CN101037662A - 一种用于乳杆菌发酵的复合培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于乳杆菌发酵的复合培养基及其制备方法。所述培养基包含8～70％甘草煎滤液。所述的培养基中，每1000毫升甘草煎滤液中可以加入7～25克多价蛋白胨。所述培养基中，每1000毫升甘草煎滤液中也可以加入2.0～5.0克肝浸粉。所选3种乳杆菌均在该培养基中生长良好，优于经典的乳杆菌选择性培养基－MRS培养基的液体深层培养效果。该培养基配方非常简单，制作方法简便，培养条件易控，成本低廉，安全无害，可广泛用于作为最重要益生菌之一的乳杆菌的研究、开发和生产等。
Description
技术领域
本发明涉及药品、食品和食品添加剂以及兽药、生物饲料、饲料添加剂生产技术领域，特别是涉及一种用于乳杆菌发酵的复合培养基及其制备方法。
背景技术
乳杆菌(Lactobacillus)是重要的生理性细菌，亦是人类和其他哺乳动物肠道中正常菌群重要的成员。由于乳杆菌及其发酵产物的生理调节作用已被长期的应用实践以及随后的科学研究所证实，故乳杆菌及其制品在药品、食品、兽药和饲料生产领域的应用范围正在不断扩大，成为这些产业领域的重要生产菌株；近些年来，更由于其益生特性、结构特性和遗传特性等特点，成为开发生物技术药物的热点研究对象，如正在研究将其用于生产SARS疫苗、禽流感疫苗和艾滋病疫苗的基因工程菌株。
而由于生产各类乳杆菌制品均有赖于乳杆菌的大规模发酵培养，因此，开发出乳杆菌的高效、廉价、易得、安全的生产型培养基，已成为提高乳杆菌制品生产能力和质量的关键环节之一。现有技术中，乳杆菌的大规模培养和发酵生产仍以经典的MRS培养基或改良MRS培养基为主。实践证明，此类培养基培养乳杆菌效果较好，细胞繁殖快，生物量较大，菌体浓度的量级一般可达109cfu/ml。但目前存在的问题是该培养基配方复杂，质量和生产条件控制不易，原料种类多、价格高，不适宜大规模发酵培养时应用，而且需加入过多的无机盐类，对人体和动物健康具有潜在的有害影响。因此，亟需寻找更为经济、有效、易控和安全的乳杆菌发酵培养基，以适应乳杆菌的生产和相关产业的蓬勃发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于乳杆菌发酵的复合培养基及该复合培养基的制备方法。该培养基组成成分均为可食用成分，对人和动物无毒无害，可使乳杆菌在发酵过程中良好生长，菌体容易与发酵液进行分离，且发酵液、菌体、上清液均可直接用于生产相关制品，从而实现乳杆菌及其制品的高效、廉价和安全生产。
为实现本发明目的而提供的一种用于乳杆菌发酵的复合培养基，所述培养基包含8～70％甘草煎滤液。
所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基，所述培养基包含10％甘草煎滤液。
所述的培养基中，每1000毫升甘草煎滤液中可以加入7～25克多价蛋白胨。
所述培养基中，每1000毫升甘草煎滤液中也可以加入2.0～5.0克肝浸粉。
所述培养基中，可以或者还包括3％牛肉膏；或者还包括1％胰蛋白胨；或者还包括0.1％吐温-80；或者还包括0.5％酵母膏；或者还包括1％大豆蛋白陈；或者还包括2％葡萄糖；或者还包括0.24％肝浸粉；或者还包括1％多价蛋白胨；或者还包括0.5％可溶性淀粉。
所述用于发酵乳杆菌的复合培养基，培养基的组成可以为：
10％甘草煎滤液 1000mL
多价蛋白胨 10g
所述用于发酵乳杆菌的复合培养基，培养基的组成可以为：
10％甘草煎滤液 1000mL
多价蛋白胨 20g
所述用于发酵乳杆菌的复合培养基，培养基的组成为：
10％甘草煎滤液 1000mL
多价蛋白胨 10g
肝浸粉 2.4g
为实现本发明目的还提供一种用于乳杆菌发酵的复合培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，制备8～70％甘草煎滤液；
步骤B，在8～70％甘草煎滤液中根据发酵需要添加配比量的营养成分，制备用于乳杆菌发酵的复合培养基。
所述步骤A包括下列步骤：
步骤A1，选择无霉变的干燥甘草根茎或饮片，清水洗净、除杂、烘干；
步骤A2，称重后，用机械粉碎的方法将净化后的甘草进行物理粉碎，直至得到平均粒径为100-150μm的细粉体；
步骤A3，将所述甘草细粉体进行低温冻结至裂碎临界点后，用气流粉碎的方法进行能量粉碎，直至得到平均粒径为5-25μm的超微粉体；
步骤A4，将所得的所述甘草超微粉体，在40℃恒温下分别用两种微生物制备的粗酶液先后进行酶解反应，每一次酶解反应时间为24h。
步骤A5，酶解完毕的甘草超微粉体，根据所需浓度补加蒸馏水定容，升温到100℃煎煮，同时灭菌灭酶，时间40分钟；
步骤A6，第一次煎煮完毕的甘草超微粉体，待煎液降温至40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取得滤液；滤渣再次煎煮，时间20分钟，降温后重复分级过滤和榨汁过程，合并滤液；
步骤A7，取所述合并滤液，加蒸馏水定容至1000mL，即确定溶质/溶剂配比量为80～700g甘草生药，按步骤A1～A7所述方法，制得1000mL的8～70％甘草煎滤液。
所述步骤B中的营养成分可以为多价蛋白胨。
所述步骤B中的营养成分可以为多价蛋白胨和肝浸粉。
所述步骤B中的营养成分可以为3％牛肉膏；或者可以为1％胰蛋白胨；或者可以为0.1％吐温-80；或者可以为0.5％酵母膏；或者可以为1％大豆蛋白陈；或者可以为2％葡萄糖；或者可以为0.24％肝浸粉；或者可以为1％多价蛋白胨；或者可以为0.5％可溶性淀粉。
所述的两种微生物制备的粗酶液进行的酶解反应，是指用去除菌体后的一种白腐菌发酵浓缩液，以及去除菌体后的一种绿色木霉发酵浓缩液，分别加入装有甘草超微粉体的有盖不锈钢浅盘中，在40℃恒温下对甘草超微粉体进行酶解反应。
本发明的有益效果是：本发明的复合培养基，可使嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌3种常用的重要益生乳杆菌在其中生长良好，其发酵增菌效果优于目前使用的经典乳杆菌培养基MRS培养基或MRS改良培养基，表明本发明提供了一种效果优良的乳杆菌选择培养基。
本发明所涉及的新型乳杆菌复合培养基配方简单，主要原料甘草价廉易得，属于可食用天然物质，对人体和环境都十分安全，其它辅加成分种类少，用量小，且亦属于可食用物质，安全性好；培养基制备方法简单，性能可靠，增菌效果稳定性、重复性好，在摇瓶和/或发酵罐培养条件下均可达到的高密度培养水平，表明本发明提供了一种安全性、适用性均好的乳杆菌发酵培养基。
本发明所涉及的复合培养基成分组成和生产工艺流程简单，成本低廉，适宜于乳杆菌的工业化大规模培养；发酵后菌体与发酵液中其它成分比重不同，易于分离，节省能耗和设备成本；不经分离的发酵液以及分离后的菌体和上清液均可直接开发成乳杆菌发酵相关制品，有利于发酵产品的多元化开发，且没有废液和废渣污染环境，表明本发明提供了一种经济效益和生态效益俱佳的乳杆菌生产培养基。
本发明所涉及复合培养基中主要原料的来源，除甘草生药外，尚可以是甘草茎叶(新鲜或干燥)、提取主要药学成分甘草酸后的药渣、或甘草用于提取其它成分后所剩的废渣；次要原料来源，则选用价格低廉、主要采用禽、畜肉类和/或大豆、花生等高油作物加工后的边角废料制备的多价蛋白胨，起到既充分利用宝贵的药材和食品资源从而降低生产成本、又防止废渣排放引起环境污染的有益效果。
附图说明
图1为嗜酸乳杆菌(Lanc1)、植物乳杆菌(Lanc2)和保加利亚乳杆菌(Lanc3)在8～70％甘草煎滤液中的摇瓶培养生长曲线示意图。
图2为嗜酸乳杆菌(Lanc1)、植物乳杆菌(Lanc2)和保加利亚乳杆菌(Lanc3)在8～70％甘草煎滤液中的发酵罐培养生长曲线示意图。
图3为嗜酸乳杆菌(Lanc1)正交试验中在三因素不同水平与试验指标的关系示意图；
图4为植物乳杆菌(Lanc2)正交试验中在三因素不同水平与试验指标的关系示意图；
图5为保加利亚乳杆菌(Lanc3)正交试验中在三因素不同水平与试验指标的关系示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的一种用于乳杆菌发酵的复合培养基及该复合培养基的制备方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的目的基于以下构思而实现：
首先，培养基新配方的设计必须符合乳杆菌的营养要求。大量科学实验和生产实践表明：乳杆菌培养需要较高且相对复杂的营养条件，因此，营养成分的适合和全面，成为研究本培养基配方的首要考虑因素；
其次，培养基原料应该价廉易得。只有低成本并容易大量获得的原料，才适于乳杆菌的大规模工业化生产。再次，培养基配方及其制备方法应该尽量简单。过于复杂的配方和制备工艺，无疑会增加生产成本和质量控制的难度；
最后，新培养基必须做到高效和安全。所谓高效，是指新培养基的培养效率至少不应低于目前常规使用的MRS培养基或改良MRS培养基；所谓安全，即培养基成分不应对人体和/或动物健康构成明显乃至潜在的威胁。
基于以上思路，经多年研究，本发明发现食药两用植物甘草可作为乳杆菌发酵培养基的基础原料。甘草(Glycyrrhiza)为豆科属多年生植物，分布甚广，在我国西北、东北、华北地区以及云贵高原均有生长，具有抗寒、抗盐碱、耐热、耐旱等优良特性，生态适应性强，生命力旺盛，系干旱、半干旱地区重要的植物资源之一。近年来，甘草在部分宜生地区已实现人工栽培，使其来源更加充分。甘草在医药方面的用途已广为人知，为重要药学成分甘草酸的主要药源植物，其提取物还作为辅助剂、调味剂、添加剂、增稠剂、防腐剂等被广泛用于医药、食品、饲料、日用化工等产业。尽管甘草的应用领域十分广泛，但尚未见有人将其用于微生物的培养基成分。
本发明是在长期的益生菌培养研究过程中发现的，即8～70％甘草煎滤液对重要益生菌乳杆菌的生长具有明显的选择性促进作用，可视为该菌的益生元物质。甘草营养成分的分析研究表明，甘草除含有较高的甘草酸外，还含有非常丰富的营养成分及多种微量生长因子。各种营养成分中，粗蛋白质达22.62％，总糖18.32％，粗脂肪5.73％，果胶酸1.50％，维生素C 3.49％，表明甘草具有丰富全面、比例均衡的营养成分结构；各类氨基酸种类齐全，配比均衡，必需氨基酸含量高，占总氨基酸的36.3％，非必需氨基酸中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸含量较高；常量元素和微量元素均十分丰富，常量元素含量依次为Ca＞K＞Mg＞P＞Na，其中Ca和K含量最高，在甘草可测定的11种微量元素中，有九种为必需微量元素，即Fe、Zn、Cu、Cr、Mn、Co、Ni、Si、Mo。由上可知，甘草具有营养成分种类齐全、丰富全面的特点，很适合用做培养基的基础成分。本发明在大量的乳杆菌培养相关研究的基础上，通过系统研究，取得了突破性成果，充分证明8～70％甘草煎滤液能选择性促进乳杆菌的生长，是本发明所述复合培养基的基础性和关键性成分。这一成果不仅为乳杆菌制剂及其相关产品的生产研制出一种高效、廉价、安全的生产型培养基，而且也为甘草资源的进一步开发利用提供了一个新的方向。
为了确定甘草复合培养基的组成，本发明进行了如下工作：
研究确定甘草做为培养基基础成分的适合状态。
本发明中所用的植物药材甘草为其地下部分-即根茎部分。研究表明，甘草的根茎富含木质纤维素(＞30％)。木质纤维素的大量存在，使植物细胞的各种组织结构和亚结构受到顽强保护，对各种营养成分和生物活性成分的溶出具有明显的结构阻隔作用，使甘草丰富的营养作用难以体现；另外，鉴于乳杆菌的生长和发酵特点，只有溶解于溶剂中的可溶性成分和粒度极小的小分子物质才能被乳杆菌直接利用或分解利用，故必需将甘草进行充分的前处理，使其转变为乳杆菌培养基基础成分的合适状态。本发明根据甘草的结构特点，通过反复试验，确定选用8～70％甘草煎滤液，较佳地，为10％甘草煎滤液(GJY，其中，GJY为“甘浸液”的汉语拼音字头)为培养基复方配方研究中甘草成分的基本浓度。其前处理工艺流程如下：
a、选择无霉变的干燥甘草根茎或饮片，清水洗净、除杂、烘干。
b、称重后，用机械粉碎(包括使用球磨机、棒磨机、管磨机，以及广义球磨机振动磨、离心球磨和行星磨等)的方法将所述甘草进行物理粉碎，直至得到平均粒径为100-150μm的细粉体。
c、将上述甘草细粉体低温冻结至裂碎临界点(玻璃点)后，用气流粉碎(包括使用圆盘式气流磨、循环管式气流磨、对喷式气流磨、流化床对喷式气流磨和靶式气流磨等)的方法进行能量粉碎，直至得到平均粒径为5-25μm的超微粉体。
d、将上述所得甘草超微粉体，在40℃恒温条件下分别用两种微生物酶粗酶液(本发明应用去除菌体后的白腐菌GIM5.178-XW发酵浓缩液以及去除菌体后的绿色木霉CGMCC3.3711-XW发酵浓缩液)先后进行酶解反应，每一次酶解反应时间为24h。
e、酶解完毕的甘草超微粉体，根据所需浓度补加蒸馏水定容，升温到100℃煎煮，同时灭菌灭酶，时间40分钟。
f、第一次煎煮完毕的甘草超微粉体，待煎液降温至40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取得滤液；滤渣再次煎煮，时间20分钟，降温后重复分级过滤和榨汁过程，合并滤液。
g、取上述合并滤液，加蒸馏水定容至1000mL，即确定溶质/溶剂配比量为80～700g甘草生药，按以上a～f步骤所述方法制得1000mL的8～70％甘草煎滤液。
较佳地，确定溶质/溶剂配比量为100g甘草生药，按以上a～f步骤所述方法制得1000mL的10％甘草煎滤液。
观察3种乳杆菌在单纯的8～70％甘草煎滤液(本实验中以10％甘草煎滤液为例)中的生长状况。
为了观察以甘草为基础原料的复合培养基的发酵作用，首先对3种乳杆菌在10％甘草煎滤液中的生长状况进行了系统研究。方法为：
a、将3株乳杆菌(分别为：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌)复苏活化后，分别以0.2％的接种量，接种到装有500ml的10％甘草煎滤液的无菌瓶中，在厌氧条件下，置37℃恒温振荡培养箱，以110r/min的速率振摇培养，以每3h为一时段，定时取样进行活菌计数。如图1所示，所得结果表明：3株乳杆菌均可在10％甘草煎滤液中良好生长。嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌大约在培养18h时进入对数生长期，在培养48h时达到生长高峰，此时嗜酸乳杆菌的最大生长量为3.03×109cfu/ml，植物乳杆菌的最大生长量为2.43×109cfu/ml；保加利亚乳杆菌大约在培养15h进入对数生长期，在培养42h时达到生长高峰，此时保加利亚乳杆菌的最大生长量为2.11×109cfu/ml。
b、将3株乳杆菌(分别为：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌)复苏活化后，分别以0.2％的接种量，接种到装有8L的10％甘草煎滤液之10L厌氧培养罐中进行培养。培养条件：初始pH5.8，温度36.5℃，110r/min间歇搅拌，以每4h为一时段，定时取样进行活菌计数。如图2所示，所得结果表明：3株乳杆菌均可在10％甘草煎滤液中良好生长。嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌大约在培养20h时进入对数生长期，在培养48h时达到生长高峰，此时嗜酸乳杆菌的最大生长量为2.86×109cfu/ml，植物乳杆菌的最大生长量为2.48×109cfu/ml；保加利亚乳杆菌大约在培养16h进入对数生长期，在培养40h时达到生长高峰，此时保加利亚乳杆菌的最大生长量为2.45×109cfu/ml。
上述结果证实，本发明所述方法制备的8～70％甘草煎滤液的营养组分构成，无论在实验室水平的摇瓶培养条件，还是在中试水平的发酵罐培养条件，均适合上述3种重要益生乳杆菌的繁殖生长，可作为筛选优化大规模培养乳杆菌之生产培养基的初始培养基。
观察在8～70％甘草煎滤液(本实验中以10％甘草煎滤液为例)中添加不同辅助营养成分对乳杆菌生长状态的影响。
在本发明中，参考经典乳杆菌培养基配方，在10％甘草煎滤液(GJY)中分别添加相关营养成分，考察其对10％甘草煎滤液(GJY)的营养补充效果，为研制效果更佳的复方培养基提供科学依据。方法为：将3种乳杆菌(分别为：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌)复苏活化后，分别以0.2％的接种量，接种到8L的10％甘草煎滤液(GJY)中，同时分别按常规比例加入受试物质成分，于10L厌氧培养罐中按前述条件进行培养，通过活菌数的测定，评价各受试物质成分对3株乳杆菌生长状态的影响。结果为：在10％甘草煎滤液(GJY)中分别添加牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、多价蛋白胨、葡萄糖时，对3种乳杆菌的促进生长作用极为显著；在10％甘草浸滤液(GJY)中分别添加肝浸粉、酵母膏、可溶性淀粉时，对3种乳杆菌的也有明显促进生长作用。结果见表1、表2和表3。
表1 甘草煎滤液添加不同受试物质成分后嗜酸乳杆菌的生长状况
| 培养基 | 活菌数(cfu/ml) | 方差分析(p) | 生长影响 |
| GJYGJY+牛肉膏(3％)GJY+胰蛋白胨(1％)GJY+吐温-80(0.1％)GJY+酵母膏(0.5％)GJY+乙酸钠(0.5％)GJY+硫酸镁(0.02％)GJY+大豆蛋白胨(1％)GJY+葡萄糖(2％)GJY+肝浸粉(0.24％)GJY+乳糖(1％)GJY+多价蛋白胨(1％)GJY+可溶性淀粉(0.5％) | 2.86×1092.56×10104.04×10100.48×10101.27×10100.20×10100.18×10103.82×10101.98×10100.84×10100.18×10105.82×10101.02×1010 | ＜0.01＜0.01＞0.05＜0.05＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.05＞0.05＜0.01＜0.05 | ++++--+++-++ |
注：“+”表示添加后有促进作用；“-”表示添加后有抑制作用。
表2 甘草煎滤液添加不同受试物质成分后植物乳杆菌的生长状况
| 培养基 | 活菌数(cfu/ml) | 方差分析(p) | 生长影响 |
| GJYGJY+牛肉膏(3％)GJY+胰蛋白胨(1％)GJY+吐温-80(0.1％)GJY+酵母膏(0.5％)GJY+乙酸钠(0.5％)GJY+硫酸镁(0.02％)GJY+大豆蛋白胨(1％)GJY+葡萄糖(2％)GJY+肝浸粉(0.24％)GJY+乳糖(1％)GJY+多价蛋白胨(1％)GJY+可溶性淀粉(0.5％) | 2.48×1091.95×10103.61×10100.43×10101.04×10100.11×10100.08×10102.24×10102.03×10100.84×10100.21×10104.74×10100.84×1010 | ＜0.01＜0.01＞0.05＜0.05＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.05＞0.05＜0.01＜0.05 | ++++--+++-++ |
表3 甘草煎滤液添加不同受试物质成分后保加利亚乳杆菌的生长状况
| 培养基 | 活菌数(cfu/ml) | 方差分析(p) | 生长影响 |
| GJYGJY+牛肉膏(3％)GJY+胰蛋白胨(1％)GJY+吐温-80(0.1％)GJY+酵母膏(0.5％)GJY+乙酸钠(0.5％)GJY+硫酸镁(0.02％)GJY+大豆蛋白胨(1％)GJY+葡萄糖(2％)GJY+肝浸粉(0.24％)GJY+乳糖(1％)GJY+多价蛋白胨(1％)GJY+可溶性淀粉(0.5％) | 2.45×1092.06×10103.83×10100.51×10100.93×10100.28×10100.34×10103.09×10101.85×10100.99×10100.16×10104.07×10101.20×1010 | ＜0.01＜0.01＞0.05＜0.05＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.05＞0.05＜0.01＜0.05 | ++++--+++-++ |
从以上3个表的结果可以得出如下初步结论：
添加不同的辅加营养物质对3种乳杆菌生长的影响效果基本一致，表明乳杆菌属对营养环境的要求具有共性特点。
与8～70％甘草煎滤液相组合，牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、多价蛋白胨、葡萄糖均分别对3种乳杆菌有极为显著的促进生长作用，但葡萄糖、牛肉膏浓度偏高，影响成本，而且牛肉膏不易保存和使用，葡萄糖则易造成菌株对8～70％甘草煎滤液利用的干扰；所选3种蛋白胨的添加浓度相同，但其中多价蛋白胨成本最低、营养更全面，效果也最好。
与8～70％甘草煎滤液相组合，酵母膏、肝浸粉、可溶性淀粉亦分别对3种乳杆菌有明显促进生长作用，但酵母膏和可溶性淀粉所需浓度远远大于肝浸粉，体积大，成本偏高，不适合用于生产培养基。
筛选优化了甘草培养基的配方，采用正交试验法确定了甘草复合培养基的最佳配方组成。
综合前述结果，并充分考虑成本因素，通过多次筛选试验，较佳地，本发明实施例选用多价蛋白胨和肝浸粉为辅助营养添加物质，与10％甘草煎滤液(GJY)分别构成3种乳杆菌的专用复合培养基。进一步地，在三因素的单因子试验基础上，设计正交试验对每种复合培养基中各种物质的最适配比组合进行了筛选优化。本发明采用了L9(34)正交表。
首先选择嗜酸乳杆菌的一个菌株(Lanc1)作为试验菌株实施正交试验。具体过程：将Lanc1复苏活化后，以0.2％的接种量接种于所选物质成分以不同配比浓度组合的各个液态培养基中(每瓶500mL)，在厌氧条件下，置37℃恒温振荡培养箱，以110r/min的速率振摇培养48h，以每4h为一时段，定时取样进行活菌计数。所得正交试验结果如表4、表5和表6所示，结果表明：参加试验的9个培养基组合中，第5号组合为最优组合，即A2 B2(见表5)。为寻找理论上的最优培养基组合，作所选两个因素不同水平与试验指标的关系图，如图3所示，结果为：A2、B2分别显示为两个因素的最佳水平。
在得到上述较理想的培养基组合配方后，选择植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌各一个菌株(分别为Lanc2和Lanc3)，进行培养效果的扩展验证试验。具体过程：将Lanc2和Lanc3复苏活化后，分别以0.2％的接种量接种于甘草浸滤液、多价蛋白胨、肝浸粉三种物质以不同浓度配比组合的各个液态培养基中(每瓶500mL)，在厌氧条件下，置37℃恒温振荡培养箱，以110r/min的速率振摇培养48h，以每4h为一时段，定时取样进行活菌计数。所得正交试验结果如表7～12所示，结果表明：与Lanc1相同，Lanc2在添加多价蛋白胨的10％甘草煎滤液中培养，活菌数可达1010cfu/ml以上，如图4所示，最优组合亦为A2B2，即在仅有10％甘草和2％蛋白胨的复合培养基中便可旺盛生长(见表8)；而Lanc3则在同时添加多价蛋白胨和肝浸粉的10％甘草煎滤液中培养，活菌数可达1010cfu/ml以上，如图5所示，最优组合为A2B2C2，即在有10％的甘草、1％蛋白胨和0.24％肝浸粉的复合培养基中Lanc3生长最好(见表11)。
经试验得出以下结果：
1、嗜酸乳杆菌发酵用复合培养基的适宜配方可以是：
8～70％甘草煎滤液 1000ml
多价蛋白胨 7-25g
更适合的配方组成是：
10％甘草煎滤液 1000ml
多价蛋白胨 10g
2、植物乳杆菌发酵用复合培养基的适宜配方可以是：
8～70％甘草煎滤液 1000ml
多价蛋白胨 7-25g
更适合的配方组成是：
10％甘草煎滤液 1000ml
多价蛋白胨 20g
3、保加利亚乳杆菌发酵用复合培养基的适宜配方可以是：
8～70％甘草煎滤液 1000ml
多价蛋白胨 7-25g
肝浸粉 2.0g-5.0g
更适合的配方组成是：
10％甘草煎滤液 1000ml
多价蛋白胨 10g
肝浸粉 2.4g
正交试验结果列表如下：
表4 Lanc1正交试验水平和因素列表
| 水平 | 因素 | |
| 甘草煎滤液A | 多价蛋白胨B | |
| 123 | 5％10％20％ | 0.5％1.0％1.5％ |
表5 Lanc1正交试验方案和结果分析表
| 实验号 | 因素 | 活菌菌数(lgcfu/ml) | |||
| A | B | C | D | ||
| 123456789 | 111222333 | 123123123 | 123231312 | 123312231 | 10.1910.2610.0610.5310.7610.319.729.989.37 |
| K1K2K3RSS | 30.5131.6029.070.841.074 | 30.4431.0029.740.420.27 | 30.4830.1630.540.130.03 | 30.3230.2930.570.090.016 | |
表6 Lanc1在A2B2组合配方培养基中验证实验
| 实验号 | 因素 | 活菌菌数(lgcfu/ml) | |
| A2 | B2 | ||
| 123 | 10％10％10％ | 1.0％1.0％1.0％ | 10.4610.5510.42 |
表7 Lanc2正交试验水平和因素列表
| 水平 | 因素 | |
| 甘草煎滤液A | 多价蛋白胨B | |
| 123 | 5％10％20％ | 1.0％2.0％3.0％ |
表8 Lanc2正交试验方案和结果分析表
| 实验号 | 因素 | 活菌菌数(lgcfu/ml) | |||
| A | B | C | D | ||
| 123456789 | 111222333 | 123123123 | 123231312 | 123312231 | 9.8710.1510.0410.2210.6810.119.439.879.34 |
| K1K2K3RSS | 30.0631.0128.640.790.95 | 29.5230.7029.490.400.32 | 29.8529.7130.150.150.03 | 29.8929.6930.130.150.03 | |
表9 Lanc2在A2B2组合配方培养基中验证实验
| 实验号 | 因素 | 活菌菌数(lgcfu/ml) | |
| A | B | ||
| 123 | 10％10％10％ | 2.0％2.0％2.0％ | 10.6310.7210.67 |
表10 Lanc3正交试验水平和因素列表
| 水平 | 因素 | ||
| 甘草煎滤液A | 多价蛋白胨B | 肝浸粉C | |
| 123 | 5％10％20％ | 0.5％1.0％1.5％ | 0.12％0.24％0.36％ |
表11 Lanc3正交试验方案和结果分析表
| 实验号 | 因素 | 活菌菌数(lgcfu/ml) | |||
| A | B | C | D | ||
| 123456789 | 111222333 | 123123123 | 123231312 | 123312231 | 9.5110.239.9310.3410.5910.279.669.7510.03 |
| K1K2K3RSS | 29.6731.2029.440.590.61 | 29.5130.5730.230.350.20 | 29.5330.6030.180.360.19 | 30.1330.1630.020.050.00 | |
表12 Lanc3在A2B2C2组合配方培养基中验证实验
| 实验号 | 因素 | 活菌菌数(lgcfu/ml) | ||
| A | B | C | ||
| 123 | 10％10％10％ | 1.0％1.0％1.0％ | 0.24％0.24％0.24％ | 10.5710.6310.56 |
本发明所述乳杆菌发酵用复合培养基的制备方法如下：
(1)制备8～70％甘草煎滤液
a、选择无霉变的干燥甘草根茎或饮片，清水洗净、除杂、烘干。
b、称重后，用机械粉碎(包括使用球磨机、棒磨机、管磨机，以及广义球磨机振动磨、离心球磨和行星磨等)的方法将所述甘草进行物理粉碎，直至得到平均粒径为100-150μm的细粉体。
c、将上述甘草细粉体低温冻结至裂碎临界点(玻璃点)后，用气流粉碎(包括使用圆盘式气流磨、循环管式气流磨、对喷式气流磨、流化床对喷式气流磨和靶式气流磨等)的方法进行能量粉碎，直至得到平均粒径为5-25μm的超微粉体。
d、将所得上述甘草超微粉体，在40℃恒温条件下分别用两种微生物酶粗酶液(本发明用去除菌体后的白腐菌GIM5.178-XW发酵浓缩液以及去除菌体后的绿色木霉CGMCC3.3711-XW发酵浓缩液)先后进行酶解反应，每一次酶解反应时间为24h。
所述的两种微生物制备的粗酶液进行的酶解反应，是指用去除菌体后的一种白腐菌发酵浓缩液，以及去除菌体后的一种绿色木霉发酵浓缩液，分别加入装有甘草超微粉体的有盖不锈钢浅盘中，在40℃恒温下对甘草超微粉体进行酶解反应。
e、酶解完毕的甘草超微粉体，根据所需浓度补加蒸馏水定容，升温到100℃煎煮，同时灭菌灭酶，时间40分钟。
f、第一次煎煮完毕的甘草超微粉体，待煎液降温至40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取得滤液；滤渣再次煎煮，时间20分钟，降温后重复分级过滤和榨汁过程，合并滤液。
g、取上述合并滤液，加蒸馏水定容至1000mL，即溶质/溶剂配比量为80～700g甘草生药，按a～f所述步骤制得1000mL的8～70％甘草煎滤液。
(2)制备复合培养基
在8～70％甘草煎滤液中根据发酵需要添加配比量的多价蛋白胨，即制得嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵用复合培养基；添加配比量的多价蛋白胨和肝浸粉，即制得保加利亚乳杆菌发酵用复合培养基。
下面通过更具体的较佳实施例进一步说明本发明的一种用于乳杆菌发酵的复合培养基及该复合培养基的制备方法：
实施例1
嗜酸乳杆菌发酵用复合培养基的组成为：
10％甘草煎滤液 10000ml
多价蛋白胨 100g
嗜酸乳杆菌发酵用复合培养基的制备：
(1)制备10％甘草煎滤液(GJY)：
a、选择无霉变的干燥甘草根茎或饮片，清水洗净、除杂、烘干。
b、称取甘草1000g，用机械粉碎的方法将所述甘草进行物理粉碎，直至得到平均粒径为100-150μm的细粉体。
c、将上述甘草细粉体低温冻结至裂碎临界点后，用气流粉碎的方法进行能量粉碎，直至得到平均粒径为5-25μm的超微粉体。
d、将所得上述甘草超微粉体，在40℃恒温下分别用去除菌体后的白腐菌GIM5.178-XW发酵浓缩液以及去除菌体后的绿色木霉CGMCC3.3711-XW发酵浓缩液先后进行酶解反应，每一次酶解反应时间为24h。
e、酶解完毕的甘草超微粉体，加蒸馏水至10000ml，升温到100℃煎煮，同时灭菌灭酶，时间40分钟。
f、第一次煎煮完毕的甘草超微粉体，待煎液降温至40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取得滤液；滤渣再次煎煮，时间20分钟，降温后重复分级过滤和榨汁过程，合并滤液。
g、取上述合并滤液，补加蒸馏水定容至10000ml，即确定溶质/溶剂配比量为1000g生甘草药，按a～f所述步骤制得10000mL的10％甘草煎滤液(GJY)。
(2)制备乳杆菌复合培养基：
在制得的10％甘草煎滤液(GJY)中添加100g多价蛋白胨，即制得嗜酸乳杆菌发酵用复合培养基。
实施例2
植物乳杆菌发酵用复合培养基的组成为：
10％甘草煎滤液 10000ml
多价蛋白胨 200g
植物乳杆菌发酵用复合培养基的制备：
(1)制备10％甘草煎滤液(GJY)：
a、选择无霉变的干燥甘草根茎或饮片，清水洗净、除杂、烘干。
b、称取甘草1000g，用机械粉碎的方法将所述甘草进行物理粉碎，直至得到平均粒径为100-150μm的细粉体。
c、将上述甘草细粉体低温冻结至裂碎临界点后，用气流粉碎的方法进行能量粉碎，直至得到平均粒径为5-25μm的超微粉体。
d、将所得上述甘草超微粉体，在40℃恒温下分别用去除菌体后的白腐菌GIM5.178-XW发酵浓缩液以及去除菌体后的绿色木霉CGMCC3.3711-XW发酵浓缩液先后进行酶解反应，每一次酶解反应时间为24h。
e、酶解完毕的甘草超微粉体，加蒸馏水至10000ml，升温到100℃煎煮，同时灭菌灭酶，时间40分钟。
f、第一次煎煮完毕的甘草超微粉体，待煎液降温至40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取得滤液；滤渣再次煎煮，时间20分钟，降温后重复分级过滤和榨汁过程，合并滤液。
g、取上述合并滤液，补加蒸馏水定容至10000ml，即确定溶质/溶剂配比量为1000g生甘草药，按a～f所述步骤制得10000mL的10％甘草煎滤液(GJY)。
(2)制备乳杆菌复合培养基：
在制得的10％甘草煎滤液(GJY)中添加200g多价蛋白胨，即制得植物乳杆菌发酵用复合培养基。
实施例3
保加利亚乳杆菌发酵用复合培养基的组成为：
10％甘草煎滤液 10000ml
多价蛋白胨 100g
肝浸粉 24g
保加利亚乳杆菌发酵用复合培养基的制备：
(1)制备10％甘草煎滤液(GJY)：
a、选择无霉变的干燥甘草根茎或饮片，清水洗净、除杂、烘干。
b、称取甘草1500g，用机械粉碎的方法将所述甘草进行物理粉碎，直至得到平均粒径为100-150μm的细粉体。
c、将上述甘草细粉体低温冻结至裂碎临界点后，用气流粉碎的方法进行能量粉碎，直至得到平均粒径为5-25μm的超微粉体。
d、将所得上述甘草超微粉体，在40℃恒温下分别用去除菌体后的白腐菌GIM5.178-XW发酵浓缩液以及去除菌体后的绿色木霉CGMCC3.3711-XW发酵浓缩液先后进行酶解反应，每一次酶解反应时间为24h。
e、酶解完毕的甘草超微粉体，加蒸馏水至10000ml，升温到100℃煎煮，同时灭菌灭酶，时间40分钟。
f、第一次煎煮完毕的甘草超微粉体，待煎液降温至40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取得滤液；滤渣再次煎煮，时间20分钟，降温后重复分级过滤和榨汁过程，合并滤液。
g、取上述合并滤液，补加蒸馏水定容至10000ml，即确定溶质/溶剂配比量为1000g生甘草药，按a～f所述步骤制得10000mL的10％甘草煎滤液(GJY)。
(2)制备乳杆菌复合培养基：
在制得的10％甘草煎滤液(GJY)中添加100g多价蛋白胨、24g肝浸粉，即制得保加利亚乳杆菌发酵用复合培养基。
本发明的复合培养基均在嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌等3种重要益生乳杆菌中生长良好，最大生长量级均可达到1010cfu/ml，发酵增菌效果优于目前使用的经典乳杆菌培养基MRS培养基或MRS改良培养基，表明本发明提供了一种效果优良的乳杆菌选择培养基。
本发明所涉及的新型乳杆菌复合培养基配方简单，主要原料甘草价廉易得，属于可食用的天然物质，对人体和环境都十分安全，其它辅加成分种类少，用量小，且亦属于可食用物质，安全性好；培养基制备方法简单，性能可靠，增菌效果稳定性、重复性好，在摇瓶和/或发酵罐培养条件下均可达到活菌数1010cfu/ml的高密度培养水平，表明本发明提供了一种安全性、适用性均好的乳杆菌发酵培养基。
本发明所涉及的复合培养基成分组成和生产工艺流程简单，成本低廉，适宜于乳杆菌的工业化大规模培养；发酵后菌体与发酵液中其它成分比重不同，易于分离，节省能耗和设备成本；不经分离的发酵液以及分离后的菌体和上清液均可直接开发成乳杆菌相关制品，有利于发酵产品的多元化开发，且没有废液和废渣污染环境，表明本发明提供了一种经济效益和生态效益俱佳的乳杆菌生产培养基。
本发明所涉及复合培养基中主要原料的来源，除甘草生药外，尚可以是甘草茎叶(新鲜或干燥)、提取主要药学成分甘草酸后的药渣、或甘草用于提取其它成分后所剩的废渣；次要原料来源，则选用价格低廉、主要采用禽、畜肉类和/或大豆、花生等高油作物加工后的边角废料制备的多价蛋白胨，起到既充分利用宝贵的药材和食品资源从而降低生产成本、又防止废渣排放引起环境污染的有益效果。
本发明的实施例是为了更好地理解本发明进行的详细的描述，并不是对本发明所保护的范围的限定，本发明的保护范围以本发明权利要求限定为准。因此，本领域普通技术人员不脱离本发明的主旨未经创造性劳动而对本明所做的改变在本发明的保护范围内。
Claims (15)
1、一种用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，所述培养基包含8～70％甘草煎滤液。
2、根据权利要求1所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，所述培养基包含10％甘草煎滤液。
3、根据权利要求1或2所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，所述的培养基中，每1000毫升甘草煎滤液中加入7～25克多价蛋白胨。
4、根据权利要求1或2所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，所述培养基中，每1000毫升甘草煎滤液中加入2.0～5.0克肝浸粉。
5、根据权利要求3所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，所述培养基中，每1000毫升甘草煎滤液中加2.0～5.0克肝浸粉。
6、根据权利要求1或2所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，所述培养基中，或者还包括3％牛肉膏；或者还包括1％胰蛋白胨；或者还包括0.1％吐温-80；或者还包括0.5％酵母膏；或者还包括1％大豆蛋白陈；或者还包括2％葡萄糖；或者还包括0.24％肝浸粉；或者还包括1％多价蛋白胨；或者还包括0.5％可溶性淀粉。
7、根据权利要求2所述用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，培养基的组成为：
10％甘草煎滤液 1000mL
多价蛋白胨 10g
8、根据权利要求2所述用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，培养基的组成为：
10％甘草煎滤液 1000mL
多价蛋白胨 20g
9、根据权利要求2所述用于乳杆菌发酵的复合培养基，其特征在于，培养基的组成为：
10％甘草煎滤液 1000mL
多价蛋白胨 10g
肝浸粉 2.4g
10、一种用于乳杆菌发酵的复合培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤A，制备8～70％甘草煎滤液；
步骤B，在8～70％甘草煎滤液中根据发酵需要添加配比量的营养成分，制备用于乳杆菌发酵的复合培养基。
11、根据权利要求9所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤A包括下列步骤：
步骤A1，选择无霉变的干燥甘草根茎或饮片，清水洗净、除杂、烘干；
步骤A2，称重后，用机械粉碎的方法将净化后的甘草进行物理粉碎，直至得到平均粒径为100-150μm的细粉体；
步骤A3，将所述甘草细粉体进行低温冻结至裂碎临界点后，用气流粉碎的方法进行能量粉碎，直至得到平均粒径为5-25μm的超微粉体；
步骤A4，将所得的所述甘草超微粉体，在40℃恒温下分别用两种微生物制备的粗酶液先后进行酶解反应，每一次酶解反应时间为24小时；
步骤A5，酶解完毕的甘草超微粉体，根据所需浓度补加蒸馏水定容，升温到100℃煎煮，同时灭菌灭酶，时间40分钟；
步骤A6，第一次煎煮完毕的甘草超微粉体，待煎液降温40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取得滤液；滤渣再次煎煮，时间20分钟，降温后重复分级过滤和榨汁过程，合并滤液；
步骤A7，取所述合并滤液，加蒸馏水定容至1000mL，即确定溶质/溶剂配比量为80～700g甘草生药，按步骤A1～A7所述方法，制得1000mL的8～70％甘草煎滤液。
12、根据权利要求10或11所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤B中的营养成分为多价蛋白胨。
13、根据权利要求10或11所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤B中的营养成分为多价蛋白胨和肝浸粉。
14、根据权利要求10或11所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤B中的营养成分为3％牛肉膏；或者为1％胰蛋白胨；或者为0.1％吐温-80；或者为0.5％酵母膏；或者为1％大豆蛋白陈；或者为2％葡萄糖；或者为0.24％肝浸粉；或者为1％多价蛋白胨；或者为0.5％可溶性淀粉。
15、根据权利要求11所述的用于乳杆菌发酵的复合培养基的制备方法，其特征在于，所述的两种微生物制备的粗酶液进行的酶解反应，是指用去除菌体后的一种白腐菌发酵浓缩液，以及去除菌体后的一种绿色木霉发酵浓缩液，分别加入装有甘草超微粉体的有盖不锈钢浅盘中，在40℃恒温下对甘草超微粉体进行酶解反应。
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