作为添加剂(例如食品添加剂)，添加到所需的食品(包括饮料)、饲料、刷牙剂、漱口剂、口香糖或含嗽剂等中。
本发明的松蕈FERM BP-7304株于平成12年9月14日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心〔(旧)工业技术院生命工学工业技术研究所(地址：
Figure C0181730400111
305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)〕。该松蕈FERM BP-7304株是由京都府龟冈市采集的松蕈CM6271株切出子实体组织，在试管内培养得到菌丝体继代株的物质，维持在吴羽化学工业株式会社生物医学研究所。
本发明的松蕈FERM BP-7304株的子实体形态与今关六也·本乡次雄编的“原色日本新菌类图鉴(I)”，保育社(大阪)，昭和62年发行，图版(Plate)15和77页记载的松蕈子实体一致。本发明的松蕈FERM BP-7304株的继代培养可以采用Ebios(干酵母，エゼオス)琼脂斜面培养基实施。大量培养上述菌株的菌丝体时，可以摄取到液体培养基中，通过例如静置培养、振荡培养或罐(tank)培养实施。
将本发明的松蕈FERM BP-7304株的菌丝体接种在Ebios琼脂平板培养基中，则白色的菌丝呈放射状密集繁殖，形成大的菌落。如果用扫描型电子显微镜观察，则存在无数粗度为1～2μm的枝状菌丝体，在菌丝体侧部经常可见数μm的突起物。另外，松蕈FERM BP-7304株能够主要以菌丝体的形状进行继代维持或培养，但有时也形成子实体的形状。
以下，说明本发明的松蕈FERM BP-7304株的菌学性质。
(1)麦芽提取物琼脂培养基上的培养特性和形态特性
本发明的松蕈FERM BP-7304株在麦芽提取物琼脂培养基中，白色的菌丝呈放射状密集繁殖，形成菌落。接种第30天的菌落直径为约4cm。
(2)马铃薯-葡萄糖琼脂培养基、恰佩克(Czapek)琼脂培养基、萨布罗(Sabouraud)琼脂培养基、燕麦片琼脂培养基、合成ムコ-ル琼脂培养基和酚氧化酶反应检验用培养基上的培养特性和形态特性
本发明的松蕈FERM BP-7304株在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基、恰佩克琼脂培养基、萨布罗琼脂培养基、燕麦片琼脂培养基、合成ムコ-ル琼脂培养基或酚氧化酶反应检验用培养基中任意一种培养基上，接种后经过1个月，也几乎见不到菌丝的生长。
(3)YpSs琼脂培养基上的培养特性和形态特性
本发明的松蕈FERM BP-7304株在YpSs琼脂培养基中，具有白色光泽，繁殖成丛(マツト)状。接种第30天的繁殖距离为约5mm。
(4)葡萄糖-干酵母琼脂培养基上的培养特性和形态特性
本发明的松蕈FERM BP-7304株在葡萄糖-干酵母琼脂培养基中，具有白色光泽，繁殖成丛状。接种第30天的繁殖距离为约2mm。
(5)最适繁殖温度和繁殖的范围
在装有灭菌处理后的液体培养基(3％葡萄糖、0.3％酵母提取液；pH7.0)10mL的100mL锥形瓶中，接种本发明的松蕈FERM BP-7304株的种菌约2mg，在5～35℃的各种温度下分别进行培养，第28天由锥形瓶取出菌体，用蒸馏水充分洗涤后，干燥，测定重量。结果，菌体重量在5～15℃的范围内直线增加，在15～25℃的范围内缓慢增加。在27.5℃以上几乎不增加。最适繁殖温度为15～25℃。
(6)最适繁殖pH和繁殖的范围
用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钾调节液体培养基(3％葡萄糖、0.3％酵母提取液)的pH，配制pH在3.0～8.0范围内的各种培养基，考察繁殖pH值。对各培养基进行滤器除菌，将培养基10mL分别注入灭菌后的100mL锥形瓶中。接种本发明的松蕈FERM BP-7304株的种菌约2mg后，在22℃下培养，第28天由锥形瓶取出菌体，用蒸馏水充分洗涤后，干燥，测定重量。结果，菌体的繁殖界限为pH3.0～7.0，最适繁殖pH为4.0～6.0。
(7)通过对峙培养有无形成带线
在Ebios琼脂平板培养基上以约2cm的间隔对峙接种本发明的松蕈FERM BP-7304株的菌块(约3mm×3mm×3mm)和下述表1所示的13种松蕈株的各菌块(约3mm×3mm×3mm)，在22℃下培养3周后，判断在两种菌落的边界部分是否产生带线。
结果，本发明的松蕈FERM BP-7304株对表1所示13种松蕈株中的任意一种菌株均不形成明显的带线。另外，一般认为松蕈在异株间对峙培养时不产生带线，在表1所示的13种松蕈株之间也不存在形成明显带线的组合。
(8)营养要求
在装有灭菌处理后的菌根菌用合成培养基(Ohta等，Trans.Mycol.Soc.Jpn.，31，323，1990)10mL的100mL锥形瓶中，接种本发明的松蕈FERM BP-7304株的种菌约2mg，在22℃下培养，第42天由锥形瓶取出菌体，用蒸馏水充分洗涤后干燥，测定重量，得到菌体441mg。
在加入28种糖类相关物质中的任意一种代替上述菌根菌用合成培养基中的碳(C)源即葡萄糖的各种培养基中，接种本发明的松蕈FERMBP-7304株，培养，培养结束后测定菌体重量。
结果，按照菌体重量多的糖类相关物质到菌体重量少的糖类相关物质的顺序表示如下。
小麦淀粉＞玉米淀粉＞糊精＞甲基β糖苷＞纤维二糖＞甘露糖＞果糖＞阿拉伯糖＞山梨糖醇＞葡萄糖＞乳糖＞糖元＞甘露糖醇＞核糖＞麦芽糖＞海藻糖＞半乳糖＞蜜三糖＞蜜二糖＞N-乙酰葡糖胺。
另外，使用纤维素、半乳糖醇(dulcitol)、蔗糖、木糖、甲基α糖苷、菊粉、肌醇或山梨糖，几乎见不到菌的生长。
接着，在加入15种氮相关物质中的任意一种代替上述菌根菌用合成培养基中的氮(N)源即酒石酸铵的各种培养基中，接种本发明的松蕈FERM BP-7304株，培养，培养结束后测定菌体重量。
结果，按照菌体重量多的氮相关物质到菌体重量少的氮相关物质的顺序表示如下。
玉米浆＞大豆蛋白胨＞乳蛋白胨＞硝酸铵＞硫酸铵＞酒石酸铵＞碳酸铵＞天冬酰胺＞磷酸铵＞氯化铵＞硝酸钠＞肉汁＞酵母提取液＞水解酪蛋白氨基酸＞小球藻(クロレラ，Chlorella)＞胰蛋白胨＞硝酸钾。
而且，在除去了上述合成培养基中的矿物和维生素类中特定的一种成分得到的培养基中，接种本发明的松蕈FERM BP-7304株，培养，培养结束后测定菌体重量。
结果，缺少氯化钙·二水合物、硫酸锰(II)·五水合物、硫酸锌·七水合物、硫酸钴·七水合物、硫酸铜·五水合物、硫酸镍·六水合物、盐酸硫胺、烟酸、叶酸、生物素、盐酸吡哆醇、氯化肉毒碱、硫酸腺嘌呤·二水合物或盐酸胆碱中任意一种时，对菌体重量几乎没有影响。另一方面，如果从培养基中除去硫酸镁·七水合物、氯化铁(II)或磷酸二氢钾中的任意一种，则菌体重量显著减少。也就是说，认为镁、铁、磷和钾是本发明的松蕈FERM BP-7304株增殖所必需的。
(9)DNA的碱基组成(GC含量)
本发明的松蕈FERM BP-7304株的GC含量为49.9％(参照下述分析例2)。
(10)采用RAPD法产生的DNA图案
对于按照分别单独使用6种不同PCR(聚合酶链反应，polymerasechain reaction)用引物(10mer；具体的碱基序列参照下述分析例1)的RAPD(随机扩增多态DNA，random amplified polymorphic DNA)法生成的DNA图案，比较本发明的松蕈FERM BP-7304株和44种松蕈株(具体的菌株名参照下述分析例1)，结果本发明的松蕈FERM BP-7304株显示与44种松蕈株均不同的DNA图案。
实施例
以下结合实施例具体说明本发明，但是这些实施例并不限定本发明的范围。
实施例1：松蕈FERM BP-7304株的干燥物粉末的制备
将松蕈FERM BP-7304株菌丝体接种在10个装有灭菌处理后的培养基(3％葡萄糖、0.3％酵母提取液，pH6.0)100mL的500mL锥形瓶中，在22℃下用250rpm的振荡培养机培养4周。用滤布将得到的培养物过滤，分离菌丝体后，用蒸馏水充分洗涤。冷冻至-60℃后，使用冷冻干燥机(MINIFAST MOD.DO.5；Edwards社)进行冷冻干燥，得到干燥菌丝体10.1g。使用匀质混合机(Wonder Blender；大阪化学社)将得到的菌丝体粉碎，得到干燥物粉末9.8g。
实施例2：松蕈FERM BP-7304株的热水提取液和碱性溶液提取液的各干燥物粉末的制备
将按照与上述实施例1同样的步骤制得的松蕈FERM BP-7304株菌丝体的干燥物粉末15g移至1L的烧杯中，加入纯水600mL后，在搅拌器搅拌下，在93～98℃的水浴中提取3小时。提取结束后，冷却至室温，通过离心分离(12000rpm，20分钟)得到上清液。
向沉淀部分加入纯水300mL，进行与上述同样的处理。该操作共计进行3次，将所有上清液合并，装入透析膜(Spectra/Por3Membrane，分子量3500分级)中，在自来水的流水中透析2天。用旋转蒸发器将透析膜内液浓缩后，进行冷冻干燥，得到热水提取液的干燥物粉末3.2g。
向实施了热水提取后残留的沉淀部分加入0.5mol/L氢氧化钠溶液400mL后，在搅拌器搅拌下，在25℃提取1小时。提取结束后，通过离心分离(12000rpm，20分钟)，得到上清液。
向沉淀部分加入1.0mol/L氢氧化钠溶液400mL，进行与上述同样的处理。将2次的上清液合并，用1.0mol/L盐酸将pH调节为7.0后，装入透析膜(Spectra/Por3 Membrane，分子量3500分级)中，在自来水的流水中透析2天。用旋转蒸发器将透析膜内液浓缩后，进行冷冻干燥，得到碱性溶液提取液的干燥物粉末5.1g。
实施例3：岩手县产松蕈子实体的干燥物粉末的制备
使用冷冻干燥机(MINIFAST MOD.DO.5；Edwards社)将市售的岩手县产松蕈子实体〔在黑潮市场(东京都新宿区北新宿)购入〕250g干燥后，使用匀质混合机(Wonder Blender；大阪化学社)粉碎，得到干燥物粉末35g。
实施例4：岩手县产松蕈的热水提取液和碱性溶液提取液的各干燥物粉末的制备
将按照与上述实施例3同样的步骤制得的市售岩手县产松蕈子实体的干燥物粉末20g移至1L的烧杯中，加入纯水800mL后，在搅拌器搅拌下，在93～98℃的水浴中提取3小时。提取结束后，冷却至室温，通过离心分离(12000rpm，20分钟)得到上清液。
向沉淀部分加入纯水500mL，进行与上述同样的处理。该操作共计进行3次，将所有上清液合并，装入透析膜(Spectra/Por3Membrane，分子量3500分级)中，在自来水的流水中透析2天。用旋转蒸发器将透析膜内液浓缩后，进行冷冻干燥，得到热水提取液的干燥物粉末1.0g。
向实施了热水提取后残留的沉淀部分加入0.5mol/L氢氧化钠溶液500mL后，在搅拌器搅拌下，在25℃提取1小时。提取结束后，通过离心分离(12000rpm，20分钟)，得到上清液。
向沉淀部分加入1.0mol/L氢氧化钠溶液500mL，进行与上述同样的处理。将2次的上清液合并，用1.0mol/L盐酸将pH调节为7.0后，装入透析膜(Spectra/Por3 Membrane，分子量3500分级)中，在自来水的流水中透析2天。用旋转蒸发器将透析膜内液浓缩后，进行冷冻干燥，得到碱性溶液提取液的干燥物粉末5.1g。
实施例5：长野县产松蕈子实体的热水提取液的干燥物粉末的制备
除了用长野县产松蕈子实体代替岩手县产松蕈子实体以外，直接重复上述实施例4的步骤，得到松蕈子实体的热水提取液的干燥物粉末1.5g。
比较例1：Agaricus blazei子实体的热水提取液的干燥物粉末的制备
除了用市售的Agaricus blazei子实体代替岩手县产松蕈子实体以外，直接重复上述实施例4的步骤，得到Agaricus blazei子实体的热水提取液的干燥物粉末3.6g。
比较例2：灵芝子实体的热水提取液的干燥物粉来的制备
除了用市售的灵芝子实体〔Ganoderma lucidum(Fr.)Karst〕代替岩手县产松蕈子实体以外，直接重复上述实施例4的步骤，得到灵芝子实体的热水提取液的干燥物粉末2.4g。
比较例3：香蕈子实体的热水提取液的干燥物粉末的制备
除了用市售的香蕈子实体〔Lentinus edodes(Berk.)Sing.〕代替岩手县产松蕈子实体以外，直接重复上述实施例4的步骤，得到香蕈子实体的热水提取液的干燥物粉末1.4g。
分析例1：采用RAPD法对松蕈FERM BP-7304株的鉴定
在本分析例中，将按照分别单独使用6种不同PCR(聚合酶链反应，polymerase chain reaction)用引物(10mer)的RAPD(随机扩增多态DNA，random amplified polymorphic DNA)法分别生成的本发明的松蕈FERM BP-7304株的DNA图案与多种公知松蕈株的各DNA图案相比较。
作为比较用的公知松蕈株，使用表1所示的13种。与上述实施例1同样，得到干燥菌丝体，再将其粉碎，得到干燥物粉末。各松蕈株的菌丝体收量(每100mL培养基的干燥菌体重量，10支的平均值)和各松蕈株的来源(建立设施)一并列于表1中。
表1
  菌编号   菌株名   收量(g)   来源(建立设施)
  12345678910111213   IFO  6915IFO  6925IFO  6930IFO  6935CM   627-2CM   627-4IFO  30604IFO  30605IFO  30606MAFF 460039KT   001IFO  6920IFO  6933   0.670.500.720.650.790.800.490.710.350.560.680.720.56   (财)发酵研究所(财)发酵研究所(财)发酵研究所(财)发酵研究所吴羽化学工业(株)吴羽化学工业(株)(财)发酵研究所(财)发酵研究所(财)发酵研究所农林水产省农业生物资源研究所吴羽化学工业(株)(财)发酵研究所(财)发酵研究所
作为上述PCR用引物，通过化学合成制备下述引物后使用。
引物RAPD1(序列表中序列号1表示的碱基序列：TGGTCACCGA)；
引物RAPD2(序列表中序列号2表示的碱基序列：AGCGCCATTG)；
引物RAPD3(序列表中序列号3表示的碱基序列：TTCGAGCCAG)；
引物RAPD4(序列表中序列号4表示的碱基序列：TGCGTGCTTG)；
引物RAPD5(序列表中序列号5表示的碱基序列：GACTAGCCTC)；以及
引物RAPD6(序列表中序列号6表示的碱基序列：CTCACCGTCC)。
RAPD法中使用的DNA使用市售的DNA制备试剂盒(Dneasy PlantMini Kit；QIAGEN社)，根据其操作说明书〔Dneasy Plant Mini Handbookfor DNA isolation from plant tissue(March，1999，QIAGEN，K.K.，东京)〕，按照以下步骤制备。
也就是说，将除去了多余水分的各松蕈菌株的菌丝体(约100mg)装入试管后，用液氮冷冻，在-80℃下保存待用。将装有试样的试管解冻后，加入缓冲液AP1(400μl)和RNA酶A储备溶液(RNase Astocksolution)4μl，使用涡流混合机将内容物充分混合。接着，将上述试管置于65℃的水浴中，温育10分钟。另外，在上述温育过程中，将试管翻转2～3次进行混合。反应结束后，在上述反应物中加入缓冲液AP2(130μL)，在冰冷条件下放置5分钟。接着，将试管内容物装入柱(QIAshredder spin column)中，将上述柱装入2mL的试管中，以15000rpm离心分离2分钟。离心分离后，将通过柱积存在试管底部的溶液移至另一试管中，测定液量。这时，注意绝对不要接触试管底部的细胞片。
接着，在试管中加入与通过柱的液体等量的100％乙醇以及半量的缓冲液AP3，充分混合。将上述溶液650μL装入另一柱(DNeasy minispin column)，将上述柱装入2mL的试管中，以8000rpm离心分离1分钟。在离心分离后的柱中装入缓冲液AW(500μL)，将上述柱装入2mL的试管中，以8000rpm离心分离1分钟，废弃试管底部的溶液。在上述柱中装入缓冲液AW(500μL)，将上述柱装入2mL的试管中，以15000rpm离心分离2分钟，废弃试管底部的溶液。接着，准备新的试管，安装进行了上述洗涤处理后的柱，装入保温于65℃的缓冲液AE(100μL)，在室温下放置5分钟后，以8000rpm离心分离1分钟，回收试管底部的DNA溶液。再重复一次同样的操作，回收合计约200μL的DNA溶液。将所得DNA中的20μL用于1％琼脂糖凝胶电泳，确认DNA的回收量以及纯度。
PCR在表2所示的反应溶液(总体积＝25μL)中，在下述条件下进行，即循环实施94℃的改性步骤(30秒)、36℃的结合步骤(1分钟)以及72℃的伸长步骤(2分钟)构成的循环45次〔其中，在第1次循环前实施94℃的预备性改性步骤(2分钟)，并且在最后的第45次循环后实施最终的伸长步骤(2分钟)〕的条件。另外，表2所示的反应溶液通过将Ex TaqTM缓冲液、TaKaRa Ex TaqTM和Taq Start抗体混合，2～3秒后添加蒸馏水、10×Ex TaqTM缓冲液、dNTP和引物，最后添加DNA溶液制备。
表2
  反应溶液(每1支试管)
  Ex TaqTM缓冲液(宝酒造)TaKaRa Ex TaqTM(宝酒造)Taq Start抗体(宝酒造)蒸馏水10×Ex TaqTM缓冲液(宝酒造)dNTP引物DNA   0.8μL0.2μL0.2μL8.3μL2.5μL2.0μL1.0μL10μL
将得到的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳法分离，得到的DNA图案如图1～4所示。图1表示表1中菌编号1～6表示的比较用菌株的DNA图案，图2表示表1中菌编号7～11表示的比较用菌株的DNA图案，图3表示表1中菌编号12～13表示的比较用菌株的DNA图案以及本发明的松蕈FERM BP-7304株的DNA图案，图4表示本发明的松蕈FERMBP-7304株的DNA图案。
图1中带圈的数字“1”～“6”、图2中带圈的数字“7”～“11”和图3中带圈的数字“12”～“13”分别对应于表1中的菌编号1～13。例如图1中带圈的数字“1”所示的谱带(line)表示表1中菌编号1的菌株，即IFO 6915株的结果。另外，图3中带圈的数字“14”所示的谱带表示本发明的松蕈FERM BP-7304株的结果。
图1～图3中的符号“RAPD1”～“RAPD6”表示引物RAPD1～RAPD6。
图4中的各谱带1～6分别表示使用各引物RAPD1～RAPD6时本发明的松蕈FERM BP-7304株的结果。
另外，图1～图4中的符号“M”表示DNA分子量标记。在上述各电泳中，使用相同的DNA分子量标记(1kb DNA ladder，商品目录编号15415-018，Life Technologies社，GIBCO-BRL，美国)。在图4中，箭头A表示的条带(band)是4072bp的DNA片断，箭头B表示的条带是3054bp的DNA片断，箭头C表示的条带是2036bp的DNA片断和1636bp的DNA片断重叠而成的条带，箭头D表示的条带是1018bp的DNA片断，箭头E表示的条带是517bp、506bp、396bp、344bp和298bp的各DNA片断重叠而成的条带。
如图1～图4所示，本发明的松蕈FERM BP-7304株显示与表1所示13种比较用松蕈株均不同的DNA图案。
另外，本发明的松蕈FERM BP-7304株与表1所示13种比较用松蕈株以外的31种松蕈株，即MAFF 460031、MAFF 460033、MAFF460034、MAFF 460035、MAFF 460036、MAFF 460037、MAFF 460038、MAFF 460040、MAFF 460041、MAFF 460042、MAFF 460046、MAFF 460050和MAFF 460096(以上源于农林水产省农业生物资源研究所)、CM 627-3、CM 627-5、CM 627-6和CM 627-7〔以上源于吴羽化学工业(株)〕以及IFO 6929、IFO 6931、IFO 6932、IFO 6934、IFO 6916、IFO  6917、IFO  6918、IFO 6919、IFO 6921、IFO 6922、IFO 6923、IFO 6924、IFO 6926和IFO 6928〔以上源于(财)发酵研究所〕的DNA图案也不同，但是具体的DNA图案没有图示。
分析例2：松蕈FERM BP-7304株的GC含量
在装有与上述实施例1同样得到的松蕈FERM BP-7304株的菌丝体(湿重量＝1.0g)的50mL锥形瓶中，加入1mg/mL蛋白酶K(默克公司，德国)的磷酸缓冲化生理盐水(PBS)(pH7.4)溶液20mL，在时常振荡的同时，在65℃下反应2小时。在100℃下热处理10分钟，使酶失活后，冷却至37℃，加入适量(约1mg)消解酶(ザイモリア-ゼ)(生化学工业)，再在37℃下反应4小时。接着，加入Tris-十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液40mL，在60℃下进行溶菌处理，配制DNA提取液。
向上述提取液中添加等量的苯酚，搅拌后，离心分离除去苯酚层。按照乙醇沉淀法由得到的上清液回收粗DNA后，用70～90％乙醇洗涤。将得到的沉淀再次溶解于枸橼酸缓冲液5mL中，实施RNA酶处理。接着，向RNA酶处理溶液中少量添加苯酚，搅拌后，离心分离除去苯酚层。再次按照乙醇沉淀法由上清液回收粗DNA，用70～90％乙醇洗涤后，实施第2次RNA酶处理。RNA酶处理后，添加含有乙二胺四乙酸(EDTA)的醋酸缓冲液0.5mL，用异丙醇使DNA沉淀，离心分离进行回收。将其再次用70～90％乙醇洗涤，最终溶解于枸橼酸缓冲液1mL中，得到纯化DNA溶液。
在100℃下对得到的纯化DNA溶液100μL进行热处理10分钟后，用冰冷却，用核酸酶P1在50℃下处理1小时，分解成核苷酸。GC含量采用高效液相色谱(LC-6A，岛津制作所)进行定量。使用GC试剂盒(ヤマサ酱油)作为标准品，使用YMC-Pack AQ-312(直径＝6.0mm，长度＝150mm)作为柱，使用0.2mol/L磷酸铵溶液(pH约4.5)作为移动相。注入量为10μL，检测在波长270nm处实施，峰的鉴定采用绝对保留时间法进行。作为定量法，使用修正百分率法。
松蕈FERM BP-7304株的GC含量为49.9％。
评价例1：对于压力负荷的恢复促进活性的评价
(1)松蕈FERM BP-7304株的热水提取液和碱性溶液提取液的评价
在本评价例中，将上述实施例2中分别制备的松蕈FERM BP-7304株的热水提取液干燥物粉末和碱性溶液提取液干燥物粉末以3.2∶5.1的比率混合，以得到的混合物作为评价用试样，将该评价用试样对小鼠口服给药4周后，负荷约束压力18小时，测定从压力中解放出来后的天然杀伤(NK)细胞活性，研究上述试样的影响。
具体而言，将评价用试样的水溶液(将上述实施例2中分别制备的松蕈FERM BP-7304株的热水提取液干燥物粉末和碱性溶液提取液干燥物粉末以3.2∶5.1的比率混合后，溶解于蒸馏水得到的溶液)对由日本SLC购入的8周龄雄性C57BL/6小鼠(每组＝5～10只)在常规的饲养用笼中口服给药4周(50mg/kg/day)。接着，将小鼠从上述饲养用笼中取出，在开了通气孔的容量50mL的带盖聚丙烯制离心用管(商品目录编号2341-050，テクノグラス社)中分别关入1只小鼠。该关入管中的小鼠处于身体不能活动的状态。接着，将这些管放回饲养用笼中，在这种状态下放置18小时，给予约束压力。使之承受18小时的压力后，将小鼠从管中取出，放回饲养用笼中，在普通的环境下进行饲养。
从上述约束压力中解放出来后，经过给定天数〔0天(刚解放后)、1天、3天、5天、7天和14天〕后，将小鼠处死，按照下述步骤，在试管内测定淋巴结细胞对NK敏感性肿瘤细胞株YAC-1的细胞损伤活性，评价天然杀伤(NK)细胞活性。
也就是说，无菌地由小鼠摘出脾脏和肠系膜淋巴结，移入装有Hanks平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution)的无菌培养皿中。用剪刀和小镊子将淋巴结拆散后，通过网筛配制淋巴细胞的单细胞液。用添加了10％胎牛血清(56℃下实施热处理30分钟)的RPMI 1640培养基将细胞洗涤3次后，用分别添加了10％胎牛血清(56℃下实施热处理30分钟)、20mmol/L的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和30μg/mL庆大霉素的RPMI 1640培养基，将细胞浓度调节为5×106个/mL，使用得到的细胞悬浮液作为效应细胞。
另一方面，用作靶细胞的YAC-1细胞是在添加了10％胎牛血清(56℃下实施热处理30分钟)的RPMI 1640培养基中，由吴羽化学工业株式会社生物医学研究所继代维持的细胞。向上述YAC-1细胞中加入放射性铬酸钠(アマ-シヤムジヤパン)，在37℃下反应20分钟。用添加了10％胎牛血清(56℃下实施热处理30分钟)的RPMI 1640培养基洗涤3次，除去未结合的放射性铬酸钠，将放射性铬标记肿瘤细胞调节为5×104个/mL。
在试管中分别加入前面制备的上述效应细胞悬浮液或其2倍稀释系列以及上述放射性铬标记肿瘤细胞悬浮液各0.1mL，在37℃的5％二氧化碳培养器中反应4小时。另外，这时为了计算出下述特异性损伤率，对于在试管中加入放射性铬标记肿瘤细胞和培养基形成的悬浮液，以及在试管中加入放射性铬标记肿瘤细胞和表面活性剂(Triton，最终浓度＝0.05％)形成的悬浮液，在37℃的5％二氧化碳培养器中反应4小时。反应结束后，再向试管中加入添加了10％胎牛血清(56℃下实施热处理30分钟)的RPMI 1640培养基1.5mL，用混合器充分混合后，离心分离(12000rpm，5分钟，4℃)，得到上清液。使用γ计数器测定得到的上清液的放射能活性。
由下式计算出特异性损伤率(S.L.：Specific Lysis)，
〔S.L.〕＝{(B-Bf)/(Bmax-Bf)}×100
〔式中，S.L.为特异性损伤率(单位＝％)，B为实验组的上清液的放射能活性(单位＝Bq)，Bf为自然游离组(即，放射性铬标记肿瘤细胞单独培养组)的上清液的放射能活性(单位＝Bq)，Bmax为最大游离组(即，Triton处理后的放射性铬标记肿瘤细胞组)的上清液的放射能活性(单位＝Bq)〕
用每107个效应细胞损伤30％肿瘤细胞的细胞数，即“30％损伤单位(Lytic Units 30％；LU30)”表示NK细胞活性。
结果如图5所示。另外，作为对照(健康正常组)试验，用蒸馏水代替评价用试样水溶液口服给药4周，并且不给予18小时的约束压力，除此以外直接重复上述操作。另外，作为比较试验，用蒸馏水代替评价用试样水溶液口服给药4周，除此以外直接重复上述操作。
在图5中，折线a(白正方形)表示对照(健康正常组)试验(非压力)的结果，折线b(黑圆圈)表示给予本发明的评价用试样(松蕈FERM BP-7304株的热水提取液干燥物粉末和碱性溶液提取液干燥物粉末的比率为3.2∶5.1的混合物)水溶液时的结果，折线c(黑三角)表示比较试验(给予蒸馏水和压力负荷)的结果。另外，在图5中，折线b的上述黑圆圈的肩部所示的符号“+”表示p＜0.01(相对于折线c的黑三角表示的结果)，折线c的上述黑三角的肩部所示的符号“*”表p＜0.01(相对于折线a的白正方形表示的结果)。
如图5的折线b、c所示，如果承受约束压力，则NK细胞活性显著降低。如折线c所示，从约束压力中解放后，即使直接放任不管，NK细胞活性也缓慢恢复，而如折线b所示，通过添加松蕈FERM BP-7304株的热水提取液干燥物粉末和碱性溶液提取液干燥物粉末的比率为3.2∶5.1的混合物，NK细胞活性的恢复显著加快。
(2)松蕈FERM BP-7304株的干燥物粉末、岩手县产松蕈子实体的干燥物粉末以及岩手县产松蕈子实体的热水提取液干燥物粉末和碱性溶液提取液干燥物粉末的混合物的评价
用上述实施例1制备的松蕈FERM BP-7304株的干燥物粉末(50mg/kg/day)、实施例3制备的市售岩手县产松蕈子实体的干燥物粉末(50mg/kg/day)以及上述实施例4制备的市售岩手县产松蕈子实体的热水提取液干燥物粉末和碱性溶液提取液干燥物粉末的比率为1.0∶5.1的混合物(25mg/kg/day)代替松蕈FERM BP-7304株的热水提取液干燥物粉末和碱性溶液提取液干燥物粉末的比率为3.2∶5.1的混合物，除此以外重复上述评价例1(1)的步骤。
结果如表3所示。在表3中，符号“*”表示p＜0.01(相对于给予蒸馏水)。
表3
                        NK细胞活性(LU30)
  0天   1天   3天   5天   7天   14天
对照试验(无压力负荷)比较试验(给予蒸馏水和压力负荷)实施例1实施例3实施例4   497101011   47921*20*22*   481135*31*37*   502246*37*41*   483048*49*46*   48425051*48
(3)各种松蕈株的干燥物粉末的评价
使用上述实施例1制备的松蕈FERM BP-7304株的干燥物粉末(50mg/kg/day)以及上述分析例1中使用的表1所示13种松蕈株的干燥物粉末(50mg/kg/day)代替松蕈FERM BP-7304株的热水提取液干燥物粉末和碱性溶液提取液干燥物粉末的比率为3.2∶5.1的混合物，除此以外重复上述评价例1(1)的步骤。
结果如表4和图6～图9所示。
在表4中，符号“*”表示p＜0.01(相对于给予蒸馏水)。
在图6～图9中，折线a(黑正方形)表示对照试验(无压力负荷)的结果，折线b(白正方形)表示比较试验(给予蒸馏水和压力负荷)的结果。
图6中，折线c(黑三角)表示本发明的松蕈FERM BP-7304株的结果，折线d(黑菱形)表示松蕈株IFO 6915的结果，折线e(黑圆圈)表示松蕈株IFO 6925的结果。
图7中，折线f(黑三角)表示松蕈株IFO 6930的结果，折线g(黑菱形)表示松蕈株IFO 6935的结果，折线h(黑圆圈)表示松蕈株CM 627-2的结果，折线i(白圆圈)表示松蕈株CM627-4的结果。
图8中，折线j(黑三角)表示松蕈株IFO 30604的结果，折线k(黑菱形)表示松蕈株IFO 30605的结果，折线1(黑圆圈)表示松蕈株IFO 30606的结果，折线m(白圆圈)表示松蕈株MAFF 460039的结果。
图9中，折线n(黑三角)表示松蕈株KT 001的结果，折线p(黑菱形)表示松蕈株IFO 6920的结果，折线q(黑圆圈)表示松蕈株IFO6933的结果。
表4
  菌株名                       NK细胞活性(LU30)
  0天   1天   3天   5天   7天   14天
  对照试验(无压力负荷)比较试验(给予蒸馏水和压力负荷)[实施例]FERM  BP-7304IFO  6915IFO  6925IFO  6930IFO  6935CM   627-2CM   627-4IFO  30604IFO  30605IFO  30606MAFF 460039KT   001IFO  6920IFO  6933   486117988786668777   47825*15171013141311141413151110   461442*18191821201920181819211917   462147*31372932333535363029343330   472850*38413639444139383637424037   46434845434542444640454445414042
如表4所示，松蕈FERM BP-7304株的干燥物粉末以及表1所示13种松蕈株的干燥物粉末均促进NK细胞活性的恢复，其中松蕈FERM BP-7304株的干燥物粉末显示最优良的恢复促进活性。
另外，除使用表1所示13种松蕈株以外的31种松蕈株，即MAFF460031、MAFF 460033、MAFF 460034、MAFF 460035、MAFF 460036、MAFF 460037、MAFF 460038、MAFF 460040、MAFF 460041、MAFF 460042、MAFF 460046、MAFF 460050和MAFF 460096(以上源于农林水产省农业生物资源研究所)、CM 627-3、CM 627-5、CM 627-6和CM 627-7〔以上源于吴羽化学工业(株)〕以及IFO 6929、IFO 6931、IFO 6932、IFO 6934、IFO 6916、IFO 6917、IFO 6918、IFO 6919、IFO 6921、IFO 6922、IFO 6923、IFO 6924、IFO 6926和IFO 6928〔以上源于(财)发酵研究所〕的干燥物粉末(50mg/kg/day)以外，重复上述评价例1(1)的步骤，对于这些松蕈株也确认了NK细胞活性的恢复，但是均没有超过本发明的松蕈FERM BP-7304株的恢复促进活性。(4)长野县产松蕈子实体的热水提取液干燥物粉末以及各种蘑菇的热水提取液干燥物粉末的评价
除使用上述实施例5制备的长野县产松蕈子实体的热水提取液干燥物粉末或者上述比较例1～3分别制备的Agaricus blazei子实体、灵芝子实体或香蕈子实体的各热水提取液干燥物作为评价用试样以外，直接重复上述评价例1(1)的操作。另外，给药量均为250mg/kg/day。
结果如表5所示。在表5中，符号“*”表示p＜0.01(相对于给予蒸馏水)。
表5
                      NK细胞活性(LU30)
  0天   1天   3天   5天   7天   14天
对照试验(无压力负荷)比较试验(给予蒸馏水和压力负荷)实施例5比较例1比较例2比较例3   47610534   48814*789   481322*151110   492634*272427   462937*302829   474447373640
工业实用性
采用本发明的压力负荷恢复促进用药物组合物，可以促进对压力负荷的恢复。
序列表独立文本
序列表的数字索引<223>中记载了“人工序列(ArtificialSequence)”的说明。具体而言，序列表中序列号1～序列号6的序列表示的碱基序列构成的各寡核苷酸为引物RAPD1～引物RAPD6。
上面，以特定的方式说明了本发明，但是对于本领域技术人员来说显而易见的变形和改良也包括在本发明的范围内。
                         序列表
<110>吴羽化学工业株式会社
<120>压力负荷恢复促进用药物组合物以及新型松蕈株
<130>KRH-655
<150>JP 2000-311034
<151>2000-10-11
<150>JP 2000-311035
<151>2000-10-11
<160>6
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物RAPD1
<400>1
tggtcaccga
<210>2
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物RAPD2
<400>2
agcgccattg
<210>3
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物RAPD3
<400>3
ttcgagccag
<210>4
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物RAPD4
<400>4
tgcgtgcttg
<210>5
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物RAPD5
<400>5
gactagcctc
<210>6
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物RAPD6
<400>6
ctcaccgtcc

Claims (16)

1.一种对于压力负荷促进恢复用的药物组合物，其中含有松、松的热水提取液或其干燥体、或者松的碱性溶液提取液或其干燥体以及药学上允许的载体。
2.如权利要求1所述的对于压力负荷促进恢复用的药物组合物，其中上述松为松FERM BP-7304株。
3.如权利要求1或2所述的对于压力负荷促进恢复用的药物组合物，其中上述松为菌丝体、培养物或子实体。
4.一种对于压力负荷促进恢复用的功能性食品，其中单独含有松、松的热水提取液或其干燥体、或者松的碱性溶液提取液或其干燥体，或者根据需要还含有1种或1种以上的食品成分。
5.如权利要求4所述的对于压力负荷促进恢复用的功能性食品，其中上述松为松FERM BP-7304株。
6.如权利要求4或5所述的对于压力负荷促进恢复用的功能性食品，其中上述松为菌丝体、培养物或子实体。
7.一种对于压力负荷促进恢复用的口腔卫生用组合物，其中含有松、松的热水提取液或其干燥体、或者松的碱性溶液提取液或其干燥体以及口腔卫生用组合物的载体。
8.如权利要求7所述的对于压力负荷促进恢复用的口腔卫生用组合物，其中上述松为松FERM BP-7304株。
9.如权利要求7或8所述的对于压力负荷促进恢复用的口腔卫生用组合物，其中上述松为菌丝体、培养物或子实体。
10.松、松的热水提取液或其干燥体、或者松的碱性溶液提取液或其干燥体在制备对于压力负荷促进恢复用的药物组合物、对于压力负荷促进恢复用的功能性食品、或者对于压力负荷促进恢复用的口腔卫生用组合物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中上述松为松FERM BP-7304株。
12.如权利要求10或11所述的用途，其中上述松为菌丝体、培养物或子实体。
13.松FERM BP-7304株。
14.松FERM BP-7304株的菌丝体、培养物或子实体。
15.松FERM BP-7304株的热水提取液或其干燥体，或者松FERM BP-7304株的碱性溶液提取液或其干燥体。
16.如权利要求15所述的热水提取液或其干燥体或者碱性溶液提取液或其干燥体，其中松FERM BP-7304株为菌丝体、培养物或子实体。
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