JP3505185B2 - 食品又は飲料 - Google Patents
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Description
も優れた食品又は飲料に関する。
酸を含有する多糖である。従来フコイダンに着目し、積
極的に食品、飲料に用いる試みは知られていなかった。
素材を利用した、食味が良く且つ健康に有用な生理作用
を有する食品及び飲料を提供することにある。
ン含有物由来のフコイダンを含有することを特徴とする
食品又は飲料に関する。
ルギン類が低減又は除去されたフコイダンを含有するこ
とを特徴とする食品又は飲料に関する。
ポトーシス誘発性を有するフコイダンを有効量含有する
ことを特徴とするアポトーシス誘発性食品又は飲料に関
する。
ルギン類が低減又は除去されたアポトーシス誘発性を有
するフコイダンを有効量含有することを特徴とするアポ
トーシス誘発性食品又は飲料に関する。
びエステル又はこれらの分解物を総称してアルギン類と
言う。
率を示すものである。
発作用を示すものである。
発作用を示すものである。
作用を示すものである。
ス誘発作用を示すものである。
おいてはこれらのフコイダンを使用することができる。
本発明においては特にフコイダン高含有の海藻、ナマコ
のフコイダンの使用が好ましい。
又はフコイダン含有物がある。
出物がある。
来の原材料からの抽出物、該抽出物の処理物が包含さ
れ、フコイダン高含有抽出物が好ましい。
は、海藻の抽出をカルシウム塩存在下で行うことにより
得られる抽出物が例示され、カルシウム塩としては例え
ば塩化カルシウムを用いることができる。
溶液で行い、抽出液に、カルシウム塩を添加し得られる
可溶性物が例示され、アルカリ性溶液としては例えば炭
酸ナトリウム溶液を用いることができ、カルシウム塩と
しては例えば塩化カルシウムを用いることができる。
溶液で行い、抽出液を酸性とした後、得られる可溶性物
が例示され、アルカリ性溶液としては例えば炭酸ナトリ
ウム溶液を用いることができる。
としては40〜200℃、1〜360分の範囲から目的に応じ選
択すれば良いが、通常50〜130℃、10〜180分の範囲より
選択して行うのが良い。
ン含有物由来の原材料の水抽出物に比べ、フコイダン含
有率が高められた物があり、更に実質的にアルギン類含
量が低減、又は除去された物が挙げられる。この場合、
従来食品や飲料に影響を与えていた、アルギン類由来の
高粘性、酸凝固性、多価金属イオンによるゲル化等の性
質を有さず、飲食品に固有の物性に影響を与えない素材
が提供できる。
が選択的に除去され、海藻臭を必要としない、食品又は
飲料への使用において特に優れている。
わち食用のフコイダン含有物を原料として大量に供給で
き、その安全性も極めて高い。
ば穀物加工品(小麦粉加工品、でんぷん類加工品、プレ
ミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、
そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等)、油脂加
工品(可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ
類、ドレッシング等)、大豆加工品(豆腐類、味噌、納
豆等)、食肉加工品(ハム、ベーコン、プレスハム、ソ
ーセージ等)、乳製品(原料乳、クリーム、ヨーグル
ト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム
等)、野菜・果実加工品(ペースト類、ジャム類、漬け
物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等)、菓子類
(チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、
餅菓子、米菓類等)、アルコール飲料(日本酒、中国
酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデ
ー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実
酒、リキュール等)、嗜好飲料(緑茶、紅茶、ウーロン
茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等)、調味料(しょ
うゆ、ソース、酢、みりん等)、缶詰・瓶詰め・袋詰め
食品(牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済
み食品)、半乾燥又は濃縮食品(レバーペースト、その
他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類)、
乾燥食品(即席面類、即席カレー、インスタントコーヒ
ー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み
食品、調理済み飲料、調理済みスープ等)、冷凍食品
(すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバークス
テーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツ
カクテル等)、固形食品、液体食品(スープ等)、香辛
料類等の農産・林産加工品、畜産加工品等が挙げられ
る。
が、調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料
の製造法による製造を挙げることができ、製造された食
品又は飲料にフコイダンが含有されていれば良く、また
食品又は飲料に有効量のアポトーシス誘発性を有するフ
コイダンを含有させることによりアポトーシス誘発性の
食品又は飲料を提供することができる。
時、更には調理・加工後にフコイダンを添加しても良い
し、調理及び加工品やその材料をフコイダンへ添加し、
フコイダンを希釈しても良い。食品又は飲料の製造にお
いては、任意の工程で、フコイダンを添加しても良い
し、食品又は飲料やその原料をフコイダンへ添加し、フ
コイダンを希釈し、食品又は飲料に含有させても良い。
また、添加は1回又は数回に渡って行ってもよい。した
がって、簡便に新規な食品又は飲料、又は有効量のフコ
イダンを含有するアポトーシス誘発作用を有するアポト
ーシス誘発性食品又は飲料を製造することができる。い
ずれの工程を経た場合も、フコイダンを含有、添加及び
/又は希釈してなる食品又は飲料、又はフコイダンを含
有、添加及び/又は希釈してなり、有効量のフコイダン
を含有するアポトーシス誘発性食品又は飲料は本発明の
食品又は飲料と定義される。
した。
液を用意し、市販のショ糖を5w/v%になるように溶解し
てショ糖液を調製した。実施例1のフコイダンIIを用
い、フコイダン含量0(対照)、0.1、0.5、1、5、1
0、20、30、40、50、100、150及び200mgw/v%を添加し
て、フコイダン入りショ糖液を舌ざわり感のまろやか
さ、なめらかさ、のどごし感及び味のバランスについて
食感面から官能評価した。パネラー20名で、5段階評価
(5良、1悪)で実施し、その結果の平均値を表1に示
した。
のバランスの面からは、フコイダン添加、すなわち0.1m
gw/v%以上で効果が認められた。
へ海藻由来のアルギン酸を0(対照)、5、10、20、3
0、40、60、80、100、150及び200mgw/v%添加してフコ
イダン及びアルギン酸の存在比が食感に及ぼす影響につ
いて、検討例1と同様にして官能評価を行い、その結果
の平均値を表2に示した。
場合が食感に及ぼす効果の官能評価が最も高く、アルギ
ン酸及びフコイダンの重量の合計値に対するフコイダン
の重量の比(フコイダン比率と以後略称)が小さくなる
につれ、食感の評価が低下した。フコイダン単独で10mg
w/v%の添加効果が見られるのは、官能評価値からは、
フコイダン比率43%以上であった。また、フコイダン単
独で5mgw/v%以上の官能評価値からはフコイダン比率13
%以上であったが、やや舌に残る食感を感じないのは27
%以上であった。
制限されず、その官能と生理活性の点より適宜選択でき
るが、例えばシステイン−硫酸法による方法で、食品又
は飲料100部当りフコース換算重量として0.001部以上、
食品としての官能又は飲料としての食味、アポトーシス
誘発作用の面及びコストの面からは好ましくは0.005〜1
0部、更に好ましくは0.01〜1.0部である。なお、本明細
書において部は重量部を意味する。
を含有すれば特にその形状に限定は無く、タブレット
状、顆粒状、カプセル状、ゲル状、ゾル状等の形状の経
口的に摂取可能な形状物も包含する。
を有効量含有し、該フコイダンの有するアポトーシス誘
発作用等によって、これらを摂取することにより発癌予
防、癌抑制効果等を有する健康食品又は飲料であり、特
に胃腸健康保持に有用な食品又は飲料である。
硫酸を含有する多糖及び/又はその分解物であり、特に
限定はない。なお褐藻植物由来のフコース含有多糖が通
常フコイダン、フコイジン、フカンと通称され、いくつ
かの分子種があることが知られているが本発明のフコイ
ダンはこれらを包含するものである。
解する方法、超音波処理など物理的に分解する方法、酵
素的に分解する方法、あるいは微生物分解方法等が挙げ
られ、本発明においては分子中にフコース硫酸を含有
し、アポトーシス誘発作用を有するフコイダン分解物を
使用することができる。
一群と、ウロン酸を数%含み構成糖にフコースやマンノ
ースを多く含む一群の分子種がある。以下、本明細書に
おいてはウロン酸を実質的に含まない方をフコイダン−
Fと称し、ウロン酸を含むフコイダンをフコイダン−U
と称し、両者の混合物を単にフコイダンと記載する。
それぞれ単独で用いても良く、また併用して用いても良
い。すなわち、純化されたフコイダン−F、フコイダン
−Uを構成成分とする食品又は飲料は本発明に包含され
るものであり、これらのフコイダン、特にフコイダン−
U含量が増加された食品又は飲料は強い健康増強効果を
有するものである。
実施例4に記載のように調製した下記理化学的性質のフ
コイダン−Uを含有する。
082(FERM BP−5402)の生産するフコイダン分解酵素に
より低分子化し、少なくとも下記式(I)、(II)、
(III)で表される化合物より選択される一種以上の化
合物が生成する。
実施例5に記載のように調製した下記理化学的性質のフ
コイダン−Fを含有する。
082(FERM BP−5402)の生産するフコダイン分解酵素に
より実質上低分子化されない。
フコイダン分解酵素生産性のフラボバクテリウム(Flav
obacterium)sp.SA−0082(FERM BP−5402)により処理
することにより、フコイダンの微生物分解物を調製する
ことができる。
ばフラボバクテリウム(Flavobacterium)sp.SA−0082
(FERM BP−5402)の生産するフコイダン分解酵素で処
理することにより、フコイダン−Uの酵素分解物を調製
することができる。またこれらの分解物より、各々の分
解物の分子量分画物を調製することができる。これらの
フコイダン分解物を含有、添加及び/又は希釈してなる
食品又は飲料も本発明の食品又は飲料である。
海藻由来抽出物を製造するに際しては、海藻としては、
紅藻類例えば海苔、てんぐさ、おごのり等、緑藻類例え
ばあおさ、褐藻類例えばかじめ、あらめ、もずく、ひじ
き、わかめ、ガゴメ昆布、マ昆布等が用いられ、本発明
においては特にフコイダン高含有藻類が適している。
コイダン高含有藻類を、例えばそのまま乾燥、粉砕して
抽出に用いても良く、またその生鮮物を細断して抽出に
用いても良い。
いかなる方法であっても良い。
程、海藻をアルコール又は含水アルコール洗浄する工程
を包含しても良く、海藻の抽出をアルコール存在下で行
っても良い。
例えば塩化カルシウム溶液による抽出操作を行い、海藻
の塩化カルシウム抽出液を調製する。
1000部で行うのが好ましく、塩化カルシウム濃度は25mM
以上で行うのが好ましい。
塩化カルシウム溶液1〜100部で行うのが好ましく、塩
化カルシウム濃度は25mM以上で行うのが好ましい。
のが好ましい。抽出条件としては、抽出液中のアルギン
類が低減され、フコイダンが効率よく抽出される条件で
あればよい。
される。不溶性成分の除去方法としては、遠心分離方
法、ろ過方法等より選択すればよい。不溶性成分除去液
中のカルシウム塩は例えば限外ろ過方法、イオン交換方
法等で除去することができる。カルシウム塩の除去液は
活性炭処理、イオン交換処理等を行うことによって更に
その海藻臭を選択的に除去することができる。
えば炭酸ナトリウム溶液による抽出操作を行い、海藻の
炭酸ナトリウム抽出液を調製する。次に該抽出液にカル
シウム塩、例えば塩化カルシウムを添加し、生成する不
溶成分を除去し、海藻由来抽出物の可溶性画分を調製す
る。
部で行うのが好ましく、炭酸ナトリウム濃度は0.1〜5
%で行うのが好ましい。
炭酸ナトリウム溶液1〜60部で行うのが好ましく、炭酸
ナトリウム濃度は0.1〜5%で行うのが好ましい。
のが好ましい。抽出条件としては、抽出液中のフコイダ
ンが効率よく抽出される条件であればよい。なお本明細
書において%は重量%を意味する。
例えば塩化カルシウムを添加し、生成する不溶性成分を
除去する。塩化カルシウムの添加量としては炭酸ナトリ
ウム抽出液に対し、アルギン類の沈殿が生じなくなるま
での量を添加すれば良く、抽出液中のアルギン類を効率
よく沈殿させる条件であればよい。生成する不溶性成分
の除去方法としては、遠心分離方法、ろ過方法等より選
択すればよい。不溶性成分除去液中の塩類、例えば炭酸
ナトリウム、塩化カルシウムは、例えば限外ろ過方法、
イオン交換方法等で除去することができる。塩類除去液
は活性炭処理、イオン交換処理等を行うことによって更
にその海藻臭を選択的に除去することができる。
えば炭酸ナトリウム溶液による抽出操作を行い、海藻の
炭酸ナトリウム抽出液を調製する。次に酸、例えば希硫
酸を使用し酸性とし、生成する不溶性成分を除去し、海
藻由来抽出物の可溶性物を調製する。
う。
液に酸溶液、例えば希硫酸溶液を添加し、生成する不溶
性成分を除去する。希硫酸の添加量としては炭酸ナトリ
ウム抽出液がpH1〜2.5となるまで添加すれば良く、抽出
液を酸性とし抽出液中のアルギン類を効率よく沈殿させ
る条件であればよい。生成する不溶性成分の除去方法と
しては、遠心分離方法、ろ過方法等より選択すればよ
い。不溶性成分除去液中の塩類は例えば限外ろ過方法、
イオン交換方法等で除去することができる。塩類除去液
は必要に応じ中和処理を行っても良く、酸性溶液、中和
溶液等の活性炭処理、イオン交換処理等を行うことによ
って、更にその海藻臭を選択的に除去することができ
る。
い。固形物を製造するに際してはスプレードライ法、凍
結乾燥法等の公知の乾燥方法より適宜選択すればよい。
め、酸性溶液やアルカリ性溶液を使用する場合低分子化
が進行し易い。加熱温度、時間、pH等を調整することに
より、任意の分解物を調製することができ、例えばゲル
ろ過処理、分子量分画膜処理等により、分解物の平均分
子量、分子量分布等を調整することができる。またフコ
イダンの分子量及び糖組成はフコイダンの原料の収穫
期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異な
り、またフコイダンの抽出時の加熱条件、pH条件等によ
り異なる。例えば酸によりフコイダンは加水分解され、
アルカリ条件下ではウロン酸のβ−脱離により、低分子
化が進行する。従って本明細書に記載したフコイダン−
U、フコイダン−Fの場合においてもその分子量、分子
量分布はその1例にすぎず、フコイダンの処理条件によ
り、その分子量、分子量分布は容易に変化させ得る。例
えば、弱アルカリ性で100℃、1時間加熱し、脱塩に際
し、ポアサイズ300の分子ふるい膜を使用すれば、分子
量分布1000から1万程度のフコイダン、フコイダン−
U、フコイダン−F等が調製できる。使用する条件によ
って任意の分子量、分子量分布のフコイダンを調製で
き、本発明のフコイダンとして使用することができる。
培養液に添加すれば、添加後1日から数日で癌細胞がア
ポトーシスを起こす。また、正常細胞に対しては毒性を
示さない。特に、食用海藻由来のフコイダン及び/又は
その分解物は安全性が高い。
るが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるもので
はない。
機(奈良機械製作所製)により粉砕した。
曹達社製)7.3kgを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物20kg
を混合した。液温12℃から液温90℃となるまで水蒸気吹
き込みにより40分間昇温させ、次いでかくはん下90〜95
℃に1時間保温し、次いで冷却し、冷却物1100リットル
を得た。
社製CNA型)を用い、冷却物の固液分離を行い、約900リ
ットルの固液分離上清液を調製した。
−FUS0382(分画分子量3万)を用い、20リットルまで
濃縮した。次いで水道水を20リットル加え、また20リッ
トルまで濃縮するという操作を5回行い、脱塩処理を行
い、フコイダンを高含有する海藻由来抽出物溶液25リッ
トルを調製した。
ix%、Ca濃度は1200ppmであった。
凍結乾燥物中に、フコイダンは65%、フコイダン−Uは
33%含有されていた。
−Uを標準物質としてHPLCで測定した。
標準物質の水溶液(0.4mg/ml)を標準液として、以下に
示す硫酸−システイン法で算出した。
酸:水=6:1溶液を氷冷中で冷却しながら添加し、充分
に冷却後、かくはんする。約20℃で3分間保持した後、
沸騰水浴中に10分間加熱する。加熱後氷水中で冷却し、
3%システイン−塩酸20μlを添加、かくはんする(発
色区)。なお対照として水20μlを添加、かくはんする
(ブランク)。かくはん後1時間放置し400nm、460nmの
吸光度をそれぞれ測定する。
nmの吸光度である。
pH7.0に中和するのに要する0.1N NaOH量(ml)で表示
した。更に糖度はブリックス糖度計で測定し、Ca濃度は
原子吸光分析法で測定した。
炭(白鷺:食添用)を添加し30分間処理後、荒ろ過、0.
8μmのフィルター処理を行い、フィルター処理ろ液
(フコイダンI)を調製した。次にそのろ液の半量を12
0℃で60分間、加圧加熱処理し、熱処理液(フコイダンI
I)を調製した。
1%Na2CO3、100mM CaCl2の10mlにそれぞれ懸濁した。
両溶液において乾燥物は完全に溶解し、アルギン類の混
入は認められなかった。
(ホソカワミクロン社製:フィッツミル)により粉砕し
た。
曹達社製)7.2kgを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物20kg
を混合した。かくはん下、液温28℃から液温95℃となる
まで水蒸気吹き込みにより95分間昇温させ、次いでかく
はん下95℃に2時間保温し、次いで冷却し、冷却物500
リットルを得た。
い、冷却物の固液分離を行い、約450リットルの固液分
離上清液を調製した。
(分画分子量3万)を用い、40リットルまで濃縮した。
次いで無菌ろ過水を通過速度40〜60リットル/hrとなる
よう連続添加し、導電率1.0mS/cm2となるまで脱塩処理
を行い、フコイダンを高含有する海藻由来抽出物溶液40
リットルを調製した。
として、セライト#545(セライト社製)0.4kg、及びシ
リカ#600−S(中央シリカ社製)0.4kgを添加し、次い
でセライト#545の0.1kg、及びシリカ#600−Sの0.1kg
でプレコートしたコンパクトフィルター(6インチ16
段、ろ紙:ADVANTEC#327)でろ過を行った。
よる連続瞬間加熱処理(98℃、60秒)を行った後、冷却
し、46リットルのフコイダン高含有海藻由来抽出物溶液
(フコイダンV)を調製した。
%、Ca濃度は920ppm、固形分1.2%、フコイダン含量は1
7mg/mlであった。なおアルギン酸、ヨウ素は検出されな
かった。
HPLCで測定した。
物質の水溶液(0.4mg/ml)を標準液として硫酸−システ
イン法で算出した。
離させ、チオ硫酸ナトリウムで滴定した。固形分は遠心
エバポレーター(60℃、18時間)処理後の乾燥重量より
求めた。
(ホソカミクロン社製:フィッツミル)により粉砕し
た。
曹達社製)7.3kgを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物20kg
を混合した。かくはん下、液温28℃から液温95℃となる
まで水蒸気吹き込みにより95分間昇温させ、次いでかく
はん下95℃に2時間保温し、次いで冷却し、冷却物500
リットルを得た。
い、冷却物の固液分離を行い、約450リットルの固液分
離上清液を調製した。
(分画分子量3万)を用い、40リットルまで濃縮した。
次いで無菌ろ過水を通過速度30リットル/hrとなるよう
連続添加し、導電率1.0mS/cm2となるまで脱塩処理を行
い、フコイダンを高含有する海藻由来抽出物溶液34リッ
トルを調製した。
リーズ社製)1.1kgを水道水20リットルに添加し、液温2
8℃から液温120℃となるまで水蒸気吹き込みにより35分
間昇温させ、次いでかくはん下で120℃、5時間保温
し、次いで冷却し、冷却物28リットルを調製した。
とペクチンの加熱処理液28リットルを混合し、無水クエ
ン酸(扶桑化学社製)により、pHを3.5に調製した。次
にろ過助剤として、セライト#545(セライト社製)0.9
kg、及びシリカ#600−S(中央シリカ社製)0.8kgを添
加し、次いでセライト#545の0.2kg、及びシリカ#600
−Sの0.2kgでプレコートしたコンパクトフィルター
(6インチ16段、ろ紙:ADVANTEC#327)でろ過を行っ
た。
レートヒーター(日阪製作所製)による連続瞬間加熱処
理(98℃、60秒)を行った後、冷却し、80リットルのフ
コイダン高含有海藻由来抽出物溶液(フコイダンVI)を
調製した。
rix%、Ca濃度は710ppm、固形分2.0%、フコイダン含量
は13mg/ml、フコイダン−U含量は6.6mg/mlであった。
なおアルギン酸、ヨウ素は検出されなかった。
の1%炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し60℃で1時間処理
後、水を加え1リットルとした。この溶液を遠心分離し
て上清を集め水を加えて4リットルとした。
生じなくなるまで添加し、生じた沈殿をろ紙で除去し
た。得られたろ液を濃縮後、マイクロアシライザーで脱
塩し、脱塩液3.6リットルを調製した。その半量を凍結
乾燥してフコイダン高含有海藻由来抽出物画分2.1g(フ
コイダンIII)を得た。次に脱塩液の残りの半量を2%
活性炭処理した後、120℃で60分間、加圧加熱処理し、
熱処理液(フコイダンIV)を調製した。
10mlにそれぞれ懸濁した。両溶液において該画分は完全
に溶解し、アルギン類の混入は認められなかった。
含有海藻由来抽出物のアポトーシス誘発作用 56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサイエ
ンス社)を10%を含むRPMI1640培地(ギブコ社製)にて
37℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞HL−60(ATCC
CCL−240)をASF104培地(味の素社製)にて5×105コ/
9mlとなるように懸濁した。この懸濁液9.0mlに対し、実
施例1、実施例2でそれぞれ調製したフコイダン高含有
海藻由来抽出物(フコイダンI、フコイダンIII)のそ
れぞれの溶液〔5mg/mlとなるよう100mMの塩化ナトリウ
ムを含む50mMヘペス緩衝液(pH7.2)に溶解し、121℃、
20分滅菌したもの〕を1ml添加し、37℃、5%二酸化炭
素存在下で18時間培養した。培養した各細胞を遠心分離
により上清と分離した。得られた細胞を10mMのエチレン
ジアミンテトラアセテート及び0.5%のナトリウムラウ
ロイルサルコシネートを含む50mMのトリス塩酸緩衝液
(pH7.8)20μlにて懸濁し、10mg/mlのリボヌクレアー
ゼA(シグマ社製)を1μl添加して50℃、30分間処理
した後、10mg/mlのプロテイネースKを1μl添加して5
0℃、1時間処理した。処理後の細胞をサンプルとし
て、2%のアガロースゲルを用いて100Vの定電圧の下で
電気泳動を行った。このゲルをエチジウムブロミド溶液
に30分間浸した後、トランスイルミネータを用いてゲル
中のDNAの状態を確認したところ、アポトーシスに特有
のDNAラダーが確認された。
れぞれ調製したフコイダン高含有海藻由来抽出物でアポ
トーシスが誘発されることが明らかとなった。
ン高含有海藻由来抽出物(フコイダンII、フコイダンI
V)をそれぞれ5mg/mlとなるよう生理食塩水に溶解し、1
21℃、20分滅菌処理をした溶液を被検液として用い、上
記の方法に準じアポトーシス誘発作用を測定し、各被検
液について同様の効果を確認した。
サイエンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブコ社製)
にて37℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞HL−60をAS
F104培地(味の素社製)にて2.5×105コ/4.5mlとなるよ
うに懸濁した。この懸濁液4.5mlに、実施例1、実施例
2でそれぞれ調製したフコイダン高含有海藻由来抽出物
(フコイダンI、フコイダンIII)〔2mg/ml、5mg/ml、1
0mg/mlとそれぞれなるよう100mMの塩化ナトリウムを含
む50mMヘペス緩衝液(pH7.2)に溶解し、121℃、20分滅
菌したもの〕をそれぞれ0.5ml添加し、37℃、5%二酸
化炭素存在下で培養した。培養開始24時間後及び44時間
後に培養液を0.5mlサンプリングし、培地中の生細胞数
を「組織培養の技術」(第2版)(朝倉出版、日本組織
培養学会編、1990年11月1日発刊、第26〜28頁)記載の
方法に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリ
パンブルー染色による方法で計測した。
ン0.2mg/ml存在下での細胞増殖を示す図であり、縦軸は
培養液1ml当りの生細胞数(×104コ/ml、以下同じ)、
横軸は培養時間(時間)を示す。図3は各フコイダン0.
5mg/ml存在下での細胞増殖を示す図であり、縦軸は培養
液1ml当りの生細胞数、横軸は培養時間(時間)を示
す。図4は各フコイダン1mg/ml存在下での細胞増殖を示
す図であり、縦軸は培養液1ml当りの生細胞数、横軸は
培養時間(時間)を示す。各図において白三角印は実施
例1で調製したフコイダン高含有海藻由来抽出物(フコ
イダンI)存在下での各時間の生細胞数、白四角印は実
施例2で調製したフコイダン高含有海藻由来抽出物(フ
コイダンIII)存在下での各時間での培養液中の生細胞
数を示す。なお対照(試料無添加)の培養液中の生細胞
数は培養24時間後で1.5×105コ/ml、44時間後で3.1×10
5コ/mlであった。
出物は培地中濃度が少なくとも200μg/ml以上あれば、H
L−60細胞を2日以内にアポトーシスにより死滅させる
ことができた。
ン高含有海藻由来抽出物(フコイダンII、フコイダンI
V、フコイダンV、フコイダンVI)をそれぞれ2〜10mg/
mlとなるよう生理食塩水に溶解し、121℃、20分滅菌処
理をした溶液を被検液として用い、上記の方法に準じア
ポトーシス誘発作用を測定し、各被検液について同様の
効果を確認した。
械製作所製)により粉砕し、得られた乾燥粉末を9リッ
トルの80%エタノールに懸濁し80℃、2時間処理した。
処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して
上記エタノール洗浄、ろ過という操作を3回繰り返しエ
タノール洗浄残渣を得た。この残渣を36リットルの0.2M
酢酸カルシウム溶液に懸濁後、95℃、2時間処理し、ろ
過した。残渣を4リットルの0.2M酢酸カルシウム溶液で
洗浄し、ガゴメ昆布のフコイダン抽出液36リットルを得
た。
外ろ過器により2リットルに濃縮し、次に、終濃度が1.
5Mとなるように食塩を添加し5%の塩化セチルピリジニ
ウムをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じ
た沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を限外
ろ過により1リットルに濃縮し、4リットルのエタノー
ルを添加し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この
沈殿に100mlの4M食塩水を添加し、良くかくはん後エタ
ノールを80%となるように添加し、かくはん後遠心分離
により沈殿を得た。この沈殿を80%エタノール中に懸濁
し遠心分離するという操作を、上清中の260nmの吸光度
がなくなるまで繰り返した。この沈殿を2Mの食塩水2リ
ットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、50ml
のDEAE−セルロファインA−800(生化学工業社製)を
添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去し
た。ろ液を2Mの食塩水で平衡化したDEAE−セルロファイ
ンA−800カラムにかけ非吸着分を排除分子量10万以下
のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、
着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過
により不溶性物質を除去し、凍結乾燥し、フコイダン−
Uを調製した。凍結乾燥フコイダン−Uの重量は15gで
あった。
イダン−Fの各塩化ナトリウム濃度における、過剰量の
塩化セチルピリジニウム存在下における沈殿形成性を図
1に示す。
トリウム濃度(M)を示す。図1中、実線及び白丸印は
本発明のフコイダン−Uの各塩化ナトリウム濃度での沈
殿形成率を示し、図1中、点線及び白三角印はフコイダ
ン−Fの各塩化ナトリウム濃度(M)での沈殿形成率を
示す。
に行った。
濃度で水及び4Mの塩化ナトリウムに溶解し、これらを様
々な割合で混合することにより様々な濃度の塩化ナトリ
ウムに溶解したフコイダン−U及びフコイダン−F溶液
を各125μlずつ調製した。次に、塩化セチルピリジニ
ウムを2.5%の濃度で水及び4Mの塩化ナトリウムに溶解
し、それらを混合することにより様々な濃度の塩化ナト
リウムに溶解した1.25%の塩化セチルピリジニウム溶液
を調製した。
ン−Fを1.25%の塩化セチルピリジニウムで完全に沈殿
させるには容量で3.2倍必要であった。そこで、各濃度
の塩化ナトリウムに溶解した2%のフコイダン−U及び
フコイダン−Fの各125μlに対して各々の濃度の塩化
ナトリウムに溶解した塩化セチルピリジニウム溶液を40
0μl添加後、十分かくはんし、30分放置後、遠心分離
し上清中の糖含量をフェノール−硫酸法〔アナリティカ
ル ケミストリー(Analytical Chemistry)、第28巻、
第350頁(1956)〕により測定し、各塩化ナトリウム濃
度下での各フコイダンの沈殿形成率を算出した。
500を用いたゲルろ過法により求めたところ、約19万を
中心とした分子量分布を示した。
リー(Journal of Biological Chemistry)、第175巻、
第595頁(1948)の記載に従いフコース量を定量した。
塩酸に0.5%の濃度で溶解し、110℃で2時間処理し、構
成単糖に加水分解した。次に、グライコタッグ(GlycoT
AG)及びグライコタッグ リージェント キット(Glyc
otag Reagent Kit)(共に宝酒造社製)を用いて加水分
解して得られた単糖の還元性末端をピリジル−(2)−
アミノ化(PA化)し、HPLCにより構成糖の比率を調べ
た。
ical Biochemistry)、第4巻、第330頁(1962)の記載
に従いウロン酸量を定量した。
urnal)、第84巻、第106頁(1962)の記載に従い硫酸含
量を定量した。
ンノース、ガラクトース、グルコース、ラムノース、キ
シロース、ウロン酸であった。
た、主要成分のフコース:マンノース:ガラクトース:
ウロン酸:硫酸基はモル比で約10:7:4:5:20であった。
フコイダン−Uの分解及び分解物の精製 精製したフコイダン−Uに下記エンド型フコイダン分
解酵素を作用させ分解物の精製を行った。
リン酸緩衝液(pH8.0)12mlと4Mの塩化ナトリウム4mlと
32mU/mlの下記エンド型フコイダン分解酵素溶液8mlを混
合し、25℃で48時間反応させた。反応の進行と共に230n
mの吸光度が増加することを確認し、本酵素によりフコ
イダン−Uが分解されていることが判明した。
により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより3つの画分
(a)、(b)、及び(c)に分離精製した。
法により調製される。
しては、該エンド型フコイダン分解酵素生産能を有する
菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体例として
は、例えばフラボバクテリウム(Flavobacterium)sp.S
A−0082株(FERM BP−5402)が挙げられる。
で、この菌株はFlavobacterium sp.SA−0082と表示さ
れ、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所[日
本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号30
5)]に平成7年3月29日よりFERM P−14872として寄
託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所にFERM BP−5402(国際寄託への移管請求日:平成
8年2月15日)として寄託されている。
し、エンド型フコイダン分解酵素を生産するものであれ
ばよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、
アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グ
リセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、
デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、
ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エ
キス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当であ
る。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マ
グネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加え
てもよい。
当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養
温度は、15℃〜30℃、培地のpHは5〜9がよく、5〜72
時間の通気かくはん培養で本エンド型フコイダン分解酵
素の生産量は最高に達する。培養条件は使用する菌株、
培地組成等に応じ、本エンド型フコイダン分解酵素の生
産量が最大になるように設定するのは当然のことであ
る。
清中にも存在する。
地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊
手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細
胞抽出液が得られる。
り精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イ
オン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲ
ルろ過等により精製を行い、他のフコイダン分解酵素を
含まない純化された本エンド型フコイダン分解酵素を得
ることができる。
にも本酵素(菌体外酵素)が大量に存在するので、菌体
内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
をグルコース0.25%、ペプトン1.0%、酵母エキス0.05
%を含む人工海水(ジャマリンラボラトリー製)pH7.5
からなる培地600mlを分注して殺菌した(120℃、20分)
2リットルの三角フラスコに接種し、24℃で24時間培養
して種培養液とした。グルコース0.25%、ペプトン1.0
%、酵母エキス0.05%、及び消泡剤(信越化学工業製KM
70)0.01%を含む人工海水(ジャマリンラボラトリー
製)pH7.5からなる培地20リットルを30リットル容のジ
ャーファーメンターに入れ120℃で20分殺菌した。冷却
後、上記の種培養液600mlを接種し、24℃で24時間、毎
分10リットルの通気量と毎分125回転のかくはん速度の
条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌
体を得た。
緩衝液(pH7.5)に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離し
て菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエン
ド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地
1ml中に5mUの活性が検出された。
モニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上
記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、50mMの食塩を含
む20mMの酢酸−リン酸緩衝液(pH7.5)で十分透析し
た。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あ
らかじめ50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液
(pH7.5)で平衡化したDEAE−セファロースFFのカラム
に吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、50mMか
ら600mMの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画
分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が4Mとなるよう
に食塩を加え、あらかじめ4Mの食塩を含む20mMのリン酸
緩衝液(pH8.0)で平衡化したフェニルセファロースCL
−4Bのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄
後、4Mから1Mの食塩のグラジエントにより溶出させ、活
性画分を集めた。次にこの活性画分を限界ろ過器で濃縮
後、あらかじめ50mM食塩を含む10mMリン酸緩衝液で平衡
化したセファクリル S−300でゲルろ過を行い活性画
分を集めた。この酵素の分子量をセファクリル S−30
0の保持時間から求めたところ約46万であった。次にこ
の活性画分に250mMの食塩を含む10mMのリン酸緩衝液(p
H7)で透析した。この酵素液を、あらかじめ250mMの食
塩を含む10mMのリン酸緩衝液(pH7)で平衡化したモノ
(Mono)Q HR5/5のカラムに吸着させ、吸着物を同緩
衝液で十分洗浄後、250mMから450mMの食塩のグラジエン
トにより溶出させ、活性画分を集め、精製酵素を得た。
以上の精製工程を表3に示す。
0μlの本酵素と、60μlの667mM塩化ナトリウムを含む
83mMリン酸緩衝液pH7.5を混合し、37℃、3時間反応さ
せた後、反応液105μlと水2mlを混合かくはんし、その
230nmにおける吸光度(AT)を測定する。対照として、
本酵素の代りに、本酵素を溶解している上記緩衝液のみ
を用いて同様の条件により反応させたもの及びフコイダ
ン溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意
し、それぞれ同様に吸光度を測定する(AB1及びAB2)。
lのマンノースとウロン酸の間のグリコシド結合を脱離
的に切断する酵素量とする。切断された結合の定量は、
脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミリモル分子吸
光係数を5.5として計算し行う。なお、酵素の活性は下
記式により求める。
係数(/mM) 105:希釈に用いる反応液の液量(μl) 0.01:酵素液量(ml) 180:反応時間(分) タンパク質の定量は、酵素液の280nmの吸光度を測定
することにより行う。その際1mg/mlのタンパク質溶液の
吸光度を1.0として計算する。
調製した。
所製)により粉砕し、10倍量の85%メタノール中で70
℃、2時間処理後、ろ過し、残渣を10倍量のメタノール
中で70℃、2時間処理し、ろ過する。残渣に20倍量の水
を加え、100℃、3時間処理しろ過により抽出液を得
る。抽出液の塩濃度を400mMの塩化ナトリウム溶液と同
じにした後、セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈
殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離する。その沈殿
を、エタノールで十分洗浄し、セチルピリジニウムクロ
リドが完全に除去できたら、限界ろ過器(ろ過膜の排除
分子量10万)(アミコン社製)により脱塩及び低分子除
去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去す
る。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコイダン
を得る。
存在するD−マンノースとD−グルクロン酸の間のα1
→4結合を脱離的に分解する酵素であり、フコイダンに
作用させると前記式(I)、(II)、及び(III)の構
造を有するオリゴ糖を生成する。
3つの画分(a)、(b)、及び(c)をそれぞれ一部
だけグライタッグ(GycoTAG)及びグライコタッグ リ
ージェント キット(GlycoTAG Reagent Kit)(共に宝
酒造社製)を用いて還元性末端を、ピリジル−(2)−
アミノ化(PA化)し、各PA化糖(PA−a)、(PA−
b)、及び(PA−c)を得た。(PA−a)、(PA−
b)、及び(PA−c)をHPLCにより分析し、上記式
(I)、(II)、及び(III)で表される3種のオリゴ
糖のPA化物との相違性を調べた。
製) 溶離液:0.2M塩化ナトリウム:ジメチルスルホキシド
=9:1 検出:蛍光検出器 F−1150(日立製作所製)にて励
起波長320nm、蛍光波長400nmで検出 流速:1ml/分 カラム温度:50℃ (イ)逆相カラムを用いたHPLC分析 装置:L−6200型(日立製作所製) カラム:L−カラム(4.6×250m)〔(財)化学薬品検
査協会〕 溶離液:50mM酢酸−トリエチルアミン(pH5.5) 検出:蛍光検出器 F−1150(日立製作所製)にて励
起波長320nm、蛍光波長400nmで検出 流速:1ml/分 カラム温度:40℃ 上記2種のHPLC分析の結果、フコイダン−Uを上記エ
ンド型フコイダン分解酵素で分解して得られた3種のオ
リゴ糖と上記式(I)、(II)、及び(III)で表され
る3種のオリゴ糖は同一のものであった。
ースに不飽和D−グルクロン酸と、硫酸基が結合したL
−フコースが結合した構造を持つ、(b)は硫酸基が結
合した還元末端残基であるD−マンノースに不飽和D−
グルクロン酸と、2個の硫酸基が結合したL−フコース
が結合した構造を持つ、(c)は還元末端残基であるD
−マンノースにD−グルクロン酸と、硫酸基が結合した
L−フコースが結合し、そのD−グルクロン酸にD−マ
ンノースが結合し、更にそのD−マンノースに不飽和D
−グルクロン酸と、硫酸基が結合したL−フコースが結
合した構造を持つ。
ン酸とD−マンノースが交互に結合した構造を持ち、少
なくとも1つ以上のD−マンノースにL−フコースが結
合している構造を有する。
(但し、式中の少なくとも1つのアルコール性水酸基は
硫酸エステル化しており、またnは1以上の整数を表
す)。
分解酵素を作用させると上記式(I)、(II)、及び
(III)で表されるオリゴ糖を生じた。
高感度旋光計SEPA−300(堀場製作所製)により測定し
たところ、−53.6度であった。
−Uの調製 ガゴメ昆布を十分乾燥後、2kgを自由粉砕機(奈良機
械製作所製)により粉砕し、得られた乾燥粉末を9リッ
トルの80%エタノールに懸濁し80℃、2時間処理した。
処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して
上記エタノール洗浄、ろ過という操作を3回繰り返しエ
タノール洗浄残渣を得た。この残渣を36リットルの0.2M
酢酸カルシウム溶液に懸濁後、95℃、2時間処理し、ろ
過した。残渣を4リットルの0.2M酢酸カルシウム溶液で
洗浄し、ガゴメ昆布のフコイダン抽出液36リットルを得
た。得られたろ液に5%の塩化セチルピリジニウムをそ
れ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離により沈
殿を集めた。この沈殿を3リットルの0.4M食塩水に懸濁
後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返し
た後沈殿に1リットルの4M食塩水を添加しよくかくはん
後エタノールを80%となるように添加し、かくはん後遠
心分離により沈殿を得た。この沈殿を80%エタノール中
に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の260nmの
吸光度がなくなるまで繰り返した。この沈殿を2Mの食塩
水3リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去
後、100mlのDEAE−セルロファインA−800(生化学工業
社製)を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により
除去した。ろ液を2Mの食塩水で平衡化したDEAE−セルロ
ファインA−800カラムにかけ非吸着分を排除分子量10
万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ
過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及
びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥し、フコイ
ダン標準物質を調製した。
た。
2Mの塩化カルシウムに溶解した。次に、4000mlのDEAE−
セファロースFFのカラムを0.2Mの塩化カルシウムで平衡
化した。0.2Mの塩化カルシウムに溶解したフコイダン標
準物質をDEAE−セファロースFFのカラムにかけ、0.2Mの
塩化カルシウムで十分洗浄し、次に、0〜4Mの塩化ナト
リウムのグラジエントで溶出させた。溶出画分の内塩化
ナトリウム濃度が0.05〜0.8Mの画分を集め透析により脱
塩後凍結乾燥し、実質的にフコイダン−Fと分離された
フコイダン−Uを2.1g得た。
1.5Mの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、実質的
にフコイダン−Uと分離されたフコイダン−Fを4.7g得
た。
いたゲルろ過法により求めたところ、約19万を中心とし
た分子量分布を示した。
分析した。
スで、そのモル比は約10:1であった。ウロン酸及びその
他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フ
コースと硫酸基のモル比は約1:2であった。
液(pH8.0)12mlと4Mの塩化ナトリウム4mlと32mU/mlの
前記エンド型フコイダン分解酵素溶液8mlを混合し、25
℃で48時間反応させた。反応による分解物の生成は認め
られず、フコイダン−Fの低分子化も認められなかっ
た。
高速・高感度旋光計SEPA−300(堀場製作所製)により
測定したところ、−135度であった。
コイダンVIの凍結乾燥物を使用し、フコイダン微生物分
解物を下記のように調製した。
トルの人工海水(ジャマリンラボラトリー製)に溶解後
ペプトン100gと酵母エキス2gを加え、30リットルのジャ
ーファーメンターに入れ滅菌後、フラボバクテリウム
sp.SA−0082株(FERM BP−5402)を植菌して培養温度2
4℃、pH7、かくはん125rpm、通気10リットル/分の条件
下26時間培養した。培養液を遠心分離し菌体を除去後、
排除分子量3万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過
装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心
分離及びろ過により不溶性物質を除去し、排除分子量3
万以下のホロファイバーで排除されないフコイダン微生
物分解物の凍結乾燥を行った。凍結乾燥フコイダン微生
物分解物の重量は32gであった。
物を使用し、実施例5−(1)記載の方法に従いフコイ
ダン−Uを調製し、フコイダン−Uのフコイダン分解酵
素分解物を下記のように調製した。
化カルシウムに溶解した。次に、4000mlのDEAE−セファ
ロースFFのカラムを0.2Mの塩化カルシウムで平衡化し
た。続いて、上記フコイダン溶解物をDEAE−セファロー
スFFのカラムにかけ、0.2Mの塩化カルシウムで十分洗浄
し、次に、0〜4Mの塩化ナトリウムのグラジエントで溶
出させた。溶出画分の内塩化ナトリウム濃度が0.05〜0.
8Mの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、フコイダ
ン−Uを得た。
トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)250mlと0.8Mの塩化ナトリ
ウム250mlと19U/mlのフラボバクテリウム sp.SA−0082
株(FERM BP−5402)の生産するエンド型フコイダン分
解酵素溶液0.15mlを混合し、25℃で80時間反応させた。
外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去
後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、排除
分子量3000以下のホロファイバーで排除されないフコイ
ダン−U酵素分解物を集めた。この画分をマイクロアシ
ライザーG3により脱塩後凍結乾燥し、フコイダン−Uの
酵素分解物の凍結乾燥物2gを得た。
誘発作用 56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサイエ
ンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブコ社製)にて37
℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞HI−60(ATCC CC
L−240)をASF104培地(味の素社製)にて5×104コ/90
0μlとなるように懸濁し、FALCON社製6ウェルプレー
ト上の各ウェルに4.5mlずつ分注した。それぞれの懸濁
液に対し、実施例5−(1)で調製したフコイダン−
F、及びフコイダン−Uを10mg/mlとなるように120mMの
塩化ナトリウムを含む30mMヘペス緩衝液(pH7)に溶解
し、121℃、20分間オートクレーブ処理したものを100μ
l添加し、37℃、5%二酸化炭素存在下で培養した。な
お、対照として上記緩衝液のみを同量添加し同様に培養
した。培養開始16時間後と40時間後の生細胞数を「組織
培養の技術」(第2版)(朝倉出版、日本組織培養学会
編)記載の方法(第26〜28頁)に従って計測した。すな
わち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で
計測した。
胞の培養液にフコイダン−U又はフコイダン−Fを1mg/
mlとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生
細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間(時
間)、縦軸は培養液中の生細胞数を示す。図5中の培地
に添加したフコース硫酸含有多糖の種類は白丸印がフコ
イダン−U、黒丸印がフコイダン−Fであることを示
す。なお対照(試料無添加)の培養液中の生細胞数は培
養16時間後で7×104コ/ml、40時間後で1.4×105コ/ml
であった。
ン−Uによりアポトーシスを誘発され細胞増殖速度が抑
制されることが判明した。
調製したフコイダン微生物分解物、フコイダン−U酵素
分解物をそれぞれ10mg/mlとなるように120mMの塩化ナト
リウムを含む30mMヘペス緩衝液(pH7)に溶解し、121
℃、20分間オートクレーブ処理したもののアポトーシス
誘発作用を上記に準じ測定し、図5のフコイダン−Uと
同様の結果を得た。
用い、常法に従って緑茶を調製した。本発明品1は、実
施例1のフコイダンIIを用い、製品100ml当りフコイダ
ン30mgを添加した。本発明品2としては、実施例1のフ
コイダンIIと通常の海藻熱水抽出した物〔常法によっ
て、ガゴメ昆布を用い、95℃、1時間熱水抽出し、抽出
液を活性炭処理した後、更に凍結乾燥した(フコイダン
比率50%)。以降の実施例で同様の物を用いた〕との混
合物(フコイダン比率60%)を用い、製品100ml当りフ
コイダン30mgに相当する量を添加した。対照は、無添加
のものとした。舌ざわり感、味のバランス、味切れ、及
びのどごし感についてパネラー20名で、5段階(5良、
1悪)の官能評価を行い、その結果の平均値を表4に示
した。
り感がよくなり、味とのバランスと味切れがよくなり、
茶の香味が引きたち、味のバランスが優れているとの評
価であった。
製した。
品100ml当りフコイダン40mgを添加した。本発明品4と
しては、実施例4のフコイダン−Uと海藻熱水抽出物と
の混合物(フコイダン比率67%)を用い、製品100ml当
りフコイダン40mgに相当する量を添加した。対照は、フ
コイダン無添加のものを用意した。実施例6と同様にし
て官能評価を行った。その結果を表6に示した。
り感、味のバランス、味切れ、のどごし感が向上し、清
涼感の富んだ飲料となった。
で、常法に従い調製した。
を用い、製品100ml当り、フコイダン400mgを添加した。
本発明品6は、フコイダンVと海藻由来の熱水抽出物と
の混合物(フコイダン比率 80%)を用い、製品100ml
当りフコイダン400mgに当る量を添加した。対照として
は、濃厚タイプのドリンクであるので、増粘剤であるジ
ュランガム400mg/100mlを添加した対照1及びキサンタ
ンガム400mg/100mlを添加した対照2を用意し、実施例
6と同様にして官能検査を行い、表8にその結果を示し
た。
比べて、舌ざわり感及び味のバランスが優れており、濃
厚タイプのドリンクとして味なれした良好な製品に仕上
がった。また実施例1−(3)記載のフコイダンVIを用
い、製品100ml当たり、フコイダン400mgを添加し、濃厚
タイプドリンクを作製し、同様の結果を得た。また実施
例5−(2)、(3)でそれぞれ調製した分解物をそれ
ぞれ用い、製品100ml当たり、分解物400mgを添加し、濃
厚タイプドリンクを作製し、同様の結果を得た。
調製した。
100ml当りフコイダン35mgを添加した。本発明品8とし
ては、実施例1のフコイダンIIと海藻熱水抽出物との混
合物(フコイダン比率55%)を用い、フコイダン35mgに
相当する量を添加した。対照は、フコイダン無添加のも
のを用いた。官能評価は、実施例6と同様にして行い、
その結果を表10に示した。
て、舌ざわり感、味のバランス、味切れ、のどごし感が
改善されていることがわかった。特に、本発明品7は酸
味がマイルドになり、完熟みかんのような風味に仕上が
った。
に従い調製した。
品100g当りフコイダン30mgを添加した。本発明品10とし
ては、実施例4のフコイダン−Uと海藻由来の熱水抽出
物との混合物(フコイダン比率75%)を用い、フコイダ
ン30mgに相当する量を添加した。対照には、フコイダン
無添加のものを用意し、実施例6と同様にして官能評価
し、表12にその結果を示した。
り感、のどごし感及び味のバランスが優れており、各成
分間の調和が優れており、味なれの効果が顕著な製品に
仕上がった。
75w/w%果糖ぶどう糖液糖1440g、95v/v%原料用アルコ
ール670ml、汲水340mlに混合した後、青梅1kgを入れ
る。
用い、製品100ml当りフコイダン40mgを添加した。本発
明品12としては、実施例2のフコイダンIIIと海藻熱水
抽出物との混合物(フコイダン比率70%)を用い、製品
100ml当りフコイダン40mgに相当する量を添加した。対
照は、フコイダン無添加とした。
かくはんし、2ヶ月間青梅を漬け込んだ。次に、28v/v
%アルコール水溶液1020mlを追加して混合し、熟成を更
に2ヶ月間続けて梅酒を得た。
にして官能評価を行い、その結果を表13に示す。
り感、のどごし感に優れ、長期熟成にみられるような味
なれ及び味のバランスの効果がみられた。
w/v%、脂肪3.5w/v%、乳糖4.5w/v%、灰分0.8w/v%)
を用い、本発明品13は、実施例1のフコイダンIを用
い、製品100ml当りフコイダン30mgを添加した。本発明
品14としては、実施例1のフコイダンIと海藻熱水抽出
物との混合物(フコイダン比率80%)を用い、フコイダ
ン30mgに相当する量を添加した。対照は、無添加のもの
を用いた。官能評価は、実施例6と同様にして行い、そ
の結果を表14に示した。
り感、味のバランスが改善され、牛乳が舌にまとわりつ
くような食感、すなわち味切れの悪さに関して、味切れ
が良くなり、牛乳が飲みやすくなった。
せ、通常のもめんごしの豆腐を調製した。
い、製品100g当りフコイダン40mgを添加した。本発明品
16としては、実施例2のフコイダンIVと海藻熱水抽出物
との混合物(フコイダン比率60%)を用い、製品100g当
り40mgのフコイダンに相当する量を添加した。対照は無
添加のものを用い、官能評価は実施例6と同様にして行
い、その結果を表15に示した。
り感が改善され、もめんごし豆腐であるが、絹ごし豆腐
のような舌ざわりの食感を生じ、総合した食感は著しく
向上する。
びオレンジゼリーを試作した。
麦粉10g、砂糖30gを用い、加温しつつ練り上げて調製し
た。
(110℃)で溶解混合した後、クッカーで120〜130℃ま
で煮上げ、水分含量2%以下とし、乳酸(50重量%溶
液)16.3g、リンゴ酸10.1g、炭酸カルシウム5.0g、及び
適量の香料を添加して調製した。
0gと混合し、水800mlを加え、混合、加熱溶解する。こ
れに、温州みかん濃縮果汁10g、クエン酸2g、クエン酸
ソーダ1.5g、オレンジアロマ2g、香料1gを加えて調製し
た。
ィ)、19(オレンジゼリー)は、それぞれ実施例4のフ
コイダン−Uを用い、製品100g当りフコイダン20mgを添
加した。本発明品20(チョコレートクリーム)、21(キ
ャンディ)、22(オレンジゼリー)としては、実施例4
のフコイダン−Uと海藻熱水抽出物との混合物(フコイ
ダン比率60%)を用い、製品100g当りフコイダン20mgに
当する量を添加した。対照は、無添加のものを用いた。
官能評価は、実施例6と同様にして行い、表16にその結
果を示した。
れぞれの対照に比べて、舌ざわり感のなめらかさが向上
し、マイルドな食感となり、総合的評価でも優れてい
た。
た。
し、コショウ7g、セージ3g、メース1gを混合し、カッテ
ィングした後、径2cmの豚腸を用いケーシングした。こ
れを15分間蒸煮してソーセージを得る。
施例1のフコイダンIを用い、製品100g当たりフコイダ
ン50mgを添加した。本発明品26(ソーセージ)として
は、実施例1のフコイダンIの海藻熱水抽出物との混合
物(フコイダン比率67%)を用い、製品100g当りフコイ
ダン50mgに相当する量を添加した。対照は、無添加のも
のを用いた。官能評価は、実施例6と同様にして行い、
その結果を表17に示した。
はそれぞれの対照に比べて、舌ざわり感の食感はマイル
ドになり、テクスチャーにも弾力性が向上した。
ラーメン専用粉(かんすい等を含む小麦粉)に乳酸ナト
リウム25.4g(50w/w%溶液)、リンゴ酸ナトリウム9.4
g、炭酸カルシウム10gを添加し、更に1.6リットルの水
を添加し、そぼろ状になるよう混合した。これを家庭用
製麺機〔三洋電気(株)製〕で製麺した。
100g当りフコイダン40mgを添加した。本発明品28として
は、実施例1のフコイダンIIと海藻熱水抽出物との混合
物(フコイダン比率60%)を用い、製品100g当りフコイ
ダン40mgに相当する量を水を添加する前に添加混合し
た。対照は、無添加のものを用いた。
理した。官能評価は、実施例6と同様にして行い、その
結果を表18に示した。
り感が向上し、テクスチャーとしても弾力性があり、歯
切れもよく、総合でも高い評価を受けた。
って試作した。
それぞれ表19及び表20に示した。
発明品29(食パン)及び30(中華まんじゅうの皮)は、
実施例2のフコイダンIVを用い、フコイダン35mgを添加
した。本発明品31(食パン)及び32(中華まんじゅうの
皮)としては、実施例2のフコイダンIVと海藻熱水抽出
物との混合物(フコイダン比率80%)を用い、フコイダ
ン35mgに相当する量を原料配合時にそれぞれ添加した。
それぞれの対照は、無添加のものを用いた。
プに包み、5℃で24時間放置した。官能評価は、放置後
の食パン及び中華まんじゅうの皮を用い、実施例6と同
様にして行い、その結果を表21に示した。
サついた食感になるが、表21で示されるように、本発明
品の29、31及び30、32はそれぞれの対照に比べて、放置
後舌ざわり感やテクスチャーの食感が優れており、舌ざ
わり感やテクスチャーの食感における劣化防止がされて
おり、食感の保持作用の効果が高いことがわかった。
施例4のフコイダン−Uを用い、製品100ml当りフコイ
ダン25mgを添加した。本発明品34としては、実施例4の
フコイダン−Uと海藻熱水抽出物との混合物(フコイダ
ン比率70%)を用い、製品100ml当りフコイダン25mgに
相当する量を添加した。対照は、無添加のものを用い
た。
に味、香りを追加し、その結果を表22に示した。
り感、特になめらかさにおいて優れており、味切れ、の
どごし感も向上し、嗜好品としての食感が改善する効果
を見出した。
本発明品35(みりん)及び37(発酵調味料)は、実施例
2のフコイダンIIIを用い、製品100ml当りフコイダン30
mgを添加した。本発明品36(みりん)及び38(発酵調味
料)としては、実施例2のフコイダンIIIと海藻熱水抽
出物との混合物(フコイダン比率67%)を用い、製品10
0ml当りフコイダン30mgに相当する量を添加した。対照
は、無添加のものを用いた。
に味、香りを追加し、その結果を表23に示した。
38は、それぞれの対照に比べ、舌ざわり感、特になめら
かさ、まろやかさ、味のバランスにおいて向上効果を示
し、調味料として調理における食材の食感改善につなが
る。
g、食塩1.0kg、グルタミン酸ソーダ0.5kgを混合し、常
法に従って造粒して調製した。
品100g当りフコイダン1000mgを添加した。本発明品40と
しては、実施例4のフコイダン−U海藻熱水抽出物との
混合物(フコイダン比率60%)を用い、製品100g当りフ
コイダン1000mgに相当する量を添加した。対照は、フコ
イダン無添加のものとした。これらふりかけを米飯にふ
りかけ、食感の官能評価を実施例6と同様にして行っ
た。
んだとき、米飯とよくなじみ、舌ざわり感がよく、ざら
つき感がなく、総合してふりかけの品質を向上させるこ
とがわかった。
及び/又はその分解物を多量に含有し、該フコイダンの
有するアポトーシス誘発作用等によって、これらを摂取
することにより発癌予防、癌抑制効果等を有する健康食
品又は飲料であり、特に胃腸健康保持に有用な機能性海
洋繊維入りの食品又は飲料である。
海藻植物、すなわち食用物質を原料として安価に大量に
供給可能であり、且つ安全性が高い点においても優れて
いる。また、本発明によりアルギン酸含量の低減又は除
去されたフコイダンが提供され、該フコイダンは飲食品
の本来の物性を損なわず、食感である舌ざわり感、味切
れ、味なれ及びテクスチャー等を改善することができ、
また食感面での良好な物性を保持する効果があるので、
飲食品の製造において極めて有用である。
Claims (18)
- 【請求項1】ガゴメ昆布またはマ昆布由来のフコイダン
を含有する食品又は飲料であって、アルギン酸及びフコ
イダンの重量の合計値に対するフコイダンの重量の比が
43%以上のフコイダン含有抽出物もしくは純化されたフ
コイダンを含有する、穀物加工品、油脂加工品、大豆加
工品、食肉加工品、乳製品、野菜・果実加工品、菓子
類、アルコール飲料、嗜好飲料から選択される食品又は
飲料。 - 【請求項2】フコイダン含有抽出物が、フコイダン含有
物からの抽出をカルシウム塩存在下で行うことにより得
られる物である請求の範囲第1項記載の食品又は飲料。 - 【請求項3】カルシウム塩が塩化カルシウムである請求
の範囲第2項記載の食品又は飲料。 - 【請求項4】フコイダン含有抽出物が、フコイダン含有
物からの抽出をアルカリ性溶液で行い、抽出液にカルシ
ウム塩を添加した後得られる可溶性物である請求の範囲
第1項記載の食品又は飲料。 - 【請求項5】アルカリ性溶液が炭酸ナトリウム溶液であ
る請求の範囲第4項記載の食品又は飲料。 - 【請求項6】カルシウム塩が塩化カルシウムである請求
の範囲第4項記載の食品又は飲料。 - 【請求項7】フコイダン含有抽出物が、フコイダン含有
物からの抽出をアルカリ性溶液で行い、抽出液を酸性と
した後得られる可溶性物である請求の範囲第1項記載の
食品又は飲料。 - 【請求項8】アルカリ性溶液が炭酸ナトリウム溶液であ
る請求の範囲第7項記載の食品又は飲料。 - 【請求項9】ガゴメ昆布またはマ昆布由来のアポトーシ
ス誘発性を有するフコイダンを含有するアポトーシス誘
発性食品又班飲料であって、アルギン酸及びフコイダン
の重量の合計値に対するフコイダンの重量の比が43%以
上のフコイダン含有抽出物もしくは純化されたフコイダ
ンを、食品又は飲料100部当たりのフコース換算重量と
して0.005〜10部含有することを特徴とする、穀物加工
品、油脂加工品、大豆加工品、食肉加工品、乳製品、野
菜・果実加工品、菓子類、アルコール飲料、嗜好飲料か
ら選択されるアポトーシス誘発性食品又は飲料。 - 【請求項10】フコイダン含有抽出物が、フコイダン含
有物からの抽出をカルシウム塩存在下で行うことにより
得られる物である請求の範囲第9項記載のアポトーシス
誘発性食品又は飲料。 - 【請求項11】カルシウム塩が塩化カルシウムである請
求の範囲第10項記載のアポトーシス誘発性食品又は飲
料。 - 【請求項12】フコイダン含有抽出物が、フコイダン含
有物からの抽出をアルカリ性溶液で行い、抽出液にカル
シウム塩を添加した後得られる可溶性物である請求の範
囲第9項記載のアポトーシス誘発性食品又は飲料。 - 【請求項13】アルカリ性溶液が炭酸ナトリウム溶液で
ある請求の範囲第12項記載のアポトーシス誘発性食品又
は飲料。 - 【請求項14】カルシウム塩が塩化カルシウムである請
求の範囲第12項記載のアポトーシス誘発性食品又は飲
料。 - 【請求項15】フコイダン含有抽出物が、フコイダン含
有物からの抽出をアルカリ性溶液で行い、抽出液を酸性
とした後得られる可溶性物である請求の範囲第9項記載
のアポトーシス誘発性食品又は飲料。 - 【請求項16】アルカリ性溶液が炭酸ナトリウム溶液で
ある請求の範囲第15項記載のアポトーシス誘発性食品又
は飲料。 - 【請求項17】フコイダンが下記理化学的性質を有する
フコイダン−U及び/又はフコイダン−Fである請求の
範囲第1項又は第9項に記載の食品又は飲料。 フコイダン−Uの理化学的性質、 (1)構成糖:ウロン酸を含有する。 (2)フラボバクテリウム(Flavobacterium)sp.SA−0
082(FERM BP−5402)の生産するフコイダン分解酵素に
より低分子化し、少なくとも下記式(I)、(II)、
(III)で表される化合物より選択される一種以上の化
合物が生成する。 フコイダン−Fの理化学的性質、 (1)構成糖:ウロン酸を実質的に含有しない。 (2)フラボバクテリウム(Flavobacterium)sp.SA−0
082(FERM BP−5402)の生産するフコダイン分解酵素に
より実質上低分子化されない。 - 【請求項18】フコイダンがフコイダン分解物である請
求の範囲第1,9又は17項に記載の食品又は飲料。
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