JPH0759564A - フコイダン分解酵素及びその製造方法 - Google Patents
フコイダン分解酵素及びその製造方法Info
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- JPH0759564A JPH0759564A JP22784793A JP22784793A JPH0759564A JP H0759564 A JPH0759564 A JP H0759564A JP 22784793 A JP22784793 A JP 22784793A JP 22784793 A JP22784793 A JP 22784793A JP H0759564 A JPH0759564 A JP H0759564A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なエキソ型のフコイダン分解酵素及びそ
の製造方法を提供する。 【構成】 フコイダンをエキソ的に分解する作用及び基
質特異性、ｐＨ３．０〜４．０付近の至適ｐＨ、４５℃
付近の至適温度、なる理化学的性質を有するフコイダン
分解酵素。真ウニ類に属する動物から抽出、精製する前
記のフコイダン分解酵素の製造方法。 【効果】 フコイダンの構造解析、分解やフコイダンオ
リゴ糖の調製などに有用である。
の製造方法を提供する。 【構成】 フコイダンをエキソ的に分解する作用及び基
質特異性、ｐＨ３．０〜４．０付近の至適ｐＨ、４５℃
付近の至適温度、なる理化学的性質を有するフコイダン
分解酵素。真ウニ類に属する動物から抽出、精製する前
記のフコイダン分解酵素の製造方法。 【効果】 フコイダンの構造解析、分解やフコイダンオ
リゴ糖の調製などに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フコイダンの構造解析
や分解及びフコイダンオリゴ糖の調製等に利用できるフ
コイダン分解酵素及びその製造方法に関する。
や分解及びフコイダンオリゴ糖の調製等に利用できるフ
コイダン分解酵素及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】藻類由来の硫酸化多糖の一種であるフコ
イダンは以前から腫瘍増殖阻止効果や抗凝血作用や脂血
清澄作用等の重要な生物活性を持つことが知られてい
る。フコイダンはフコースを主成分とする硫酸化多糖で
あり、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マン
ノース、グルコース等をも含む物が知られているが、由
来となる海藻の種類によってこれらの構成糖の種類や量
が異なる。またその構造もよくわかっておらず、分子量
も均一ではないため、フコイダンの生物活性に関する研
究はあまり進展していない。フコイダンの構造を解析し
たり分子量の調整を行うに当ってはエキソ（ exo )型や
エンド（ endo ) 型のフコイダンを分解する酵素を利用
するのが有利である。従来より、アワビ、ホタテ貝、海
洋微生物などが、それぞれある種の、フコイダンを分解
する酵素を生産する可能性が報告されている。しかしな
がら、これらの酵素は一般に生体の中に極微量含まれて
いるだけなので、これらの酵素を完全に精製するには様
々な精製方法を駆使する必要があり、フコイダンを分解
する酵素の入手は困難である。実際に、現在までに完全
に精製されたフコイダンを分解する酵素はホタテ貝由来
の酵素〔バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アン
ド・バイオケミストリー（ Biosci. Biotech. Biochem.
)、第５６巻、第４９０〜４９４頁（１９９２）、日本
農芸化学会誌、第６６巻、第３号、第３５８頁（１９９
２）〕、及びビブリオ属細菌の酵素〔バイオサイエンス
・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー、
第５６巻、第１８２９〜１８３４頁（１９９２）〕しか
ない。また、ブレチン オブ ザ ジャパニーズ ソサ
エティ オブ サイエンティフィック フィッシャリー
ズ（ Bulletin ｏf the Japanese Society of Scientif
ic Fisheries )、第５０巻、第７号、第１２５５〜１２
６０頁（１９８４）には、キタムラサキウニ（ Strongy
locentrotus nudus ) の消化管のホモジネートの未精製
の上清がフコイダンに作用して還元性物質が増加するこ
とをソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nelson ) 法で確認し
たという報告があるが、生成物の確認はなされていな
い。上述のごとく、現在フコイダンを分解する酵素の入
手は困難である。
イダンは以前から腫瘍増殖阻止効果や抗凝血作用や脂血
清澄作用等の重要な生物活性を持つことが知られてい
る。フコイダンはフコースを主成分とする硫酸化多糖で
あり、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マン
ノース、グルコース等をも含む物が知られているが、由
来となる海藻の種類によってこれらの構成糖の種類や量
が異なる。またその構造もよくわかっておらず、分子量
も均一ではないため、フコイダンの生物活性に関する研
究はあまり進展していない。フコイダンの構造を解析し
たり分子量の調整を行うに当ってはエキソ（ exo )型や
エンド（ endo ) 型のフコイダンを分解する酵素を利用
するのが有利である。従来より、アワビ、ホタテ貝、海
洋微生物などが、それぞれある種の、フコイダンを分解
する酵素を生産する可能性が報告されている。しかしな
がら、これらの酵素は一般に生体の中に極微量含まれて
いるだけなので、これらの酵素を完全に精製するには様
々な精製方法を駆使する必要があり、フコイダンを分解
する酵素の入手は困難である。実際に、現在までに完全
に精製されたフコイダンを分解する酵素はホタテ貝由来
の酵素〔バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アン
ド・バイオケミストリー（ Biosci. Biotech. Biochem.
)、第５６巻、第４９０〜４９４頁（１９９２）、日本
農芸化学会誌、第６６巻、第３号、第３５８頁（１９９
２）〕、及びビブリオ属細菌の酵素〔バイオサイエンス
・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー、
第５６巻、第１８２９〜１８３４頁（１９９２）〕しか
ない。また、ブレチン オブ ザ ジャパニーズ ソサ
エティ オブ サイエンティフィック フィッシャリー
ズ（ Bulletin ｏf the Japanese Society of Scientif
ic Fisheries )、第５０巻、第７号、第１２５５〜１２
６０頁（１９８４）には、キタムラサキウニ（ Strongy
locentrotus nudus ) の消化管のホモジネートの未精製
の上清がフコイダンに作用して還元性物質が増加するこ
とをソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nelson ) 法で確認し
たという報告があるが、生成物の確認はなされていな
い。上述のごとく、現在フコイダンを分解する酵素の入
手は困難である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、フコ
イダンに関する研究に有用な、新規なエキソ型のフコイ
ダン分解酵素、及びその製造方法を提供することにあ
る。
イダンに関する研究に有用な、新規なエキソ型のフコイ
ダン分解酵素、及びその製造方法を提供することにあ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするフコイダン分解酵素に関する。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエキソ的に分
解する。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは３．０〜４．０付
近にある。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は４５℃付近であ
る。 また本発明の第２の発明は、上記第１の発明のフコイダ
ン分解酵素の製造方法に関する発明であって、真ウニ類
に属する動物から抽出、精製することを特徴とする。
発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするフコイダン分解酵素に関する。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエキソ的に分
解する。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは３．０〜４．０付
近にある。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は４５℃付近であ
る。 また本発明の第２の発明は、上記第１の発明のフコイダ
ン分解酵素の製造方法に関する発明であって、真ウニ類
に属する動物から抽出、精製することを特徴とする。
【０００５】以下本発明について詳細に説明する。本発
明に使用される原材料は真ウニ類に属する動物であれば
特に限定されるものではない。また本発明のフコイダン
分解酵素を採取するのに用いる部位は特に限定されない
が、消化管壁や生殖巣が利用できる。本発明のフコイダ
ン分解酵素を抽出精製する際には、例えばキタムラサキ
ウニの消化管壁を集め、通常用いられる細胞破壊手段、
例えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕し、無細胞抽出
液を得る。次いで、この抽出液から通常用いられる精製
手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、
塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、疎水結合カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、
凍結乾燥などにより精製を行い、純化されたフコイダン
分解酵素を得ることができる。
明に使用される原材料は真ウニ類に属する動物であれば
特に限定されるものではない。また本発明のフコイダン
分解酵素を採取するのに用いる部位は特に限定されない
が、消化管壁や生殖巣が利用できる。本発明のフコイダ
ン分解酵素を抽出精製する際には、例えばキタムラサキ
ウニの消化管壁を集め、通常用いられる細胞破壊手段、
例えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕し、無細胞抽出
液を得る。次いで、この抽出液から通常用いられる精製
手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、
塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、疎水結合カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、
凍結乾燥などにより精製を行い、純化されたフコイダン
分解酵素を得ることができる。
【０００６】本発明のフコイダン分解酵素の酵素化学的
及び理化学的性質は次のとおりである。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエキソ的に分
解する。本発明者らは、以下に述べるごとく、本発明の
エキソ型フコイダン分解酵素の酵素反応生成物をを２−
アミノピリジンを用いた蛍光標識方法によるＨＰＬＣ分
析及び質量分析計による測定で決定した。後述の方法に
より精製したヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製）
に本発明のフコイダン分解酵素を後述の酵素活性測定方
法に記載した条件に従って１８時間反応させた後、パル
ステーションモデル４０００及びパルステーションピリ
ジルアミネーションリエイジェントキット（共に宝酒造
社製）を用い、各々の取扱い説明書に従って生成物の還
元末端をピリジルアミノ化（ＰＡ化）し、このＰＡ化し
た反応液をＨＰＬＣにより分析した。使用したカラムは
ショウデックス（ Shodex ) ＳＢ−８０３（昭和電工社
製）で、蛍光検出器（日立製作所製、Ｆ−１１５０、Ｅ
ｘ ３２０ｎｍ／Ｅｍ ４００ｎｍ）により検出した。
対照として、本発明のフコイダン分解酵素標品の代り
に、オートクレーブで１２０℃、５分の処理により変性
させた本発明の酵素の精製標品を用いて同様の条件によ
り反応させ、分析を行った。また、フコイダンを酸分解
〔カーボハイドレート・リサーチ（ CarbohydrateResea
rch )、第１３巻、第１６７〜１６９頁（１９７０）〕
して得られたフコース硫酸をＰＡ化してＨＰＬＣ分析用
のマーカーとした。なお、この酸分解で得られた単糖が
フコース硫酸である確認は質量分析計でネガティブモー
ドでの検出で行った。質量分析計は、高性能四重極三連
質量分析計ＡＰＩ III（パーキン エルマ サイエック
ス社製）を用いた。
及び理化学的性質は次のとおりである。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエキソ的に分
解する。本発明者らは、以下に述べるごとく、本発明の
エキソ型フコイダン分解酵素の酵素反応生成物をを２−
アミノピリジンを用いた蛍光標識方法によるＨＰＬＣ分
析及び質量分析計による測定で決定した。後述の方法に
より精製したヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製）
に本発明のフコイダン分解酵素を後述の酵素活性測定方
法に記載した条件に従って１８時間反応させた後、パル
ステーションモデル４０００及びパルステーションピリ
ジルアミネーションリエイジェントキット（共に宝酒造
社製）を用い、各々の取扱い説明書に従って生成物の還
元末端をピリジルアミノ化（ＰＡ化）し、このＰＡ化し
た反応液をＨＰＬＣにより分析した。使用したカラムは
ショウデックス（ Shodex ) ＳＢ−８０３（昭和電工社
製）で、蛍光検出器（日立製作所製、Ｆ−１１５０、Ｅ
ｘ ３２０ｎｍ／Ｅｍ ４００ｎｍ）により検出した。
対照として、本発明のフコイダン分解酵素標品の代り
に、オートクレーブで１２０℃、５分の処理により変性
させた本発明の酵素の精製標品を用いて同様の条件によ
り反応させ、分析を行った。また、フコイダンを酸分解
〔カーボハイドレート・リサーチ（ CarbohydrateResea
rch )、第１３巻、第１６７〜１６９頁（１９７０）〕
して得られたフコース硫酸をＰＡ化してＨＰＬＣ分析用
のマーカーとした。なお、この酸分解で得られた単糖が
フコース硫酸である確認は質量分析計でネガティブモー
ドでの検出で行った。質量分析計は、高性能四重極三連
質量分析計ＡＰＩ III（パーキン エルマ サイエック
ス社製）を用いた。
【０００７】その結果を図１及び図２に示す。すなわち
図１は精製したヒバマタ由来のフコイダンに本発明のフ
コイダン分解酵素を作用させ、その反応生成物をＰＡ化
してＨＰＬＣ分析を行った際のクロマトグラムである。
図２はフコイダンを酸分解して得られたフコース硫酸を
ＰＡ化してＨＰＬＣ分析を行った際のクロマトグラムで
ある。両図において、縦軸は相対蛍光強度、横軸及び図
中の数字は保持時間（分）を示す。図中、図１の矢印ａ
のピークはＰＡ化された反応生成物の溶出位置を示し、
図２の矢印ｂのピークはＰＡ化されたフコース硫酸の溶
出位置を示す。矢印ａとｂの溶出時間を比較すると溶出
時間が一致していた。このことから、本発明のフコイダ
ン分解酵素の反応生成物がフコース硫酸であることが示
唆された。
図１は精製したヒバマタ由来のフコイダンに本発明のフ
コイダン分解酵素を作用させ、その反応生成物をＰＡ化
してＨＰＬＣ分析を行った際のクロマトグラムである。
図２はフコイダンを酸分解して得られたフコース硫酸を
ＰＡ化してＨＰＬＣ分析を行った際のクロマトグラムで
ある。両図において、縦軸は相対蛍光強度、横軸及び図
中の数字は保持時間（分）を示す。図中、図１の矢印ａ
のピークはＰＡ化された反応生成物の溶出位置を示し、
図２の矢印ｂのピークはＰＡ化されたフコース硫酸の溶
出位置を示す。矢印ａとｂの溶出時間を比較すると溶出
時間が一致していた。このことから、本発明のフコイダ
ン分解酵素の反応生成物がフコース硫酸であることが示
唆された。
【０００８】次に、上記で使用したものと同様の酵素反
応液を１８〜２０時間反応させ、その生成物を質量分析
計により分析した。結果を図３に示す。すなわち図３は
本発明のフコイダン分解酵素の反応生成物を質量分析計
で測定した際のマススペクトル図である。縦軸は相対強
度（％）、横軸はｍ／ｚ値を示し、図中の矢印ａのピー
クは本発明のフコイダン分解酵素の生成物のｍ／ｚ値を
示す。フコース硫酸のｍ／ｚ値は２４３であるので、矢
印ａピークのｍ／ｚ値（２４３）と一致する。よって、
この結果からも本発明のフコイダン分解酵素の反応生成
物がフコース硫酸であることが示唆された。以上、２つ
の分析結果より、本発明のフコイダン分解酵素はフコイ
ダンをエキソ的に切断してフコース硫酸を生成している
ことがわかった。
応液を１８〜２０時間反応させ、その生成物を質量分析
計により分析した。結果を図３に示す。すなわち図３は
本発明のフコイダン分解酵素の反応生成物を質量分析計
で測定した際のマススペクトル図である。縦軸は相対強
度（％）、横軸はｍ／ｚ値を示し、図中の矢印ａのピー
クは本発明のフコイダン分解酵素の生成物のｍ／ｚ値を
示す。フコース硫酸のｍ／ｚ値は２４３であるので、矢
印ａピークのｍ／ｚ値（２４３）と一致する。よって、
この結果からも本発明のフコイダン分解酵素の反応生成
物がフコース硫酸であることが示唆された。以上、２つ
の分析結果より、本発明のフコイダン分解酵素はフコイ
ダンをエキソ的に切断してフコース硫酸を生成している
ことがわかった。
【０００９】（II) 酵素活性の測定方法 フコイダン分解酵素の活性の測定は以下の様にして行っ
た。 （１）市販フコイダンの精製 １ｇのヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製）を５０
ｍｌの２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解し、同緩衝液で
十分透析後、遠心分離して不溶物を除き、あらかじめ２
００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ２．５）で平衡化した２５０ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロース（ Sepharose )ＦＦ（ファルマシア
社製）を詰めたカラムに流す。同カラムを、２００ｍＭ
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ２．５）で洗浄し、次に２００〜３０００ｍＭの
塩化ナトリウムでグラジエント溶出し、８００〜２００
０ｍＭの溶出画分を集め、限外ろ過により脱塩、濃縮し
４０ｍｌの精製フコイダンを得た。
た。 （１）市販フコイダンの精製 １ｇのヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製）を５０
ｍｌの２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解し、同緩衝液で
十分透析後、遠心分離して不溶物を除き、あらかじめ２
００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ２．５）で平衡化した２５０ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロース（ Sepharose )ＦＦ（ファルマシア
社製）を詰めたカラムに流す。同カラムを、２００ｍＭ
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ２．５）で洗浄し、次に２００〜３０００ｍＭの
塩化ナトリウムでグラジエント溶出し、８００〜２００
０ｍＭの溶出画分を集め、限外ろ過により脱塩、濃縮し
４０ｍｌの精製フコイダンを得た。
【００１０】こうして得られた精製フコイダンを用い
て、以下の方法でフコイダン分解酵素の活性を測定し
た。 （２）酵素活性の測定方法 上記精製フコイダン溶液１００μｌと１２５ｍＭの塩化
ナトリウムを含む５０ｍＭの酢酸・リン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ３．５）１００μｌを加え、適当に希釈した
フコイダン分解酵素を５０μｌ加えてよくかくはんし３
７℃で１８時間保温する。別に対照としてフコイダン溶
液の代りに水を加えたものと、酵素溶液の代りに酵素が
溶解している緩衝液を加えたものも同条件で保温する。
これらの反応液に含まれる還元糖量をソモジ−ネルソン
法（福井作蔵著、還元糖の定量法、第２版、第９頁、学
会出版センター、１９９０年発行）により測定し、別に
Ｌ−フコースを標準物質として作成した検量線よりＬ−
フコース当量を求める。その後、下記の式（数１）より
酵素溶液の活性を求める。
て、以下の方法でフコイダン分解酵素の活性を測定し
た。 （２）酵素活性の測定方法 上記精製フコイダン溶液１００μｌと１２５ｍＭの塩化
ナトリウムを含む５０ｍＭの酢酸・リン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ３．５）１００μｌを加え、適当に希釈した
フコイダン分解酵素を５０μｌ加えてよくかくはんし３
７℃で１８時間保温する。別に対照としてフコイダン溶
液の代りに水を加えたものと、酵素溶液の代りに酵素が
溶解している緩衝液を加えたものも同条件で保温する。
これらの反応液に含まれる還元糖量をソモジ−ネルソン
法（福井作蔵著、還元糖の定量法、第２版、第９頁、学
会出版センター、１９９０年発行）により測定し、別に
Ｌ−フコースを標準物質として作成した検量線よりＬ−
フコース当量を求める。その後、下記の式（数１）より
酵素溶液の活性を求める。
【００１１】
【数１】〔（Ｔ−Ｅ−Ｆ）×Ａ×ｄｆ〕／（Ｂ×Ｃ）＝
（Ｕ／ｍｌ）
（Ｕ／ｍｌ）
【００１２】Ｔ ： 反応液中に生成した還元力のＬ
−フコース当量（μｍｏｌ／ｍｌ） Ｅ ： フコイダンの代りに水を用いた反応液中に生
成した還元力のＬ−フコース当量（μｍｏｌ／ｍｌ） Ｆ ： 酵素溶液の代りに酵素が溶解している緩衝液
を加えた反応液中に生成した還元力のＬ−フコース当量
（μｍｏｌ／ｍｌ） Ａ ： 反応液の液量（ｍｌ） Ｂ ： 反応に使用した酵素液の液量（ｍｌ） Ｃ ： 反応時間（分） ｄｆ ： 酵素の希釈倍率
−フコース当量（μｍｏｌ／ｍｌ） Ｅ ： フコイダンの代りに水を用いた反応液中に生
成した還元力のＬ−フコース当量（μｍｏｌ／ｍｌ） Ｆ ： 酵素溶液の代りに酵素が溶解している緩衝液
を加えた反応液中に生成した還元力のＬ−フコース当量
（μｍｏｌ／ｍｌ） Ａ ： 反応液の液量（ｍｌ） Ｂ ： 反応に使用した酵素液の液量（ｍｌ） Ｃ ： 反応時間（分） ｄｆ ： 酵素の希釈倍率
【００１３】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌのＬ−フコース当量の還元力を生成させ
る酵素量とする。タンパク質の定量は、酵素液の２８０
ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その際１ｍ
ｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算
した。
間に１μｍｏｌのＬ−フコース当量の還元力を生成させ
る酵素量とする。タンパク質の定量は、酵素液の２８０
ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その際１ｍ
ｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算
した。
【００１４】（III)至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは３．
０〜４．０付近にある（図４）。 すなわち図４は、本酵素のｐＨと相対活性の関係を表す
グラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示
す。
０〜４．０付近にある（図４）。 すなわち図４は、本酵素のｐＨと相対活性の関係を表す
グラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示
す。
【００１５】（IV) 至適温度：本酵素の至適温度は４５
℃付近である（図５）。 すなわち図５は、本酵素の温度と相対活性の関係を表す
グラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度
（℃）を示す。
℃付近である（図５）。 すなわち図５は、本酵素の温度と相対活性の関係を表す
グラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度
（℃）を示す。
【００１６】
【実施例】以下に本発明によるフコイダン分解酵素の製
造方法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実施例
の範囲のみに限定されるものではない。
造方法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実施例
の範囲のみに限定されるものではない。
【００１７】実施例１ 以下の操作は４℃で行った。キタムラサキウニ（３０ｋ
ｇ）の消化管壁及び一部の消化管内容物１５００ｇを常
法によりアセトンパウダー（１６１ｇ）とし、２．５リ
ットルの１０ｍＭ酢酸リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）に懸濁し、２０時間かくはん後遠心分離し上清
を得た。その上清に７０％飽和となるように硫安を加え
１時間かくはん後遠心分離し上清を得た。その上清に９
０％飽和となるように硫安を加え１時間かくはん後遠心
分離し沈殿を得た。その沈殿を１０ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、１０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４．５）で透析して酵素液（１６６ｍ
ｌ）を得た。この酵素液を遠心分離した得られた上清に
対し、ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）
を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。その活性
画分を集め１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲ（ファル
マシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーを行っ
た。この活性フラクションを集め、限外ろ過により濃縮
し、再びセファクリルＳ−２００ＨＲを用いたカラムク
ロマトグラフィーを行った。この活性画分を集め精製フ
コイダン分解酵素１９１ｍＵを得た。ゲルろ過法（セフ
ァクリルＳ−２００ＨＲ）により測定された精製フコイ
ダン分解酵素の分子量は約１０万であった。以上の精製
工程の各結果を表１に示す。
ｇ）の消化管壁及び一部の消化管内容物１５００ｇを常
法によりアセトンパウダー（１６１ｇ）とし、２．５リ
ットルの１０ｍＭ酢酸リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）に懸濁し、２０時間かくはん後遠心分離し上清
を得た。その上清に７０％飽和となるように硫安を加え
１時間かくはん後遠心分離し上清を得た。その上清に９
０％飽和となるように硫安を加え１時間かくはん後遠心
分離し沈殿を得た。その沈殿を１０ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、１０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４．５）で透析して酵素液（１６６ｍ
ｌ）を得た。この酵素液を遠心分離した得られた上清に
対し、ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）
を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。その活性
画分を集め１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲ（ファル
マシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーを行っ
た。この活性フラクションを集め、限外ろ過により濃縮
し、再びセファクリルＳ−２００ＨＲを用いたカラムク
ロマトグラフィーを行った。この活性画分を集め精製フ
コイダン分解酵素１９１ｍＵを得た。ゲルろ過法（セフ
ァクリルＳ−２００ＨＲ）により測定された精製フコイ
ダン分解酵素の分子量は約１０万であった。以上の精製
工程の各結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 工 程 総タン 総活性 比活性 収 率 パク （単位） （単位／mg) （％） (mg) ─────────────────────────────────── アセトンパウダー抽出液* 112,000 − − − 硫安分画 2,450 1,100 0.449 100 ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ 640 890 1.39 80.9 セファクリルＳ−２００ＨＲ 14.3 235 16.4 21.4 セファクリルＳ−２００ＨＲ 6.79 191 27.4 17.4 ─────────────────────────────────── ＊ 混合物の妨害により活性測定不能
【００１９】
【発明の効果】本発明により、フコイダンの構造解析や
フコイダンの分解やフコイダンオリゴ糖の調製などに有
用なフコイダン分解酵素及びその簡便な製造方法が提供
された。
フコイダンの分解やフコイダンオリゴ糖の調製などに有
用なフコイダン分解酵素及びその簡便な製造方法が提供
された。
【図１】精製したヒバマタ由来のフコイダンに本発明の
フコイダン分解酵素を作用させ、生成物をＰＡ化して、
蛍光分析を行った際のクロマトグラムを示す図である。
フコイダン分解酵素を作用させ、生成物をＰＡ化して、
蛍光分析を行った際のクロマトグラムを示す図である。
【図２】フコイダンを酸分解して得られたフコース硫酸
をＰＡ化して蛍光分析を行った際のクロマトグラムを示
す図である。
をＰＡ化して蛍光分析を行った際のクロマトグラムを示
す図である。
【図３】精製したヒバマタ由来のフコイダンに本発明の
フコイダン分解酵素を作用させ、生成物を質量分析計で
測定した際のマススペクトル図である。
フコイダン分解酵素を作用させ、生成物を質量分析計で
測定した際のマススペクトル図である。
【図４】本発明の酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグ
ラフである。
ラフである。
【図５】本発明の酵素の温度と相対活性の関係を表すグ
ラフである。
ラフである。
フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするフコイダン分解酵素。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエキソ的に分
解する。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは３．０〜４．０付
近にある。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は４５℃付近であ
る。 - 【請求項２】 真ウニ類に属する動物から抽出、精製す
ることを特徴とする請求項１記載のフコイダン分解酵素
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22784793A JPH0759564A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | フコイダン分解酵素及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22784793A JPH0759564A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | フコイダン分解酵素及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759564A true JPH0759564A (ja) | 1995-03-07 |
Family
ID=16867311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22784793A Pending JPH0759564A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | フコイダン分解酵素及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0759564A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997047208A1 (fr) * | 1996-06-12 | 1997-12-18 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Aliments ou boissons |
| JP2001226408A (ja) * | 1996-01-26 | 2001-08-21 | Takara Shuzo Co Ltd | フコース硫酸含有多糖 |
| CN112654709A (zh) * | 2018-07-31 | 2021-04-13 | Arc医疗器械股份有限公司 | 褐藻糖胶的酶促水解 |
-
1993
- 1993-08-23 JP JP22784793A patent/JPH0759564A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001226408A (ja) * | 1996-01-26 | 2001-08-21 | Takara Shuzo Co Ltd | フコース硫酸含有多糖 |
| WO1997047208A1 (fr) * | 1996-06-12 | 1997-12-18 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Aliments ou boissons |
| JP3505185B2 (ja) * | 1996-06-12 | 2004-03-08 | タカラバイオ株式会社 | 食品又は飲料 |
| CN112654709A (zh) * | 2018-07-31 | 2021-04-13 | Arc医疗器械股份有限公司 | 褐藻糖胶的酶促水解 |
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