CN1382055A

CN1382055A - 治疗剂

Info

Publication number: CN1382055A
Application number: CN00814678A
Authority: CN
Inventors: 富永隆生; 山下周作; 水谷滋利; 佐川裕章; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2002-11-27
Anticipated expiration: 2020-08-17
Also published as: WO2001013925A1; CN100384433C; KR20020031411A; DE60035604D1; JP4202645B2; DE60035604T2; EP1226826A1; EP1226826B1; JP2009051836A; AU6593400A; KR100675541B1; EP1226826A4; ATE367166T1

Abstract

本发明涉及需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的治疗剂或预防剂,其特征在于含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分。还涉及含有岩藻依聚糖和/或其分解产物的调节细胞因子生成用食品、饮料或饲料、诱导一氧化氮产生用食品、饮料或饲料或者抗变态反应用食品、饮料或饲料。

Description

治疗剂

技术领域

本发明涉及源于水生生物的生理活性物质作为药物、食品、饮料或饲料的用途。

背景技术

作为源于水生生物的生理活性物质，已知岩藻依聚糖。这种岩藻依聚糖是含在藻类、棘皮动物等中的含硫酸化岩藻糖的多糖，含有硫酸化岩藻糖作为构成糖。

作为岩藻依聚糖的生理作用，已知癌增殖抑制活性、癌转移抑制活性、抗凝血活性、抗病毒活性等，期待开发作为药品的用途。

发明公开

本发明在于发现岩藻依聚糖的新型生理作用，其目的在于提供一种利用岩藻依聚糖的细胞因子生成调节作用等的药物、食品、饮料或饲料。另外，在本说明书中，有时将本发明的治疗剂或预防剂称为药物。

如果概括地描述本发明，本发明的第1项发明涉及需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的治疗剂或预防剂，其特征在于，含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分。

本发明的第2项发明涉及调节细胞因子生成用食品、饮料或饲料、诱导一氧化氮产生用食品、饮料或饲料或者抗变态反应用食品、饮料或饲料，其特征在于，含有岩藻依聚糖和/或其分解产物。

另外，作为本发明的一种方式，涉及岩藻依聚糖和/或其分解产物在治疗或预防需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病中的用途；岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的治疗剂或预防剂中的用途；或者使用岩藻依聚糖和/或其分解产物治疗或预防需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的方法。

而且，作为本发明的一种方式，涉及含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的细胞因子生成调节剂、一氧化氮产生诱导剂、抗变态反应剂或IgE产生抑制剂。

而且，作为本发明的一种方式，涉及岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备细胞因子生成调节剂、一氧化氮产生诱导剂、抗变态反应剂或IgE产生抑制剂中的用途。

而且，作为本发明的一种方式，涉及岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备调节细胞因子生成用食品、饮料或饲料、诱导一氧化氮产生用食品、饮料或饲料或者抗变态反应用食品、饮料或饲料中的用途。

而且，作为本发明的一种方式，涉及使用岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的细胞因子生成调节方法、一氧化氮产生诱导方法、变态反应抑制方法或IgE产生抑制方法。

而且，作为本发明的一种方式，涉及岩藻依聚糖和/或其分解产物在调节细胞因子生成、诱导一氧化氮产生、抑制变态反应或抑制IgE产生中的用途。

作为本发明更优选的方式，岩藻依聚糖和/或其分解产物对于调节抗原致敏时，例如抗原呈递细胞和T细胞之间的抗原呈递时的细胞因子生成具有显著效果。另外，岩藻依聚糖和/或其分解产物对于治疗抗原致敏后的变应性疾病，特别是抑制抗原致敏后的抗原特异性IgE产生具有显著效果。另外，本发明中，细胞因子生成调节剂包括通过增强、促进细胞因子类的生成等，调节细胞因子的产量。

因此，作为本发明的一种方式，涉及抗原致敏时需要调节细胞因子生成的疾病或抗原致敏后的变应性疾病的治疗剂或预防剂，其特征在于含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分。

另外，本发明的一种方式涉及抗原致敏时调节细胞因子产生用食品，饮料或饲料，或抗原致敏后的抗变态反应用食品、饮料或饲料，其特征在于含有岩藻依聚糖和/或其分解产物。

另外，作为本发明的一种方式，涉及岩藻依聚糖和/或其分解产物在治疗或预防抗原致敏时需要调节细胞因子生成的疾病或抗原致敏后的变应性疾病中的用途；岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备抗原致敏时需要调节细胞因子生成的疾病或抗原致敏后的变应性疾病的治疗剂或预防剂中的用途；或者使用岩藻依聚糖和/或其分解产物治疗或预防抗原致敏时需要调节细胞因子生成的疾病或抗原致敏后的变应性疾病的方法。

而且，作为本发明的一种方式，涉及含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的抗原致敏时的细胞因子生成调节剂、抗原致敏后的抗变态反应剂或IgE产生抑制剂。

而且，作为本发明的一种方式，涉及岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备抗原致敏时的细胞因子生成调节剂、抗原致敏后的抗变态反应剂或抗原致敏后的IgE产生抑制剂中的用途。

而且，作为本发明的一种方式，涉及岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备调节抗原致敏时的细胞因子生成用食品、饮料或饲料、或者抗原致敏后的抗变态反应用食品、饮料或饲料中的用途。

而且，作为本发明的一种方式，涉及使用岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的抗原致敏时的细胞因子生成调节方法、抗原致敏后的变态反应抑制方法或抗原致敏后的IgE产生抑制方法。

而且，作为本发明的一种方式，涉及岩藻依聚糖和/或其分解产物在调节抗原致敏时的细胞因子生成、抑制抗原致敏后的变态反应或抑制抗原致敏后的IgE产生中的用途。

本发明中使用的岩藻依聚糖没有特别的限定，优选例如源于藻类的岩藻依聚糖或源于棘皮动物的岩藻依聚糖。

另外，作为岩藻依聚糖的分解物，可使用例如岩藻依聚糖的酸分解物，岩藻依聚糖的酶分解物。

作为本发明中使用的岩藻依聚糖、岩藻依聚糖的分解产物，例如岩藻依聚糖的酸分解产物、岩藻依聚糖的酶分解产物，只要是显示细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、或抗变态反应作用，例如IgE产生抑制作用等，没有特别的限定，能够以上述作用等作为指标适当配制。

另外，本说明书中所说的细胞因子特别是指岩藻依聚糖或其分解产物能够显示生成调节作用的细胞因子，例如白介素类(如白介素-12)、干扰素类(如干扰素-γ)。

而且，抗变态反应作用是指岩藻依聚糖或其分解产物能够显示的变态反应抑制作用，例如IgE产生抑制作用。

附图说明

图1是表示源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的DEAE-Cellulofine A-800柱洗脱曲线的图。

图2是表示添加7-12SFd-F培养时培养基中的NO₂ ^-浓度的图。

图3是表示添加级分I培养时培养基中的NO₂ ^-浓度的图。

图4是表示添加级分II培养时培养基中的NO₂ ^-浓度的图。

图5是表示添加级分III培养时培养基中的NO₂ ^-浓度的图。

图6是表示添加阳性对照的LPS培养时培养基中的NO₂ ^-浓度的图。

图7是表示岩藻依聚糖及其分解产物的IFN-γ产生诱导作用的图。

图8是表示岩藻依聚糖及其分解产物的IL-12产生诱导作用的图。

图9是表示源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖对小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒性免疫增强作用的图。

图10是表示G-岩藻依聚糖的IFN-γ产生诱导作用的图。

图11是表示G-岩藻依聚糖的IL-12产生诱导作用的图。

图12表示各种抗体对岩藻依聚糖的IFN-γ或IL-12产生诱导作用的作用。

图13是表示各种岩藻依聚糖的IFN-γ产生诱导作用的图。

发明的最佳实施方式

本发明使用的岩藻依聚糖是含有硫酸化岩藻糖作为构成成分的多糖，只要具有细胞因子类生成调节作用，例如抗原呈递细胞(APC)和T细胞之间的抗原呈递反应时的干扰素-γ产生调节作用、白介素-12产生调节作用；一氧化氮产生诱导作用；或抗变态反应作用，例如IgE产生抑制作用，并没有特别的限定。例如，藻类中的Kjellmaniella crassifolia、Kjellmaniella gyrata、墨角藻属(Fucus)、冲绳海蕴(Cladosiphon okamuranus)、裙带菜属(Undaria)、昆布(Ecklonia kurome)、茶色海藻(Eiseniabicyclis)、褐藻(Ecklonia cava)、巨藻(Giant kelp)、黑巨藻(Lessonia nigrescence)、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)等海带目(Laminariales)、索藻目(Chordariales)、岩藻目(Fucales)海藻富含适用于本发明的岩藻依聚糖，适合作为原料。另外，也可以使用源于棘皮动物，例如海参、海胆、海星等的岩藻依聚糖。

这些岩藻依聚糖的制备可以分别按照公知的方法制备，在本发明中可以使用纯化品或含有该岩藻依聚糖的物质等。

例如由Kjellmaniella crassifolia制备岩藻依聚糖，该岩藻依聚糖可以进一步分离成含有葡萄糖醛酸的岩藻依聚糖(称为U-岩藻依聚糖)和不含葡萄糖醛酸的岩藻依聚糖(称为F-岩藻依聚糖)。这些岩藻依聚糖可以用作本发明的治疗剂或预防剂等的有效成分。另外，也可以由Kjellmaniella crassifolia制备硫酸化岩藻半乳聚糖(称为G-岩藻依聚糖)使用。

U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖在由Kjellmaniellacrassifolia制备岩藻依聚糖后，用阴离子交换树脂、表面活性剂等分离。源于Kjellmaniella crassifolia的U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖的存在比按重量比约为1∶2，U-岩藻依聚糖含有岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等，硫酸含量为约20重量％，F-岩藻依聚糖含有岩藻糖和半乳糖，硫酸含量为约50重量％，两种物质的分子量均以约20万为中心分布(第18次糖质讨论会要旨集，第159页，1996年)。

例如将由Kjellmaniella crassifolia制备的岩藻依聚糖溶液施于DEAE-Cellulofine A-800柱上后，用含有NaCl的缓冲液按浓度梯度法进行洗脱，可以分离U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖。图1表示其中的一个实例。也就是说，图1是表示U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖的分离的图，图中前峰为U-岩藻依聚糖，后峰为F-岩藻依聚糖。

另外，通过将源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖用交替单胞菌属(Alteromonas sp.)SN-1009(FERM BP-5747)产生的F-岩藻依聚糖特异分解酶以及黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)SA-0082(FERM BP-5402)产生的U-岩藻依聚糖特异分解酶分解，除去分解产物，可以纯化上述G-岩藻依聚糖。

另外，源于墨角藻属的岩藻依聚糖、源于Cladosiphonokamuranus的岩藻依聚糖、源于裙带菜属的岩藻依聚糖、源于裙带菜(Undaria pinnatifida)的岩藻依聚糖也可以按照公知的方法制备，用于本发明。

本发明中适用的源于棘皮动物的岩藻依聚糖，例如特开平4-91027号公报中记载的海参中含有的岩藻依聚糖，可以按照该公报中记载的方法由海参制备该岩藻依聚糖。

另外，本发明中使用的具有细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用的岩藻依聚糖分解产物可以按照酶学方法、化学方法、物理方法等公知的方法，选择具有所需的细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用的分解产物后使用。

作为所述岩藻依聚糖的分解产物的制备方法，例如有酸分解法，可以通过对该岩藻依聚糖进行酸分解，制备具有细胞因子生成调节作用、免疫激活作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用的分解产物。

上述酸分解法的酸分解条件只要是生成具有细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用的分解产物(以下称为本发明的分解产物)的条件即可，没有特别的限定。

例如通过将岩藻依聚糖溶解或悬浊于酸中，使之反应，生成本发明的分解产物。另外，通过在反应时进行加热，可以缩短生成本发明的分解产物所必需的时间。

溶解或悬浊岩藻依聚糖的酸的种类没有特别的限定，可以使用盐酸、硫酸、硝酸等无机酸，枸橼酸、甲酸、醋酸、乳酸、抗坏血酸等有机酸，以及阳离子交换树脂、阳离子交换纤维、阳离子交换膜等固体酸。

酸的浓度没有特别的限定，优选以0.0001～5N，更优选以0.01～1N的浓度使用。另外，反应温度也没有特别的限定，优选设定为0～200℃，更优选20～130℃。

另外，反应时间也没有特别的限定，优选设定为数秒～数日。酸的种类和浓度、反应温度和反应时间最好根据本发明分解产物的产量、分解产物的聚合度适当选择。另外，制备本发明的分解产物时，优选使用枸橼酸、乳酸、苹果酸等有机酸，酸的浓度在10mM～数M的范围内选择，加热温度在50～110℃，更优选在70～95℃的范围内选择，加热时间在数分钟～24小时的范围内选择，可以制备本发明的分解产物。作为岩藻依聚糖的酸分解产物，例如源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的酸分解产物，该分解产物可以作为具有细胞因子生成调节作用，特别是APC和T细胞之间的抗原呈递反应时的干扰素-γ产生调节作用，一氧化氮产生诱导作用以及抗变态反应作用的强效新生理功能的食物纤维使用。

本发明的分解产物能够以细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用为指标进行分级，例如可以按照凝胶过滤法、采用分子量分级膜的分级法等对酸分解产物进一步进行分子量分级。

作为凝胶过滤法的实例，使用Cellulofine GCL-300，可以制备例如分子量大于25000、分子量25000～大于10000、分子量10000～大于5000、分子量5000以下等任意的分子量级分，使用CellulofineGCL-25，可以将分子量为5000以下的级分制备成分子量5000～大于3000、分子量3000～大于2000、分子量2000～大于1000、分子量1000～大于500、分子量500以下等任意的分子量级分。

另外，也可以使用超滤膜进行工业分子量分级，例如可以通过使用DAICEL公司生产的FE10-FUS0382制备分子量30000以下的级分，或者通过使用DAICEL公司生产的FE-FUS-T653制备分子量6000以下的级分。也可以进一步使用纳米滤膜得到分子量500以下的级分，可以通过将这些凝胶过滤法、分子量分级法组合，制备任意的分子量级分。

作为本发明中能够使用的具有细胞因子生产调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用的岩藻依聚糖分解产物，例如下述式(I)～式(IV)表示的化合物，这些化合物可以按照国际公开第97/26896号说明书、国际申请号PCT/JP99/00606号说明书、国际申请号PCT/JP00/00965号说明书中记载的方法制备。另外，作为本发明的岩藻依聚糖分解产物，也包括国际公开第97/26896号、国际申请号PCT/JP99/00606号说明书、国际申请号PCT/JP00/00965号说明书中记载的岩藻依聚糖分解产物。另外，具有式(I)所示化合物的重复结构的岩藻依聚糖以及低聚糖也可以适用于本发明。(式中，R为OH或OSO₃H。)

(式中，R为OH或OSO₃H。)

(式中，R为OH或OSO₃H。)

(式中，R为OH或OSO₃H。)

另外，作为式(I)所示化合物的实例，例如下述式(V)表示的化合物。

式(I)表示的化合物例如可以通过用交替单胞菌属SN-1009(FERM BP-5747)产生的内切型硫酸化多糖分解酶(F-岩藻依聚糖特异分解酶)处理上述F-岩藻依聚糖，由其分解产物纯化得到。关于该化合物中硫酸酯基的含量、部位，可以由其分解产物中纯化得到任意的物质。另外，该分解产物中也含有式(I)所示化合物的聚合物，可以根据目的进行分离、纯化。

式(II)表示的化合物和式(III)表示的化合物分别可以通过例如用黄杆菌属SA-0082(FERM BP-5402)产生的内切型硫酸化多糖分解酶(U-岩藻依聚糖特异分解酶)处理上述U-岩藻依聚糖，由其分解产物纯化得到。针对该化合物中硫酸酯基的含量、部位，可以由其分解产物中纯化得到任意的物质。另外，该分解产物中也含有以式(II)所示化合物中没有双键的化合物作为基本骨架的聚合物，可以根据目的进行分离、纯化。

式(IV)表示的化合物例如可以通过使从黄杆菌属SA-0082(FERMBP-5402)得到的特异地分解G-岩藻依聚糖的内切型硫酸化多糖分解酶(G-岩藻依聚糖特异分解酶)作用于G-岩藻依聚糖，制备该G-岩藻依聚糖的分解产物，由该分解产物纯化得到。针对该化合物中硫酸酯基的含量、部位，可以由其分解产物中纯化得到任意的物质。另外，该分解产物中也含有以式(IV)所示化合物为基本骨架的聚合物，可以根据目的进行分离、纯化。

另外，岩藻依聚糖或其分解产物的细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用或抗变态反应作用按照例如后述实施例1、2、7和8记载的方法检定。作为被测对象的岩藻依聚糖或其分解产物显示所述作用时，以其作为指标选择本发明中可以使用的岩藻依聚糖或其分解产物。

在本发明中，能够通过岩藻依聚糖或其分解产物调节生成的细胞因子没有特别的限定，例如白介素(IL)-1～18、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、淋巴毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、干细胞因子(SCF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。

这些细胞因子包括以延迟型过敏反应或靶细胞障碍为主与各种细胞性免疫反应的表达或调节有关的细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α、TNF-β等)、在抗体产生机理中与其调节功能有关的细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等)、对肿瘤细胞直接显示增殖抑制作用或破坏作用的细胞因子(TNF-α、TNF-β、IFN等)、促进骨髓中的造血干细胞或前体细胞增殖、分化的细胞因子(IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、GM-CSF、G-CSF、M-CSF等)、与炎症反应有关的细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、TNF-β、IFN等)、与变态反应有关的细胞因子(IL-3、IL-4、IL-5等)、增强NK细胞活性的细胞因子(IL-12)等。另外，本发明中使用的岩藻依聚糖和/或其分解产物具有的细胞因子生成调节作用是指仅仅在存在病毒感染或癌等体内应排除的抗原，必须增强细胞性免疫时，能够选择性产生的细胞因子生成调节作用，例如IFN-γ、IL-12的产生诱导作用或者其产生增强作用或产生促进作用。因此，该岩藻依聚糖和/或其分解产物不会导致不必要状态下的免疫系统活化或增强，因而不会引起变态反应症状、自身免疫疾病等疾病，是非常安全而且有效的成分。另外，该岩藻依聚糖和/或其分解产物也可以增强细胞毒性免疫，例如增强淋巴细胞的细胞毒性。

因此，使用岩藻依聚糖和/或其分解产物，通过调节这些细胞因子的生成，能够治疗或预防需要调节细胞因子生成的疾病，例如癌等需要表达或调节细胞性免疫反应的疾病，自身免疫疾病等需要调节抗体产生的疾病，贫血、糖尿病等需要细胞分化的疾病，败血症性休克、炎症性肠疾病、慢性关节风湿、多发性硬化、葡萄膜炎等需要抑制炎症的疾病。

本发明中使用的岩藻依聚糖及其分解产物具有细胞因子生成调节作用，能够以这些化合物作为有效成分制备需要调节细胞因子生成的上述疾病的治疗剂或预防剂。

另外，本发明中使用的岩藻依聚糖及其分解产物具有一氧化氮产生诱导作用，使用这些化合物作为有效成分，能够治疗或预防需要产生一氧化氮的疾病，例如需要松弛血管平滑肌、抑制血小板、粒细胞和单核细胞向血管壁粘附、阻止分泌性平滑肌细胞增殖等的动脉硬化。另外，该岩藻依聚糖及其分解产物也可以通过上述作用发挥免疫激活效果。另外，一氧化氮产生诱导作用也包括诱导增强作用或诱导促进作用。

而且，本发明中使用的岩藻依聚糖及其分解产物具有抗变态反应作用，例如IgE产生抑制作用，使用这些化合物作为有效成分，能够治疗或预防变应性疾病，例如由于产生IgE介导的或恶化的症状，例如IgE引起的变应性疾病，如支气管哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、变应性结膜炎、荨麻疹、过敏性休克等。

另外，上述岩藻依聚糖的特定级分，特别是F-岩藻依聚糖、U-岩藻依聚糖、G-岩藻依聚糖，是基本结构初次确定的岩藻依聚糖级分，在这一点上，使用特异地作用于各级分的酶制备的各种分解产物，特别是其分解产物的级分，例如式(I)～(IV)等化合物是分子量较岩藻依聚糖低的分子；而且与岩藻依聚糖具有同等的生理活性，在这一点上，与结构、组成、物性不明确的简单分离得到的岩藻依聚糖或含有岩藻依聚糖的物质相比显著优良。

在本发明中，提供一种需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的治疗剂或预防剂，其中含有上述岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分。

特别是作为本发明的需要调节细胞因子生成的疾病的治疗剂或预防剂，从有效性的观点来看，优选需要调节白介素类或干扰素类生成的疾病的治疗剂或预防剂，更优选需要调节干扰素-γ或白介素-12生成的疾病的治疗剂或预防剂。另外，本发明的变应性疾病的治疗剂或预防剂具有抗原致敏后的IgE产生抑制作用，且通过口服给药具有抗原致敏后的IgE产生抑制作用，在这一点上，是非常有用的抗变态反应剂。而且，本发明的变应性疾病的治疗剂或预防剂能够通过口服给药抑制特别是在花粉病样由抗原致敏产生的症状中的抗原特异性IgE产生，在这一点上显著优良。因此，作为变应性疾病的治疗剂或预防剂，优选需要抑制IgE产生的疾病的治疗剂或预防剂。

本发明的治疗剂或预防剂以岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分，通过将其与公知的药用载体组合制成制剂得到。该制剂的制备一般通过将岩藻依聚糖和/或其分解产物与药学上允许的液状或固体状的载体配合，并根据需要加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体制剂、溶液剂、悬浊剂、乳剂等液体制剂进行。另外，也可以制成能够在使用之前添加适当的载体形成液状的干燥品。

药用载体可以根据本发明的治疗剂或预防剂的给药方式和剂型适当选择。

口服剂的场合，可以利用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，配制口服剂时，也可以进一步配合粘结剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、矫味剂、着色剂、香料等。

另一方面，非口服剂的场合，可以按照常规方法使本发明的有效成分岩藻依聚糖和/或其分解产物溶解或悬浊于作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根据需要加入杀菌剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等进行配制。

本发明的治疗剂或预防剂可以根据制剂形态采用适当的给药途径给药。另外，给药方法也没有特别的限定，可以内用、外用和注射。注射剂可以在静脉内、肌肉内、皮下、真皮内等给药，外用剂也包括栓剂等。另外，所述治疗剂或预防剂从其有效性的观点来看，优选口服用治疗剂或口服用预防剂。

本发明的治疗剂或预防剂的给药量并不是一定的，可以根据其制剂形态、给药方法、使用目的及其适用的患者年龄、体重、症状适当设定，一般制剂中含有的岩藻依聚糖和/或其分解产物的量优选成人每天0.1～2000mg/kg。因此，本发明的治疗剂或预防剂中岩藻依聚糖和/或其分解产物的含量最好适当决定，使得通过给予该治疗剂或预防剂至少能够在上述范围内给予岩藻依聚糖和/或其分解产物。另外，给药量根据种种条件变化，因此有时采用低于上述给药量的量就足够，或者有时必须超过上述范围。本发明的治疗剂或预防剂可以直接口服给药，也可以添加到任意的饮食品中使之日常摄取。另外，也可以使用岩藻依聚糖和/或其分解产物作为调节细胞因子生成用饮食品或饲料、诱导一氧化氮产生用饮食品或饲料、抗变态反应用饮食品或饲料的原料。

另外，作为本发明的一种方式，提供一种岩藻依聚糖和/或其分解产物在治疗或预防需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病中的用途；或者使用岩藻依聚糖和/或其分解产物治疗或预防需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的方法。

为了治疗或预防需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病，最好按上述例举的范围给予岩藻依聚糖和/或其分解产物，例如适当给予本发明的治疗剂或预防剂。

而且，作为本发明的一种方式，提供含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的细胞因子生成调节剂，例如IFN-γ生成调节剂、IL-12生成调节剂；一氧化氮产生诱导剂；或抗变态反应剂，例如IgE产生抑制剂。这些药物可以按照上述治疗剂或预防剂制备。例如细胞因子生成调节剂对研究细胞因子的功能、筛选与细胞因子有关的疾病用药物是有用的。这些药物的剂型、用量等只要可以相应于各种用途得到该药物发挥的所需效果即可，没有特别的限定。另外，对于上述例举的疾病等也可以适用。

而且，作为本发明的一种方式，提供岩藻依聚糖和/或其分解产物在调节细胞因子生成、诱导一氧化氮产生、抑制变态反应或抑制IgE产生中的用途；或使用岩藻依聚糖和/或其分解产物的细胞因子生成调节方法、一氧化氮产生诱导方法、变态反应抑制方法或IgE产生抑制方法。

为了调节细胞因子生成、诱导一氧化氮产生、抑制变态反应或抑制IgE产生，可以使用上述细胞因子生成调节剂、一氧化氮产生诱导剂等以根据各种用途获得所需的效果。

以下说明本发明使用的岩藻依聚糖或其分解产物的推定药理作用。

关于从淋巴细胞诱导产生IFN-γ，已知ConA等促细胞分裂剂对T细胞直接刺激产生的诱导以及抗原致敏时抗原呈递细胞(APC)和T细胞的细胞间相互作用产生的诱导。前者是促细胞分裂剂对T细胞受体直接结合产生的诱导，后者是APC与T细胞各受体的刺激以及通过该刺激由APC产生的IL-12引起的诱导。作为与IL-12产生诱导有关的受体反应，除T细胞受体(TCR)/主要组织相容复合体(MHC)以外，作为副刺激，已知T细胞侧的CD40L和APC侧的CD40、以及T细胞侧的CD28和APC侧的B7的各种反应。

以前，有报道称源于海带(Laminaria japonika)的岩藻依聚糖诱导源于正常小鼠的脾脏淋巴细胞产生IFN-γ，增强NK细胞的活化(中国海洋药物杂志，1995第3期，9～13)，但这是对处于静止期的原初T细胞直接刺激产生的诱导。

另一方面，关于这次本发明人等确认的源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖及其级分的IFN-γ产生诱导作用，如实施例所示，确认没有直接刺激淋巴细胞或刺激同种异源抗原时的诱导作用，仅在致敏淋巴细胞的抗原刺激下促进IFN-γ产生。而且，确认这时诱导IL-12产生。这种抗原呈递反应时的IFN-γ产生诱导作用在由抗IL-12抗体中和产生的IL-12时抑制约50％，在通过抗CD40抗体和抗CD28抗体抑制这些受体反应时则完全抑制。因此，关于来源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖及其级分的IFN-γ产生诱导作用机理，推测可能是由于在抗原呈递反应时对APC作用促进IL-12产生引起的，以及对由于APC细胞和T细胞的相互作用处于活化状态的T细胞作用诱导的。

发现对静止期T细胞的直接诱导作用的上述报道中记载的岩藻依聚糖和本发明中使用的源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖不同，其结果显示完全不同的作用。

另外，在使用抗原呈递细胞之一的巨噬细胞株的系统中，岩藻依聚糖及其分解产物诱导一氧化氮产生，并基于这种诱导显示免疫激活效果，但是即使在这种系统中，也未见岩藻依聚糖及其分解产物诱导IFN-γ产生，认为本发明中使用的岩藻依聚糖及其分解产物没有直接诱导IFN-γ产生的活性，促进一氧化氮产生与促进IL-12产生平行，因此可以推测本发明的岩藻依聚糖及其分解产物引起的IFN-γ产生增强不是由于静止期T细胞的直接刺激引起的诱导，而是抗原呈递反应时对APC作用促进IL-12产生引起的，以及对由于APC与T细胞的相互作用处于活化状态的T细胞作用诱导的。基于这一点，本发明中使用的岩藻依聚糖及其分解产物显示与发现直接诱导作用的上述报道完全不同的作用。

另外，IFN-γ在T细胞(Th1)的T细胞受体被抗原呈递细胞(APC)等刺激时产生，并通过APC产生的IL-12促进产生。IFN-γ在病毒、真菌感染以及癌疾病等中具有使NK细胞、巨噬细胞等细胞性免疫活化，发挥增强生物防御能力的作用。

另一方面，已知IFN-γ能抑制作为以哮喘、花粉病、特异性皮炎等为代表的变态反应疾病的发生原因的Th2细胞活化。Th2细胞诱导免疫球蛋白E抗体(IgE)产生。产生的IgE与肥大细胞的细胞膜上的受体结合，引起肥大细胞释放化学介质。以这种炎症性介质为出现变态反应症状的直接原因。

本发明的抗变态反应剂在抗原致敏后的口服给药中，抑制IgE产生，对于改善发病后的以哮喘、花粉病、特异性皮炎等为代表的变应性疾病的症状非常有用。

而且，本发明提供含有岩藻依聚糖和/或其分解产物的调节细胞因子生成用食品或饮料、诱导一氧化氮产生用食品或饮料或者抗变态反应用食品或饮料。

特别是作为本发明的调节细胞因子生成用食品或饮料，从有效性的观点来看，优选调节白介素类或干扰素类生成用食品或饮料，更优选调节干扰素-γ或白介素-12生成用食品或饮料。

另外，本发明的抗变态反应用食品或饮料具有抗原致敏后的IgE产生抑制作用，通过摄取发挥抗原致敏后的IgE产生抑制作用，在这一点上，是非常有用的食品或饮料。因此，作为抗变态反应用食品或饮料，优选抑制IgE产生用食品或饮料。

另外，关于后述的饲料，基于同样的观点也优选具有这些作用的饲料。

所述食品或饮料基于其细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用，对于改善、预防对岩藻依聚糖或其分解产物显示敏感性的需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病、变应性疾病的症状是非常有用的。

另外，本发明的食品、饮料或饲料、后述化妆品中所谓“含有”这一用语包括含有、添加、稀释的含义，含有是指食品、饮料等中含有本发明使用的有效成分这种状态，添加是指在食品、饮料等的原料中添加本发明使用的有效成分这种状态，稀释是指在本发明使用的有效成分中添加食品、饮料等的原料这种状态。

本发明的食品或饮料的制备方法可以按照公知的方法进行，没有特别的限定。作为所述的制备方法，可以列举烹调、加工以及一般采用的食品或饮料的制备方法，只要制得的食品或饮料中含有具有细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用和抗变态反应作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分即可。

本发明的食品或饮料没有特别的限定，例如含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的谷类加工品(小麦粉加工品、淀粉加工品、预混合加工品、面类、通心粉类、面包类、馅类、荞麦面类、麸子、米粉、粉条、包装饼等)，油脂加工品(可塑性油脂、油炸用油、色拉油、蛋黄酱类、调味汁等)，大豆加工品(豆腐类、豆酱、纳豆等)，肉类加工品(火腿、熏猪肉、压缩火腿、香肠等)，水产品(冷冻碎鱼肉、鱼糕、鱼卷、鱼肉山芋蒸饼、油炸鱼丸子、汆鱼丸子、饭卷、鱼肉火腿、香肠、干狐鲣、鱼子加工品、水产品罐头、煮的鱼贝等)，乳制品(原料乳、乳酪、酸乳、奶油、干酪、炼乳、乳粉、冰淇淋等)，蔬菜·果实加工品(馅类、果酱类、腌菜类、果类饮料、蔬菜饮料、混合饮料等)，糖果类(巧克力、饼干类、甜点类、蛋糕、年糕、米糕类等)，酒精饮料(日本酒、中国酒、葡萄酒、威士忌酒、日本蒸馏酒、伏特加酒、白兰地、杜松子酒、糖蜜酒、啤酒、清凉醇饮料、果酒、利口酒等)，嗜好饮料(绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料、乳酸饮料等)，调料(酱油、辣酱油、醋、料酒等)，罐装、瓶装、袋装食品(牛肉盖饭、小锅什锦饭、红小豆饭、咖哩饭、其它各种烹调好的食品)，半干燥或浓缩食品(肝酱、其它涂抹果酱的食品、荞麦·面条的汁、浓缩的汤类)，干燥食品(速食面类、速食咖哩饭、速溶咖啡、果汁粉、汤粉、速食酱类、烹调好的食品、烹调好的饮料、烹调好的汤等)，冷冻食品(素烧、蒸鸡蛋羹、烤鳗鱼串、汉堡包、烧麦、饺子、各种面条、鸡尾酒等)，固态食品、液态食品(汤等)，香料类等农产·林产加工品、畜牧加工品、水产加工品等。

作为本发明的食品或饮料，含有具有选自细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用等生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物，只要含有用于表达其生理作用的必要量即可，对其形状没有特别的限定，也包括片状、颗粒状、胶囊状等能够口服摄取的形状。

岩藻依聚糖和/或其分解产物在食品或饮料中的含量可以根据其功能和生理活性适当选择，例如每100重量份食品为10^-9重量份以上，优选10^-7～2重量份，例如每100重量份饮料为10^-9重量份以上，优选10^-7～2重量份。另外，例如成人每天最好摄取岩藻依聚糖和/或其分解产物达到0.01～2000mg/kg。

另外，具有选自细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用等生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物作为同时具有该生理作用和食物纤维功能的健康食品材料、作为食品或饮料的制造材料是非常有用的。

而且，按照本发明，还提供一种含有具有选自细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用等生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的生物用饲料。

另外，作为本发明的一种方式，提供将具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物给予生物的生物饲养方法。

另外，作为本发明的一种方式，提供含有具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物的生物饲养用剂。

在这些发明中，生物是指例如养殖动物、宠物等，作为养殖动物，例如家畜、试验动物、家禽、鱼类、甲壳类或贝类。

作为饲料，例如基于岩藻依聚糖和/或其分解产物的生理作用的身体状况改善用饲料。

作为饲养用剂，例如浸渍用剂、饲料添加剂、饮料用添加剂。

这些发明中，具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物具有提高生物的饲养效率，例如存活率、养肥率、产卵率、产仔率、断奶率等的效果。

在将岩藻依聚糖和/或其分解产物给予生物的生物饲养方法中，通常每1kg对象生物的体重、每天优选给予具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物0.01～2000mg/kg。给药可以通过例如将岩藻依聚糖和/或其分解产物添加、混合到人工配合饲料的原料中，或与人工配合饲料的粉末原料混合后，添加、混合到其它原料中进行。另外，也可以给予本发明的饲料，使之能够达到所述岩藻依聚糖和/或其分解产物的给药量。

具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物在饲料中的含量没有特别的限定，可以根据目的使用，优选0.001～15重量％的比例。

作为人工配合饲料例如以鱼粉、酪蛋白、乌贼粉等动物性原料，大豆粕、小麦粉、淀粉、饲料用酵母等植物性原料，鳕鱼肝油、乌贼肝油等动物性油脂，大豆油、菜籽油等植物性油脂，维生素类、矿物类、氨基酸、抗氧化剂等为原料的人工配合饲料。另外，还例如鱼肉绞碎物等鱼类用饲料。

另外，也可以使用如低聚果糖、低聚异麦芽糖等功能性低聚糖，如聚葡萄糖、难消化性糊精、β-1，3-葡聚糖等食物纤维，蜂胶，如麦芽糖醇、palanitit、赤藓糖醇等糖醇，EPA，γ-亚麻酸，亚铁血红素，小球藻、螺旋藻属、白浆果提取物，如多元酚等止龋材料等功能性食品材料作为本发明饲料的原料。另外，在本发明中作为饲料，也包括饲料添加剂、饲料用营养辅助食品。

本发明饲料的制备方法没有特别的限定，只要制得的饲料中含有具有选自细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用等生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物的有效量即可。

另外，也可以通过将具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物直接添加到池塘、水槽、贮水池或饲养区域的水、海水等中，浸渍对象生物给药。这种浸渍方法在对象生物的饲料摄取量低下时特别有效。

水或海水中岩藻依聚糖和/或其分解产物的浓度没有特别的限定，可以根据目的使用，优选0.00001～1重量％的比例。

另外，也可以使对象生物摄取含有具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物的饮料作为饲养用饮料。

饮料中具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物的浓度没有特别的限定，可以根据目的使用，优选0.0001～1重量％的比例。

以具有所述生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的生物饲养用剂，例如浸渍用剂、饲料添加剂、饮料用添加剂可以按照其本身公知的方法制备。

本发明可以适用的生物没有限定，作为养殖动物，例如马、牛、猪、羊、山羊、骆驼、驼羊等家畜，小鼠、大鼠、土拨鼠、兔等实验动物，鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等家禽，真鲷、石鲷、比目鱼、鲽鱼、师鱼、黄尾笛鲷、黄条师、金枪鱼、大甲参、香鱼、鲑类、河豚、鳗鲡、泥鳅、鲇鱼等鱼类，对虾、黑虎虾、青蟹等甲壳类等，鲍、蝾螺、扇贝、牡蛎等贝类，作为宠物，例如狗、猫等，可以广泛适用于陆上、水中动物。

通过摄取含有具有选自细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用等生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物的饲料，或者将对象生物浸渍在含有该岩藻依聚糖和/或其分解产物的液体中，能够显著改善家畜、实验动物、家禽、鱼类、甲壳类、贝类、宠物等的身体状况、健康、生物体的体内平衡、新陈代谢等，本发明对于防止生物老化是非常有用的。

而且，具有选自细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用等生理作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物作为化妆品的有效成分是有用的，作为本发明的一种方式，提供以岩藻依聚糖和/或其分解产物为有效成分的调节细胞因子生成用化妆品、诱导一氧化氮产生用化妆品、抗变态反应用化妆品等。

这些化妆品等中含有的岩藻依聚糖和/或其分解产物的含量通常优选为0.0001～20重量％，更优选0.001～5重量％。

本发明的化妆品对透皮、口服使用有效，按照本发明可以提供通过透皮给药、口服给药有效的化妆品。特别是抗变态反应用化妆品是基于其抗变态反应作用对治疗、预防特应性皮炎有用的化妆品。另外，其给药量或适用量可以适当调节以得到所需的效果。

本发明的化妆品可以按照常规方法制备，作为调节细胞因子生成用化妆品、诱导一氧化氮产生用化妆品、抗变态反应用化妆品，可以制备例如洗剂、乳液、面霜、面膜剂、浴用剂、洗面剂、浴用洗剂、毛发滋养剂、生发剂或洗发剂。

本发明所使用的具有细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用、抗变态反应作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物在给大鼠口服时，确认即使一次口服给药1g/kg，也没有死亡例。

实施例

以下给出实施例，更具体地说明本发明，但是本发明并不受这些记载的任何限定。另外，实施例中的％表示重量％。参考例1(1)将Kjellmaniella crassifolia充分干燥后，用自由粉碎机(奈良机械制作所制)将干燥物20kg粉碎。

将氯化钙二水合物(日本曹达社制)7.3kg溶解于自来水900升中，其次混合Kjellmaniella crassifolia粉碎物20kg。通入水蒸气使之由液体温度12℃升温40分钟达到液体温度90℃，接着搅拌条件下在90～95℃保温1小时，接着冷却，得到冷却物1100升。

接着，使用固液分离装置(West Farrier Separator公司制CNA型)，对冷却物进行固液分离，制备约900升的固液分离上清液。

使用DAICEL公司制FE10-FC-FUS0382(级分分子量3万)，将固液分离上清液360升浓缩至20升。接着，加入自来水20升，再浓缩至20升，这种操作进行5次，进行脱盐处理，配制源于Kjellmaniella crassifolia的萃取液25升。

冷冻干燥该溶液1升，得到源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖干燥物13g。(2)将参考例1-(1)记载的岩藻依聚糖干燥物7g溶解于含有50mM氯化钠和10％乙醇的20mM的咪唑缓冲液(pH8.0)700ml中，通过离心分离除去不溶物。用同样的缓冲液将DEAE-Cellulofine A-800柱(φ11.4cm×48cm)平衡化，供给离心分离上清液后，用同样的缓冲液洗涤，按照氯化钠50mM至1.95M的浓度梯度进行洗脱(1级分：250ml)。用酚硫酸法以及咔唑硫酸法求出总糖量和糖醛酸含量，按洗脱顺序得到级分43～49、级分50～55、级分56～67。接着，通过电透析将这些级分脱盐后进行冷冻干燥，分别由级分43～49制得I级分(340mg)，由级分50～55制得II级分(870mg)，由级分56～67制得III级分(2.64g)。

图1表示源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的DEAE-Cellulofine A-800柱洗脱曲线。图1中纵轴表示按咔唑硫酸法得到的530nm处的吸光度(图中黑圆圈)、按酚硫酸法得到的480nm处的吸光度(图中白圆圈)以及电导率(mS/cm：图中白方块)，横轴表示级分序号。参考例2(1)在分别注入了含有葡萄糖0.25％、蛋白胨1.0％、酵母提取物0.05％的人工海水(Jamarin Laboratory公司制)pH8.2构成的培养基600ml并灭菌(120℃，20分钟)后的2升锥形瓶中接种交替单胞菌属(Alteromonas sp.)SN-1009(FERM BP-5747)，在25℃下培养26小时，得到种培养液。将含有蛋白胨1.0％、酵母提取物0.02％、下述参考例2-(2)记载的硫酸化多糖0.2％以及消泡剂(信越化学工业社制KM70)0.01％的人工海水pH8.0构成的培养基20升装入30升容量的发酵罐中，在120℃下杀菌20分钟。冷却后，接种上述种培养液600ml，在每分钟10升的通气量和每分钟250转的搅拌速度的条件下，在24℃培养24小时。培养结束后，离心分离培养液，得到菌体和培养上清液。用装有排除分子量1万的全纤维的超滤器浓缩得到的培养上清液，之后用85％饱和硫酸铵盐析，通过离心分离收集生成的沉淀，对含有十分之一浓度人工海水的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.2)充分透析，配制600ml选择性作用于硫酸化多糖的内切型硫酸化多糖分解酶(F-岩藻依聚糖特异分解酶)液。(2)用装有直径1mm的筛网的切磨机(增幸产业社制)将干燥后的Kjellmaniella crassifolia 2Kg粉碎，将得到的海带碎片悬浊于20升的80％乙醇中，在25℃下搅拌3小时，用滤纸过滤后，充分洗涤残渣。将得到的残渣悬浊于加热至95℃的40升含有50mM氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液pH6.5中，不断搅拌的同时在95℃下处理2小时，提取硫酸化多糖。

过滤提取液中的悬浊物，制得滤液后，用3.5升100mM氯化钠洗涤过滤残渣，再得到滤液。

将两次的滤液合并后，将温度降低至30℃，添加3000U的海藻酸裂合酶K(Nagase生化学工业社制)后，加入乙醇4升，在25℃下搅拌24小时。其次，进行离心分离，用具备排除分子量10万的全纤维的超滤器将得到的上清液浓缩至4升，再用含有10％乙醇的100mM氯化钠继续超滤，直到着色性物质不再过滤。

通过离心分离除去非滤液中生成的沉淀，将该上清液的温度降低至5℃，用0.5N盐酸调节pH至2.0后，通过离心分离除去生成的蛋白质等沉淀，迅速用1N氢氧化钠将得到的上清液的pH调节至8.0。

其次，用装有排除分子量10万的全纤维的超滤器进行超滤，用20mM氯化钠pH8.0完全取代溶剂后，再调节pH至8.0，离心分离后，进行冷冻干燥，制得约95g的硫酸化多糖。(3)用装有直径1mm筛网的切磨机粉碎干燥的Kjellmaniellacrassifolia 2Kg，将得到的海带碎片悬浊于20升的80％乙醇中，在25℃下搅拌3小时，用滤纸过滤后，充分洗涤残渣。将得到的残渣悬浊于含有30ml上述参考例2-(1)制得的内切型硫酸化多糖分解酶、10％乙醇、100mM氯化钠、50mM氯化钙以及50mM咪唑的20升缓冲液(pH8.2)中，在25℃下搅拌48小时。用网眼的直径为32μm的不锈钢金属网过滤该悬浊液，用含有50mM氯化钙的10％乙醇洗涤残渣。再将该残渣悬浊于10升含有50mM氯化钙的10％乙醇中，搅拌3小时后，用不锈钢金属网过滤，洗涤。再将该残渣在同样的条件下悬浊后，搅拌16小时，用直径32μm的不锈钢金属网过滤，洗涤。

收集这样得到的滤液和洗涤液，用装有排除分子量3000的全纤维的超滤器进行超滤，分离成滤液和非滤液。

用旋转式汽化器将该滤液浓缩至约3升后，离心分离得到上清液。用装有排除分子量300的膜的电透析器将得到的上清液脱盐后，向该溶液中添加醋酸钙达到0.1M，离心分离除去生成的沉淀。将该上清液装入预先用50mM醋酸钙平衡后的DEAE-Cellulofine(树脂量4升)，用50mM醋酸钙和50mM氯化钠充分洗涤后，按50mM～800mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。这时的收集量按每1级分500ml进行。用醋酸纤维素膜电泳法〔Analytical Biochemistry，第37卷，第197～202页(1970)〕分析收集的级分，用氯化钠浓度为约0.4M洗脱的硫酸化糖(级分序号63附近)是均一的。

然后，首先将级分序号63的溶液浓缩至150ml后，添加氯化钠使浓度达到4M，装入预先用4M氯化钠平衡后的Phenyl-Cellulofine(树脂量200ml)，用4M氯化钠充分洗涤。收集非吸附性的硫酸化糖级分，用装有排除分子量300的膜的电透析器脱盐，得到脱盐液505ml。

将得到的脱盐液中40ml装入用含有10％乙醇的0.2M氯化钠平衡后的Cellulofine GCL-90柱(4.1cm×87cm)中，进行凝胶过滤。收集按每1级分9.2ml进行。

按照酚硫酸法〔Analytical Chemistry，第28卷，第350页(1956)〕对总级分进行总糖量的分析。

结果，由于硫酸化糖形成了1个峰，收集其峰的中央部分，即级分序号63～70，用装有排除分子量300的膜的电透析器脱盐后，冷冻干燥，得到112mg下述式V表示的化合物的干燥品。参考例3(1)用装有孔径1mm筛网的切磨机(增幸产业社制)粉碎干燥Kjellmaniella crassifolia 2Kg，在20升的80％乙醇中25℃下搅拌3小时后过滤，洗涤。将得到的残渣悬浊于含有50mM氯化钙、100mM氯化钠、10％乙醇以及参考例2-(1)制得的交替单胞菌属(Alteromonas sp.)SN-1009(FERM BP-5747)内切型硫酸化多糖分解酶(F-岩藻依聚糖特异分解酶)1U的20升30mM咪唑缓冲液(pH8.2)中，在25℃下搅拌2天，其次用孔径32μm的不锈钢金属网过滤，洗涤。将得到的残渣悬浊于含有100mM氯化钠、10％乙醇以及4g海藻酸裂合酶(Nagase生化学工业制)的40升磷酸钠缓冲液(pH6.6)，在25℃搅拌4天后，离心分离得到上清液。为了除去所得上清液中含有的海藻酸的低分子化物，用装有排除分子量10万的全纤维的超滤器浓缩至2升后，用含有10％乙醇的100mM氯化钠进行溶液更换。向该溶液中添加等量的400mM醋酸钙搅拌后，离心分离，将得到的上清液用冰冷却，同时用1N盐酸调节至pH2。通过离心分离除去生成的沉淀，用1N氢氧化钠将得到的上清液调节至pH8.0。通过超滤将该溶液浓缩至1升后，用100mM的氯化钠进行溶液交换。通过离心分离除去这时产生的沉淀。为了除去得到的上清液中的疏水性物质，向上清液中加入氯化钠达到1M，装入用1M氯化钠平衡后的3升Phenyl-Cellulofine柱(生化学工业制)，收集流出的级分。通过超滤器将该级分浓缩后，用20mM的氯化钠进行溶液交换，冷冻干燥。冷冻干燥物的重量为29.3g。(2)将上述冷冻干燥物15g溶解于含有400mM氯化钠以及培养国际公开第97/26896号说明书记载的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)SA-0082(FERM BP-5402)与参考例2-(1)同样由该培养物得到的内切型硫酸化多糖分解酶(U-岩藻依聚糖特异分解酶)9U的1.5升50mM Tris-盐酸缓冲液，在25℃下反应6天后，用蒸发器浓缩至约300ml。将浓缩液加入到排除分子量3500的透析管中彻底透析，将残留在透析管内的液体装入用50mM氯化钠平衡后的4升DEAE-Cellulofine A-800中，用50mM氯化钠充分洗涤后，按照50～650mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。再用650mM的氯化钠充分洗脱同一柱。收集洗脱级分中用650mM氯化钠洗脱出的级分作为硫酸化岩藻半乳聚糖级分，用排除分子量10万的超滤器浓缩后，用10mM的氯化钠更换溶液，冷冻干燥得到硫酸化岩藻半乳聚糖的冷冻干燥物0.85g。得到的硫酸化岩藻半乳聚糖(G-岩藻依聚糖)含有半乳糖和岩藻糖作为构成糖，其摩尔比为约2∶1。参考例4

用装有孔径1mm筛网的切磨机粉碎市售的裙带菜(Undariapinnatifida)干燥物1Kg后，悬浊于10升的80％乙醇中，搅拌3小时后，用滤纸过滤，得到残渣。将残渣悬浊于含有50mM氯化钠的40mM磷酸缓冲液(pH6.5)20升中，在95℃下处理2小时。将处理液冷却至37℃后，添加乙醇达到10％，添加市售的海藻酸裂合酶K(Nagase生化学工业社制)12000U后，在室温下搅拌24小时。离心分离得到的处理液，用装有排除分子量10万的全纤维的超滤器将该上清液浓缩至2升后，通过离心分离除去生成的沉淀。将得到的上清液冷却至5℃后，添加0.5N盐酸调节pH至2.0后，搅拌30分钟，通过离心分离除去生成的沉淀。用0.5N氢氧化钠将上清液的pH调节至8.0，通过超滤将溶液更换为20mM的氯化钠。将溶液的pH调节至8.0后，将离心分离得到的上清液冷冻干燥，得到90.5g源于裙带菜的岩藻依聚糖。参考例5

参考例5

将粉碎的墨角藻(Fucus vesiculosus)干燥物1Kg悬浊于10升的80％乙醇中，搅拌3小时后，用滤纸过滤，得到残渣。将残渣悬浊于含有100mM氯化钠的30mM磷酸缓冲液(pH6.0)30升中，在95℃下处理2小时。将处理液冷却至37℃后，添加100g活性炭，搅拌30分钟。添加市售的海藻酸裂合酶K3000U后，添加乙醇至10％，在室温下搅拌24小时。离心分离得到的处理液，用装有排除分子量10万的全纤维的超滤器将该上清液浓缩至2升后，通过离心分离除去生成的沉淀。向该上清液中加入提取液，同时进行超滤，除去色素。将得到的非滤液冷却至5℃后，添加0.5N盐酸调节pH至2.0后，搅拌30分钟，通过离心分离除去生成的沉淀。用0.5N氢氧化钠将上清液的pH调节至8.0，通过超滤将溶液更换为20mM氯化钠。将溶液的pH调节至8.0后，将离心分离得到的上清液冷冻干燥，得到71g源于墨角藻的岩藻依聚糖。参考例6

将按照参考例1-(1)记载的方法制得的源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖2g溶解于100ml水中，用枸橼酸将其pH调节至pH3后，在100℃下处理3小时，制得该岩藻依聚糖的酸分解产物。通过采用Cellulofine GCL-300或Cellulofine GCL-25的凝胶过滤对该酸分解产物进行分子量分级，分级得到分子量大于25000(A级分)、25000～大于10000(B级分)、10000～大于5000(C级分)、5000～大于2000(D级分)、2000～大于500(E级分)、500以下(F级分)。然后，分别将这些级分和酸分解产物脱盐后进行冷冻干燥，制得酸分解产物的各级分和酸分解产物。参考例7

将刺参5kg解剖，除去内脏，收集体壁。每200g体壁湿重量加入500ml丙酮，用匀浆机处理后过滤，用丙酮洗涤残渣直到没有更多的着色物质。将该残渣抽滤干燥，得到140g干燥物。向该干燥物中加入0.4M食盐水2.8升，在100℃下处理1小时后，过滤。用0.4M食盐水充分洗涤残渣，得到提取液3.7升。向该提取液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓直到没有沉淀生成，通过离心分离收集生成的沉淀。将该沉淀悬浊于0.4M食盐水后再次离心分离，向得到的沉淀中添加1升4M食盐水，用匀浆机处理后，搅拌的同时添加4升乙醇，搅拌1小时后，过滤，得到沉淀。对于该沉淀，反复进行悬浊于80％乙醇中然后过滤的操作，直到上清液在260nm处的吸光度达到0为止。将得到的沉淀残渣与2升2M食盐水中，通过离心分离除去不溶物。用装有排除分子量3万的膜的超滤装置对上清液进行超滤，完全脱盐后，冷冻干燥，得到3.7g源于刺参的岩藻依聚糖。参考例8

将市售的盐腌冲绳海蕴(Cladosiphon okamuranus)625g悬浊于4375ml的30mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)中，用匀浆机以8000转/分钟处理5分钟后，在95℃下处理1小时，离心分离得到上清液。向得到的上清液中加入10g活性炭后，搅拌30分钟，离心分离得到上清液。用装有排除分子量10万的全纤维的超滤器将得到的上清液浓缩至2升后，用20mM氯化钠更换溶液，冷冻干燥，得到10.9g源于冲绳海蕴的岩藻依聚糖级分的干燥物。

实施例1

将RAW264.7细胞(ATCC TIB 71)悬浊于含有10％胎牛血清(Gibco公司制)、不含酚红、含有2mM L-谷氨酰胺(Life TechnologiesOriental公司制，25030-149)的Dulbecco改良Eagle培养基(BioWhittaker公司制，12-917F)中达到6×10⁵细胞/ml，向48孔微板的孔中分别加入500μl，在5％二氧化碳气体存在下，在37℃培养12小时或24小时。向各孔中添加下述试样的各水溶液，培养上述规定时间后，测定一氧化氮(NO)在培养基中氧化生成的NO₂ ^-浓度。作为试样使用的参考例1-(2)记载的源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖的I级分、II级分和III级分、参考例2-(3)记载的式V表示的化合物(以下称为7-12SFd-F)添加至最终浓度达到1、10、100μg/ml。另外，对照组添加与试样等量的灭菌蒸馏水。另外，阳性对照组添加脂多糖(LPS，Sigma公司制)使最终浓度达到1μg/ml。

上述培养后，向100μl培养基中加入100μl的4％格里斯试剂(Sigma公司制，G4410)，室温下放置15分钟后，测定540nm处的吸光度。根据由预先按照已知浓度溶解于上述培养基中的NaNO₂制作的标准曲线计算出培养基中的NO₂ ^-浓度。测定均进行3次。

结果得知7-12SFd-F、源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的I级分、II级分和III级分均促进诱导产生NO，具有免疫激活作用。其结果如图2～图5所示。也就是说，图2是表示添加7-12SFd-F培养时培养基中NO₂ ^-浓度的图，图3是表示添加I级分培养时培养基中NO₂ ^-浓度的图，图4是表示添加II级分培养时培养基中NO₂ ^-浓度的图，图5是表示添加III级分培养时培养基中NO₂ ^-浓度的图。另外，图6是表示添加阳性对照的LPS培养时培养基中NO₂ ^-浓度的图。在图2～图6中，横轴表示培养条件，纵轴表示NO₂ ^-浓度(μM)。

根据这些结果，得知源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的I级分、II级分、III级分以及7-12SFd-F具有NO产生诱导作用以及基于该作用的免疫激活效果。

另外，各参考例记载的其它岩藻依聚糖及其分解产物也显示同样的NO产生诱导作用。

另外，使用ELISA试剂盒(Genzyme公司)对与测定NO₂ ^-浓度的培养液相同的培养液中的IFN-γ量进行测定。但是，在该系统中源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的I级分、II级分、III级分、7-12SFd-F以及其它各参考例记载的岩藻依聚糖及其分解产物均未见诱导IFN-γ产生。

实施例2(1)来自非刺激淋巴细胞的IFN-γ产生诱导作用

由日本SLC购入ICR小鼠(雌性，7周龄，体重约25g)，预饲养1周后，用于实验。由小鼠摘出脾脏，细粉碎后，悬浊于含有10％胎牛血清(Hiclone公司)的RPMI-1640培养基(Gibco公司)中，得到单细胞液。使粘连性细胞粘附在塑料陪替氏培养皿上除去，以非粘连性细胞作为脾脏淋巴细胞使用。将脾脏淋巴细胞悬浊于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，调节至2×10⁶细胞/ml，按180μl/孔接种在96孔微板上。将各试样溶解于蒸馏水，调节至100mg/ml的浓度，用培养基稀释至显示量的10倍浓度。对照组添加与试样等量的培养基，向对照组以外的各孔中添加各种浓度(10～50μg/ml)的参考例记载的各种岩藻依聚糖、Kjellmaniellacrassifolia岩藻依聚糖的I级分、II级分、III级分、7-12SFd-F或100μg/ml的刀豆球蛋白A(Con A，Nakalaitesque公司)溶液20μg/ml，在37℃、5％二氧化碳培养器中培养2天或4天。培养后，回收培养上清液，使用ELISA试剂盒(Genzyme公司)测定IFN-γ量。

结果，参考例记载的各种岩藻依聚糖、源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖的I级分、II级分、III级分、7-12SFd-F确认采用500μg/ml以下的用量时没有来自非刺激淋巴细胞的IFN-γ产生诱导作用。另一方面，添加Con A的细胞确认有较强的IFN-γ产生诱导。(2)同种异源抗原刺激下的IFN-γ产生诱导作用

由日本SLC购入BALB/c小鼠(雌性，6周龄，体重约20g)、C57BL/6小鼠(雌性，6周龄，体重约20g)，预饲养1周后，用于实验。由H-2单元型不同的小鼠(BALB/c：H-2d、C57BL/6：H-2b)摘出脾脏，通过上述方法得到脾脏淋巴细胞。将各细胞浮游液的细胞浓度调节至2×10⁶细胞/ml，分别在96孔微板上接种100μl。在该对照组以外的各孔中与实施例2-(1)同样添加各种浓度(10～500μg/ml)的参考例记载的各种岩藻依聚糖、源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖的I级分、II级分、III级分、7-12SFd-F或10μg/ml的ConA。另外，对照组添加与试样等量的培养基。将其在37℃、5％二氧化碳培养器中培养4天。培养后，回收培养上清液，使用ELISA试剂盒测定IFN-γ量。

结果，参考例记载的各种岩藻依聚糖、源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖的I级分、II级分、III级分、7-12SFd-F确认采用500μg/ml以下的用量时对同种异源抗原刺激状态的淋巴细胞没有IFN-γ产生诱导作用。另一方面，添加Con A的细胞确认有较强的IFN-γ产生诱导。(3)致敏淋巴细胞的抗原刺激下的IFN-γ产生诱导作用

由日本SLC购入C57BL/6小鼠(雌性，6周龄，体重约20g)，预饲养1周后，用于实验。将1×10⁶细胞的Meth-A小鼠肉瘤细胞接种在小鼠的腹腔内，进行免疫。肿瘤接种14天后摘出脾脏，通过上述方法得到脾脏淋巴细胞。将细胞浮游液的细胞浓度调节至2×10⁶细胞/ml，分别在96孔微板上接种100μl。为了制备刺激细胞，向悬浊于RPMI-1640培养基中调节至2×10⁶细胞/ml的Meth-A小鼠肉瘤细胞中以50μg/ml的浓度添加丝裂霉素C(协和发酵社制)，在37℃下处理30分钟，洗涤2次后，悬浊于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，调节至2×10⁶细胞/ml。将制得的刺激细胞续加到按100μl/孔加有脾脏淋巴细胞的板的各孔中，在37℃、5％二氧化碳培养器中培养4天。与实施例2-(1)同样配制、添加使源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖达到1～100μg/ml，使源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的I级分、II级分、III级分、7-12SFd-F分别达到10～500μg/ml，另外阳性对照使ConA达到10μg/ml，同样进行培养。另外，对照组添加与试样等量的培养基。培养后，回收培养上清液，用ELISA试剂盒测定IFN-γ量。对于同一培养上清液，使用ELISA试剂盒(ENDOGEN公司)测定IL-12量。

其结果如图7和图8所示。也就是说，图7是表示岩藻依聚糖及其分解产物的IFN-γ产生诱导作用的图，图中纵轴表示IFN-γ产生量(pg/ml)，横轴表示各试样以及添加量(μg/ml)。

另外，图8是表示岩藻依聚糖及其分解产物的IL-12产生诱导作用的图，图中纵轴表示IL-12产生量(pg/ml)，横轴表示各试样以及添加量(μg/ml)。

如图7、图8所示，在致敏淋巴细胞的抗原刺激下，源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖按1～100μg/ml的用量，I级分、II级分、III级分和7-12SFd-F按10～500μg/ml的用量显示用量依存的IFN-γ和IL-12产生增强作用。另外，其它各参考例记载的岩藻依聚糖及其分解产物也显示同样的作用。

实施例3

由日本SLC购入C57BL/6小鼠(雌性，7周龄，体重约20g)，预饲养1周后，用于实验。由小鼠摘出脾脏，细粉碎后，悬浊于含有10％胎牛血清(Hiclone公司)的RPMI-1640培养基(Bio Whittake公司)中，得到单细胞液。将脾脏淋巴细胞悬浊于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，调节至3×10⁶细胞/ml，向T25烧瓶(Iwaki公司)中加入10ml。分别准备2个同样的烧瓶，一个仅添加培养基，另一个还添加源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖使之达到10μg/ml，在37℃、5％CO₂存在下培养。

从开始培养10天后回收细胞，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释到规定浓度，向96孔圆底微板中分别注入100μl。

关于细胞的细胞毒性，以⁵¹Cr标记的EL4胸腺肿瘤细胞(以下称为EL4细胞)作为靶细胞，测定游离到培养上清液中的γ射线量。也就是说，向EL4细胞中加入铬-51放射性核素(Chromium-51Radionuclide)(New England Nuclear公司)1850kBq，在37℃下培养1小时，通过离心分离用RPMI-1640培养基洗涤3次。将该细胞悬浊于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，调节至1×10⁵细胞/ml。在上述96孔圆底微板中分别注入100μl，在37℃、5％CO₂存在下培养5小时，采集上清液100μl后，用γ射线闪烁计数器测定游离的γ射线量。如下所示计算出细胞毒性。

细胞毒性(％)＝〔(实验值-对照值)/(总放射活性值-对照值)〕×100

这里，总放射活性值表示使用0.1％Triton-X 100μl代替培养脾细胞时的γ射线量。另外，对照值表示用培养基100μl代替培养脾细胞时的γ射线量，实验值表示使用培养脾细胞时的γ射线量。

其结果如图9所示。也就是说，图9是表示源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖对小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒性免疫增强作用的图，纵轴表示细胞毒性(％)，横轴表示对照的效应细胞和添加参考例1记载的源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖达到10μg/ml进行培养得到的效应细胞(E)与靶细胞(T)的比(E/T比)。条形图表示每组5只的平均值和标准误差。

如图9所示，小鼠的培养脾细胞(效应细胞)对EL4细胞(靶细胞)显示细胞毒性(对照)。加入岩藻依聚糖达到10μg/ml进行培养得到的细胞对EL4细胞的细胞毒性增强，岩藻依聚糖添加组尽管效应细胞和靶细胞的比低，仍显示高细胞毒性，因而岩藻依聚糖增强了细胞毒性免疫。

另外，参考例记载的其它各种岩藻依聚糖、其分解产物、I级分、II级分、III级分以及7-12SFd-F也显示同样的活性。

实施例4(1)来自非刺激淋巴细胞的IFN-γ产生诱导作用

由日本SLC购入C57BL/6小鼠(雌性，6周龄，体重约20g)，预饲养1周后，用于实验。向接种了按上述方法制得的脾脏淋巴细胞的微板各孔中添加参考例3-(2)制得的G-岩藻依聚糖达到10～500μg/ml，在37℃、5％二氧化碳培养器中培养4天。培养后，回收培养上清液，使用ELISA试剂盒测定IFN-γ量。

其结果，确认在所讨论的用量下没有G-岩藻依聚糖产生的IFN-γ产生诱导作用。(2)致敏淋巴细胞的抗原刺激下的IFN-γ产生诱导作用

由日本SLC购入C57BL/6小鼠(雌性，6周龄，体重约20g)，预饲养1周后，用于实验。作为试样，将参考例3-(2)制得的G-岩藻依聚糖溶解于蒸馏水，配制成100mg/ml，用培养基稀释至显示量的10倍浓度。向接种了按照上述方法制得的脾脏淋巴细胞以及Meth-A小鼠肉瘤细胞的微板各孔中添加G-岩藻依聚糖，使最终浓度达到10～500μg/ml，在37℃、5％二氧化碳培养器中培养4天。另外，对照组添加与试样等量的培养基，进行培养。培养后，回收培养上清液，用ELISA试剂盒测定IFN-γ量和IL-12量。

其结果如图10和图11所示。也就是说，图10是表示G-岩藻依聚糖的IFN-γ产生诱导作用的图，图中纵轴表示IFN-γ产生量(pg/ml)，横轴表示试样以及添加量(μg/ml)。另外，图11是表示G-岩藻依聚糖的IL-12产生诱导作用的图，图中纵轴表示IL-12产生量(pg/ml)，横轴表示试样以及添加量(μg/ml)。如图10、图11所示，在致敏淋巴细胞的抗原刺激下，G-岩藻依聚糖按10～500μg/ml的用量具有用量依存的IFN-γ产生增强作用。对于IL-12也确认按500μg/ml的用量具有显著的产生增强作用。

实施例5

抗IL-12抗体和抗副刺激受体(CD28、CD40)抗体对源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的IFN-γ产生诱导作用的作用

混合按照上述方法制得的源于C57BL/6小鼠的脾脏淋巴细胞以及Meth-A小鼠肉瘤细胞，接种在96孔微板上，向所有孔中添加终浓度100μg/ml的参考例1-(1)制得的源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖。而且，向对照组以外的孔中添加终浓度1μg/m l的抗IL-12抗体(R&D公司)或者终浓度10μg/ml的抗CD28抗体或抗CD40抗体，在37℃、5％二氧化碳培养器中培养4天。培养后，回收培养上清液，用ELISA测定IFN-γ量以及IL-12量。其结果如图12所示。也就是说，图12表示各种抗体对岩藻依聚糖的IFN-γ或IL-12产生诱导作用的作用，图中左纵轴表示IFN-γ产生量(pg/ml)，右纵轴表示IL-12产生量(pg/ml)，横轴表示使用的各种抗体。

如图12所示，抗原呈递反应时源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖引起的IL-12的产生诱导被抗IL-12抗体、抗CD28抗体或抗CD40抗体完全抑制。另一方面，来自致敏淋巴细胞的IFN-γ产生诱导被抗IL-12抗体抑制约50％，被抗CD28抗体或抗CD40抗体完全抑制。

实施例6

各种岩藻依聚糖的IFN-γ产生诱导作用的比较

给C57BL/6小鼠接种Meth-A小鼠肉瘤细胞进行免疫，接种24天后摘出脾脏。混合按照上述方法制得的源于C57BL/6小鼠的脾脏淋巴细胞以及Meth-A小鼠肉瘤细胞，接种在96孔微板上。作为试样，使用参考例1制得的源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖、参考例8制得的源于冲绳海蕴的岩藻依聚糖、参考例5制得的源于墨角藻的岩藻依聚糖和参考例4制得的源于裙带菜的岩藻依聚糖，与实施例2-(1)同样进行配制、添加，使各种岩藻依聚糖的最终浓度达到10～500μg/ml，在37℃、5％二氧化碳培养器中培养4天。另外，对照组添加与试样等量的培养基，进行培养。培养后，回收培养上清液，用ELISA试剂盒测定IFN-γ量。

其结果如图13所示。也就是说，图13是表示各种岩藻依聚糖的IFN-γ产生诱导作用的图，图中纵轴表示IFN-γ生产量(pg/ml)，横轴表示各试样和添加量(μg/ml)。

如图13所示，关于致敏淋巴细胞的抗原刺激下的IFN-γ产生诱导能力，确认源于Kjellmaniella crassifolia与墨角藻的岩藻依聚糖具有同等的IFN-γ产生诱导作用，冲绳海蕴、裙带菜具有较弱的IFN-γ产生诱导作用。

实施例7

对每组4或5只的5周龄Wistar系雄性大鼠(日本SLC社)腹腔给予蛋清蛋白(Sigma公司)的0.01％生理盐水溶液100μl以及明矾(商品名：Imject Alum，Pierce公司)100μl，致敏，14天后由腹腔静脉采集血液。

采集的血液离心分离(2000rpm，5分钟)后，分离血浆，通过使用大鼠的被动皮肤过敏症(PCA)反应测定抗原特异性IgE量。也就是说，使用生理盐水制备血浆的2倍至64倍梯度稀释系列，分别给剔毛后的7周龄Wistar系雄性大鼠的背部真皮内注射0.1ml。真皮内注射48小时后，由尾静脉注射0.05％蛋清蛋白和0.5％伊凡斯蓝(Nakalaitesque公司制)的混合溶液1ml。尾静脉注射30分钟后，断头、放血处死大鼠，观察背部出现的青色斑点，以直径为5mm以上的斑点为阳性，IgE效价用最高稀释倍数表示。

参考例1-(1)制得的源于Kjellmaniell acrassifolia的岩藻依聚糖的给药组从抗原致敏日7天前至采血日将0.1％或1％的源于Kjellmaniell acrassifolia的岩藻依聚糖装入给水瓶中，使之自由摄取。另外，对照组同样给予自来水。结果，通过饮水摄取1％源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖显著抑制蛋清蛋白致敏引起的抗原特异性IgE量上升。其结果如表1所示。

表1

动物No. IgE抗体效价对照 1 8

2 64

3 16

4 16

5 32源于Kjellmaniella 1 8Crassifolia的

2 32岩藻依聚糖0.1％

3 32

4 32源于Kjellmaniella 1 ＜2Crassifolia的

2 ＜2岩藻依聚糖1％

3 ＜2

4 4

5 8

实施例8

对于按照与实施例7同样的方法致敏的大鼠，在初次致敏19天后在相同条件下追加免疫，最终免疫14天后由腹腔静脉采集血液。采集的血液与上述同样通过PCA反应测定抗原特异性IgE量。

参考例1-(1)制得的源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖的给药组从追加免疫日至采血日将0.1％或1％的源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖装入给水瓶中，使之自由摄取。另外，对照组同样给予自来水。结果，通过饮水摄取1％源于Kjellmaniella crassifolia的岩藻依聚糖显著抑制蛋清蛋白引起的抗原特异性IgE量上升。由此表明岩藻依聚糖除了预防性给予，即使从抗原致敏时治疗性给予，也是有效的。其结果如表2所示。

表2

动物No. IgE抗体效价对照 1 8

2 32

3 32

4 32

5 32源于Kjellmaniella 1 16Crassifolia的

2 16岩藻依聚糖0.1％

3 32

4 32源于Kjellmaniella 1 2Crassifolia的

2 2岩藻依聚糖1％

3 2

4 4

5 2实施例9(1)配合原料，使1.5g中含有作为岩藻依聚糖的源于Kjellmaniellacrassifolia的岩藻依聚糖20mg，作为多元酚的市售苹果提取物(商品名：Applephenon，Nikka Whisky(株)制)、葡萄籽提取物(商品名：Gravinol，KIKKOMAN(株)制)、甜茶提取物(商品名：Sunten-chaS，SUNTORY(株)制)合计82mg，其余为牛肉提取物(大日本制药(株)制)、啤酒酵母(KIRIN啤酒(株)制)、乳糖、玉米淀粉(加藤化学(株)制)、还原麦芽糖(东和化成工业(株)制)，使用挤出造粒机制造本发明的饲料添加物(直径1mm)，一包为1.5g。(2)大型犬(体重约30kg)的场合1日3包，中型犬(体重约10kg)的场合1日2包，小型犬(体重约5kg)的场合1日1包，分别在饲料中添加上述饲料添加剂作为营养辅助食品。

通过摄取本发明的饲料添加剂，大型犬、中型犬、小型犬均变得活跃，食欲也增加了。另外，基于身体状况的改善效果，毛色得以改善，体臭、粪尿的臭味减轻。特别是对于老犬可明显见到这些效果，本发明的饲料对于改善老犬的身体状况、恢复健康、恢复青春是非常有用的。保藏的生物材料

(1)保藏机构的名称

通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所

日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305-8566)

(2)保藏的微生物

(i)交替单胞菌属(Alteromonas sp.)SN-1009

原保藏日：平成8年2月13日

移送至国际保藏的请求日：平成8年11月15日

保藏号： FERM BP-5747

(ii)黄杆菌属(Flavobacterium sp.)SA-0082

原保藏日：平成7年3月29日

移送至国际保藏的请求日：平成8年2月15日

保藏号： FERM BP-5402工业实用性

按照本发明提供一种含有显示细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用和抗变态反应作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的对需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病以及变应性疾病有效的药物。该药物具有调节生物体内白介素类、干扰素类等生成的活性，作为癌、免疫性疾病等必须调节细胞因子生成的疾病的治疗剂或预防剂有用。

另外，特别是作为需要使用这些药物作为IFN-γ产生调节剂、IL-2产生调节剂、NO产生诱导剂的疾病的治疗剂有用。

有时不必要状态下的免疫系统活化或增强会引起变态反应、自身免疫疾病等疾病，但本发明制剂引起的细胞因子增强、免疫增强是选择性的，仅仅在病毒感染或癌等体内存在应排除的抗原且必需增强细胞性免疫时作用，因而本发明的制剂对于生物防御非常有用。

另外，本发明的制剂能抑制过剩的体液性免疫活化，本发明的制剂对于抑制变态反应也非常有用。

而且，能够使用具有细胞因子生成调节作用、一氧化氮产生诱导作用和抗变态反应作用的岩藻依聚糖和/或其分解产物制备饮食品或饲料，通过作为日常的饮食品摄取，能够改善需要调节细胞因子生成的疾病、如动脉硬化等需要产生一氧化氮的疾病、变应性疾病等的症状等。

因此，以岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分的功能性饮食品或饲料由于这些生理作用，是对于维持生物的体内平衡有用的功能性饮食品或饲料。

另外，还提供一种细胞因子生成调节剂，该调节剂对于研究细胞因子类的功能、筛选与细胞因子有关的疾病用药物是有用的。

Claims

1.一种需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的治疗剂或预防剂，其特征在于，含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分。

2.如权利要求1所述的治疗剂或预防剂，岩藻依聚糖源于藻类或源于棘皮动物。

3.如权利要求1或2所述的治疗剂或预防剂，细胞因子为白介素类或干扰素类。

4.如权利要求3所述的治疗剂或预防剂，干扰素类为干扰素-γ。

5.如权利要求3所述的治疗剂或预防剂，白介素类为白介素-12。

6.如权利要求1或2所述的治疗剂或预防剂，变应性疾病为需要抑制IgE产生的疾病。

7.如权利要求1～6中任意一项所述的治疗剂或预防剂，为口服用治疗剂或口服用预防剂。

8.一种调节细胞因子生成用食品、饮料或饲料、诱导一氧化氮产生用食品、饮料或饲料或者抗变态反应用食品、饮料或饲料，是含有岩藻依聚糖和/或其分解产物的调节细胞因子生成用、诱导一氧化氮产生用或者抗变态反应用食品、饮料或饲料。

9.如权利要求8所述的食品、饮料或饲料，岩藻依聚糖源于藻类或源于棘皮动物。

10.如权利要求8或9所述的食品、饮料或饲料，细胞因子为白介素类或干扰素类。

11.如权利要求10所述的食品、饮料或饲料，干扰素类为干扰素-γ。

12.如权利要求10所述的食品、饮料或饲料，白介素类为白介素-12。

13.如权利要求8或9所述的食品、饮料或饲料，抗变态反应用食品、饮料或饲料为抑制IgE产生用食品、饮料或饲料。

14.岩藻依聚糖和/或其分解产物在治疗或预防需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病中的用途。

15.岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的治疗剂或预防剂中的用途。

16.一种治疗或预防需要调节细胞因子生成的疾病、需要产生一氧化氮的疾病或变应性疾病的方法，使用岩藻依聚糖和/或其分解产物。

17.一种细胞因子生成调节剂、一氧化氮产生诱导剂、抗变态反应剂或IgE产生抑制剂，含有岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分。

18.岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备细胞因子生成调节剂、一氧化氮产生诱导剂、抗变态反应剂或IgE产生抑制剂中的用途。

19.岩藻依聚糖和/或其分解产物在制备调节细胞因子生成用食品、饮料或饲料、诱导一氧化氮产生用食品、饮料或饲料或者抗变态反应用食品、饮料或饲料中的用途。

20.一种细胞因子生成调节方法、一氧化氮产生诱导方法、变态反应抑制方法或IgE产生抑制方法，使用岩藻依聚糖和/或其分解产物作为有效成分。

21.岩藻依聚糖和/或其分解产物在调节细胞因子生成、诱导一氧化氮产生、抑制变态反应或抑制IgE产生中的用途。