EA002021B1 - Фукоидансодержащие пищевые продукты, в частности, вызывающие апоптоз - Google Patents

Фукоидансодержащие пищевые продукты, в частности, вызывающие апоптоз Download PDF

Info

Publication number
EA002021B1
EA002021B1 EA199900017A EA199900017A EA002021B1 EA 002021 B1 EA002021 B1 EA 002021B1 EA 199900017 A EA199900017 A EA 199900017A EA 199900017 A EA199900017 A EA 199900017A EA 002021 B1 EA002021 B1 EA 002021B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fucoidan
food product
product according
food
apoptosis
Prior art date
Application number
EA199900017A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199900017A1 (ru
Inventor
Есихиса Умеда
Хироси Кихара
Катсусиге Икаи
Икуносин Като
Original Assignee
Такара Сузо Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26494325&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA002021(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Такара Сузо Ко., Лтд. filed Critical Такара Сузо Ко., Лтд.
Publication of EA199900017A1 publication Critical patent/EA199900017A1/ru
Publication of EA002021B1 publication Critical patent/EA002021B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G3/00—Sweetmeats; Confectionery; Marzipan; Coated or filled products
    • A23G3/34—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof
    • A23G3/36—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G3/42—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by the carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/14—Organic oxygen compounds
    • A21D2/18—Carbohydrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23F—COFFEE; TEA; THEIR SUBSTITUTES; MANUFACTURE, PREPARATION, OR INFUSION THEREOF
    • A23F3/00—Tea; Tea substitutes; Preparations thereof
    • A23F3/40—Tea flavour; Tea oil; Flavouring of tea or tea extract
    • A23F3/405—Flavouring with flavours other than natural tea flavour or tea oil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A23L13/42—Additives other than enzymes or microorganisms in meat products or meat meals
    • A23L13/426—Addition of proteins, carbohydrates or fibrous material from vegetable origin other than sugars or sugar alcohols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L21/00—Marmalades, jams, jellies or the like; Products from apiculture; Preparation or treatment thereof
    • A23L21/10—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products
    • A23L21/15—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products derived from fruit or vegetable juices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
    • A23L29/256—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin from seaweeds, e.g. alginates, agar or carrageenan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/109—Types of pasta, e.g. macaroni or noodles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
    • C07H5/08—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to sulfur, selenium or tellurium
    • C07H5/10—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to sulfur, selenium or tellurium to sulfur

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Tea And Coffee (AREA)

Abstract

Изобретение касается фукоидансодержащего пищевого продукта, из которого частично или полностью извлечены альгины, полученного из фукоидансодержащего вещества посредством экстрагирования указанного фукоидансодержащего вещества в присутствии соли кальция, а также фукоидансодержащего пищевого продукта, из которого частично или полностью извлечены альгины, полученного из фукоидансодержащего вещества посредством экстрагирования указанного фукоидансодержащего вещества щелочным раствором с последующим подкислением экстракта. Изобретение также касается пищевого продукта, вызывающего апоптоз, представляющего собой фукоидансодержащий продукт по изобретению, содержащий фукоидан в количестве, эффективном для вызывания апоптоза. Пищевые продукты по изобретению охватывают также напитки.

Description

Настоящее изобретение относится к фукоидансодержащим пищевым продуктам, и в частности, к подобным пищевым продуктам, вызывающим апоптоз.
Фукоидан представляет собой полисахарид, содержащий сульфатированную фукозу. Этот полисахарид имеется в морских водорослях, трепангах и т.п. До настоящего времени не были известны попытки уделить внимание фукоидану и его полезному применению в пищевых продуктах и напитках.
Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить фукоидансодержащие материалы и содержащие их пищевые продукты и напитки, обладающие физиологической активностью, полезные для здоровья и имеющие превосходный вкус.
Существо настоящего изобретения кратко изложено ниже.
Так, первый объект настоящего изобретения относится к пищевому продукту или напитку, содержащему фукоидан, полученный из фукоидансодержащих веществ.
Другой объект изобретения относится к пищевому продукту или напитку, содержащему фукоидан, причем альгины, происходящие от фукоидансодержащих веществ, имеют пониженное содержание или они удалены.
Третий объект настоящего изобретения относится к индуцирующему апоптоз (арорфδίδ) пищевому продукту или напитку, содержащему фукоидан, полученный из фукоидансодержащих веществ, в количестве, эффективном для индуцирования апоптоза.
Четвертый объект касается индуцирующего апоптоз пищевого продукта или напитка, содержащего фукоидан в количестве, эффективном для индуцирования апоптоза, в котором альгины, происходящие от фукоидансодержащих веществ, имеют пониженное содержание или они удалены.
Термин альгины, используемый в настоящем описании, относится к альгиновой кислоте, ее солям и эфирам, а также их модифицированным продуктам.
На сопровождающих иллюстрациях фиг. 1 показывает скорости образования осадка для фукоида-на-И и фукоидана-Т;
фиг. 2 показывает индуцирующее апоптоз действие экстракта (0,2 мг/мл), полученного из морских водорослей;
фиг. 3 показывает индуцирующее апоптоз действие экстракта (0,5 мг/мл), полученного из морских водорослей;
фиг. 4 показывает индуцирующее апоптоз действие экстракта (1 мг/мл), полученного из морских водорослей;
фиг. 5 показывает индуцирующее апоптоз действие фукоидана-И и фукоидана-Т.
Настоящее изобретение более подробно пояснено ниже.
Фукоидан может быть получен из морских водорослей, трепангов, и т.п., и по настоящему изобретению может быть использован полученный таким образом фукоидан. Использование морских водорослей и трепангов, содержащих большие количества фукоидана, является по изобретению наиболее предпочтительным.
Примерами фукоидана по изобретению являются фукоидан в очищенном виде и/или фукоидансодержащие вещества.
Примерами фукоидансодержащих веществ являются фукоидансодержащие экстракты.
Фукоидансодержащие экстракты включают экстракт из неочищенного материала, полученного из фукоидансодержащих веществ, и продукт, полученный обработкой указанного экстракта, причем предпочтителен экстракт с высоким содержанием фукоидана.
Примерами указанного фукоидансодержащего экстракта, такого как экстракт морских водорослей, являются экстракты, полученные экстрагированием морских водорослей в присутствии соли кальция. В качестве соли кальция может быть использован, например, хлористый кальций.
Примерами указанного экстракта морских водорослей являются растворимые вещества, которые получены экстрагированием морских водорослей щелочным раствором с последующим добавлением соли кальция к экстракту. В качестве щелочного раствора может быть использован, например, раствор карбоната натрия, тогда как, например, хлористый кальций может быть использован в качестве соли кальция.
Примерами указанных экстрактов морских водорослей являются растворимые вещества, которые получены экстрагированием морских водорослей щелочным раствором с последующим подкислением полученного экстракта. В качестве щелочного раствора может быть использован, например, раствор карбоната натрия.
Температура и время экстракции сырьевых материалов из фукоидинсодержащих веществ могут находиться в интервале 40-200°С и 1-360 мин, соответственно, и обычно их выбирают в интервале 50-130°С и 10-180 мин, соответственно.
Примером фукоидана, используемого по настоящему изобретению, является вещество, в котором содержание фукоидана больше, чем в водном экстракте материала, полученного из фукоидансодержащего вещества, и в котором содержание альгинов существенно снижено или они удалены. В качестве такого вещества можно предложить материал, не имеющий таких свойств, как высокая вязкость и кислотная коагуляция, обуславливаемых альгинами, и гелеобразование, вызываемое ионами многовалентных металлов, которые отрицательно влияют на качество пищевых продуктов и напитков и не оказывают влияния на физические свойства, присущие пищевым продуктам и напиткам.
В особенности для продукта, полученного обработкой экстракта морских водорослей активированным углем, селективно удаляется только запах морских водорослей, и указанный продукт наиболее предпочтителен для использования в пищепродуктах и напитках, у которых запах морских водорослей нежелателен.
Фукоидан, используемый по настоящему изобретению, может быть получен в больших количествах из съедобных фукоидансодержащих веществ, таких как съедобные морские водоросли и трепанги, и в высшей степени безопасен.
Нет особых ограничений для пищевых продуктов и напитков по настоящему изобретению, и таковыми могут быть, например, продукты переработки злаковых [такие как продукты, изготовленные из пшеничной муки, из крахмала, обработанных ртеш1х продукты, лапша, макароны, хлеб, бобовые джемы, соба (японская гречишная лапша), фу (японский пшеничный клейкий хлеб), биифун (китайские бобовые желейные палочки), харусаме (японские бобовые желейные палочки) и упакованные мочи (рисовые кексы)], продукты переработки жиров и масел [такие как жиры и масла в пластиковых упаковках, фритюрные масла, салатные масла, майонезы и заправки], продукты переработки соевых бобов [такие как тофу (соевый творог), мисо (ферментированная соевая паста) и натто (ферментированные соевые бобы)], продукты переработки мяса [такие как ветчина, бекон, прессованная ветчина и колбасы], морепродукты [такие как мороженое рыбное филе, камабоко (вареная рыбная паста), чикува (другой тип вареной рыбной пасты), ханпен (рыбные кексы), сацума-аге (жареные во фритюре рыбные шарики), цумире' (вареная рыбная паста), сужи (продукты из рыбьих мышц), рыбная ветчина, рыбные колбасы, сушеный бонито, продукты переработки рыбьей икры, консервированные морепродукты и цукудани (рыба, отваренная в соевом соусе)], молочные продукты [такие как сырое молоко, сливки, йогурт, масло, сыр, сгущенное молоко, порошковое молоко и мороженое], продукты обработки овощей и фруктов [такие как пасты, джемы, маринады, фруктовые напитки, овощные напитки и смешанные напитки], кондитерские изделия [такие как шоколад, бисквиты, булочки, кексы, мочи-гаши (рисовые круглые кексы) и рисовые крекеры], алкогольные напитки [такие как японские саке, китайские вина, виски, сочу (японские дистиллированные спирты), водка, бренди, джин, ром, пиво, алкогольные напитки для закуски, фруктовые вина и ликеры], столовые напитки [такие как зеленый чай, чай, черный китайский чай, кофе, освежающие напитки и напитки с молочной кислотой], приправы [такие как соевый соус, вустерский соус, уксус и мирин (сладкое саке)], баночные, бутылочные или пакетирован ные пищевые продукты [гиумеши (тушеное мясо с рисом), камамеши (отварной рис, помещенный в небольшие горшочкообразные контейнеры), секихан (рис, отваренный с красными бобами), приправленный ккэри рис и другие пищевые продукты быстрого приготовления], полусухие или концентрированные пищевые продукты [такие как печеночная паста и другие пасты, супы для соба или удон и концентрированные супы], сухие пищевые продукты [такие как лапша быстрого приготовления, кэрри гоих быстрого приготовления, растворимый кофе, сухие соки, сухие супы, суп мисо быстрого приготовления и пищевые продукты быстрого приготовления, напитки и супы], замороженные пищевые продукты [такие как замороженные сукиаки, чаванмуши (приготовленное в горшочке рагу), унаги-кабаяки (жареные угри), гамбургер-стейк, шао-маи (китайские паровые клецки), гийоза (жареные во фритюре клецки, фаршированные измельченной свининой, и т.д.), желе и фруктовые смеси], твердые пищевые продукты, жидкие пищевые продукты [такие как супы], специи и другие обработанные сельскохозяйственные, лесные, дикорастущие и морские продукты.
Нет особых ограничений для приготовления пищевых продуктов и напитков по настоящему изобретению, но любые способы кулинарной обработки и приготовления и любые технологические методы, которые обычно применяются, могут быть использованы для обеспечения того, чтобы полученный в результате пищевой продукт или напиток содержал фукоидан. Когда эффективное количество индуцирующего апоптоз фукоидана добавлено в пищевой продукт или напиток, можно получить индуцирующий апоптоз пищевой продукт или напиток.
В случае кулинарной обработки и приготовления, фукоидан может быть добавлен до, во время или после кулинарной обработки и приготовления. По другому варианту приготовленное блюдо или изготовленный продукт могут быть добавлены к фукоидану, так, чтобы фукоидан оказался разбавленным. При приготовлении пищевых продуктов или напитков фукоидан может быть добавлен на любой стадии, или пищевой продукт, или напиток, или продукт этих стадий может быть добавлен к фукоидану так, чтобы фукоидан оказался разбавленным и содержал пищевой продукт или напиток. Добавление может проводиться за один раз или по частям в несколько приемов. Таким образом возможно легко приготовить новый пищевой продукт или напиток или индуцирующий апоптоз пищевой продукт или напиток, имеющие индуцирующее апоптоз действие, содержащее эффективное количество фукоидана. В случае, когда используют вышеупомянутые стадии, тогда пищепродукт или напиток, в которых содержится фукоидан, добавленный к ним и/или разбавленный ими, и индуцирующий апоптоз пищепродукт или напиток, где содержится фукоидан, добавленный к ним и/или разбавленный ими, содержащие эффективное количество фукоидана, могут быть определены как пищевые продукты или напитки по настоящему изобретению.
Количество фукоидана, которое должно быть добавлено в пищевой продукт, было затем исследовано при использовании модельного напитка, как описано ниже.
Исследовательский пример 1.
Для проведения модельных испытаний напитка готовили буфер 0,01М молочной кислоты с рН 3,8 и затем в нем растворяли имеющийся в продаже сахар так, чтобы получить концентрацию сахарозы 5 вес/об.% после приготовления раствора. Использовали фукоидан II примера 1, и 0 (контроль), 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 и 200 мг вес/об. % его добавляли, в результате чего получали растворы сахарозы, содержащие фукоидан, и их подвергали органолептическому испытанию для оценки, при питье, их сладости и мягкости, ощущения при проглатывании и на сбалансированность вкуса. Использовали 20 испытателей и испытание проводили с использованием пятибалльного метода оценки (где 5 ставится за хороший показатель и 1 - за плохой). Результаты приведены в таблице 1 в виде средних значений.
Таблица 1. Органолептическое испытание модельного напитка
Количество добавленного фукоидана (мгвес''об.%) Ощущение на языке Ощущение при проглатывании Сбалансированность вкуса Общая оценка
Сладость Мягкость
0 1,2 1,4 1,6 1,5 1,4
0,1 1,6 1,7 1,7 1,6 1,6
0,5 2,0 1,9 1,8 1,7 1,8
1 2,1 2,2 2,0 1,9 2,0
5 2,5 2,6 2,7 2,8 2,6
10 3,5 3,6 3,4 3,8 3,6
20 4,0 4,2 4,1 4,5 4,2
30 4,5 4,7 4,3 4,5 4,5
40 4,6 4,7 4,3 4,6 4,6
50 4,7 4,7 4,5 4,8 4,7
100 4,3 4,6 4,6 4,8 4,6
150 4,0 3,9 3,2 3,8 3,7
200 3,8 3,6 3,1 3,6 3,5
Из таблицы 1 видно, что с точки зрения ощущения на языке, ощущения при проглатывании и баланса вкуса при органолептической оценке заметен эффект добавления фукоидана, т.е. при его концентрациях 0,1 мг вес/об.% или более.
Исследовательский пример 2.
К модельному напитку примера 1, содержащему 30 мг вес/об.% фукоидана II, добавляли альгиновую кислоту, полученную из морских водорослей в количестве 0 (контроль), 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 150 или 200 мг вес/об.% и оценивали влияние соотношения присутствующих в смеси фукоидана к альгиновой кислоте на ощущение при съедании посредством такого же органолептического испытания, как в исследовательском примере 1. Средние значения результатов приведены в таблице 2.
Таблица 2. Влияние фукоидана и альгиновой кислоты на органолептические оценки
Альгиновая кислота Фукоидан Фукоидиновое число* Ощущение на языке Ощущение при проглатывании Сбалансированность вкуса Общая оценка
мг вес/об.% Сладость Мягкость
0 30 100 4,5 4,7 4,3 4,5 4,5
5 30 85 4,5 4,6 4,2 4,5 4,4
10 30 75 4,3 4,5 4,2 4,5 4,4
20 30 60 4,2 4,4 4,1 4,5 4,3
30 30 50 4,2 4,4 4,1 4,4 4,3
40 30 43 4,0 4,1 3,7 3,9 3,9
60 30 33 3,5 3,6 3,1 3,2 3,3
80 30 27 3,2 3,3 3,2 3,1 3,2
100 30 23 3,2 3,1 3,0 3,1 3,1
немного остается на языке
150 30 17 2,9 2,8 2,5 3,0 2,8
немного остается на языке
200 30 13 2,7 2,6 2,3 2,6 2,6
немного остается на языке
*: (фукоидан)/(альгиновая кислота + фукоидан) (%)
Из таблицы 2 видно, что общая оценка была наивысшей у модельного напитка, когда к нему добавляли только фукоидан, а когда отношение веса фукоидана к весу альгиновой кислоты и фукоидана (обозначенное здесь и ниже как фукоидановое число) становилось меньше, то оценка ухудшалась. По данным органолептической оценки эффект, достигаемый при добавлении 10 мг вес/об.% фукоидана был замечен, когда фукоидановое число составляло 43% или более. Эффект, достигаемый при добавлении 5 мг вес/об.% фукоидана, был замечен, когда фукоидановое число было 13% или более, тогда как случаи, где не было отмечено остаточное ощущение на языке, были достигнуты, когда число было 27% или более.
Нет никакого особого ограничения для количества фукоидана в пищевых продуктах или напитках по изобретению, но количество может быть соответствующим образом выбрано при рассмотрении органолептической и физиологической активности. Например, его количество, рассчитанное по фукозе, на 100 частей пищевого продукта или напитка по цистеинсернокислотному методу составляет 0,001 частей или более, и с точки зрения органолептичности пищи или вкуса напитка, с точки зрения индуцирования апоптоза, и также с точки зрения цены, указанное количество предпочтительно составляет 0,005-10 частей, или, более предпочтительно, 0,01-1,0 часть. В данном случае, термин часть (части), использованный в этом описании, означает часть/части по весу.
Нет никакого особого ограничения на форму пищевых продуктов или напитков по настоящему изобретению, если только они содержат фукоидан по настоящему изобретению, и указанная форма включает ту, которая может быть принята перорально в виде таблеток, гранул, капсул, геля и золя.
Пищевой продукт или напиток по изобретению содержит эффективное количество физиологически активного фукоидана, и благодаря его индуцирующему апоптоз или подобному действию, продукт по изобретению является полезным для здоровья или функциональным пищевым продуктом или напитком, проявляющим эффект предотвращения или подавления рака. Он представляет собой пищевой продукт или напиток, который особенно полезен для поддержания желудка и кишечника в здоровом состоянии.
В настоящем изобретении фукоидан представляет собой полисахарид, содержащий в молекуле сульфат фукозы и/или продукт ее разложения, и здесь нет особого ограничения. В данном случае фукозосодержащий полисахарид, полученный из бурых водорослей, обычно называют фукоиданом, фукоидином или фуканом, и, хотя уже известны несколько его молекулярных разновидностей, фукоидан по настоящему изобретению включает любую и все из них.
Примерами модифицирования фукоидана являются способы химической модификации путем обработки его кислотой и т.п., физической модификации путем обработки его ультразвуковыми волнами и т.п., ферментативной модификации, и способ модифицирования его микроорганизмами. По настоящему изобретению может быть использован любой модифицированный фукоидан, содержащий в молекуле сульфатированную фукозу и индуцирующий апоптоз.
В указанных молекулярных разновидностях фукоидана имеется группа, где фукоза является основным компонентом, и другая группа, где содержится несколько процентов урониевой кислоты, и в которых содержится большое количество фукозы и маннозы в качестве составляющих сахаридов.
Здесь и далее группа, в которой урониевая кислота не содержится в существенных количествах, будет называться фукоидан-В, тогда как другая, в которой содержится урониевая кислота, будет называться фукоидан-ϋ, и их смесь будет называться фукоиданом.
По настоящему изобретению и фукоидан-В и фукоидан-ϋ могут использоваться по отдельности, или оба могут использоваться совместно. Таким образом, пищевые продукты или напитки, в которых основным компонентом является фукоидан-В или фукоидан-ϋ, также охватываются настоящим изобретением. Такие пищевые продукты или напитки с повышенным содержанием указанных фукоиданов, в особенности фукоидана-и, обладают сильным укрепляющим здоровье действием.
Экстракт, полученный из фукоидансодержащих натуральных продуктов в соответствии с изобретением, содержит фукоидан-ϋ, который получен, например, способом по примеру 4, и имеет следующие физические и химические свойства:
(1) составляющий сахар содержит урониевую кислоту; и (2) модифицирован эндофукоиданлиазой, продуцируемой В1ауо-Ьас1егшш зр. 8Л-0082 (ВЕКМ ВР-5402), чтобы в результате образовать, по меньшей мере, одно из соединений, выбранных из тех, которые представлены нижеследующими формулами (I), (II) и (III).
Экстракт, полученный из фукоидансодержащих натуральных продуктов в соответствии с изобретением, содержит фукоидан-Б, который получен, например, способом по примеру 5, и имеет следующие физические и химические свойства:
(1) составляющий сахар является по существу свободен от урониевой кислоты; и (2) и по существу не модифицирован эндофукоиданлиазой, продуцируемой Б1ауоЬаск!егшш δρ. 8Л-0082 (БЕЕМ ВР-5402).
Если фукоидан обработан модифицирующим его микроорганизмом, таким как вышеупомянутой производящей эндофукоиданлиазу Б1ауоЬас!егшш δρ. 8Л-0082 (БЕЕМ ВР-5402), может быть получен микробиологически модифицированный фукоидан.
Далее, когда вышеупомянутый фукоидани обработан эндофукоиданлиазой, такой как продуцируется Б1ауоЬас!егшш δρ. 8Л-0082 (БЕЕМ ВР-5402), может быть получен ферментативно модифицированный фукоидан-ϋ. Эти модифицированные фукоидан и/или фукоидани легко фракционировать по их молекулярным весам. Пищевые продукты или напитки, которые содержат эти модифицированные фукоиданы, добавленные к ним и/или разбавленные ими, также являются пищевыми продуктами и напитками по изобретению.
При производстве экстракта, полученного из морских водорослей, который является одним из примеров фукоидана, содержащегося в пищевых продуктах и напитках по изобретению, пригодными морскими водорослями являются, например, Ейоборйусеае, такие как обычная красная водоросль (Рогрйуга !епега), беНсБ шш саг!11а§1шеиш и Огасйапа соηίе^νо^άеδ; СЫогорйусеае, такие как И1уа 1ас!иса; и Рйаеорйусеае, такие как Еск1оша сауа, Е^δеη^а агЬопа уаг. В1сус11^, Nетасуδΐиδ Шс1р1е1ъ, Н171к1а Г^Чогше, Ипбапа ртиабйба, К)е11шате11а ста^ИоНа и Баштана ]аротса, и среди них морские водоросли с высоким содержанием фукоидана являются особо подходящими для настоящего изобретения.
Что касается морских водорослей, используемых по изобретению, то морская водоросль, которая содержит большое количество фукоидана, такая как Рйаеорйусеае, может быть, например, непосредственно высушена, размолота и экстрагирована, или свежая водоросль может быть мелко нарезана и высушена.
Может быть применен любой способ экстрагирования, обеспечивающий эффективное извлечение фукоидана.
Способ приготовления экстракта морской водоросли может включать в себя стадию промывки водоросли водой, спиртом или водным спиртом. Экстракция водоросли также может проводиться в присутствии спирта.
По настоящему изобретению морскую водоросль экстрагируют, например, раствором соли кальция, такой как хлористый кальций, чтобы получить экстракт морской водоросли в растворе хлористого кальция.
Предпочтительно осуществлять экстракцию при использовании 10-1000 частей раствора хлористого кальция на одну часть сухой водоросли, так, чтобы концентрация хлористого кальция была 25 мМ или более.
Если используют свежую водоросль, то предпочтительно использовать 1-100 частей раствора хлористого кальция на одну часть свежей водоросли при концентрации хлористого кальция 25 мМ или более.
Предпочтительно проводить экстракцию при 50-130°С в течение 10-180 мин. Вообще пригодны любые условия экстракции, обеспечивающие эффективное извлечение фукоидана, если содержание альгинов в экстракте понижено.
После завершения экстракции водоросли раствором соли кальция нерастворимые вещества удаляют. Способ удаления нерастворимых веществ может быть выбран из центрифугирования, фильтрации и т.п. Соль кальция может быть удалена из раствора, из которого удалены нерастворимые вещества, например, ультрафильтрацией или способами ионообмена. Раствор, из которого удалена соль кальция, может быть далее обработан активированным углем, ионообменником, и т.п. так, чтобы селективно устранить запах морской водоросли.
По настоящему изобретению морскую водоросль, например, экстрагируют щелочным раствором, таким как раствор карбоната натрия, чтобы получить экстракт морской водоросли в карбонате натрия. Затем к указанному экстракту добавляют соль кальция, такую как хлористый кальций, и образующиеся в результате нерастворимые вещества удаляют, в результате чего могут быть получены растворимые фракции полученного из морской водоросли экстракта.
Предпочтительно, чтобы экстракция проводилась при использовании 10-160 частей раствора карбоната натрия на одну часть водорос11 ли, и чтобы концентрация карбоната натрия составляла 0,1-5%.
Когда используют свежую водоросль, предпочтительно использовать 1-60 частей раствора карбоната натрия на одну часть свежей водоросли при концентрации карбоната натрия 0,1-5%.
Предпочтительно, чтобы экстракция проводилась при 50-130°С в течение 10-180 мин. Могут быть приняты любые условия экстракции, которые обеспечивают эффективное извлечение фукоидана в экстракт. В данном случае, термин %, использованный в этом описании, относится к весовым процентам.
После завершения экстрагирования водоросли раствором карбоната натрия к экстракту добавляют соль кальция, такую как хлористый кальций, и выделившиеся нерастворимые компоненты удаляют. Количество добавляемого хлористого кальция находится в таких пределах, чтобы альгины больше не выпадали в осадок при добавлении его к натрийкарбонатному экстракту, и любые условия будут подходящими, если только альгины могут быть эффективно осаждены из экстракта. Способ удаления образующихся в результате нерастворимых компонентов может быть выбран из центрифугирования, фильтрации и т. п. Соли, такие как карбонат натрия и хлористый кальций из раствора, из которого удалены нерастворимые компоненты, могут быть удалены, например, способами ультрафильтрации или ионообмена. Раствор, из которого удалены соли, может быть затем обработан активированным углем, ионообменником, и т.п. так, чтобы селективно устранить запах морской водоросли.
По настоящему изобретению морскую водоросль, например, экстрагируют щелочным раствором, таким как раствор карбоната натрия с получением экстракта морской водоросли в карбонате натрия. После этого экстракт подкисляют кислотой, такой как разбавленная серная кислота, и образующиеся нерастворимые компоненты удаляют, в результате чего получают растворимое вещество полученного из морской водоросли экстракта.
Экстракцию морской водоросли раствором карбоната натрия проводят способом, упомянутым выше.
После завершения экстрагирования водоросли раствором карбоната натрия к экстракту добавляют раствор кислоты, такой как разбавленная серная кислота, и образующиеся в результате нерастворимые компоненты удаляют. Количество добавляемой разбавленной серной кислоты находится в таких пределах, чтобы рН экстракта карбонатом натрия достиг значения 12,5, и любые условия будут подходящими, если только подкислен экстракт, посредством чего альгины могут быть эффективно осаждены из экстракта. Способ удаления образующихся в результате нерастворимых компонентов может быть выбран из центрифугирования, фильтрации и т. п. Соли могут быть удалены из раствора, из которого удалены нерастворимые компоненты, например, способами ультрафильтрации или ионообмена. Раствор, из которого удалены соли, может быть, если необходимо, нейтрализован, и после чего кислый или нейтрализованный раствор может быть затем обработан активированным углем, ионообменником, и т. п. так, чтобы селективно устранить запах морской водоросли.
Фукоидан по изобретению может быть или жидким, или твердым. Для получения твердого фукоидана может быть выбран подходящий из известных способов, таких как распылительная сушка или сушка вымораживанием.
Обычно фукоидан мало устойчив к кислотам и щелочам и потому деградирует на низкомолекулярные вещества при использовании кислых или щелочных растворов. Если правильно подобрать температуру нагревания, рН и т.п., легко получить желаемый модифицированный деградацией продукт. Можно регулировать средний молекулярный вес и распределение молекулярных весов посредством, например, гель-фильтрации, обработки на мембране для фракционирования по молекулярному весу, и т.д. Молекулярный вес и содержание сахарного компонента в фукоидане варьируют в зависимости от времени сбора материала для получения фукоидана, способа сушки указанного материала, способа хранения указанного материала, и т.д., и также зависит от условий нагрева, рН и т.д. во время процесса экстракции фукоидана. Например, фукоидан гидролизуется кислотой, в то время как в щелочных условиях он превращается в низкомолекулярные продукты в результате бета-отщепления урониевой кислоты. Соответственно, по отношению к фукоидану-И и фукоидану-Е, упомянутым в этом описании, молекулярный вес и распределение молекулярного веса, приведенные здесь, являются просто примерами и могут быть легко изменены регулированием условий процесса получения фукоидана. Например, когда фукоидан нагревают при 100°С в течение одного часа в слабо щелочных условиях, и когда для удаления соли используют мембрану из молекулярного сита, имеющего размер пор 300, возможно получить фукоидан, фукоидан-и, фукоидан-Е и т.д., имеющий распределение молекулярного веса от примерно 1.000 до примерно 10.000. В зависимости от использованных условий может быть получен фукоидан, имеющий любой молекулярный вес и любое распределение молекулярного веса, и такой продукт может быть использован в качестве фукоидана по изобретению.
Когда фукоидан и/или продукт его деградации в соответствии с настоящим изобретением добавляют к жидкой культуре раковых клеток, спустя один или несколько дней после добавления наступает апоптоз указанных раковых клеток. В данном случае они не проявляют ток13 сичности по отношению к нормальным клеткам. В особенности, фукоидан, полученный из съедобных морских водорослей и/или продукт его разложения в высокой степени безопасны.
Настоящее изобретение будет далее пояснено на нижеследующих примерах, хотя настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.
Пример 1.
(1) К)е11тап1е11а сгахиГойа хорошо высушивали и 20 кг сухой водоросли размалывали с помощью свободного дезинтегратора (Ыага Κίка1 Зекакшйо).
Дигидрат хлористого кальция (7,3 кг) (Νίρροη 8оба) растворяли в 900 л водопроводной воды и смешивали с 20 кг размолотой К)е11таше11а сгахиГойа. Через смесь продували пар, в результате чего температура жидкости поднималась с 12 до 90°С в течение 40 мин, затем температуру поддерживали на уровне 9095°С в течение одного часа при перемешивании и охлаждали, получая 1100 л охлажденной смеси.
Эту смесь подвергали обработке на сепараторе твердое-жидкость (тип ί,’ΝΛ, ХУеИГайег 8ерага1ог), чтобы разделить смесь на твердую и жидкую фазы, после чего получили около 900 л надосадочной жидкости.
Надосадочную жидкость (360 л) концентрировали до 20 л, используя РЕ10-РС-РИ80382 (Оа1ее1) (молекулярный вес включительно 30.000). К концентрату добавляли 20 л водопроводной воды, после чего смесь концентрировали до 20 л, и эту операцию повторяли пять раз, чтобы удалить из смеси соль, в результате чего приготовили 25 л экстрактного раствора, полученного из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана.
Экстрактный раствор имел рН около 6,5, кислотность 0,06 мл, степень сахаристости 0,8% по Впх и концентрацию кальция 1.200 ррт.
Указанный раствор (один литр) сушили вымораживанием, получая 13 г сухого продукта, в котором содержалось 65% фукоидана и 33% фукоидана-и.
Содержание фукоидана-и измеряли посредством ЖХВР, используя стандартное вещество фукоидан-и, который был получен в примере 4.
В данном случае содержание фукоидана рассчитывали по нижеследующему сернокислотно-цистеиновому методу, используя водный раствор стандартного фукоидана (0,4 мг/мл), полученного в примере 5.
Испытуемый раствор (200 мкл) набирали в пробирку, к нему при охлаждении льдом добавляли 900 мкл смеси 6:1 концентрированной серной кислоты и воды, и полученную смесь хорошо охлаждали и перемешивали. Ее выдерживали при примерно 20°С в течение трех минут и нагревали в бане с кипящей водой в течение десяти минут. После нагревания ее охлаждали в ледяной воде и добавляли 20 мкл 3% цистеингидрохлористой кислоты с последующим перемешиванием (окрашенная часть). В качестве контроля к ней добавляли 20 мкл воды с последующим перемешиванием (неокрашенная часть). После перемешивания смеси давали постоять в течение одного часа и определяли поглощения при 400 и 460 нм.
Содержание фукоидана в испытуемом растворе рассчитывали по следующей формуле: Содержание (мг/мл) = Испытуемый раствор [окрашенная часть (А400-А460) -Неокрашенная часть (Л400-Л460)]/Стандартн^1й раствор [окрашенная часть (А400-А460)-Неокрашенная часть (А40о-А460)] х число разведения х 20,4
В формуле Ад00 представляет поглощение при 400 нм, тогда как Ад60 представляет поглощение при 460 нм.
В данном случае рН измеряли с помощью рН-метра, тогда как кислотность выражали через количество (мл) 0,1Ν №·1ΘΗ. требующееся для нейтрализации 10 мл пробы раствора до рН 7,0. Степень сахаристости измеряли сахарометром Впх, тогда как концентрацию кальция измеряли посредством спектрометрии атомного поглощения.
Затем к раствору экстракта из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана, добавляли 2% активированного угля (выпускаемого в качестве пищевой добавки Зййахащ Вгапб), и смесь обрабатывали в течение 30 мин, грубо фильтровали и окончательно фильтровали, используя фильтр 0,8 мкм, чтобы получить фильтрат (фукоидан I), проходящий через фильтр. Затем одну половину фильтрата нагревали при 120°С в течение 60 мин под давлением, чтобы получить термически обработанную жидкость (фукоидан II).
Фильтрат, прошедший через фильтр, сушили вымораживанием и 10 мг высушенного продукта суспендировали в каждом из 10 мл 1% раствора карбоната натрия и 100 мкл раствора хлористого кальция. В обоих растворах высушенный продукт полностью растворялся и загрязнения альгинами не были отмечены.
(2) К)е11тап1е11а сгахиГойа хорошо сушили и 20 кг сухой водоросли размалывали с помощью дезинтегратора (Ρίΐζ МШ; Нохока\\а Μίсгоп).
Дигидрат хлористого кальция (7,2 кг) (№ррои 8оба) растворяли в 400 л водопроводной воды, после чего смешивали с 20 кг размолотой К)е11таше11а сгахиГойа. Через смесь при перемешивании в течение 95 мин продували пар, в результате чего температура жидкости поднималась с 28 до 95°С, и смесь поддерживали при температуре 95°С в течение двух часов при перемешивании и охлаждали, получая 500 л охлажденного продукта.
Охлажденный продукт подвергали сепарации на твердую и жидкую фазы, используя твердо-жидкостный сепаратор (ТапаЬе ^ейесй), получая около 450 л надосадочной жидкости после сепарирования.
Указанную жидкость концентрировали до 40 л, используя ЕЕ10-ЕС-ЕН80382 (молекулярный вес включительно 30.000 (Όαίοοί). После этого к концентрату непрерывно добавляли стерилизованную фильтрацией воду при скорости потока 40-60 л/ч, проводя таким образом обессоливание до тех пор, пока электропроводность не достигала значения 1,0 мС/см2, в результате чего готовили 40 л экстрактного раствора, полученного из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана.
Затем к указанному раствору экстракта добавляли 0,4 кг Се1йе #545 (изготовленного Се1йе) и 0,4 кг 8Шса #600-8 (Сйио 8Шса) в качестве вспомогательных фильтровальных веществ, и смесь фильтровали, используя пресс-фильтр (16 ступеней х 15 см; фильтровальная бумага: ΆΌУАЫТЕС #327) с предварительным нанесением 0,1 кг Се1йе #545 и 0,1 кг 8Шса #600-8.
Полученный в результате фильтрат подвергали непрерывной сильной тепловой обработке, используя тарельчатый нагреватель (N1сЫйаи 8е1какикйо), при 98°С в течение 60 с и охлаждали, получая 46 л экстрактного раствора (фукоидан IV), полученного из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана.
Указанный экстрактный раствор имел рН около 7, кислотность 0 мл, степень сахаристости 1,2% по Βηχ и концентрацию кальция 920 ррт, содержание твердого вещества 1,2% и содержание фукоидана 17 мг/мл. Ни альгиновая кислота, ни йод не были обнаружены.
Содержание альгиновой кислоты определяли методом ЖХВР, используя доступную в продаже альгиновую кислоту в качестве стандартного вещества.
Содержание фукоидана рассчитывали по сернокислотному-цистеиновому методу, используя в качестве стандартного раствора водный раствор (0,4 мг/мл) стандартного фукоидана, полученного в примере 5.
Электропроводность измеряли электрокондуктометром. Йод выделяли бромом и титровали тиосульфатом натрия. Содержание твердого вещества определяли по сухому весу после обработки в центрифужном сепараторе (при 60°С в течение 18 ч).
(3) К)е11тап1е11а сгаккйойа хорошо высушивали и 20 кг сухой водоросли размалывали с помощью дезинтегратора (Είΐζ М111; Нокока^а Мюгоп).
Дигидрат хлористого кальция (Ырроп 8оба) (7,3 кг) растворяли в 400 л водопроводной воды, после чего смешивали с 20 кг размолотой К)е11таше11а сгаккйойа. Через смесь при перемешивании в течение 95 мин продували пар, в результате чего температура жидкости поднималась с 28 до 95°С, и смесь поддерживали при температуре 95°С в течение двух часов при пе ремешивании и охлаждали, получая 500 л охлажденного продукта.
Охлажденный продукт подвергали твердожидкостной сепарации, используя соответствующий сепаратор (ТапаЬе \Уе11ес11). получая около 450 л надосадочной жидкости после сепарирования.
Указанную жидкость концентрировали до 40 л, используя ЕЕ10-ЕС-Еи80382 (молекулярный вес включительно 30.000 (Эа1се1). После этого к концентрату непрерывно добавляли стерилизованную фильтрацией воду при скорости потока 30 л/ч, проводя таким образом обессоливание до тех пор, пока электропроводность не достигала значения 1,0 мС/см2, в результате чего готовили 34 л экстрактного раствора, полученного из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана.
После этого 1,1 кг пектина (Ротосш Ресйп ЬМ-13С6; Негси1ек) добавляли к 20 л водопроводной воды, пар продували через смесь так, что температура поднималась с 28 до 120°С в течение пяти часов при перемешивании и охлаждали, получая 28 л охлажденного продукта.
Затем 34 л экстрактного раствора, полученного из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана, смешивали с 28 л термообработанного пектина, и смесь доводили до рН 3,5 ангидридом лимонной кислоты (Рико Казаки). После этого добавляли 0,9 кг СеШе # 545 (изготовленного Се1йе) и 0,8 кг 8Шса #600-8 (Сйио 8Шса) в качестве вспомогательных фильтровальных веществ, и смесь фильтровали, используя пресс-фильтр (16 ступеней х 15 см; фильтровальная бумага: АЭУЛЫТЕС #327) с предварительным нанесением 0,2 кг Се1йе #545 и 0,2 кг 8Шса #600-8.
К полученному фильтрату добавляли 18 л чистой воды и полученную смесь подвергали непрерывной сильной тепловой обработке, используя тарельчатый нагреватель (МсЫйап 8е1какикйо), при 98°С в течение 60 с и охлаждали, получая 80 л экстрактного раствора (фукоидан VI), полученного из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана.
Указанный экстрактный раствор имел рН около 3,5, кислотность 1,7 мл, степень сахаристости 2,1% по Βηχ и концентрацию кальция 710 ррт, содержание твердого вещества 2,0%, содержание фукоидана 13 мг/мл и содержание фукоидана-и 6,6 мг/мл. Ни альгиновая кислота, ни йод не были обнаружены.
Один литр указанного раствора сублимировали (вымораживанием), получая 20 г высушенного продукта.
Пример 2.
Свежую Ьатшапа )аротса мелко нарезали,
200 г полученной мелко нарезанной водоросли суспендировали в 600 мл 1% водного раствора карбоната натрия, суспензию нагревали при
60°С в течение одного часа и добавляли к ней воду, доводя общий объем до одного литра.
Этот раствор центрифугировали, супернатантную жидкость собирали и добавляли к ней воду, доводя общий объем до четырех литров.
К этому раствору добавляли 500 мМ хлористого кальция до тех пор, пока не прекращалось выпадение осадка, и образовавшийся осадок выделяли на фильтровальной бумаге. Полученный фильтрат концентрировали и обессоливали с помощью устройства М|сгоасПухсг. получая 3,6 л обессоленного продукта. Половину продукта подвергали сублимированию, получая 2,1 г сухой фракции экстракта (фукоидан III) из водоросли с высоким содержанием фукоидана. Другую половину обессоленного раствора обрабатывали 2% активированного угля с последующим нагреванием под давлением при 120°С в течение 60 мин, получая термически обработанный раствор (фукоидан IV).
Вышеописанный сублимированный продукт (10 мг) суспендировали в 10 мл 1% раствора карбоната натрия и в 100 мМ раствора хлористого кальция. В обоих растворах указанная фракция полностью растворилась и загрязнения альгинами не были обнаружены.
Пример 3. Индуцирующая апоптоз активность экстрактов, полученных из морских водорослей с высоким содержанием фукоидана, приготовленных в примерах 1 и 2.
Клетки промиелоцитной лейкемии человека НЬ-60 (АТСС СС1-240), инкубированные при 37°С в среде РРМ! 1640 (61Ьсо), содержащей 10% околоплодной телячьей сыворотки (ЖН Вюкаепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, суспендировали в среде А8Р 104 (Арпото1о), чтобы получить суспензию, содержащую 5 х 105 клеток/9 мл. К 9,0 мл этой суспензии добавляли 1 мл каждого из растворов экстрактов (фукоиданы I и III), полученных из морских водорослей с высоким содержанием фукоидана по примерам 1 и 2 [приготовленных путем растворения каждого из фукоиданов в 50 мМ буфере НЕРЕ8 (рН 7,2), содержащем 100 мМ хлористого натрия, до концентрации 5 мг/мл с последующей стерилизацией при 121°С в течение 20 мин], и каждую смесь инкубировали при 37°С в течение 18 ч в присутствии 5% двуокиси углерода. Инкубированные клетки центрифугировали для отделения от надосадочной жидкости. Полученные клетки суспендировали в 20 мкл 50 мМ Трис-гидрохлоридного буфера (рН: 7,8), содержащего 10 мМ этилендиаминтетраацетата и 0,5% лаурилсаркозината натрия, затем добавляли к суспензии 1 мкл рибонуклеазы А (10 мг/мл) (81дта) с последующей обработкой при 50°С в течение 30 мин и 1 мкл протеиназы К(10 мг/мл) с последующей обработкой при 50°С в течение одного часа. Клетки после обработки использовали в качестве пробы и подвергали электрофорезу с использованием 2% агарового геля при постоянном напряжении 100 вольт. Гель погружали в этидийбромид на 30 мин, и затем проверяли состояние ДНК в геле, исполь зуя трансиллюминатор (просвечиватель), устанавливая лэддер (полосы нуклеотидов), характерный для апоптоза.
Из этих результатов стало ясно, что у клеток НЬ-60 апоптоз индуцируется экстрактами, полученными из морских водорослей с высоким содержанием фукоидана, приготовленными по примерам 1 и 2.
Далее, каждый из указанных экстрактов (фукоидан II и фукоидан IV), полученных из морских водорослей с высоким содержанием фукоидана, приготовленных по примерам 1 и 2, растворяли в физиологическом солевом растворе, чтобы получить раствор 5 мг/мл, с последующей стерилизацией при 1 21 °С в течение 20 мин и полученный раствор использовали как испытуемый раствор для измерения индуцирующей апоптоз активности по вышеупомянутому методу, в результате чего такой же эффект был подтвержден для каждого из испытуемых растворов.
После этого клетки промиелоцитной лейкемии человека НЬ-60 (АТСС СС1-240), инкубированные при 37°С в среде РРМ! 1640 (61Ьсо), содержащей 10% околоплодной телячьей сыворотки (ЖН Вюкшепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, суспендировали в среде А8Е 104 (АрпотоФ), чтобы получить суспензию, содержащую 2,5 х 105 клеток/4,5 мл. К 4,5 мл этой суспензии добавляли 0,5 мл каждого из растворов экстрактов (фукоиданы I и III), полученных из морских водорослей с высоким содержанием фукоидана в примерах 1 и 2 [приготовленных путем растворения каждого из фукоиданов в 50 мМ буфере НЕРЕ8 (рН 7,2), содержащем 100 мМ хлористого натрия, чтобы получить концентрации 2 мг/мл, 5 мг/мл и 10 мг/мл, с последующей стерилизацией при 121°С в течение 20 мин], и каждую смесь инкубировали при 37°С в присутствии 5% двуокиси углерода. Спустя 24 и 44 ч от начала инкубации отбирали в качестве пробы по 0,5 мл культуральной жидкости и подсчитывали число выживших клеток в среде по методу, описанному ТесНпк|ие5 ίη Т188ие СиЙиге, 2-ое издание (публикация Акакига 8киррап; ред. 1арап ТЬкие Сийиге 8ос1е1у, 1 ноября 1990, стр. 26-28). Так, подсчет проводили после окрашивания клеток краской Трипан синий на гемоцитометре.
Результаты показаны на фиг. 2-4. Фиг. 2 показывает пролиферацию клеток в присутствии 0,2 мг/мл каждого фукоидана, где ордината показывает количество выживших клеток на мл культуральной жидкости (х 104/мл; это будет применимо также к последующим описаниям), а абсцисса показывает длительность инкубации (часы). Фиг. 3 показывает пролиферацию клеток в присутствии 0,5 мг/мл каждого фукоидана, где ордината показывает число выживших клеток на мл культуральной жидкости, а абсцисса показывает длительность инкубации (часы). Фиг. 4 показывает пролиферацию клеток в присутст19 вии 1 мг/мл каждого фукоидана, где ордината показывает количество выживших клеток на мл культуральной жидкости, а абсцисса показывает длительность инкубации (часы). На каждой из фиг. 2-4 треугольник обозначает количество выживших клеток для каждого периода инкубации в присутствии экстракта (фукоидан I), полученного из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана по примеру 1, тогда как квадрат обозначает количество выживших клеток для каждого периода инкубации в присутствии экстракта (фукоидан III), полученного из морской водоросли с высоким содержанием фукоидана по примеру 2.
В данном случае в контроле, где проба не добавлялась, количество выживших клеток в культуральной жидкости составляло 1,5 х 105/мл и 3,1 х 105/мл после инкубации в течение 24 и 44 ч, соответственно.
Как показано на фиг. 2-4, экстракт, полученный из морских водорослей с высоким содержанием фукоидана, способен убивать клетки НЬ-60 путем апоптоза в течение двух суток, при условии, что его концентрация в среде составляет, по меньшей мере, 200 мкг/мл.
Далее, каждый из указанных экстрактов (фукоидан II, фукоидан IV, фукоидан V и фукоидан VI), полученных из морских водорослей с высоким содержанием фукоидана в примерах 1 и 2, растворяли в физиологическом солевом растворе, чтобы получить растворы 2-10 мг/мл, с последующей стерилизацией при 121°С в течение 20 мин, и полученные растворы использовали как испытуемые растворы для измерения индуцирующей апоптоз активности в соответствии с вышеописанной методикой, в результате чего такой же эффект был подтвержден для каждого из испытуемых растворов.
Пример 4. Получение фукоидана-И.
Водоросль К)е11таше11а сгакйГоНа хорошо высушивали, 2 кг высушенной водоросли размалывали на свободном дезинтеграторе (Иата К1ка1 8е1какикйо), полученный сухой порошок суспендировали в девяти литрах 80% этанола, и суспензию нагревали при 80°С в течение двух часов. После этого суспензию фильтровали через фильтровальную бумагу, получая осадок. Осадок подвергали вышеупомянутым операциям промывки этанолом и последующей фильтрации и указанные операции повторяли три раза, в результате чего получили промытый этанолом осадок. Его суспендировали в 36 л 0,2М раствора ацетата кальция, нагревали при 95°С в течение двух часов и фильтровали. Остаток промывали четырьмя литрами 0,2М раствора ацетата кальция, получая 36 л фукоиданового экстракта из К)е11таше11а сгакйГоНа.
Вышеупомянутый экстракт концентрировали до двух литров на ультрафильтраторе, оборудованном ультрафильтрующей мембраной, имеющей молекулярный вес исключения 100.000, к нему добавляли соль, чтобы получить ее конечную концентрацию 1,5М и затем добавляли 5% цетилпиридинийхлорид до тех пор, пока не прекращалось образование осадка. Полученный таким образом осадок удаляли центрифугированием. Полученную в результате надосадочную жидкость концентрировали до одного литра путем ультрафильтрации, к ней добавляли четыре литра этанола и образовавшийся осадок отбирали центрифугированием. К этому осадку добавляли 100 мл 4М водного раствора хлористого натрия, смесь хорошо перемешивали, добавляли этанол, чтобы довести его концентрацию до 80%, и смесь перемешивали и центрифугировали, получая осадок. Осадок суспендировали в 80% этаноле, после чего проводили центрифугирование, и такие операции повторяли до тех пор, пока не исчезало поглощение в надосадочной жидкости на 260 нм. Полученный осадок растворяли в двух литрах 2М водного раствора хлористого натрия, образовавшееся нерастворимое вещество удаляли центрифугированием, добавляли 50 мл ΌΕΆΕСе11ойпе А-800 (8е1кадаки Кодуо), смесь перемешивали и добавленную смолу удаляли фильтрацией. Фильтрат пропускали через колонку с ОЕАЕ-СеПоПпе А-800, доведенную до равновесия 2М водным раствором хлористого натрия, непоглощенные вещества подвергали ультрафильтрации на ультрафильтраторе, оборудованном пористой тканью, которая способна исключить молекулярный вес 100.000 и менее, в результате чего полностью удаляли окрашивающие вещества и соль, и затем нерастворимые вещества удаляли путем центрифугирования и фильтрации с последующим сублимированием, получая фукоидан-ϋ. Вес сублимированного фукоидана-И составил 15 г.
Фиг. 1 показывает способность к образованию осадка фукоидана-И и фукоидана-Е, который получен в нижеследующем примере 5, при различных концентрациях хлористого натрия в присутствии избытка цетилпиридинхлорида.
На фиг. 1 ордината показывает коэффициент осаждения (%), тогда как абсцисса показывает концентрацию (М) хлористого натрия. Сплошная линия с кружочками относится к коэффициенту осаждения фукоидана-И по настоящему изобретению при различных концентрациях (М) хлористого натрия, тогда как пунктирная линия с треугольниками относится к коэффициенту осаждения фукоидана-Е по изобретению при различных концентрациях (М) хлористого натрия.
Коэффициенты осаждения определяли по температуре раствора 37°С следующим образом.
Фукоидан-и и фукоидан-Е каждый растворяли в воде и в 4М растворе хлористого натрия при концентрации 2% каждого. Затем эти растворы смешивали в различных соотношениях, получая тем самым 125 мкл порции растворов фукоидана-и и фукоидана-Е, имеющих разные концентрации хлористого натрия. Далее цетилпиридинхлорид растворяли в воде и в 4 М хлористом натрии в концентрации 2,5%, и полученные растворы смешивали в различных соотношениях, получая тем самым 1,25% растворы цетилпиридинхлорида с различными концентрациями хлористого натрия.
Для полного осаждения фукоидана-и и фукоидана-Е, каждый из которых растворен в воде при концентрации 2%, требуется в 3,2 раза больше по объему 1,25% раствора цетилпиридинхлорида. К 125 мкл порциям 2% растворов фукоидана-и и фукоидана-Е с различными концентрациями хлористого натрия добавляли 400 мкл порции растворов цетилпиридинхлорида с различными концентрациями хлористого натрия. После тщательного перемешивания и отстоя в течение 30 мин каждую смесь центрифугировали и определяли содержание сахара в надосадочной жидкости по фенольно-сернокислому методу [Аиа1убса1 Сйет181ту, 28, 350 (1956] с последующим расчетом коэффициента осаждения каждого фукоидана при каждой концентрации хлористого натрия.
Молекулярный вес полученного таким образом фукоидана-и определяли методом гельфильтрации с помощью Зерйасту1 3-500. В результате найдено распределение молекулярного веса вокруг примерно 190.000.
Далее анализировали компоненты фукоидана-и.
Сперва определяли содержание фукозы в соответствии с методикой, описанной в 1оита1 о£ Вю1о§1са1 СйешЫту, 175, 595 (1948).
Затем полученный таким образом сухой препарат фукоидана-и растворяли в 1Ν соляной кислоте, чтобы получить концентрацию 0,5%, и обрабатывали при 110°С в течение двух часов, чтобы тем самым гидролизовать его на составляющие сахара. Вслед за этим восстанавливаемые концы полученных гидролизом моносахаридов подвергали пиридил-(2)-аминированию (ПА), используя О1усоТАО и наборы реактивов О1усоТАО (каждый от Такага 31ιιιζο) и анализировали соотношение составляющих сахаров методом ЖХВР.
Далее определяли содержание урониевой кислоты в соответствии с методикой, описанной в Аиа1убса1 ВюсйешЫту, 4, 330 (1962).
Вслед за этим определяли содержание серной кислоты в соответствии с методикой, описанной в Вюсйеш1са1 1оитпа1, 84, 106 (1962).
В результате было найдено, что составляющими сахарами фукоидана-и являются фукоза, манноза, галактоза, глюкоза, рамноза, ксилоза и урониевая кислота, и в нем не содержалось существенных количеств других нейтральных сахаров. Соотношение мольных содержаний главных компонентов было следующим: фукоза : манноза : галактоза : урониевая кислота : сульфатная группа ж 10:7:4:5:20.
Структура фукоидана-и была определена следующим образом.
Модифицирование фукоидана-и ферментами, способными деградировать фукоидан-И, и очистка продуктов ферментации:
Очищенный фукоидан-И обрабатывали эндофукоиданлиазой, как будет описано далее, и полученные продукты очищали.
А именно, 16 мл 1% раствора фукоиданаи, 12 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 8,0), 4 мл 4 М раствора хлористого натрия и 8 мл 32 мЕ/мл раствора эндофукоиданлиазы смешивали и оставляли взаимодействовать при 25°С в течение 48 ч. Было подтверждено, что поглощение реакционной смеси на 230 нм увеличивается по мере протекания реакции, доказывая тем самым, что идет разложение фукоидана-и этим ферментом. После обессоливания с помощью Мтсто Аа^ет С3 (АкаЫ Сйеш1са1 1иби81гу) реакционную смесь разделяли на три фракции (а), (Ь) и (с) с помощью ОЕАЕ-Зерйатоке ЕЕ.
Вышеупомянутую эндофукоиданлиазу готовили следующим образом.
Штамм, который используется для продуцирования этого фермента, может быть выбран произвольно, при условии, что он был способен продуцировать эндофукоиданлиазу. В качестве конкретного примера его можно указать на Е1ауоЬас!етшт §р. ЗА-0082 (ЕЕКМ ВР-5402).
Этот штамм был выделен авторами настоящего изобретения из морской воды в Аошоп. Он определен как Е1ауоЬас1етшт §р. ЗА0082 и депонирован в Ыа1юпа1 1и81йи1е о£ Вю8с1епсе апб Нитап-Тесйпо1оду, Адепсу о£ 1пби51па1 Заепсе апб Тесйпо1оду (1-3, ШдакЫ 1сйоте, ТкикиЬа, 1Ьадап, 305 1арап) с депозитарным номером ЕЕКМ Р-14872 29 марта 1995, а затем получил депозитарный номер ЕЕКМ ВР5402 (перевод в международный депозит был заявлен 15 февраля 1996).
Питательные вещества, которые должны быть добавлены к среде для культивирования штамма, могут быть выбраны произвольно, при условии, что применяемый штамм может усваивать их так, чтобы продуцировать эндофукоиданлиазу. Примеры подходящих источников углерода включают фукоидан, порошок морских водорослей, альгиновую кислоту, фукозу, глюкозу, маннитол, глицерин, сахарозу, мальтозу, лактозу и крахмал, в то время как примеры подходящих источников азота включают экстракт дрожжей, пептон, касаминокислоты, кукурузный экстракт, мясной экстракт, обезжиренные соевые бобы, сульфат аммония и хлористый аммоний. Среда может дополнительно содержать неорганические вещества и соли металлов, такие как соли натрия, фосфаты, соли калия, соли магния и соли цинка.
Выход эндофукоиданлиазы, продуцируемой при культивировании штамма, изменяется в зависимости от условий культивирования. В общем, предпочтительно, чтобы температура культивирования находилась в интервале от 15 до 30°С, а рН среды - от 5 до 9. Выход эндофукоиданлиазы достигает максимума при культивировании штамма при аэрации и перемешивании в течение времени от 5 до 72 ч. Само собой разумеется, что условия культивирования выбираются должным образом в зависимости от применяемого штамма, состава среды и т. д. так, чтобы достичь максимального выхода.
Эндофукоиданлиаза содержится и в клетках и в надосадочной жидкости культуры.
Вышеупомянутая Е1ауоЬас1етшт зр. 8А0082 культивируется в подходящей среде, и клетки собирали и разрывали применяемыми для разрыва клеток, такими как обработка ультразвуком. Таким образом получали свободный от клеток экстракт.
После этого экстракт очищали по методике, обычно применяемой на практике, чтобы получить препарат очищенного фермента. Очистка, например, может быть проведена высаливанием, ионообменной хроматографией, колоночной хроматографией гидрофобной связи, гель-фильтрацией или подобными методами, чтобы посредством этого получить очищенную эндофукоиданлиазу, свободную от любой другой эндофукоиданлиазы.
Культуральная жидкость, полученная удалением клеток из вышеупомянутой культуральной среды, также содержит большое количество этого фермента (внеклеточный фермент), который может быть очищен теми же методами, которые применяют для очистки внутриклеточного фермента.
Ниже приведен пример очистки эндофукоиданлиазы.
Е1ауоЬас1етшт зр. 8А-0082 (ЕЕКМ ВР5402)высевали в 600 мл среды, содержащей искусственную морскую воду (рН 7,5, 1атапп ЬаЬога1огу), содержащей 0,25% глюкозы, 1,0% пептона и 0,05% экстракта дрожжей, которую вводили пипеткой в двухлитровую колбу Эрленмейера и стерилизовали при 120°С в течение 20 мин. Затем штамм культивировали в ней при 24°С в течение 24 ч, чтобы получить тем самым посеянную культуру. В тридцатидвухлитровый сосуд-ферментер вводили 20 л среды, состоящей из искусственной морской воды (рН 7,5, 1атапп ЬаЬога1огу), содержащей 0,25% глюкозы, 1,0% пептона, 0,05% экстракта дрожжей и 0,01 пеноподавляющего агента (КМ70, 8Ып-Е1зи С11е11йса1 Со., Ыб), и стерилизовали при 120°С в течение 20 мин. После охлаждения среду инокулировали 600 мл вышеупомянутой посевной культурой, которую затем культивировали в нем при 24°С при аэрировании со скоростью 10 л/мин и перемешивали при 124 об/мин. После завершения культивирования культуральную среду центрифугировали, чтобы тем самым отобрать клетки.
Отобранные клетки суспендировали в 20 мМ ацетатфосфатного буфера (рН 7,5), содер жащего 200 мМ хлористого натрия, разрывали обработкой ультразвуком и центрифугировали, получая тем самым клеточный экстракт. Эндофукоиданлиаза в этом клеточном экстракте проявляет активность 5 мЕ/мл среды.
К этому экстракту добавляли сульфат аммония так, чтобы в конце достичь 90% насыщения. После растворения за счет перемешивания смесь центрифугировали и осадок суспендировали в таком же буфере, как тот вышеупомянутый буфер, в котором суспендировали клетки. Затем суспензию тщательно диализировали в 20 мМ ацетатно-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 50 мМ хлористого натрия. После удаления осадка, образованного диализным центрифугированием, его адсорбировали в колонке РЕАЕ-8ерйатозе ЕЕ, которую доводили до равновесия 20 мМ ацетатно-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 50 мМ хлористого натрия. Затем адсорбированное вещество хорошо промывали тем же буфером и проявляли линейным градиентным элюированием хлористым натрием от 50 мМ до 600 мМ. Активные фракции объединяли и добавляли к ним хлористый натрий так, чтобы получить конечную концентрацию 4 мМ. Далее его адсорбировали в колонке Р11епу1 8ерйагозе СЬ-4В, которую доводили до равновесия 20 мМ фосфатным буфером (рН 8,0), содержащим 4М хлористого натрия. Затем адсорбированное вещество хорошо промывали тем же буфером и проявляли линейным градиентным элюированием хлористым натрием от 4М до 1М. Активные фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией. Далее его подвергали гель-фильтрации с помощью 8ерйасгу1 8-300, который доводили до равновесия 10 мМ фосфатным буфером, содержащим 50 мМ хлористого натрия. Активные фракции объединяли. Молекулярный вес фермента, определенный по времени удерживания на 8ерйасгу1 8300, составил около 460.000. Затем активные фракции диализировали в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7), содержащем 250 мМ хлористого натрия. Раствор фермента адсорбировали в колонке Мопо О НК.5/5, которую доводили до равновесия 10 мМ фосфатным буфером (рН 7), содержащим 250 мМ хлористого натрия. Адсорбированное вещество хорошо промывали тем же буфером и проявляли линейным градиентным элюированием хлористым натрием от 250 до 450 мМ. Активные фракции объединяли, получая тем самым очищенный фермент. Таблица 3 суммирует вышеописанные стадии очистки.
Таблица 3
Стадия Общий протеин (мг) Общая активность (МЕ) Удельная активность (мЕ/мг) Выход (%)
Клеточный экстракт 61,900 101,000 1,63 100
Осаждение сульфатом аммония 33,800 88,600 2,62 87,7
ПЕАЕг8ер6агове РР 2,190 40,400 18,4 40,0
Р1епу1 8ер11аго§е СГ-В 48,2 29,000 601 28,7
8ерЬасгу1 8-300 7,24 19,600 2,710 19,4
Мопо Л 0,824 15,000 18,200 14,9
Активность этого фермента определяли следующим образом. Пятьдесят микролитров 2,5% раствора фукоидана, полученного из К)е11тап1е11а сгаккИойа, 10 мкл этого фермента и 60 мкл 83 мМ фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 667 мМ хлористого натрия, смешивали и оставляли реагировать при 37°С в течение 3 ч. Затем 105 мкл реакционной смеси смешивали с 2 мл воды при перемешивании и измеряли поглощение (АТ) при 230 нм. В качестве контроля использовали реакционную смесь, приготовленную тем же методом, но при замене фермента одним вышеупомянутым буфером, использованным для растворения фермента, и другую реакционную смесь, приготовленную тем же методом, но при замене фукоидана одной водой, и замеряли также их поглощением (АВ1 и АВ2).
Количество фермента, которым можно разорвать полностью один миллимоль гликозидных связей между маннозой и урониевой кислотой за одну минуту, принято за одну единицу (Е). Разорванные таким образом связи определяли, принимая милимольный коэффициент молекулярного поглощения ненасыщенной урониевой кислоты, образовавшейся при реакции элиминирования за 5,5. Активность фермента определяли по следующему уравнению:
Активность(Е'мл=(АТ-АВ1-АВ2)х2,105х120/ (5,5х105х0,01х180);
2,105 - объем (мл) образца, поглощение которого измеряли;
120 - объем (мкл) реакционной смеси фермента;
5,5 - миллимольный коэффициент молекулярной экстинции (/мМ) ненасыщенной урониевой кислоты на 230 нм;
105 - объем (мкл) реакционной смеси, использованной для разбавления;
0,01 - объем (мл) фермента; и
180 - время реакции (мин);
Протеин определяли измерением поглощения раствора фермента на 280 нм и расчетом, принимая поглощение 1 мг/мл раствора протеина за 1,0.
Фукоидан, происходящий из К)е11таше11а сгаккИойа, использованной как субстрат, готовили следующим образом.
Сырую К)е11таше11а сгаззИоИа измельчали мельницей модели М-2 (Ыата К1ка1 БешакиДю) и обрабатывали 10-кратным количеством 85% метанола при 70°С в течение 2 ч. Затем ее фильтровали и остаток дополнительно обрабатывали 10-кратным количеством метанола при 70°С в течение 2 ч. После фильтрации к остатку добавляли 20-кратное количество воды. Затем смесь обрабатывали при 100°С в течение 3 ч и фильтровали, получая таким образом экстракт. Концентрацию соли в экстракте доводили до такого же уровня, как у 400 мМ раствора хлористого натрия. Затем к нему добавляли цетилпиридинхлорид до тех пор, пока не прекращалось образование осадка. После центрифугирования осадок тщательно промывали этанолом, чтобы тем самым полностью убрать цетилпиридинхлорид. Далее его подвергали обессоливанию и удалению веществ с низким молекулярным весом, используя ультрафильтрацию ультрафильтрационной мембраной (мол. вес. 100.000), фирмы Атйоп. Образованный таким образом осадок удаляли центрифугированием. Надосадочную жидкость сублимировали с получением очищенного фукоидана К)е11таше11а сга881&11а.
Анализ структуры реакции фермента
Вышеупомянутая эндофукоиданлиаза представляет собой фермент, который разрывает альфа 1^4 связь между Ό-маннозой и Όглюкурониевой кислотой в сложном полисахариде. Когда полученный выше фукоидан-И обрабатывают этим ферментом, образуются олигосахариды, имеющие структуры, представленные приведенными выше формулами (I), (II) и (III).
Часть каждой из вышеупомянутых трех фракций (а), (Ь) и (с), разделенных и очищенных на ЬЕЛЕ-БерНагоке РР подвергают пиридил-(2)аминированию по восстанавливаемому концу, используя С1усоТАС и набор реагентов С1усоТАС (оба от Такага Б1шхо). чтобы тем самым получить ПА-сахариды (ПА-а), (ПА-Ь) и (ПА-с). Эти (ПА-а), (ПА-Ь) и (ПА-с) анализировали посредством ЖХВР и исследовали различия ПАпродуктов из трех олигосахаридов, представленных формулами (I), (II) и (III).
В данном случае условия ЖХВР были следующими.
(ί) Анализ ЖХВР с использованием колонки, фракционирующей по молекулярному весу.
аппаратура: Модель Ь-6200 (НйасЫ, ЬЙ); колонка: 8ΗΟΌΕΧ 8В-803 (4,6 х 250 мм, 811о\\а Оепко);
элюент: 0,2М хлористый натрий : диметилсульфоксид =9 : 1;
детектирование: флюорометрический детектор Р-1150 (НйасЫ, ЬЙ), длина волны возбуждения: 320 нм, длина волны флюоресценции: 400 нм;
скорость потока: 1 мл/мин; и температура колонки: 50°С.
(й) Анализ ЖХВР с использованием колонки с обращенной фазой аппаратура: модель Ь-6200 (НйасЫ, ЬЙ); колонка: Ь-колонка (4,6 х 250 мм, Кадаки УакиЫп Кепка Куо-ка1);
элюент: 50 мМ уксусная кислотатриэтиламин (рН 5,5);
детектирование: флюорометрический детектор Г-1150 (НИасЫ, Ыб), длина волны возбуждения: 320 нм, длина волны флюоресценции: 400 нм;
скорость потока: 1 мл/мин; и температура колонки: 40°С.
В результате двух вышеупомянутых анализов ЖХВР все три олигосахарида, полученные разложением фукоидана-ϋ вышеуказанной эндофукоиданлиазой, были идентичны, соответственно, трем олигосахаридам, представленным формулами (I), (II) и (III).
Поэтому соединение (а) имеет структуру, в которой ненасыщенная Ό-глюкурониевая кислота и Ь-фукоза, имеющая присоединенную к ней сульфатную группу, присоединены к Όманнозе, которая представляет собой восстанавливаемый радикал; соединение (Ь) имеет структуру, в которой ненасыщенная Ό-глюкурониевая кислота и Ь-фукоза, имеющая две присоединенных к ней сульфатных группы, присоединены к Ό-маннозе, которая представляет собой восстанавливаемый радикал и имеет присоединенную к ней сульфатную группу;
и соединение (с) имеет структуру, в которой ненасыщенная Ό-глюкурониевая кислота и Ь-фукоза, имеющая присоединенную к ней сульфатную группу, присоединены к Όманнозе, которая представляет собой восстанавливаемый радикал, и к этой Ό-глюкурониевой кислоте присоединена Ό-манноза, и в свою очередь, к этой Ό-маннозе дополнительно присоединены Ό-глюкурониевая кислота и Ь-фукоза, имеющая присоединенную к ней сульфатную группу.
Как обсуждалось выше, полученный фукоидан-и имеет структуру, в которой Όглюкурониевая кислота и Ό-манноза, чередуясь, связаны друг с другом и Ь-фукоза присоединена, по меньшей мере, к одной Όманнозе.
Кроме того он имеет предпочтительную структуру, представленную следующей общей формулой (IV), в которой, по меньшей мере, одна из спиртовых гидроксильных групп сульфатирована, а η обозначает целое число, равное или большее 1.
Таким образом, когда фукоидан-ϋ обрабатывают вышеупомянутой эндофукоиданлиазой, получают олигосахариды, представленные упомянутыми формулами (I), (II) и (III).
Удельное вращение этого высушенного вымораживанием фукоидана-ϋ, измеренное высокоскоростным и высокочувствительным полярометром 8ЕРА-300 (НопЬа, Ыб.), составило -53,6°С.
Пример 5.
(1) Получение стандартного фукаиданового вещества, фукоидана-Г и фукоидана-ϋ.
Два килограмма тщательно высушенной К]е11шаше11а сгаззИойа измельчали на мельнице (Ыага К1ка1 Зехзакизйо). Полученный таким образом сухой порошок суспендировали в 9 л 80% этанола и обрабатывали при 80°С в течение 2 ч. Затем смесь фильтровали через фильтровальную бумагу, чтобы получить остаток. Этот остаток повторно промывали этанолом и фильтровали трижды таким же образом, как описано выше, чтобы получить тем самым остаток после этанольной промывки. Этот остаток суспендировали в 36 л 0,2М раствора ацетата кальция, обрабатывали при 95 °С в течение 2 ч и фильтровали. Остаток промывали 4 л 0,2М раствора ацетата кальция, получая тем самым 36 л экстракта, содержащего фукоидан из К]е11шате11а сгаззИойа. К полученному таким образом фильтрату добавляли 5% цетилпиридинхлорид до тех пор, пока не прекращалось образование осадка. Затем осадки отбирали центрифугированием и промывали, суспендируя их в 3 л 0,4М водного раствора хлористого натрия с последующим центрифугированием. После троекратного повторения процедуры промывки, к осадку добавляли 1 л 4М водного раствора хлористого натрия и смесь перемешивали. Затем к ней добавляли этанол так, чтобы получить концентрацию 80%, и смесь перемешивали и центрифугировали, получая тем самым осадок. Полученный осадок суспендировали в 80% этаноле и центрифугировали. Эти процедуры повторяли до тех пор, пока поглощение надосадочной жидкости на 260 нм не достигало нуля. Осадок растворяли в 3 л 2М водного раствора хлористого натрия. После удаления нерастворимых веществ 100 мл ОЕАЕ-СеНийпе А-800 (8е1ка§аки Кодуо) добавляли к смеси и перемешивали. Далее добавленную выше смолу удаляли фильтрацией. Фильтрат подавали на колонку с ΌΕΑΕСе11и1те А-800, доведенную до равновесия 2М водным раствором хлористого натрия и непоглощенную часть подвергали ультрафильтрации с использованием ультрафильтратора, оборудованного пористой мембраной для исключения мол. веса 100.000 или менее, чтобы полностью удалить окрашивающие вещества и хлористый натрий. Далее, нерастворимые вещества удаляли центрифугированием и фильтрацией с последующим сублимированием для получения стандартного фукоиданового вещества.
Вес указанного стандартного фукоиданового вещества составил 90 г.
Семь граммов этого сублимированного стандартного фукоиданового вещества отвешивали и растворяли в 0,2М хлористом кальции.
Затем 4.000 мл колонку с ОЕАЕ-Зерйагозе ГЕ доводили до равновесия 0,2М хлористым каль29 цием. Стандартное фукоидановое вещество, растворенное в 0,2М хлористом кальции вводили в колонку с ИЕАЕ-8ерЬагоке РР и тщательно промывали 0,2М хлористым кальцием. Далее, ее проявляли линейным градиентным элюированием хлористым натрием от 0 до 4М. Из полученных таким образом фракций, фракции, имеющие концентрацию хлористого натрия от 0,05 до 0,8М объединяли, обессоливали диализом и затем подвергали сушке вымораживанием. Таким образом получали 2,1 г фукоидана-И, существенно отделенного от фукоидана-Р.
Из числа элюированных выше фракций фракции с концентрацией хлористого натрия от 0,9 до 1,5М объединяли, обессоливали диализом и затем подвергали сушке вымораживанием. Таким образом получали 4,7 г фукоидана-Р, существенно отделенного от фукоидана-И.
Молекулярный вес фукоидана-Р определяли посредством гель-фильтрации, используя 8ерЬасгу1 8-500, и было найдено, что он имеет распределение молекулярного веса вокруг примерно 190.000.
Компоненты фукоидана-Р анализировали по методике, упомянутой в примере 4.
Составляющими сахарами для фукоиданаР были фукоза и галоктоза, и их молярное соотношение было около 10:1. Урониевая кислота и другие нейтральные сахара не содержались в заметных количествах. Молярное отношение фукозы к сульфату было около 1:2.
Однопроцентный раствор фукоидана-Р (16 мл) смешивали с 8 мл 32 мЕ/мл вышеупомянутого раствора эндофукоиданлиазы, 12 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 8,0) и 4 мл 4М хлористого натрия и инкубировали при 25°С в течение 48 ч. Продукт реакции деградации не был обнаружен, и не было также замечено превращение фукоидана-Р в низкомолекулярные вещества.
Затем удельное вращение этого высушенного вымораживанием фукоидана-Р было измерено высокоскоростным высокочувствительным поляриметром 8ЕРА- 300 (НопЬа. Ыб.) и найдено равным -135°.
(2) Сублимированный фукоидан VI, упомянутый в примере 1-(3) использовали в качестве фукоидана и продукты деградации фукоидана микроорганизмами получали нижеследующим образом.
Шестьдесят граммов вышеупомянутого сублимированного (высушенного замораживанием) фукоидана VI взвешивали, растворяли в 20 л искусственной морской воды (башапп ЬаЬога!огу), добавляли 100 г пептона и 2 г экстракта дрожжей, смесь загружали в 30литровый сосуд-ферментер и стерилизовали, засеивали штамм Р1ауоЬас!егшт кр. 8А-0082 (РЕЕМ ВР-5402) и проводили инкубацию в течение 26 ч при следующих условиях инкубации: температура 24°С, рН 7, скорость перемешивания 125 об/мин, аэрация 10 л/мин. Культураль ную среду центрифугировали для удаления клеток, обрабатывали на ультрафильтрационном приборе, оборудованном пористой тканью с молекулярным весом исключения 30.000 или менее для полного удаления низкомолекулярных веществ, и центрифугировали и фильтровали для удаления нерастворимых веществ и продуктов микробиальной деградации фукоидана, которые не были исключены пористой тканью с молекулярным весом исключения 30.000 или ниже, и сушили вымораживанием. Вес сублимированного микробиально деградированного фукоидана составил 32 г.
(3) Сублимированный фукоидан-У1, упомянутый в примере 1-(3), был обработан по методике, упомянутой в примере 5-(1) для получения фукоидана-И, и затем продукты деградации фукоидана-И с использованием эндофукоиданлиазы были получены следующим образом.
Так, 7 г вышеупомянутого высушенного замораживанием фукоидана-У! взвешивали и растворяли в 0,2М хлористом кальции. Затем 4.000 мл колонку с ИЕАЕ-8ерЬагоке РР доводили до равновесия 0,2М хлористым кальцием. После этого вышеупомянутый фукоидан, растворенный как таковой, загружали в колонку с ИЕАЕ-8ерЬагоке РР, хорошо промывали 0,2М хлористым кальцием и элюировали с градиентом от 0 до 4М хлористого натрия. Из элюированных фракций собирали те фракции, где концентрации хлористого натрия были 0,05-0,8М, обессоливали посредством диализа и сушили вымораживанием, получая фукоидан-И.
Фукоидан-И, приготовленный таким образом, смешивали с 250 мл 100 мМ Трисгидрохлоридного буфера (рН 8,0), 250 мл 0,8М хлористого натрия и 0,15 мл раствора эндофукоиданлиазы (19 Е/мл), продуцированной штаммом Р1ауоЬас!егшт кр. 8А-0082 (РЕЕМ ВР-5402) и оставляли реагировать при 25°С в течение 80 ч.
Реакционную смесь подвергали ультрафильтрации, используя ультрафильтрационную установку, оборудованную пористой тканью, исключающей молекулярный вес 3.000 или менее и, после того как низкомолекулярные вещества были полностью удалены, нерастворимое вещество удаляли методами центрифугирования и фильтрации, чтобы собрать ферментативно расщепленный фукоидан-И, который не был исключен пористой тканью, имеющей молекулярный вес исключения 3.000 или менее. Указанную фракцию обессоливали на МюгоасПухег С3 и сушили вымораживанием, получая высушенный замораживанием ферментативно расщепленный фукоидан-И.
(4) Индуцирующая апоптоз активность фукоидана-И и фукоидана-Р.
Клетки промиелоцитной лейкемии человека НЬ-60 (АТСС ССЬ-240) инкубировали при
37°С в среде ЕРМI 1640 (61Ьсо), содержащей
10% околоплодной телячьей сыворотки (1ЕН
Вю5С1Спес). обработанной при 56°С в течение 30 мин и затем суспендировали в среде А8Е 104 (Л_риото1о Со.. Ыб) таким образом, чтобы получить концентрацию 5 х 104 клеток/900 мкл. Затем суспензию вводили пипеткой в шестиячеечный планшет (Еа1еоп) в количестве 4.5 мл на ячейку. Каждый из фукоидана-Е и фукоидана-и, полученных в примере 5-(1) растворяли в 30 мМ НЕРЕ8-буфере (рН 7). содержащем 120 мМ хлористого натрия так, чтобы получить концентрацию 10 мг/мл, с последующей обработкой в автоклаве при 121°С в течение 20 мин, и 100 мкл полученного раствора добавляли к каждой из уже приготовленных суспензий с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% двуокиси углерода. В качестве контроля только вышеупомянутый буфер добавляли к таким же количествам, после чего подвергали их такой же инкубации. Число выживших клеток спустя 16 и 40 ч от начала инкубации подсчитывали по методике, описанной в Тсе11пк|ис5 ίη Т|55пе Си11иге (2б еб.. Лкакига Зйирраи. ебйеб Ьу 1арап Тщкие СиИиге 8ое1е1у. рр. 26-28). Так, подсчет проводили после окрашивания трипаном синим на гемоцитометре.
Результаты приведены на фиг. 5. Так, фиг. 5 показывает связь между временем инкубации и количеством выживших клеток в культуральной среде, когда фукоидан-И, и фукоидан-Е добавлены к культуральной среде клеток НЬ-60 до их концентрации 1 мг/мл. Абсцисса показывает время инкубации (час). тогда как ордината показывает число выживших клеток. Что касается типа сульфатированных фукозосодержащих полисахаридов, то незакрашенные кружочки относятся к фукоидану-и, тогда как черные кружочки обозначают фукоидан-Е. В данном случае число выживших клеток в культуральной среде контроля (пробы не добавлялись) спустя 16 и 40 ч после начала инкубации составили 7 х 104 клеток/мл и 1.4 х 105 клеток/мл, соответственно.
В результате было найдено, что фукоидани и фукоидан-Е индуцируют апоптоз у клеток НЬ-60. поскольку скорость размножения клеток подавлялась.
Каждый из фукоиданов, которые были разложены микроорганизмами, полученными в примере 5-(2). и фукоидан-И, который был разложен ферментом, полученным в примере 5-(3) выше, растворяли в 30 мМ буфера НЕРЕ8 (рН 7). содержащем 120 мМ хлористого натрия, чтобы получить его концентрацию 10 мг/мл, с последующей обработкой в автоклаве при 121°С в течение 20 мин и измеряли достигнутую таким образом индуцирующую апоптоз активность в соответствии с вышеупомянутой методикой, после чего были получены такие же результаты, как показанные на фиг. 5 для фукоидана-и.
Пример 6.
Зеленый чай готовили обычным способом, используя 10 г листьев зеленого чая, 0.2 г витамина С и 1.000 мл деионизированной воды. В продукте 1 по настоящему изобретению использовали фукоидан-ΙΙ примера 1 и добавляли 30 мг фукоидана на 100 мл продукта. В продукте 2 по настоящему изобретению использовали смесь (содержащую 60% фукоидана) фукоидана-ΙΙ примера 1 и экстракта, полученного из морской водоросли горячей водой по обычному способу [К)е11таше11а егаккбойа экстрагировали горячей водой при 95°С в течение одного часа обычным методом, и экстракт обрабатывали активированным углем и подвергали сушке вымораживанием (содержание фукоидана 50%); такой же материал использовали также в следующих примерах] и добавляли ее в количествах, соответствовавших содержанию 30 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. Контролем было то, где ничего не добавляли. Органолептический тест проводился 20 испытателями по пятибальной шкале (где 5 означает хорошо, тогда как 1 означает плохо) в терминах ощущения на язык, баланса вкуса, свежести вкуса и ощущения при проглатывании, и средние результатов показаны в таблице 4.
Таблица 4. Органолептическая оценка
Продукт 1 Продукт 2 Контроль
Ощущение на язык
Сладость 4.5 3.3 2.1
Гладкость 4.7 2.9 2.0
Баланс вкуса 4.2 2.7 2.0
Свежесть вкуса 4.0 2.5 2.0
Ощущение при проглатывании 4.5 3.1 2.3
Общая оценка 4.4 2.9 2.1
Оценки в таблице 4 показывают, что при сравнении с контролем продукты 1 и 2 по настоящему изобретению показали лучшее ощущение на язык, лучшие баланс и свежесть вкуса, выдающийся аромат и вкус чая и превосходный баланс вкуса.
Пример 7.
Питательный напиток готовили по обычному способу в соответствии с рецептурой, приведенной в таблице 5.
Таблица 5. Рецептура
Фруктозо-глюкозный жидкий сахар 150 г
Очищенный мед 2 г
Экстракт гуараньи 1 г
Экстракт корейского жень-шеня 0.1 г
Королевское желе 0.05 г
Витамин С 0.5 г
Никотинамид 0.1 г
Витамин В1 гидрохлорид 0.02 г
Витамин В6 гидрохлорид 0.02 г
Б-Фенилаланин 0.04 г
Б-Изолейцин 0.01 г
Лимонная кислота 1.5 г
Аромат 2 г
Деионизированная вода баланс
Всего 1.000 мл
В продукте 3 по настоящему изобретению использовали фукоидан-И примера 4 и добавляли 40 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. В продукте 4 использовали смесь (содержащую 67% фукоидана) фукоидана-И примера 4 и экстракта морской водоросли горячей водой и добавляли ее в количествах, соответствовавших содержанию 40 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. Контролем было то, где ничего не добавляли. Органолептический тест проводился таким же образом, как в примере 6. Результаты приведены в таблице 6.
Таблица 6. Органолептическая оценка
Продукт 3 Продукт 4 Контроль
Ощущение на язык
Сладость 3,0 2,5 1,8
Гладкость 3,5 2,4 1,5
Баланс вкуса 3,6 3,2 3,0
Свежесть вкуса 3,8 3,0 2,8
Ощущение при проглатывании 3,7 3,4 3,0
Общая оценка 3,4 2,9 2,4
Из таблицы 6 видно, что продукты 3 и 4 по настоящему изобретению вполне являлись освежающими напитками, имевшими улучшенные ощущения на язык, баланс вкуса, свежесть вкуса и ощущение при проглатывании по сравнению с контролем.
Пример 8.
Фукоидановый напиток концентрированного типа готовили обычным способом в соответствии с рецептурой, приведенной в таблице 7.
Таблица 7. Рецептура
Мальтозный жидкий сахар (кг) 30,00
Порошок ума (японский абрикос) (кг) 0,50
1/5 прозрачный лимонный сок (кг) 2,00
Пектин (кг) 3,00
Ангидрид лимонной кислоты (кг) 0,19
Витамин С (кг) 0,20
Аромат (кг) 1,20
Деионизированная вода баланс
Всего (литры) 1.000
рН продукта: 3,1
В продукте 5 по настоящему изобретению использовали фукоидан V, упомянутый в примере 1-(2) и добавляли 400 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. В продукте 6 по настоящему изобретению была использована смесь (содержащая 80% фукоидана) фукоидана V и экстракта морской водоросли горячей водой, и ее количество соответствовало 400 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. Поскольку продукты были напитками концентрированного типа, в качестве контроля были приготовлены Контроль 1, куда добавили 400 мг/100 мл дурановой смолы (загуститель) и Контроль 2, куда добавили 400 мг/100 мл ксантановой смолы. Их подвергли органолептическому испытанию таким же образом, как в примере 6, и ее результаты приведены в таблице 8.
Таблица 8. Органолептическая оценка
Продукт 3 Продукт 4 КопроиЛ КошроиД
Ощущение на язык
Сладость 4,0 3,7 3,5 3,4
Гладкость 4,1 3,6 3,3 3,2
Баланс вкуса 4,0 3,8 3,2 3,1
Свежесть вкуса 3,5 3,3 3,1 3,3
Ощущение при проглатывании 3,7 3,6 3,2 3,3
Общая оценка 4,0 3,7 3,3 3,2
Из таблицы 8 видно, что продукты 5 и 6 по настоящему изобретению проявили лучшее ощущение на язык и баланс вкуса по сравнению с контролем 1 и 2, что дает хорошие продукты, имеющие превосходный вкус в качестве напитков концентрированного типа. Далее, использовали фукоидан VI, упомянутый в примере 1-(3), и добавили 400 мг фукоидана на 100 мл продукта, чтобы приготовить напиток концентрированного типа, который показал такой же результат. Кроме того, использовали каждый из деградированных продуктов, полученных по примерам 5-(2) и (3), и добавляли 400 мг указанного разложенного продукта на 100 мл конечного продукта, чтобы приготовить напитки концентрированного типа, которые дали такие же результаты.
Пример 9.
Алкогольный напиток готовили обычным способом в соответствии с рецептурой, приведенной в таблице 9.
Таблица 9. Рецептура Концентрированный сок замороженных цитрусов уншу (45° по Впх) 110г
Гранулированный сахар 80г
Лимонная кислота 2г
Цитрат натрия 0,5г
Апельсиновая эссенция 2г
5% (об) водный раствор спирта баланс
Всего 1.000 мл
Примечание: Приготовленный напиток охлаждали до 5°С и затем в него вводили угольную кислоту с помощью обычного сифона для газирования.
Для продукта 7 по настоящему изобретению использовали фукоидан II примера 1 и добавляли 35 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. Для продукта 8 по настоящему изобретению использовали смесь (содержание фукоидана 55%) фукоидана II примера 1 и экстракта морской водоросли горячей водой и добавляли ее количество, соответствующее 35 мг фукоидана. В качестве контроля использовали продукт, к которому не добавляли фукоидан. Органолептическое испытание проводили таким же образом, как в примере 6, и результаты его приведены в таблице 10.
Таблица 10. Органолептическая оценка
Продукт 7 Продукт 8 Контроль
Ощущение на язык
Сладость 4,2 3,3 2,7
Гладкость 4,3 3,1 2,8
Баланс вкуса 4,0 3,5 2,5
Свежесть вкуса 3,9 3,0 2,7
Ощущение при проглатывании 3,5 2,7 2,1
Общая оценка 4,0 3,1 2,6
Как показано в таблице 10, продукты 7 и 8 по настоящему изобретению имели улучшенные ощущение на язык, баланс вкуса, свежесть вкуса и ощущение при проглатывании по сравнению с контролем. В особенности у продукта 7 кислотный вкус становился мягче, придавая продукту вкус спелого королевского апельсина.
Пример 10.
Спортивный напиток готовили обычным способом в соответствии с рецептурой, приведенной в таблице 11.
Таблица 11. Рецептура
Глюкоза 48 г
Фруктоза 7,8 г
Лимонная кислота 1,4 г
Цитрат натрия 1,0 г
Чистая соль 0,3 г
Лактат кальция 0,1 г
Хлористый магний 0,1 г
Витамин С 0,2 г
Витамин В1 гидрохлорид 0,02 г
Аромат лимонного лайма 2 г
Деионизированная вода баланс
Всего 1.000 г
Для продукта 9 по настоящему изобретению использовали фукоидан-И примера 4 и добавляли 30 мг фукоидана на 100 г конечного продукта. Для продукта 10 по настоящему изобретению использовали смесь (содержание фукоидана 75%) фукоидана-и примера 4 и экстракта морской водоросли горячей водой и добавляли ее количество, соответствующее 30 мг фукоидана. В качестве контроля использовали продукт, к которому не добавляли фукоидан. Органолептическое испытание проводили таким же образом, как в примере 6. Результаты приведены в таблице 12.
Таблица 12. Органолептическая оценка
Продукт 9 Продукт 10 Контроль
Ощущение на язык
Сладость 4,5 3,8 2,5
Гладкость 4,3 3,5 2,3
Баланс вкуса 3,9 3,5 3,2
Свежесть вкуса 3,7 3,2 2,9
Ощущение при проглатывании 4,0 3,5 2,8
Общая оценка 4,0 3,5 2,7
Из таблицы 12 видно, что по сравнению с контролем продукты 9 и 10 по настоящему изобретению имели лучшие ощущение на язык, ощущение при проглатывании и баланс вкуса, показанный превосходным балансом компонентов, и дали значительный эффект зрелого вкуса.
Пример 11.
Для приготовления сливового бренди с фруктами 1440 г 75% (вес) фруктозоглюкозного жидкого сахара, 670 мл 95% (об) спирта и 340 мл воды смешивали в пятилитровой бутыли, снабженной крышкой, и помещали в нее 1 кг незрелых слив.
Для продукта 11 по настоящему изобретению при загрузке материалов использовали фукоидан III примера 2 и добавляли 40 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. Для про дукта 12 по настоящему изобретению использовали смесь(содержание фукоидана 70%) фукоидана III и экстракта морской водоросли горячей водой и добавляли ее количество, соответствующее 40 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. В качестве контроля использовали продукт, к которому не добавляли фукоидан.
Каждую бутыль закрывали и давали ей стоять при комнатной температуре в течение двух месяцев при периодическом перемешивании. После этого в них добавляли по 1020 мл 28% (об) водного спирта, перемешивали и продолжали вызревание еще в течение двух месяцев для приготовления сливового бренди.
Каждое из полученных вызревших сливовых бренди подвергали органолептическому испытанию таким же образом, как в примере 6. Результаты приведены в таблице 13.
Таблица 13. Органолептическая оценка
Продукт 11 Продукт 12 Контроль
Ощущение на язык
Сладость 4,5 3,2 2,5
Гладкость 4,2 3,3 2,6
Баланс вкуса 4,6 4,0 2,4
Свежесть вкуса 3,8 3,5 2,7
Ощущение при проглатывании 4,2 3,4 2,8
Общая оценка 4,3 3,5 2,6
Из таблицы 13 видно, что продукты 11 и 12 по настоящему изобретению имели лучшее ощущение на язык и ощущение при проглатывании по сравнению с контролем и показали зрелый и хорошо сбалансированный вкус, подобный вкусу продукта, который вызревал длительное время.
Пример 12.
В продукте 13 по настоящему изобретению использовали гомогенизированное обычное молоко (содержавшее 88,6% вес/об воды, 2,8% вес/об протеина, 3,5% вес/об жира, 4,5% вес/об лактозы и 0,8% вес/об золы) и фукоидан I примера 1 и добавляли 30 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. В продукте 14 по настоящему изобретению использовали смесь(содержание фукоидана 80%) фукоидана I и экстракта морской водоросли горячей водой в количестве, соответствовавшем 30 мг фукоидана. В качестве контроля использовали продукт, к которому не добавляли фукоидан. Органолептическое испытание проводили таким же образом, как в примере 6. Результаты приведены в таблице 14.
Таблица 14. Органолептическая оценка
Продукт 13 Продукт 14 Контроль
Ощущение на язык
Сладость 3,6 3,0 2,1
Гладкость 3,5 2,9 2,5
Баланс вкуса 4,0 3,6 3,0
Свежесть вкуса 4,2 2,8 2,4
Ощущение при проглатывании 3,9 3,3 2,1
Общая оценка 3,8 3,1 2,4
Из таблицы 14 видно, что по сравнению с контролем продукты 13 и 14 по настоящему изобретению имели улучшенное ощущение на язык и баланс вкуса, показали большую свежесть вкуса (по сравнению с ощущением для контроля, где молоко как бы зависало на языке, т.е. плохая свежесть вкуса), благодаря чему полученным молочным продуктам можно оказать предпочтение.
Пример 13.
Соевое молоко готовили из соевых бобов обычным способом и коагулировали в коагуляторе для получения обычного соевого творога.
В продукте 15 по настоящему изобретению использовали фукоидан IV примера 2 в соевом молоке и добавляли его в количестве 40 мг фукоидана на 100 г конечного продукта. В продукте 16 по настоящему изобретению использовали смесь(содержание фукоидана 60%) фукоидана IV примера 2 и экстракта морской водоросли горячей водой и добавляли количество смеси, соответствовавшее 40 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. В качестве контроля использовали продукт, в который не вводили добавки. Органолептическое испытание проводили таким же образом, как в примере 6. Результаты приведены в таблице 15.
Таблица 15. Органолептическая оценка
Продукт 15 Продукт 16 Контроль
Ощущение на язык
Сладость 4,0 3,2 2,8
Гладкость 3,8 3,1 2,5
Текстура 3,6 3,2 2,8
Общая оценка 3,8 3,2 2,7
Из таблицы 15 видно, что по сравнению с контролем продукты 15 и 16 по настоящему изобретению имели улучшенное ощущение на язык и давали также приятное ощущение на языке, подобно соевому творогу, приготовленному отжимом через шелковую ткань, в результате чего общая органолептическая оценка была существенно улучшена.
Пример 14.
Что касается кондитерских продуктов, то шоколадный крем, леденцы и апельсиновое желе готовили следующим образом.
Шоколадный крем готовили смешением двух яичных желтков, 125 мл коровьего молока, 10 г пшеничной муки и 30 г сахара при нагревании.
Леденцы готовили следующим образом. Так, 1,2 кг сахара и 0,8 кг сиропа смешивали и растворяли в растворителе (110°С), кипятили при 120-130°С на плите, чтобы довести содержание воды до 2% или менее, и затем для приготовления леденцов добавляли 16,3 г молочной кислоты (50% раствор по весу), 10,1 г малоновой кислоты, 5,0 г карбоната кальция и соответствующее количество ароматизатора.
Апельсиновое желе готовили следующим образом. Так, 9 г каррагена (ирландский мох) смешивали со 180 г гранулированного сахара и добавляли туда 800 мл воды, после чего перемешивали и растворяли при нагревании. К смеси добавляли 10 г концентрированного фруктового сока уншу-микан (цитрусы уншу”), 2 г лимонной кислоты, 1,5 г цитрата натрия, 2 г апельсинового аромата и 1 г ароматизатора для получения конечного продукта.
Для каждого из продуктов 17 (шоколадный крем), 18 (леденцы) и 19 (апельсиновое желе) по настоящему изобретению использовали фукоидан-и примера 4 и добавляли 20 мг фукоидана на 100 г конечного продукта. Для каждого из продуктов 20 (шоколадный крем), 21 (леденцы) и 22 (апельсиновое желе) по настоящему изобретению использовали смесь (содержание фукоидана 60%) фукоидана-И примера 4 и экстракта морской водоросли горячей водой, и добавляли ее в количестве, соответствующем 20 мг фукоидана на 100 г конечного продукта. Контролем были продукты, для которых добавки не применялись. Проводили органолептические испытания, и результаты приведены в таблице 16.
Таблица 16. Органолептическая оценка
Ощущение на язык Текстура Общая оценка
Продукты 17 20 Контроль Продукты 17 20 Контроль Продукты 17 20 Контроль
Шоколадный крем 3,5 2,9 2,4 3,7 3,2 2,6 3,6 3,0 2,5
Продукты 18 21 Контроль Продукты 18 21 Контроль Продукты 18 21 Контроль
Леденцы 3,8 3,1 2,3 3,6 3,2 2,4 3,7 3,1 2,3
Продукты 19 22 Контроль Продукты 19 22 Контроль Продукты 1 19 22 Контроль
Апельсиновое желе 4,2 3,0 2,2 4,1 2,9 2,3 4,1 2,9 2,2
Из таблицы 16 видно, что продукты 17/18/19 и 20/21/22 показали улучшенную гладкость ощущения на язык, что дает мягкий вкус в целом, и также заслужили лучшую оценку по сравнению с контролем для каждого из них.
Пример 15.
Что касается мясных пастообразных продуктов, то готовили камабоко, используя рыбную пасту и колбасу, используя животное мясо.
В случае камабоко 100 г воды и 20 г соли добавляли к 1 кг размолотого мяса (категория: 8А) мелкой трески (сайды), смесь измельчали/смешивали в течение 15 мин, 40 г каждого упаковывали в виниловый мешочек, хранили в течение ночи при 5°С и варили на пару под обычным давлением, получая вареное на пару камабоко (вареную рыбную пасту).
В случае колбасы 2 кг свинины и 700 г сала измельчали на волчке с решеткой с отверстиями диаметром 5 мм, затем смешивали с 7 г перца, 3 г шалфея и 1 г муската, и смесь делили на части и упаковывали, используя свиную кишку диаметром 2 см. Затем ее готовили на пару в течение 15 мин для приготовления колбасы.
Использовали фукоидан I примера 1, и 50 мг фукоидана на 100 г продукта добавляли к камабоко (продукт 23) перед измельчением/смешиванием или к колбасе (продукт 24) перед расфасовкой. В случае камабоко в продукте 25 и колбасы в продукте 26 использовали смесь (содержание фукоидана 67%) фукоидана I примера 1 и экстракта морской водоросли горячей водой и добавляли ее в количестве, соответствующем 50 мг фукоидана на 100 г конечного продукта. Контролем были продукты, для которых добавки не применялись. Органолептические испытания проводили таким же образом, как в примере 6, и результаты приведены в таблице 17.
Таблица 17. Органолептическая оценка
Ощущение на язык Текстура Общая оценка
Продукты Контроль Продукты Контроль Продукты Контроль
23 25 23 25 23 25
Камабоко 3,8 3,4 2,7 3,7 3,0 2,6 3,7 3,2 2,6
Продукты Контроль Продукты Контроль Продукты Контроль
24 26 24 26 24 26
Колбаса 3,8 3,1 2,8 3,6 3,1 2,5 3,7 3,1 2,6
Из таблицы 17 видно, что по сравнению с контролем продукты 23/25 (камабоко) и 24/26 (колбаса) по настоящему изобретению дают более мягкое ощущение на язык и имеют улучшенную эластичность в текстуре.
Пример 16.
Готовили рамен (род китайской лапши). Так, 25,4 г лактата натрия (раствор 50% вес.), 9,4 г малата натрия и 10 г карбоната кальция добавляли к 4 кг специальной мучной смеси для рамен (пшеничная мука, содержащая специфическую щелочную соль), затем туда добавляли 1,6 л воды и смесь хорошо перемешивали. Тесто превращали в лапшу, используя домашнюю машину для изготовления лапши (8аиуо Е1есйтс).
В продукте 27 по настоящему изобретению использовали фукоидан II примера 1 и добавляли 40 мг фукоидана на 100 г конечного продукта. В продукте 28 по настоящему изобретению использовали смесь (содержание фукоидана 60%) фукоидана II примера 1 и экстракта морской водоросли горячей водой и перед добавлением воды добавляли количество смеси, соответствовавшее 40 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. В качестве контроля использовали продукт, в который не вводили добавки.
Полученную лапшу рамен варили обычным образом, и органолептическое испытание проводили таким же образом, как в примере 6. Результаты приведены в таблице 18.
Таблица 18. Органолептическая оценка
Продукт 27 Продукт 28 Контроль
Ощущение на язык 3,8 3,2 2,5
Текстура 3,5 3,0 2,8
Общая оценка 3,6 3,1 2,6
Из таблицы 18 видно, что по сравнению с контролем продукты 27 и 28 по настоящему изобретению показали улучшенное ощущение на язык и имели эластичную структуру, дающее хорошее ощущение при откусывании, благодаря чему общая оценка была высокой.
Пример 17.
Хлеб и китайские маньжу (б1ш кит или булочки с начинкой) готовили обычным образом. Составы и условия приготовления хлеба и оболочек для китайских маньжу приведены, соответственно, в таблицах 19 и 20.
Таблица 19. Рецептура и условия приготовления хлеба Рецептура для приготовления кислого теста Пшеничная мука 70 частей по весу
Дрожжи2
Пища для дрожжей0,1
Вода40
Рецептура для конечной операции замешивания Пшеничная мука 30 частей по весу
Сахар5
Соль2
Жир для рассыпчатости5
Казеин0,5
Вода2,5
Условия
Время ферментации приготовления ч (при температуре 27°С и влажности 75%) 40 мин (при температуре 38°С и влажности 85%) 36 мин(при 210°С)
Время дозревания
Время печения
Таблица 20. Рецептура и условия приготовления оболочек для китайских маньжу
Рецептура для приготовления оболочек
Пшеничная мука 100 частей по весу
Сахар 15
Соль 0,8
Разрыхлитель 1
Лярд 5
Дрожжи 3,5
Вода 43,5
Условия приготовления
Время дозревания 90 мин (при температуре 45°С и влажности 75%)
Время готовки на пару 15 мин
В продуктах 29 (хлеб) и 30 (оболочки для китайских маньжу) по настоящему изобретению использовали фукоидан IV примера 2, и добав ляли 35 мг фукоидана на 100 г хлеба или оболочек. В продуктах 31 (хлеб) и 32 (оболочки для китайских маньжу) по настоящему изобретению использовали смесь (содержание фукоидана 80%) фукоидана IV примера 2 и экстракта морской водоросли горячей водой и количество смеси, соответствовавшее 35 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта, добавляли на стадии смешения материалов. В качестве контроля использовали продукт, в который не вводились добавки.
Полученные хлеб и оболочки для китайских маньжу обертывали чистой пластиковой оберткой и оставляли их постоять при 5°С в течение 24 ч. Органолептические испытания проводили для хлеба и оболочки для китайских маньжу как таковых таким же образом, как в примере 6, и результаты приведены в таблице 21.
Таблица 21. Органолептическая оценка
Ощущение на язык Текстура Общая оценка
Продукты Контроль Продукты Контроль Продукты Контроль
29 31 29 31 29 31
Хлеб 3,3 2,0 1,5 3,0 1,8 1,3 3,1 1,9 1,4
Продукты Контроль Продукты Контроль Продукты Контроль
30 32 30 32 30 32
Оболочки 2,8 2,1 1,6 3,4 1,7 1,1 3,1 1,9 1,3
Когда хлеб и оболочки для китайских маньжу хранили при низкой температуре, их влажность ухудшается, давая ощущение сухости при еде. Однако, как показано в таблице 21, продукты 29/31 и 30/32 по настоящему изобретению показали после хранения лучшее ощущение на язык и лучшую текстуру по сравнению с контролем для каждого из них в результате хорошего замедления ухудшения органолептики, каковым образом был подтвержден значительный эффект сохранения их хорошей органолептики.
Пример 18.
Для продукта 33 по настоящему изобретению использовали приготовленное обычным способом саке (японское рисовое вино) и фукоидан-и примера 4, и добавляли 26 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. В продукте 34 по настоящему изобретению использовали смесь (содержание фукоидана 70%) фукоиданаи примера 4 и экстракта морской водоросли горячей водой, и добавляли количество смеси, соответствовавшее 25 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта.
Органолептические испытания проводили таким же образом, как в примере 6. Вкусовые и ароматические добавки вводили в продукты для оценки, и результаты приведены в таблице 22.
Таблица 22. Органолептическая оценка
Продукт 33 Продукт 34 Контроль
Вкус 3,1 3,0 3,0
Аромат 2,9 2,8 2,9
Ощущение на язык
Сладость 3,9 3,2 2,5
Гладкость 4,2 3,5 2,8
Баланс вкуса 3,5 3,1 2,9
Свежесть вкуса 3,6 3,2 2,7
Ощущение при проглатывании 3,8 3,0 2,6
Из таблицы 22 видно, что по сравнению с контролем продукты 33 и 34 по настоящему изобретению показали лучшее ощущение на язык, в особенности в терминах гладкости, и проявили также улучшенные свежесть вкуса и ощущение при проглатывании, в результате чего был получен эффект улучшения ощущений при питье как у первосортного продукта.
Пример 19.
Обычным образом приготовленные мирин (сладкое саке) и ферментированная приправа были использованы в этом примере. Так, для продуктов 35 (мирин) и 37 (ферментированная приправа) по настоящему изобретению использовали фукоидан III примера 2 и добавляли 30 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. Для продуктов 36 (мирин) и 38 (ферментированная приправа) использовали смесь (содержание фукоидана 67%) фукоидана III примера 2 и экстракта морской водоросли горячей водой, и добавляли смесь в количестве, соответствовавшем 30 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. Контролем являлись те продукты, для которых не использовали добавки.
Органолептические испытания проводили таким же образом, как в примере 6. К продуктам для оценки добавляли вкусовые добавки и ароматизаторы, и результаты приведены в таблице 23.
Таблица 23. Органолептическая оценка
Мирин Ферментированная приправа
Продукт Контроль Продукт Контроль
35 37 36 38
Вкус 2,9 2,8 2,8 2,7 2,6 2,7
Аромат 2,7 2,4 2,7 2,4 2,1 2,4
Ощущениенаязык
Сладость 3,9 3,0 2,5 3,7 2,8 2,6
Гладкость 4,1 3,2 2,7 3,8 2,9 2,4
Баланс вкуса 3,4 3,2 3,1 2,9 2,5 2,4
Свежесть вкуса 3,5 3,1 3,0 3,2 2,8 2,3
Общая оценка 3,4 3,0 2,8 3,1 2,6 2,5
Из таблицы 23 видно, что по сравнению с контролем каждого продукта, мирин (35/37) и ферментированные приправы (36/38) по настоящему изобретению показали улучшенные ощущение на язык (особенно по пунктам сладости и гладкости) и баланс вкуса, благодаря чему эти продукты эффективны как приправы для улучшения вкусовых ощущений продуктов в кулинарии.
Пример 20.
Рыбный порошок (4,7 кг), 0,8 кг сушеного лавра, 2,5 кг кунжута, 1,0 кг соли и 0,5 кг глютамата натрия смешивали с последующим гранулированием обычным методом для приготовления фурикаке (рыбная мука для приправ).
В продукте 39 по настоящему изобретению применяли фукоидан-и примера 4 и добавляли 1000 мг фукоидана на 100 г конечного продукта. В продукте 40 по настоящему изобретению применяли смесь (содержание фукоидана 60%) фукоиданаи примера 4 и экстракта морской водоросли горячей водой, и добавляли смесь в количестве, соответствовавшем 1000 мг фукоидана на 100 мл конечного продукта. Контролем являлись те продукты, для которых не использовали добавки. Продукт насыпали на вареный рис и проводили органолептическую оценку вкусовых ощущений таким же образом, как в примере 6.
По сравнению с контролем, продукты 39 и 40 по изобретению хорошо сочетались на вкус с вареным рисом, давая хорошее ощущение на языке, и не создавали грубых ощущений, благодаря чему в целом было найдено, что они улучшают качество рыбной муки для приправ.
Достоинства изобретения
Пищевой продукт или напиток по настоящему изобретению содержит фукоидан, имеющий физиологическую активность и/или продукты его деградации и, благодаря индуцирующему апоптоз действию указанного фукоидана, продукт является оздоравливающим или функциональным пищевым продуктом или напитком, проявляющим при его приеме эффект предотвращения карциногенеза и подавления рака, и, в частности, этот продукт является пищевым продуктом или напитком, содержащим функциональную морскую ткань, которая полезна для поддержания в здоровом состоянии желудка и кишечника.
Фукоидан по настоящему изобретению, в особенности, фукоидан из морских водорослей, является очень хорошим веществом, поскольку он может быть получен по низкой цене в больших количествах из съедобных морских водорослей, т.е. из съедобных продуктов, и в высшей степени безопасен. Кроме того, согласно настоящему изобретению может быть предложен фукоидан, в котором содержание альгиновой кислоты уменьшено или отсутствует. Указанный фукоидан способен улучшать вкусовые ощущения, такие как ощущение на язык, свежесть вкуса, баланс вкуса, текстуру, и т.п. без ухудшения характерной природы пищевого продукта или напитка и также способен поддерживать хорошее качество с точки зрения ощущений при еде, в результате чего он крайне полезен при производстве пищевых продуктов и напитков.

Claims (2)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фукоидансодержащий пищевой продукт, из которого частично или полностью извлечены альгины, полученный из фукоидансодержащего вещества посредством экстрагирования указанного фукоидансодержащего вещества в присутствии соли кальция.
    2. Пищевой продукт по п.1, в котором солью кальция является хлорид кальция.
    3. Фукоидансодержащий пищевой продукт, из которого частично или полностью извлечены альгины, полученный из фукоидансодержащего вещества посредством экстрагирования указанного фукоидансодержащего вещества щелочным раствором с последующим добавлением к экстракту соли кальция.
    4. Пищевой продукт по п.3, в котором щелочным раствором является раствор карбоната натрия.
    5. Пищевой продукт по п.3, в котором солью кальция является хлорид кальция.
    6. Фукоидансодержащий пищевой продукт, из которого частично или полностью извлечены альгины, полученный из фукоидансодержащего вещества посредством экстрагирования указанного фукоидансодержащего вещества щелочным раствором с последующим подкислением экстракта.
    7. Пищевой продукт по п.6, в котором щелочным раствором является раствор карбоната натрия.
    8. Пищевой продукт по любому из пп.1-7, содержащий фукоидан, полученный из морских водорослей.
    9. Пищевой продукт по п.8, в котором фукоидан является фукоиданом-ϋ и/или фукоиданом Ρ, имеющим следующие физические и химические свойства:
    физические и химические свойства фукондана-И:
    1) компонентный сахар содержит уроновую кислоту, и
  2. 2) молекулярный вес снижается под действием эндофукоиданлиазы, продуцированной Р1ауоЬасДепит 8р. БА-0082 (РЕКМ ВР-5402), обспечивая один или более продуктов, выбранных из соединений, представленных, по меньшей мере, следующими формулами (I), (II) и (III):
    физические и химические свойства фукоидана-Б:
    1) компонентный сахар по существу не содержит уроновой кислоты, и
    2) молекулярный вес по существу не снижается под действием эндофукоиданлиазы, продуцированной Б1ауоЬас!егшш δρ. 8Л-0082 (БЕЕМ ВР5402).
    10. Пищевой продукт по любому из пп.1-9, представляющий собой напиток.
    11. Пищевой продукт по любому из пп.1-10, в котором фукоидан является расщепленным фукоиданом.
    12. Пищевой продукт по любому из пп.1-11, в котором количество фукоидана, рассчитанного как фукоза, составляет 0,001 вес./вес.% или более.
    13. Вызывающий апоптоз пищевой продукт, представляющий собой фукоидансодержащий продукт по любому из пп.1-12 и содержащий фукоидан в количестве, эффективном для вызывания апоптоза.
    14. Вызывающий апоптоз пищевой продукт по п.13, представляющий собой напиток.
    15. Вызывающий апоптоз пищевой продукт по п.13 или 14, в котором фукоидан является расщепленным фукоиданом.
    16. Вызывающий апоптоз пищевой продукт по любому из пп. 13-15, в котором количество фукоидана, рассчитанного как фукоза, составляет 0,001 вес./вес.% или более.
EA199900017A 1996-06-12 1997-05-15 Фукоидансодержащие пищевые продукты, в частности, вызывающие апоптоз EA002021B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP17166696 1996-06-12
JP31859896 1996-11-15
PCT/JP1997/001664 WO1997047208A1 (fr) 1996-06-12 1997-05-15 Aliments ou boissons

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199900017A1 EA199900017A1 (ru) 1999-06-24
EA002021B1 true EA002021B1 (ru) 2001-12-24

Family

ID=26494325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900017A EA002021B1 (ru) 1996-06-12 1997-05-15 Фукоидансодержащие пищевые продукты, в частности, вызывающие апоптоз

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0916269B1 (ru)
JP (1) JP3505185B2 (ru)
CN (1) CN1081903C (ru)
AT (1) ATE329499T1 (ru)
CA (1) CA2253573C (ru)
DE (1) DE69736110T2 (ru)
EA (1) EA002021B1 (ru)
TW (1) TW536391B (ru)
WO (1) WO1997047208A1 (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3555766B2 (ja) * 1996-01-26 2004-08-18 タカラバイオ株式会社 アポトーシス誘発剤
JPH11228602A (ja) * 1998-02-09 1999-08-24 Yakult Honsha Co Ltd 免疫力強化剤及び免疫力強化食品
EP2116600B1 (en) 1998-04-23 2013-09-18 Takara Bio Inc. Method for synthesizing DNA
JP3982916B2 (ja) * 1998-07-31 2007-09-26 タカラバイオ株式会社 抗ヘリコバクター・ピロリ剤
ATE367166T1 (de) * 1999-08-20 2007-08-15 Takara Bio Inc Heilmittel
KR100594342B1 (ko) * 1999-11-30 2006-07-03 다카라 바이오 가부시키가이샤 화장료
CN1592626A (zh) * 2000-09-13 2005-03-09 宝生物工程株式会社 内环境稳定维持剂
DE10145246A1 (de) * 2001-09-13 2003-04-10 Pm Internat Ag Luxemburg Luxem Mischung enthaltend eine koffeinhaltige Substanz, insbesondere Guarana
JP2006143816A (ja) * 2004-11-17 2006-06-08 South Product:Kk 脱色フコイダンの製造方法
JP2006143817A (ja) * 2004-11-17 2006-06-08 South Product:Kk 脱色フコイダンの製造方法
US7749545B2 (en) * 2005-03-18 2010-07-06 Sakura Properties, Llc Fucoidan compositions and methods for dietary and nutritional supplements
WO2007057873A2 (en) * 2005-11-21 2007-05-24 Bioatlantis Limited Novel compositions to improve gut health and animal performance and methods of making the same
JP5374804B2 (ja) * 2006-02-23 2013-12-25 基市 塚原 健康機能性食品
WO2007097423A1 (ja) * 2006-02-27 2007-08-30 Sapporo Breweries Limited 製造方法決定支援システム
BRPI0711970A2 (pt) * 2006-06-01 2012-01-10 Sakura Properties Llc composições e métodos de fucoidano
JP5201499B2 (ja) * 2007-09-12 2013-06-05 国立大学法人九州大学 ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキット
JP5410152B2 (ja) * 2009-05-12 2014-02-05 理研ビタミン株式会社 貧血予防用組成物
KR101191887B1 (ko) 2010-04-22 2012-10-16 한국원자력연구원 우주환경에서 취식이 가능한 동결건조 미역국 및 이의 제조방법
JP5889593B2 (ja) * 2010-10-15 2016-03-22 株式会社海産物のきむらや アルコール飲料の風味改善剤
BR112013012712A2 (pt) * 2010-11-23 2016-09-06 Fmc Corp processo para isolar fucoidano e laminarina a partir de alga marinha colhida, viva
JP6012963B2 (ja) * 2011-12-28 2016-10-25 焼津水産化学工業株式会社 スティック包装ゼリー食品
CN103549016A (zh) * 2013-11-18 2014-02-05 北京三力源食品商贸有限公司 一种辅助调理“三高”人群健康的配方奶粉
CN103859514B (zh) * 2014-03-24 2016-03-02 浙江宇翔生物科技有限公司 一种海藻多糖饮品
JP6936721B2 (ja) * 2017-12-13 2021-09-22 株式会社ニップン 減塩手延べ干しめん及びその製造方法
CN109452501A (zh) * 2018-10-24 2019-03-12 大连海宝生物技术有限公司 一种含褐藻糖胶的纯天然复合饮料及制备方法
CN109430412A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 光明乳业股份有限公司 一种含岩藻多糖的功能型液态乳及其制备方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5626174A (en) * 1979-08-13 1981-03-13 Kimitsu Kagaku Kenkyusho:Kk Molding of meat
JPS5685269A (en) * 1979-12-11 1981-07-11 Kimitsu Kagaku Kenkyusho:Kk Production of tangle bearing spawn on the surface
IL85145A (en) * 1987-01-23 1994-08-26 Univ Australian Anti-metastatic pharmacological or veterinary preparations containing modified herpin with reduced anticoagulant activity
EP0293826A3 (en) * 1987-06-02 1989-05-10 Stichting REGA V.Z.W. Therapeutic and prophylactic application of sulfated polysaccharides against aids
JPH0611763B2 (ja) * 1987-09-29 1994-02-16 喜郎 板谷 フコイダンの製造法
JPH01313433A (ja) * 1988-06-13 1989-12-18 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk 抗ｈｉｖ剤
JP2502006B2 (ja) 1992-04-28 1996-05-29 オンキヨー株式会社 バイオフィ―ドバックシステム
JPH0759564A (ja) * 1993-08-23 1995-03-07 Tousa Kogaku Kenkyusho:Kk フコイダン分解酵素及びその製造方法
JP3403496B2 (ja) * 1993-09-24 2003-05-06 株式会社ヤクルト本社 抗潰瘍剤およびヘリコバクター・ピロリの定着阻害剤
JP3714426B2 (ja) * 1994-02-01 2005-11-09 株式会社糖鎖工学研究所 フコイダンオリゴ糖組成物含有癌転移抑制剤
JPH08196234A (ja) * 1995-01-21 1996-08-06 Kakouzuru Kk 栄養補助食品
JP2959996B2 (ja) * 1995-07-28 1999-10-06 株式会社バイオックス ダイエット組成物
JPH1087601A (ja) * 1996-09-13 1998-04-07 Nagase Kasei Kogyo Kk ３−スルホプロピルベタイン類の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE69736110D1 (de) 2006-07-27
EP0916269A1 (en) 1999-05-19
AU2789897A (en) 1998-01-07
EP0916269B1 (en) 2006-06-14
EP0916269A4 (en) 1999-08-11
CN1221320A (zh) 1999-06-30
JP3505185B2 (ja) 2004-03-08
DE69736110T2 (de) 2007-01-18
AU711896B2 (en) 1999-10-21
ATE329499T1 (de) 2006-07-15
TW536391B (en) 2003-06-11
WO1997047208A1 (fr) 1997-12-18
CA2253573A1 (en) 1997-12-18
EA199900017A1 (ru) 1999-06-24
CN1081903C (zh) 2002-04-03
CA2253573C (en) 2005-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA002021B1 (ru) Фукоидансодержащие пищевые продукты, в частности, вызывающие апоптоз
US7422750B2 (en) Food or beverage containing fucoidan and method of production thereof
TWI708565B (zh) 冷藏食品或冷凍食品、其等之製造方法及素材感之改良方法、以及發酵調味料組合物
JP4819849B2 (ja) アガロビオース含有組成物
US6824801B2 (en) Process for producing foods having good keeping qualities and food keeping agents
US20100040734A1 (en) Cacao Husk-Derived Water-Soluble, Dietary Fiber, Process For Its Production, Foods and Beverages Containing It And Methods For Their Preparation
JP2001204405A (ja) キャベツシロップの製造方法及び用途
JP4431195B2 (ja) 調味料組成物及びその製造方法及び該調味料組成物を用いてなる呈味改善された飲食品類
JP4559954B2 (ja) 風味改善用組成物及びそれらの使用、並びに風味改善方法
KR100478768B1 (ko) 식료품
JPH09154532A (ja) 食品の赤色着色方法
JP2003159011A (ja) アウレオバシジウム培養液を含有する食品
KR20020089921A (ko) 배추 즙을 이용한 액상 김치의 제조 방법 및 이 방법에의해 제조된 액상 김치
WO2023195538A1 (ja) サツマイモ由来のイモ蜜、その上清、又はこれら双方の粉末又は顆粒からなるイモ蜜粉
JP6755606B1 (ja) 酢酸菌含有組成物
JP2004166628A (ja) α−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法
JP4429588B2 (ja) 高脂血症改善剤の製造方法
JP4429591B2 (ja) 高脂血症改善剤の製造方法
JP2004215663A (ja) きのこ子実体熱水抽出物
BG108199A (bg) Безалкохолни зърнени напитки и метод за получаването им

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU