JPH08266A - フコース硫酸遊離酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 フコイダンに関する研究に有用な、新規なエ
キソ型のフコース硫酸遊離酵素及びその製造方法を提供
する。 【構成】 ２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ピリジ
ルアミノ（ＰＡ）化Ｌ−フコースに作用して、２−硫酸
化−Ｌ−フコースを遊離させる作用、３．０付近の至適
ｐＨ、４５℃付近の至適温度、約１３万の分子量（セフ
ァクリルＳ−２００を用いたゲルろ過法による）なる理
化学的性質を有するフコース硫酸遊離酵素。真ウニ類に
属する動物から抽出精製する前記酵素の製造方法。原料
の例にはキタムラサキウニの消化管壁及び消化管内容物
がある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フコイダンの構造解析
やフコイダンの分解及びオリゴ糖の製造等に利用できる
フコース硫酸遊離酵素及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】藻類由来の硫酸化多糖の一種であるフコ
イダンは以前から腫瘍増殖阻止効果や抗凝血作用や脂血
清澄作用等の重要な生物活性を持つことが知られてい
る。フコイダンはフコースを主成分とする硫酸化多糖で
あり、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マン
ノース、グルコース等をも含む物が知られているが、由
来となる海藻の種類によってこれらの構成糖の種類や量
が異なる。またその構造もよくわかっておらず、分子量
も均一ではないため、フコイダンの生物活性に関する研
究はあまり進展していない。フコイダンの構造を解析し
たり分子量の調整を行うに当ってはエキソ（ exo )型や
エンド（ endo ) 型のフコイダンを分解する酵素を利用
するのが有利である。従来より、アワビ、ホタテ貝、海
洋微生物などが、それぞれある種の、フコイダンを分解
する酵素を生産する可能性が報告されている。しかしな
がら、これらの酵素は一般に生体の中に極微量含まれて
いるだけなので、これらの酵素を完全に精製するには様
々な精製方法を駆使する必要があり、フコイダンを分解
する酵素の入手は困難である。実際に、現在までに完全
に精製されたフコイダンを分解するエンド型酵素はホタ
テ貝由来の酵素〔バイオサイエンス・バイオテクノロジ
ー・アンド・バイオケミストリー（ Biosci. Biotech.
Biochem. )、第５６巻、第４９０〜４９４頁（１９９
２）、日本農芸化学会誌、第６６巻、第３号、第３５８
頁（１９９２）〕、及びビブリオ属細菌の酵素〔バイオ
サイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミ
ストリー、第５６巻、第１８２９〜１８３４頁（１９９
２）〕しかない。また、ブレチン オブ ザ ジャパニ
ーズ ソサエティ オブ サイエンティフィック フィ
ッシャリーズ（ Bulletin ｏf the Japanese Society o
f Scientific Fisheries )、第５０巻、第７号、第１２
５５〜１２６０頁（１９８４）には、キタムラサキウニ
（ Strongylocentrotus nudus ) の消化管のホモジネー
トの未精製の上清がフコイダンに作用して還元性物質が
増加することをソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nelson )
法で確認したという報告があるが、生成物の確認はなさ
れておらず、フコイダンを分解する酵素の入手は困難で
あった。一方、本発明者らはキタムラサキウニの消化管
より、下記理化学的性質を有するエキソ型フコイダナー
ゼの単離に成功している（特願平５−２２７８４７
号）。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエキソ的に分
解する。 （II) 至適ｐＨ：至適ｐＨは３．０〜４．０付近にあ
る。 （III)至適温度：至適温度は４５℃付近である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】フコイダンは前述の様
にフコースを主成分とする硫酸化多糖であり、由来とな
る海藻の種類によってこれらの構成糖の種類や量が異な
る。よってフコイダンの構造を解析したり、オリゴ糖を
調製するためには基質特異性の異なる多数の酵素が必要
である。本発明の目的は、フコイダンに関する研究に有
用な、新規なエキソ型のフコース硫酸遊離酵素及びその
製造方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするフコース硫酸遊離酵素に関する。 （Ｉ）作用：２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ピリ
ジルアミノ（ＰＡ）化Ｌ−フコースに作用して、２−硫
酸化−Ｌ−フコースを遊離させる。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは３．０付近にあ
る。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は４５℃付近であ
る。 （IV) 分子量：本酵素の分子量は約１３万〔セファクリ
ル（Sephacryl)Ｓ−２００を用いたゲルろ過法による〕
である。 また本発明の第２の発明は、上記第１の発明のフコース
硫酸遊離酵素の製造方法に関する発明であって、真ウニ
類に属する動物から抽出精製することを特徴とする。

【０００５】以下本発明について詳細に説明する。本発
明に使用される原材料は真ウニ類に属する動物であれば
特に限定されるものではない。また本発明のフコース硫
酸遊離酵素を採取するのに用いる部位は特に限定されな
いが、消化管壁や生殖巣が利用できる。本発明のフコー
ス硫酸遊離酵素を抽出精製する際には、例えばキタムラ
サキウニの消化管壁を集め、通常用いられる細胞破壊手
段、例えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕し無細胞抽
出液を得る。次いで、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、疎水結合カラムクロマトグラフィー、ゲルろ
過、凍結乾燥などにより精製を行い、純化されたフコー
ス硫酸遊離酵素を得ることができる。

【０００６】本発明のフコース硫酸遊離酵素の酵素化学
的及び理化学的性質は次のとおりである。 （Ｉ）作用：２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ＰＡ
化Ｌ−フコースに作用して、２−硫酸化−Ｌ−フコース
を遊離させる。ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラ
ノシドには作用しない。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは３．０付近にある
（図１）。すなわち図１は、本酵素のｐＨと相対活性の
関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸
はｐＨを示す。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は４５℃付近である
（図２）。すなわち図２は、本酵素の温度と相対活性の
関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸
は反応温度（℃）を示す。 （IV) 分子量：本酵素の分子量は約１３万（セファクリ
ルＳ−２００を用いたゲルろ過法による）である。 （Ｖ）ｐＨ安定性：本酵素はｐＨ２．０〜５．０の間で
安定である（図３）。すなわち図３は、本酵素を処理し
たｐＨと残存活性の関係を表すグラフであり、縦軸は残
存活性（％）、横軸はｐＨを示す。 （VI) 温度安定性：本酵素は約５０℃以下で安定である
（図４）。すなわち図４は、本酵素を処理した温度と残
存活性の関係を表すグラフであり、縦軸は残存活性
（％）、横軸は処理温度（℃）を示す。

【０００７】フコース硫酸遊離酵素の活性の測定は以下
の様にして行った。 （１）２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ−
フコース及びＰＡ化２−硫酸化−Ｌ−フコースの調製 フコイダン（シグマ社製）２ｇを１００ｍｌの水に溶解
しそのｐＨを酢酸にてｐＨ２．５に調整後１００℃で３
時間処理した。この加水分解物をセルロファインＧＣＬ
−２５（生化学工業社製）によるゲルろ過で分子量分画
し分子量５００以下の画分を集め凍結乾燥を行い１．０
ｇの生成物を得た。本物質１００ｍｇに、８ｇの２−ア
ミノピリジンと４ｍｌのメタノールと２．７ｍｌの酢酸
を混合した物を加え、１００℃で３０分間反応させ、そ
の反応液に、０．７８ｇのジメチルアミンボランコンプ
レックスと１３ｍｌの酢酸と２ｍｌのトリエチルアミン
を混合した物を加え、８０℃で１０分間反応させた。反
応液をセルロファインＧＣＬ−２５でゲルろ過しＰＡ化
フコイダンオリゴ糖の単糖画分及び２糖画分を別々に分
取した。次に単糖画分分取液を下記条件のＨＰＬＣに供
し、溶出時間７．３分の位置に溶出する下記式（化１）
で表されるＰＡ化２−硫酸化−Ｌ−フコースを分取し
た。

【０００８】

【化１】

【０００９】次に２糖画分を同様にＨＰＬＣに供し、溶
出時間１４．７分の位置に溶出する下記式（化２）で表
される２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ−
フコースを分取した。

【００１０】

【化２】

【００１１】〔ＨＰＬＣの条件〕 装置：Ｌ−６２０００型（日立製作所製） カラム：パルパック タイプ（PALPAK Type)Ｒ（４．６
ｍｍ×２５０ｍｍ）（宝酒造社製） 溶離液：１００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ４．
０） 検出：蛍光検出器Ｆ１１５０（日立製作所製）にて励起
波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出。 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：４０℃

【００１２】（２) 酵素活性の測定方法 ２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ−フコー
ス溶液０．２５μｌと１２５ｍＭの塩化ナトリウムを含
む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）４．５μｌ、
脱イオン水０．７５μｌを加え、適当に希釈したフコー
ス硫酸遊離酵素を０．５μｌ加えてよくかくはんし３７
℃で２時間保温する。別に対照として２−硫酸化−α−
Ｌ−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ−フコース溶液の代りに水
を加えたものと、酵素溶液の代りに酵素が溶解している
緩衝液を加えたものを同条件で保温する。これらの反応
液を３７℃で２時間保温した後、酵素反応を停止させる
ために１００℃で５分加温し、１００ｍＭの酢酸緩衝液
（トリエチルアミンでｐＨ４．０に調製）を４４μｌ加
え希釈し、よくかくはんする。これらの反応液はＨＰＬ
Ｃ法で酵素活性を確認する。酵素活性はフコース硫酸遊
離酵素が２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ
−フコースに作用して遊離してくるＰＡ化Ｌ−フコース
の量から求める。この時、遊離してくるＰＡ化Ｌ−フコ
ースは市販のＰＡ化Ｌ−フコース（宝酒造社製）と溶出
時間を比較することで確認する。使用したカラムはパル
パック タイプ Ｒ（宝酒造社製）を用い、蛍光検出器
（日立製作所製、Ｆ−１１５０、励起波長３２０ｎｍ／
蛍光波長４００ｎｍ）により検出する。溶出バッファー
は１００ｍＭの酢酸緩衝液（トリエチルアミンでｐＨ
４．０に調整）を使用する。その結果を図５と図６に示
す。図５はフコース硫酸遊離酵素を２−硫酸化−α−Ｌ
−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ−フコースに作用させ、ＨＰ
ＬＣ分析した際のクロマトグラムで、は酵素反応前、
は酵素反応後のクロマトグラムである。図６は市販の
ＰＡ化Ｌ−フコース（宝酒造社製）をＨＰＬＣ分析した
際のクロマトグラムである。両図において、縦軸は相対
蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。図中、図５の
における矢印ａのピークは２−硫酸化−α−Ｌ−フコ
シル−２−ＰＡ化Ｌ−フコースの溶出位置を示し、に
おける矢印ｂのピークはフコース硫酸遊離酵素を２−硫
酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ−フコースに作
用させた時に遊離したＰＡ化Ｌ−フコースの溶出位置を
示す。また、図６の矢印ｃのピークは市販のＰＡ化Ｌ−
フコースの溶出位置を示す。矢印ｂとｃの溶出時間を比
較すると溶出時間が一致していた。このことから、本発
明のフコース硫酸遊離酵素が上記反応系においてＰＡ化
Ｌ−フコースを生成していることがわかる。その後、下
記の式（数１）より酵素活性を求める。

【００１３】

【数１】〔Ａ×（Ｃ＋Ｄ）〕／（Ｂ×Ｅ×Ｆ）＝Ｕ

【００１４】Ａ：反応液中に生成したＰＡ化Ｌ−フコー
スのＨＰＬＣ分析におけるピーク面積値 Ｂ：市販のＰＡ化Ｌ−フコース１μｍｏｌのＨＰＬＣ分
析におけるピーク面積値 Ｃ：反応液の液量（ｍｌ） Ｄ：反応液の希釈に用いた液の量（ｍｌ） Ｅ：ＨＰＬＣへの希釈した反応液の注入量（ｍｌ） Ｆ：反応時間（分） １単位の酵素は上記の反応系において１分間に１μｍｏ
ｌのＰＡ化Ｌ−フコースを生成させる酵素量とする。

【００１５】（３）酵素反応生成物の確認 上記の酵素反応系にて３７℃、２時間反応させた後、グ
リコタッグ（GlycoTAC) （宝酒造社製）を用い、その取
扱い説明書に従って特公平５−６５１０８号公報に記載
の方法により反応生成物の還元末端をＰＡ化し、このＰ
Ａ化した反応液をＨＰＬＣにより分析した。カラムはパ
ルパック タイプ Ｒ（宝酒造社製）を用い、蛍光検出
器（日立製作所製、Ｆ−１１５０、励起波長３２０ｎｍ
／蛍光波長４００ｎｍ）により検出した。対照として、
本発明のフコース硫酸遊離酵素標品の代りに、オートク
レーブで１２０℃、５分の処理により変性させた本発明
の酵素の精製標品を用いて同様の条件により反応させ、
分析を行った。

【００１６】また、（１）で得られたＰＡ化２−硫酸化
Ｌ−フコース硫酸をＨＰＬＣ分析用のマーカーとした。
その結果を図７及び図８に示す。図７は２−硫酸化−α
−Ｌ−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ−フコースに本発明のフ
コース硫酸遊離酵素を作用させ、その反応生成物をＰＡ
化してＨＰＬＣ分析を行った際のクロマトグラムであ
る。図８は（１）で得られたＰＡ化２−硫酸化Ｌ−フコ
ースのクロマトグラムである。両図において、縦軸は相
対蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。図中、図７
の矢印ａのピークはＰＡ化された反応生成物の溶出位置
を示し、図８の矢印ｂのピークはＰＡ化２−硫酸化Ｌ−
フコースの溶出位置を示す。矢印ａとｂの溶出時間を比
較すると溶出時間が一致していた。このことから、本発
明のフコース硫酸遊離酵素の反応生成物が２−硫酸化−
Ｌ−フコースであることが確認された。

【００１７】以上、本発明により基質特異性が解明され
たフコース硫酸遊離酵素が提供される。なお前述の特願
平５−２２７８４７号明細書に記載の酵素は、本発明の
酵素活性測定方法では全く活性を示さず、明らかに本発
明とは異なる基質特異性の酵素である。

【００１８】

【実施例】以下に、本発明によるフコース硫酸遊離酵素
の製造方法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実
施例の範囲のみに限定されるものではない。

【００１９】実施例１ 以下の操作は４℃で行った。キタムラサキウニの消化管
壁及び消化管内容物２．１ｋｇを常法によりアセトンパ
ウダー（２２０ｇ）とし、４４００ｍｌの１０ｍＭ酢酸
−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に懸濁し、１
８時間かくはん後、遠心分離し上清を得た。その上清に
９０％飽和となるように硫安を加え８時間かくはん後、
遠心分離し沈殿を得た。その沈殿を約２００ｍｌの１０
ｍＭ酢酸−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶
解後、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ３．５）で透析し、遠心分離した上清を同
バッファーで平衡化したＳＰ−トヨパール（Toyopearl)
６５０Ｍカラム（東ソー株式会社製）、３００ｍｌを用
いたカラムクロマトグラフィーを行い、酵素液を得た。
その活性画分を集め、限外ろ過により濃縮し、５０ｍＭ
の塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ４．５）で平衡化したＣＭ−セファロース（Se
pharose)ＦＦ（ファルマシア社製）を用いたカラムクロ
マトグラフィーを行い、酵素液を得た。次に、その活性
画分を集め、限外ろ過により濃縮し、５００ｍＭの塩化
ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸−リン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ４．５）で平衡化したセファクリルＳ−２００
ＨＲ（ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラ
フィーを行った。この活性画分を集め精製フコース硫酸
遊離酵素、８６４μＵを得た。ゲルろ過法（セファクリ
ルＳ−２００ＨＲ）により測定された精製フコース硫酸
遊離酵素の分子量は約１３万であった。以上の精製工程
の各結果を下記表１に示す。

【００２０】

【表１】 表 １ ──────────────────────────────────── 工 程 総タンパク 総活性 比活性 収 率 （マイクロ （マイクロ (mg) 単位） 単位／mg) （％） ──────────────────────────────────── アセトンパウダー抽出液 106,000 53,100 0.500 100 ９０％硫安塩析 1,860 33,600 18.1 63.3 ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ 160 19,700 123 37.1 ＣＭ−セファロースＦＦ 14.8 1,840 124 3.47 セファクリルＳ−２００ 5.60 864 154 1.63 ────────────────────────────────────

【００２１】

【発明の効果】本発明により、フコイダンの構造解析や
フコイダンの分解やフコイダンオリゴ糖の調製などに有
用なフコース硫酸遊離酵素及びその簡便な製造方法が提
供された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグ
ラフである。

【図２】本発明の酵素の反応温度と相対活性の関係を表
すグラフである。

【図３】本発明の酵素を処理したｐＨと残存活性の関係
を表すグラフである。

【図４】本発明の酵素を処理した温度と残存活性の関係
を表すグラフである。

【図５】フコース硫酸遊離酵素を２−硫酸化−α−Ｌ−
フコシル−２−ＰＡ化Ｌ−フコースに作用させ、ＨＰＬ
Ｃで蛍光分析した際のクロマトグラムを示す図であり、
は酵素反応前、は酵素反応後のクロマトグラムを示
す図である。

【図６】市販のＰＡ化Ｌ−フコース（宝酒造社製）をＨ
ＰＬＣで蛍光分析した際のクロマトグラムを示す図であ
る。

【図７】２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ＰＡ化Ｌ
−フコースに本発明のフコース硫酸遊離酵素を作用さ
せ、その反応生成物をＰＡ化してＨＰＬＣで蛍光分析し
た際のクロマトグラムを示す図である。

【図８】フコイダンを酸分解後、ＰＡ化して得られたＰ
Ａ化２−硫酸化Ｌ−フコースをＨＰＬＣで蛍光分析した
際のクロマトグラムを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
   とするフコース硫酸遊離酵素。 （Ｉ）作用：２−硫酸化−α−Ｌ−フコシル−２−ピリ
   ジルアミノ化Ｌ−フコースに作用して、２−硫酸化−Ｌ
   −フコースを遊離させる。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは３．０付近にあ
   る。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は４５℃付近であ
   る。 （IV) 分子量：本酵素の分子量は約１３万（セファクリ
   ルＳ−２００を用いたゲルろ過法による）。
2. 【請求項２】 真ウニ類に属する動物から抽出、精製す
   ることを特徴とする請求項１記載のフコース硫酸遊離酵
   素の製造方法。