JP3202365B2 - オリゴマンヌロン酸を重合度によって分離する方法 - Google Patents
オリゴマンヌロン酸を重合度によって分離する方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オリゴマンヌロン酸を
重合度によって分離する方法に関する。
重合度によって分離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、自然界に見いだされる多糖類の分
解物に様々な生理活性のあることが発見されており、例
えば、ペクチンの分解物には、植物の生長を促進する活
性や、抗菌活性があることが知られており、また、キチ
ン、キトサンの分解物に抗菌活性のあることが認められ
ている。また、アルギン酸の分解物には、人体の腸内に
おける有用細菌であるビフィズス菌の増殖活性が認めら
れている。
解物に様々な生理活性のあることが発見されており、例
えば、ペクチンの分解物には、植物の生長を促進する活
性や、抗菌活性があることが知られており、また、キチ
ン、キトサンの分解物に抗菌活性のあることが認められ
ている。また、アルギン酸の分解物には、人体の腸内に
おける有用細菌であるビフィズス菌の増殖活性が認めら
れている。
【０００３】このようなことから、アルギン酸の分解生
成物のひとつであるオリゴマンヌロン酸についても、有
用な生理活性を有することが期待されている。また構造
既知のオリゴマンヌロン酸は、生理活性物質の作用メカ
ニズムの解明やアルギン酸の構造解明の手掛かりとして
も非常に有用な物質である。
成物のひとつであるオリゴマンヌロン酸についても、有
用な生理活性を有することが期待されている。また構造
既知のオリゴマンヌロン酸は、生理活性物質の作用メカ
ニズムの解明やアルギン酸の構造解明の手掛かりとして
も非常に有用な物質である。
【０００４】アルギン酸はグルロン酸およびマンヌロン
酸が−１,４−結合したポリマーであり、ポリグルロン
酸（以下ポリＧという）、ポリマンヌロン酸（以下ポリ
Ｍという）、グルロン酸マンヌロン酸交互に連なるポリ
マー（以下ポリＭＧという）の３つのブロックからなる
共重合体である。
酸が−１,４−結合したポリマーであり、ポリグルロン
酸（以下ポリＧという）、ポリマンヌロン酸（以下ポリ
Ｍという）、グルロン酸マンヌロン酸交互に連なるポリ
マー（以下ポリＭＧという）の３つのブロックからなる
共重合体である。
【０００５】アルギン酸の分解方法としては、従来は加
水分解法が用いられていたが、操作が煩雑であり、収率
が低いという欠点があった。これに対し、最近、酵素を
用いて穏やかな条件下で行う方法が開発された。アルギ
ン酸を分解する酵素は、フラボバクテリウム属菌、シュ
ウドモナス属菌（特開昭５９−１４３５９７）およびア
ルテロモナス属菌（特開昭６３−２１４１９２）等の培
養液から得られることが知られている。
水分解法が用いられていたが、操作が煩雑であり、収率
が低いという欠点があった。これに対し、最近、酵素を
用いて穏やかな条件下で行う方法が開発された。アルギ
ン酸を分解する酵素は、フラボバクテリウム属菌、シュ
ウドモナス属菌（特開昭５９−１４３５９７）およびア
ルテロモナス属菌（特開昭６３−２１４１９２）等の培
養液から得られることが知られている。
【０００６】アルギン酸を分解する酵素には、ポリグル
ロン酸リアーゼ（Ｇ-ase）、ポリマンヌロン酸リアーゼ
（Ｍ-ase）およびポリマンヌロン酸グルロン酸リアーゼ
（ＭＧ-ase）とがあり、それぞれ異なる基質特異性を有
している。Ｇ-aseはポリＧおよびポリＭＧを分解するが
ポリＭを分解せず、Ｍ-aseはポリＭおよびポリＭＧを分
解するがポリＧを分解せず、ＭＧ-aseはポリＭ、ポリＧ
およびポリＭＧのいずれも分解することができる。
ロン酸リアーゼ（Ｇ-ase）、ポリマンヌロン酸リアーゼ
（Ｍ-ase）およびポリマンヌロン酸グルロン酸リアーゼ
（ＭＧ-ase）とがあり、それぞれ異なる基質特異性を有
している。Ｇ-aseはポリＧおよびポリＭＧを分解するが
ポリＭを分解せず、Ｍ-aseはポリＭおよびポリＭＧを分
解するがポリＧを分解せず、ＭＧ-aseはポリＭ、ポリＧ
およびポリＭＧのいずれも分解することができる。
【０００７】上述のようにして得られたオリゴマンヌロ
ン酸は、構造研究等の特定の目的のためには、その重合
度によって分離する必要がある。従来、オリゴマンヌロ
ン酸を重合度によって分離した例は少なく、主としてゲ
ル濾過法が用いられている。一般的にゲル濾過は、１回
の処理量に制限があり、回収効率も低い。一方、陰イオ
ン交換クロマトグラフィーを用いた例も報告されている
が、精製効率が悪く、工業的な生産方法としては適して
いない。
ン酸は、構造研究等の特定の目的のためには、その重合
度によって分離する必要がある。従来、オリゴマンヌロ
ン酸を重合度によって分離した例は少なく、主としてゲ
ル濾過法が用いられている。一般的にゲル濾過は、１回
の処理量に制限があり、回収効率も低い。一方、陰イオ
ン交換クロマトグラフィーを用いた例も報告されている
が、精製効率が悪く、工業的な生産方法としては適して
いない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】以上のことから本発明
は、オリゴマンヌロン酸の重合度別分離を効率良く行う
方法を開発することを目的とする。
は、オリゴマンヌロン酸の重合度別分離を効率良く行う
方法を開発することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意研究した結果、重炭酸化合物を
溶出液として用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを
行うことにより、重合度の異なるオリゴマンヌロン酸の
混合物から、効率良くオリゴマンヌロンを重合度別に分
離しうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
的を達成するために鋭意研究した結果、重炭酸化合物を
溶出液として用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを
行うことにより、重合度の異なるオリゴマンヌロン酸の
混合物から、効率良くオリゴマンヌロンを重合度別に分
離しうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】本発明において用いられるオリゴマンヌロ
ン酸混合物は、例えば、アルギン酸を加水分解するか、
または上述のアルギン酸分解酵素を用いて分解すること
により得ることができる。オリゴＭは不飽和二重結合を
含んでいてもよい。
ン酸混合物は、例えば、アルギン酸を加水分解するか、
または上述のアルギン酸分解酵素を用いて分解すること
により得ることができる。オリゴＭは不飽和二重結合を
含んでいてもよい。
【００１１】酵素としては周知のＭ-aseまたはＭＧ-ase
のいずれをも用いることができる。例えば、Pseudomona
s aeruginosa（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー 1
984,p958-964）、Bacillus circulans（アプライド・ア
ンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー 198
4, p.704-709）、海洋性軟体動物（Littorina sp.肝、
バイオキミカ・エト・バイオフィジカ 1979、 Vol.569,
p.259-266)、海洋性軟体動物（Dolabella auricula, ザ
・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー Vol.64(1),
p.25）等に由来するＭ-aseが一般に知られている。
のいずれをも用いることができる。例えば、Pseudomona
s aeruginosa（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー 1
984,p958-964）、Bacillus circulans（アプライド・ア
ンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー 198
4, p.704-709）、海洋性軟体動物（Littorina sp.肝、
バイオキミカ・エト・バイオフィジカ 1979、 Vol.569,
p.259-266)、海洋性軟体動物（Dolabella auricula, ザ
・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー Vol.64(1),
p.25）等に由来するＭ-aseが一般に知られている。
【００１２】次に本発明によるオリゴＭ混合物の分画お
よび精製方法について説明する。
よび精製方法について説明する。
【００１３】オリゴＭ混合物を、重炭酸化合物等の適当
な緩衝液に溶解し、陰イオン交換樹脂カラムに吸着させ
る。陰イオン交換樹脂カラムとしては、一般に多糖類の
分画に用いられる陰イオン交換樹脂カラムのいずれをも
用いることができるが、特に、DEAE-Sephadex A-25、QA
E-Sephadex A-25、DEAE-SepharoseまたはQAE-Sepharose
を用いることが好ましい。
な緩衝液に溶解し、陰イオン交換樹脂カラムに吸着させ
る。陰イオン交換樹脂カラムとしては、一般に多糖類の
分画に用いられる陰イオン交換樹脂カラムのいずれをも
用いることができるが、特に、DEAE-Sephadex A-25、QA
E-Sephadex A-25、DEAE-SepharoseまたはQAE-Sepharose
を用いることが好ましい。
【００１４】また、不飽和ウロン酸を含まないオリゴＭ
を分離精製する場合には、陰イオン交換カラムクロマト
グラフィーを行う前に、酵素反応液から不飽和ウロン酸
を除去しておく。
を分離精製する場合には、陰イオン交換カラムクロマト
グラフィーを行う前に、酵素反応液から不飽和ウロン酸
を除去しておく。
【００１５】次に、陰イオン交換カラムに吸着されたオ
リゴＭを、重炭酸化合物溶液を用いて溶出する。重炭酸
化合物としては、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウ
ム、重炭酸カリウム等を用いることができる。溶出液の
濃度は段階的または連続的に変化させてもよい。例えば
0.1Ｍから1.0Ｍの重炭酸アンモニウム溶液の直線勾配を
用いることができる（図２）。溶出液を分画して、重合
度別に分離精製されたオリゴＭが得られる。
リゴＭを、重炭酸化合物溶液を用いて溶出する。重炭酸
化合物としては、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウ
ム、重炭酸カリウム等を用いることができる。溶出液の
濃度は段階的または連続的に変化させてもよい。例えば
0.1Ｍから1.0Ｍの重炭酸アンモニウム溶液の直線勾配を
用いることができる（図２）。溶出液を分画して、重合
度別に分離精製されたオリゴＭが得られる。
【００１６】本発明によるオリゴマンヌロン酸の分離方
法は、スケールアップが可能であり、大量調製にも適し
ている。
法は、スケールアップが可能であり、大量調製にも適し
ている。
【００１７】
（参考例） ポリＭおよびオリゴＭの製造 ポリＭは、フラボバクテリウム マルチボラムＫ−１１
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３３８）を培養して工業的に得ら
れるアルギン酸分解酵素（ナガセ生化学工業（株）製、
特開平第４−１６９１８９号）の粗酵素標品中に含まれ
るＧ-aseを用いて、アルギン酸を分解して調製した。粗
酵素標品を、１mMリン酸緩衝液（pＨ６〜6.5）に溶解
し、同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化し
た陽イオン交換樹脂に通し、非吸着画分を回収して、Ｇ
-aseとして用いた。
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３３８）を培養して工業的に得ら
れるアルギン酸分解酵素（ナガセ生化学工業（株）製、
特開平第４−１６９１８９号）の粗酵素標品中に含まれ
るＧ-aseを用いて、アルギン酸を分解して調製した。粗
酵素標品を、１mMリン酸緩衝液（pＨ６〜6.5）に溶解
し、同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化し
た陽イオン交換樹脂に通し、非吸着画分を回収して、Ｇ
-aseとして用いた。
【００１８】アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ＝1.75）10
ｇを0.1MNaClを含む水１lに溶解し、pＨ7.2に調整して3
7°Cに加温した。このアルギン酸溶液に酵素溶液325ml
（175.8単位、１単位は、１分間に１μmolのβ−ホルミ
ルピルビン酸を生成する酵素量である）を加えて、37°
Cで酵素反応を行わせた。酵素の活性測定は1.0％アルギ
ン酸ナトリウム溶液と酵素液を１：１の割合で混合し、
37°Cで30分間反応を行い、100°C５分で反応を止めた
後、TBA反応（チオバルビツール反応）により酵素反応
で生成したオリゴウロン酸の不飽和ウロン酸を定量する
ことにより行った。
ｇを0.1MNaClを含む水１lに溶解し、pＨ7.2に調整して3
7°Cに加温した。このアルギン酸溶液に酵素溶液325ml
（175.8単位、１単位は、１分間に１μmolのβ−ホルミ
ルピルビン酸を生成する酵素量である）を加えて、37°
Cで酵素反応を行わせた。酵素の活性測定は1.0％アルギ
ン酸ナトリウム溶液と酵素液を１：１の割合で混合し、
37°Cで30分間反応を行い、100°C５分で反応を止めた
後、TBA反応（チオバルビツール反応）により酵素反応
で生成したオリゴウロン酸の不飽和ウロン酸を定量する
ことにより行った。
【００１９】Ｇ-aseの酵素反応は、37°Cにおいて24時
間行った。酵素処理後は、100°Cで10分間加熱処理し、
放冷した。酵素反応処理液は、0.1NHCl溶液を加えるこ
とによって、pＨを1.5に調整し、４°Cで一晩静置した
のち、遠心分離を行い沈殿を得た。得られた沈殿を0.1M
NaClを含む希塩酸で洗った後、水に懸濁し、希アルカリ
で中和した。得られたの中和溶液をエタノール中に滴下
し、沈殿物を得た。この沈殿物は、エーテル処理により
脱水し、減圧下で乾燥した。２ｇのポリＭが得られた
（Ｍ含量90％以上、回収率20％）。
間行った。酵素処理後は、100°Cで10分間加熱処理し、
放冷した。酵素反応処理液は、0.1NHCl溶液を加えるこ
とによって、pＨを1.5に調整し、４°Cで一晩静置した
のち、遠心分離を行い沈殿を得た。得られた沈殿を0.1M
NaClを含む希塩酸で洗った後、水に懸濁し、希アルカリ
で中和した。得られたの中和溶液をエタノール中に滴下
し、沈殿物を得た。この沈殿物は、エーテル処理により
脱水し、減圧下で乾燥した。２ｇのポリＭが得られた
（Ｍ含量90％以上、回収率20％）。
【００２０】次に、得られたポリＭを、0.1M重炭酸アン
モニウムに２％となるように溶かし、酵素（Ｍ-ase、ア
ワビアセトン粉末由来）をポリＭ１ｇに対して５単位と
なるように加えて反応させた。反応条件は37°C、２時
間であった。酵素反応は、100°C５分間の加熱により終
了させた。図１に得られたオリゴＭ混合物の薄層クロマ
トグラフィーの結果を示す。
モニウムに２％となるように溶かし、酵素（Ｍ-ase、ア
ワビアセトン粉末由来）をポリＭ１ｇに対して５単位と
なるように加えて反応させた。反応条件は37°C、２時
間であった。酵素反応は、100°C５分間の加熱により終
了させた。図１に得られたオリゴＭ混合物の薄層クロマ
トグラフィーの結果を示す。
【００２１】（実施例１） オリゴＭの分離精製 参考例にしたがって得られたオリゴＭを、0.1M重炭酸ア
ンモニウムに溶解し、同溶液で平衡化させた陰イオン交
換樹脂、モノＱ（ファルマシア社製）に負荷した。0.1M
〜1.0Mの重炭酸アンモニウム溶液の直線濃度勾配を用い
て溶出し、不飽和ウロン酸を含むオリゴマンヌロン酸を
重合度別に分離精製した。図２に陰イオン交換クロマト
グラフィーの結果を示す。
ンモニウムに溶解し、同溶液で平衡化させた陰イオン交
換樹脂、モノＱ（ファルマシア社製）に負荷した。0.1M
〜1.0Mの重炭酸アンモニウム溶液の直線濃度勾配を用い
て溶出し、不飽和ウロン酸を含むオリゴマンヌロン酸を
重合度別に分離精製した。図２に陰イオン交換クロマト
グラフィーの結果を示す。
【００２２】（実施例２） 不飽和ウロン酸を含まない
オリゴＭの分離精製 参考例にしたがって得られたオリゴＭの混合物を含む溶
液を弱酸性（pＨ３）にし、100°C、２時間加熱して不
飽和ウロン酸を除去した。次にこれを中和して、実施例
１と同様に陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理
した。なお、負荷量は、1mgオリゴマンヌロン混合物、
流速1ml/minであった。その結果、不飽和ウロン酸を含
まないオリゴＭが、実施例１と同様に、重合度別に分離
精製された。
オリゴＭの分離精製 参考例にしたがって得られたオリゴＭの混合物を含む溶
液を弱酸性（pＨ３）にし、100°C、２時間加熱して不
飽和ウロン酸を除去した。次にこれを中和して、実施例
１と同様に陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理
した。なお、負荷量は、1mgオリゴマンヌロン混合物、
流速1ml/minであった。その結果、不飽和ウロン酸を含
まないオリゴＭが、実施例１と同様に、重合度別に分離
精製された。
【図１】図１はオリゴマンヌロン酸混合物の薄層クロマ
トグラフィーによる分析結果を示す。
トグラフィーによる分析結果を示す。
【図２】図２はオリゴマンヌロン酸の陰イオン交換クロ
マトグラフィーによる分離精製結果を示す。
マトグラフィーによる分離精製結果を示す。
△ 不飽和ウロン酸 Ｍ マンヌロン酸
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０８Ｂ 37/12 Ｃ０８Ｂ 37/12 Ｚ (72)発明者 村田 克巳 埼玉県狭山市下奥富531−２−905 (56)参考文献 Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，Ｖｏ ｌ．215，Ｎｏ．１，（1991）ｐ．105− 115 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 1/06 B01D 15/04 B01D 15/08 B01J 41/06 C07H 7/033 C08B 37/12 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】オリゴマンヌロン酸を重合度によって分離
する方法であって、重合度の異なるオリゴマンヌロン酸
混合物を、重炭酸化合物を溶出液とする陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを行うことにより分離することを特徴
とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32528992A JP3202365B2 (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | オリゴマンヌロン酸を重合度によって分離する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32528992A JP3202365B2 (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | オリゴマンヌロン酸を重合度によって分離する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06172375A JPH06172375A (ja) | 1994-06-21 |
| JP3202365B2 true JP3202365B2 (ja) | 2001-08-27 |
Family
ID=18175157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32528992A Expired - Fee Related JP3202365B2 (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | オリゴマンヌロン酸を重合度によって分離する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3202365B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11337989B2 (en) | 2013-12-19 | 2022-05-24 | Evofem, Inc. | Compositions and methods for inhibiting inflammation and diseases using an alginic acid-based antimicrobial compound |
| US11419835B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-08-23 | Evofem, Inc. | Method of treatment and prevention of bacterial vaginosis |
| US11439610B2 (en) | 2012-06-13 | 2022-09-13 | Evofem, Inc. | Compositions and methods for enhancing the efficacy of contraceptive microbicides |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100501584B1 (ko) * | 2000-02-03 | 2005-07-18 | (주)케이비피 | 저분자 폴리만유로네이트의 제조방법, 혈청지질개선제로서의 이의 신규 용도 및 이를 함유하는 기능성식품 및 건강 보조 식품 |
| CN1562050A (zh) * | 2004-03-24 | 2005-01-12 | 中国海洋大学 | 褐藻酸寡糖在抗痴呆、抗糖尿病中的应用 |
| EP3061461A1 (en) | 2004-10-29 | 2016-08-31 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
| ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
| US20080274958A1 (en) | 2006-07-21 | 2008-11-06 | Neose Technologies, Inc. | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
| US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
| NZ580030A (en) | 2007-04-03 | 2012-06-29 | Biogenerix Ag | Methods of treatment using glycopegylated g-csf |
| WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| CN104897835B (zh) * | 2015-05-28 | 2017-07-07 | 江南大学 | 一种利用uplc‑q‑tof/ms技术快速测定寡聚古罗糖醛酸的方法 |
| WO2020073275A1 (zh) * | 2018-10-11 | 2020-04-16 | 深圳大学 | 寡聚甘露糖醛酸在抑制总Tau表达、磷酸化和聚集中的应用 |
-
1992
- 1992-12-04 JP JP32528992A patent/JP3202365B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２１５，Ｎｏ．１，（１９９１）ｐ．１０５−１１５ |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11439610B2 (en) | 2012-06-13 | 2022-09-13 | Evofem, Inc. | Compositions and methods for enhancing the efficacy of contraceptive microbicides |
| US11337989B2 (en) | 2013-12-19 | 2022-05-24 | Evofem, Inc. | Compositions and methods for inhibiting inflammation and diseases using an alginic acid-based antimicrobial compound |
| US11419835B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-08-23 | Evofem, Inc. | Method of treatment and prevention of bacterial vaginosis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06172375A (ja) | 1994-06-21 |
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