JPH07501684A - 抗凝固剤およびその調製方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ゛　およびその−１゛ 主車ヱし１社 本発明は抗凝固剤として有用である多量体化合物およびその製造方法に関する。

た丘艮歪 交互に存在しているＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの ユニットからなる、酵素的に変性された多糖類は、ヘパリンおよび硫酸ヘパラン の生合成に関連して広く研究されてきた（例えばｒＨＥＰＡＲＩＮ−Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、　ｃｌｉｎｉｃ ａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＪ、Ｄ、　ＬａｎｅおよびＵ。

Ｌｉｎｄａｈｌｉｉ集、Ｅｄｗａｒｄ　Ａｒｎｏｌｄにより出版、ｐ、　１５９ −１９０．１９８９およびＵ、　Ｌｉｎｄａｈｌら、ＴｌＢ５．１１．１９８６ 年５月、９．２２１を参照せよ）。このような酵素的変性は、グルコサミンユニ ットのＮ−説アセチル化、引続き得られる遊離アミン基のＮ−硫酸化、Ｄ−グル クロン酸残基のＬ−イズロン酸残基へのＣ５−エピマー化、および様々な位置（ おもにイズロン酸類のＣ−２およびグルコサミンユニットのＣ−６）での〇−硫 酸化を含む。追加的な酵素的〇−硫酸化によってグルコサミン残基の３−位のＯ Ｈ基も影響され得る。

今日まで、この一連の酵素的工程は、実験目的のみに適した小規模でしか実行可 能ではなく、ヘパリンおよび硫酸ヘパランの生合成中に、哺乳動物の肥満細胞に おいて起きることを模倣するに過ぎなかった。ヘパリンと硫酸ヘパランの化学的 および生物学的相違は、Ｂ、　Ｃａ５ｕら、Ａｒｚ、　Ｆｏｒｓｃｈ、、Ｈ１１ ３５、（１９８３）に例示されている。

文献はまた、多糖類分子中に存在するＮ−アセチルへキソサミン残基（７）Ｎ− 説アセチル化の方法（Ｌ、　Ｔｈｕｎｂｅｒｇら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　 Ｒｅｓ、１００．３９３　［１９８２］および５ｈａｋｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅ Ｉｌ、　Ｊ、％υ、７．１８７　［１９８４］）、並びに、Ｎ−および〇−硫酸 化の手順（Ｌｅｖｙら、Ｐｒｏｃ、　ＳＯＣ，ＥＸｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、 、出、９０１　［１９６２］）を示している。

ＥＰ−Ａ−３３３２４３は、Ｅ、　ｃｏｌｉ株から単離されたに５糖を様々に硫 酸化することによって得られる化合物を開示している。

及匪旦１１ に５から調製され、有用な抗凝固性／抗血栓性の活性を有し、従来技術によって 供される大規模で製造され得る化合物を提供することが、目的である。

Ｅ、　ｃｏｌｉのに５糖から調製される抗凝固剤／抗血栓剤を提供し、特に良好 な活性を有する製品の大量生産を可能にすることが、更なる目的である。

本発明は、脱アセチル化の量が天然に生じたに５のアセチル基の少なくとも３５ ％である脱アセチル化されたに５Ｅ、ｃｏｌｉ糖を提供する。

［Ｌ旦２車屋説所 添付の図面（図１〜３２）は、本発明の多様な化合物のＮＭＲスペクトルである 。

及朋！敬咀 本発明は更に、上記で定義されたように変性されたに５糖であって、脱アセチル 化されたに５の位置の全てまたは実質的に全てが硫酸基によって置換されている 糖を提供する。前記位置は、通常アセチル化されていると予測されるもの、特に グルコサミン（とりわけＤ−グルコサミン）残基のアミン基を含む。

本発明はまた、上記で定義されたように変性されたに５であって、グルクロン酸 残基の少なくともいくつかがし一イズロン酸残基にエピマー化されているに５を 提供する。

本発明はまた、定義されたように変性されたに５であって、遊離ヒドロキシル基 （特にグルコサミン酸残基の６−位にある遊離ヒドロキシル基、および／または 、場合によってイズロン酸残基の２−位にある遊離ヒドロキシル基）の少なくと もいくつか、好ましくは少なくとも２５％程度が硫酸化されている、Ｋ５を提供 する。

本発明は更に、上記で定義されたように変性されたに５であって、実質的にグル クロン酸およびグルコサミンの二二、、トからなる、特に該ユニットが交互に存 在する、糖またはその誘導体を提供する。

本発明は更に、定義されたように変性された化合物のいずれかであって、前記残 基の少なくともいくつかが３−０−硫酸化された化合物を提供する。

本発明はまた、発明に係る化合物の治療での使用を提供する。

本発明は更に、抗血栓性または抗凝固性の活性を必要とする状態の治療または予 防のための薬剤の製造での、発明に係る化合物のいずれかの使用を提供する。

本発明はまた、上記のすべての化合物の調製の方法を提供し、該方法は以下の工 程の１つまたはそれ以上を包含する：ａ）適切な開始物質をＮ−説アセチル化プ ロセスに供す工程；ｂ）特に上記該工程ａ）で生成した遊離Ｎ１３基を硫酸化す る工程；Ｃ）上記Ｄ−グルクロン酸残基の少なくともいくつかをＬ−イズロン酸 残基に置換するようにｂ）の生成物をエピマー化する工程；および ｄ）得られた化合物の遊離ヒドロキシ基の少なくともいくつかを硫酸化する工程 。

好ましくは、上記方法は、特定の旦、　ｃｏｌｔ株から抽出して得られる様々な 分子量を有する多糖類（以後に５糖類と称する）を一連の化学的および酵素的方 法に供することを包含する。

該一連の化学的および酵素的方法の概略は以下のように例示される： ａ）本質的に交互に直線的に存在するＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチルーＤ −グルコサミンの配列からなる上記Ｘ５糖類を化学的Ｎ−説硫酸化プロセスに供 する； ｂ）工程ａ）で得られた生成物の遊離Ｎ１３基を適切な硫酸化剤を用いて硫酸化 する； Ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、ウシの肝臓から抽出されるｐ−グルクロニル −し−イズロニルー０５−エピメラーゼを用いてインキュベートし、一定量のＤ −グルクロン酸残基をＬ−イズロン酸残基に置換する； ｄ）工程Ｃ）で得られた生成物を適切な硫酸化剤と反応させることにより多糖類 鎖中の遊離ヒドロキシ基の水素を一定量硫酸基で置換する。

好適な実施態様において、本発明は、交互に存在するウロン酸およびグルコサミ ン残基の配列からなる新規な多糖類を提供し、該多糖類は、含有百分率が約３５ から約１００の範囲のＮ−硫酸化基、含有百分率が約０から約６５の範囲のＮ− アセチル化基、含有百分率が約ｌＯから約２５の範囲のし一イズロン酸残基、最 小含有百分率が約２５の６−〇−硫酸化基を有し、これらの化合物は更に、残留 しているウロン酸残基が本質的に叶グルクロン酸残基であることで特徴付けられ る。このような化合物番よ、以下の方法で調製され得る。

ａ）本質的に交互に直線的に存在するＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ −グルコサミン残基の配列からなるに５糖をヒドラジン／硫酸ヒドラジンの混合 物を用いて約３０分から約６時間の間、約８０°Ｃと約１１０°Ｃとの間の温度 で処理する；ｂ）工程ａ）で得られた化合物を二酸化硫黄と窒素含有有機塩基と の複合体から選択される硫酸化剤を用いて約４５°Ｃと約６５°Ｃとの間の温度 で最大２４時間までの時間処理する；Ｃ）工程ｂ）で得られ、アセチルアミノお よびスルファミノ基を様々な比率で含有する本質的に交互に存在するＤ−グルコ サミン残基ならびにＤ−グルクロン酸からなる多糖類である化合物を酵素Ｄ−グ ルクロニル−し一イズロニルー０５−エピメラーゼの作用に供し、はぼ室温にて 最大２日間までの期間処理する；ｄ）工程Ｃ）で得られた化合物を、窒素含有有 機塩基の対応する塩類に変換し、引続き二酸化硫黄と窒素含有有機塩基との複合 体から選択される硫酸化剤を用い、不活性有機溶媒中にて、約−５℃と６０℃と の間の温度で、最大２４時間までの時間処理する； この方法は、工程ｄ）で得られた化合物が必要に応じて工程ｂ）の硫酸化工程に 供、され得ることで更に特徴付けられる。

上記方法は、好ましくは、生成物を本来定義するように、３−０−スルホトラン スフェラーゼの作用に供す工程を包含する。

本発明は更に、下記の化学式で表される、本質的に交互に直線的に存在するＤ− グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の配列からなるに５糖 類を提供する。

該に５糖類は約１０００から約１０００００ダルトンまたはそれ以上の平均分子 量を有し、その”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルは１０４．９８、およびｓｓｐｐｍで 固有シグナルを示す。本発明はまた、本質的に交互に存在するＤ−グルクロン酸 およびＤ−グルコサミンのユニ・ノドの配列からなる多糖類を提供する。これら の多糖類は、Ｎ−硫酸化基を約３５から約１００％含有し、Ｎ−アセチル化基を 約０から約６５％含有し、かつその１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが１０４．６０、 および２４ｐｐｍで固有シグナルを示すことで特徴付けられる。

本発明の他の多糖類は、本質的に交互に存在するＤ−グルクロン酸およびＤ−グ ルコサミンのユニットの配列からなる多糖類を包含し、Ｎ−硫酸化基を約３５か ら約１００％含有し、Ｎ−アセチル化基を約０から約６５％含有し、かつ最小含 有百分率約２５の６−〇−硫酸化基を含有する。この化合物は、約１．０から約 ２．７の範囲の硫酸化基／カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ｇｒｏｕｐ ｓ）の比率、約＋５５°から約＋６５゛の範囲の旋光度、および抗トロンビンＩ Ｉ＋に対する親和性を有することによって更に特徴付けられる。

これらの化合物は、上記の方法を適切な順序、例えばａ）およびｂ）、ａ）、ｂ ）およびｄ）等で行うことにより調製され得る。

この順序に従って得られる新規な多糖類およびそれぞれの反応工程における中間 体は、遊離酸、もしくは、無機のアルカリ塩（ナトリウム、カリウム、カルシウ ム、またはマグネシウム塩を包含する）のような、例えば無機あるいは有機酸と の処理により次々に調製され得る化合物自体からのこれらの塩の形に、回復され 得る。

本発明の化学的および酵素的工程の組み合わせは新規であり、以前に微生物起源 の多糖類から開始されたことはなかった。

一般に、通常ＨＰＬＣで決定された約１０００から約１０００００ダルトンの範 囲またはそれ以上の分子量を有するに５糖類は、上記工程ａ）に従って、例えば 、硫酸ヒドラジンを含むヒドラジン、好ましくは約１０重量％の硫酸ヒドラジン により、好ましくは密封管内で、約３０分から約６時間までの適当な様々な時間 、約８０℃と約１１０°Ｃとの間の温度で処理され得る。

この手順により、グルコサミンユニ・７トのある含有百分率のＮ−アセチル基が 除去され、得られる化合物は、工程ｂ）に従って、遊離アミン基をスルファミノ 基に置換するために、適当な硫酸化剤で処理される。適当な硫酸化剤は、三酸化 硫黄と窒素含有有機塩基との複合体、例えばトリ（Ｃ＋−４アルキル）アミン二 酸化硫黄、ピリノン、三酸化硫黄、およびそのアナログから選択され得る。少量 の水の存在でさえ最終生成物の性質に影響し得るので、脱水剤が使用されること は、本質的ではないが、通常好ましい。所望の位置にＳＯ３−基を導入すること が可能な他の硫酸化剤もまた、本発明の範囲に含まれる。

Ｎ−硫酸化反応は、好ましくは、約４５℃と６５℃との間の温度で行われ、反応 が完了する時間に依存する。ト硫酸化は、それ以上またはそれ以下の範囲である 。通常、遊離アミノ基の大部分を硫酸化するには、約６から約２４時間で充分で ある。

得られた多糖類は、一般的に、種々の部分においてアセチルアミ７基およびスル ファミノ基を含有する本質的に交互に存在するＤ−グルクロン酸およびＤ−グル コサミンユニットがらなり、次いで、酵素的処理に供され得る。この酵素的処理 は、例えば、上記の工程Ｃ）に従い、多糖類鎖のある程度のＤ−グルクロン酸残 基をＬ−イズロン酸残基にエピマー化するために行われる。このエピマー化は、 Ｈ，Ｐｒ１ｈａｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９゜４９５　［１９８０ １）の手順に従い、ウシの肝臓から得られ得る酵素、Ｄ−クルクロニル−し−イ ズロニルー０５−エピメラーゼによって、最も好ましく成し遂げられる。

好ましい実施においては、ｂ）に基づいて得られる多糖類は、当業者に明かな条 件下で、室温にて、例えば、数時間から２日間までの期間、酵素とともにインキ ユベートされる。さらに、使用される基質の型およびインキユベートの時間に依 存して、異なる割合でし一イズロン酸残基に置換したＤ−グルクロン酸残基を有 する多糖類は得られ得る。工程ｄ）は実質的にＡ、　Ｏｇａｍｏら（Ｃａｒｂｏ ｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、、奥、１６５　［１９８９］）によって記述された方 法または以下に例示された方法に従って行われ得る。

Ｃ）に基づいて得られる多糖類は、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミ ン、またはトリブチルアミンの塩のような有機窒素含有塩基に相当する塩に有利 に第一に変換され、次いで、工程ｂ）のＮ−硫酸化に用いられるような適切な硫 酸化剤と処理される。この反応は、無水で、不活性な有機溶媒、例えば、ジメチ ルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルホキンド、またはそれら の混合物の存在下で好ましく行われる。

〇−硫酸化の割合は、使用される基質、および反応条件に依存する。

本発明の目的のために、この過程は、約−５℃と約６０℃との間の温度で、２４ 時間までの期間行われる。

一般に、Ｎ−説アセチル化−Ｎ−硫酸化に５多糖の量から換算された、重量基準 で約５から約２０当量の予め測定された硫酸化剤が使用される。

部分的なＮ−脱硫酸化は、この反応の過程の間に生じ得る。

所望であれば、工程ｄ）の生成物は、工程ｂ）に記述と同様のＮ−硫酸化の手順 に供され得る。

このように調製される多糖類は、当該技術分野において公知の方法、例えば、反 応混合物の透析、次いで透析された溶液の凍結乾燥、に従って回収され得、そし て”Ｃ−ＮＭＲおよび’　）Ｉ−ＮＭＲスペクトル分析（ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏ ｐｙ）によって特徴付けられ得る。これはグリコサミノグリカンの特異的な識別 特徴を提供し得る（Ａ、Ｓ、ＰｅｒｌｉｎＳＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏ ｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

？　［１９７６］、９４；　Ｌ、Ａｙｏｔｔｅら、Ｃａｒｂ、Ｒｅｓ、［１９８ ０Ｆ、ｕｌ、２６７）。

池の特徴付けの方法、例えばＨＰＬＣｌもまた、有利に用いられ得る。

さらに詳細には、’　Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、図５．７からＩＬ　および１６ に記載のスペクトルの５．３５ｐｐ＋ｓおよび４．５５ｐｐｍにおけるシグナル によって、非硫酸化のし一イズロン酸残基およびＤ−グルクロン酸残基の同定お よび定量がなされる（Ｄ、　ＬａｎｅおよびＵ、　Ｌｉｎｄａｈ１編、Ｅｄｗａ ｒｄ　Ａｒｎｏｌｄによって出版された、Ｂ、　Ｃａ５ｕのｒＨＥＰＡＲＩＮ、 　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｊ、２５−４９［１９８６］参照）。

末端残基に関連する１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて他のマイナ−シグナルが 検出可能で、還元性のアノマー性炭素の残基のシグナルは９０−９５および９９ ５−９８ｐｐにあり（Ａ、Ｓ、　ＰｅｒｌｉｎおよびＢ、Ｃａ５ｕ；　Ｔｈｅ　 Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、１巻、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＳ　 ＮｅｗＹｏｒｋ［１９Ｂ２］、１３３の表１）、そして不飽和末端ウロン酸残基 のシグナルは１１０ｐｐｍにある（Ｂ、　Ｃａ５ｕら、Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｊ、 　１３３．５９９［１９８１１；　Ｂ、　Ｃａ５ｕ、　Ｎｏｕｖ、　Ｒｅｖ、　 Ｆｒ、　ＨａｅｍａｔｏｌＳ１４．２１１　［１９８４］；　Ｊ、　Ｒ，Ｌｉｎ ｈａｒｄｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６１．１４４４８　［１９８６ ］）。

Ｄ−グルクロン酸とし一イズロン酸との相対的な割合はまた、Ｊ、　Ｊａｃｏｂ ｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　Ｕｌ、７７　（１９７９）に記載され た操作に従って、Ｃ５−エピマー化多糖類の脱アミノ性開裂（こよって得られた 三糖類のペーパークロマトグラフィーによって測定され得る。関連するクロマト グラムを図１３に示す。

ＮＭＲスペクトルおよびペーパークロマトグラムの解析は、本発明の新規な多糖 類が、約３５から約１００％の間で変化する含有百分率のＮ−硫酸化基、約０か ら約６５％の間で変化する含有百分率のＮ−アセチル化基、総ウロン酸に対して 換算した約１０％と約２５％との間の含有百分率のＬ−イズロン酸、および約２ ５％の最ｌＪＸ含宵百分率の６−〇−硫酸化基を有することを示す。

より低い割合のＮ−硫酸化基、より高い割合のＮ−アセチル化基、２５％より高 い含有百分率のイズロン酸および２５％より低０最小含有百分率の６−〇−硫酸 化基を宵する多糖類もまた、上述の方法に従って得られることが、当業者に明白 である。該イし合物は、種々の反応工程において対応する中間体とともに、本発 明の範囲に入るものである。

上述のように、これらの新規な多糖類は、重要かつ有用な、特に、抗血栓剤およ び抗凝固剤としての生物学的特性を示し、そして本発明の特定の化合物の活性は 、実施例１４および１５とともに示される。

本発明の化合物は、例えば、約３０から約３００■ｇの間で変化する単位注射剤 容量を１日当り１回またはそれ以上投与され得る。

本発明は、特に、経済的に実行可能な規模で製造され得る生成物を提供する。本 発明は、抗血栓剤および抗凝固剤などとしてヒト治療に適用するための、本発明 から得られた生成物の使用を伴う工業的規模に適用され得るすべての局面に関す る。本発明の目的である化合物は、この目的のため、例えば非経口投与に適切な 薬剤組成物に適切な賦形剤および他の成分などを用いる慣習的な技術によって処 方され得る。

非経口投与用の処方物の例としては、例えば、アンプルに入れられた滅菌溶液が 包含され、溶液を体液と等張にする物質もまた、包含され得る。

本発明の種々の製造工程のそれぞれにおいて中間体として得られる化合物は、一 般に、単離され、特徴付けられるが、次の置換などにおいてもまた、用いられ得 る。それらを特徴づける場合は、末端多糖類について上記に示されたように、’ 　Ｈ−ＮＭＲおよび”Ｃ−ＮＭＲスペクトル分析、またはいずれかの他の適切な 手段によって定性が行われる。

従って、例えば、工程ｂ）で調製される物質は、本質的に、交互に存在するＤ− グルクロン酸およびＤ−グルコサミン残基からなり、約３５から約１００％のＮ −硫酸化基および約Ｏから約６５％のＮ−アセチル化基を含有する多糖類で有り 得る。それらの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Ｎ−硫酸化基およびＮ−アセチル 化基に典型的な、６０ｐｐｍおよび２４ｐｐｍの固有シグナルとともに、Ｄ−グ ルクロン酸に典型的なＬＱ４ｐｐｍの固有シグナルを示す（図４．５および７か ら１１）。

上記スペクトルで検出可能な他のマイナーシグナルは１０９および１０３ｐｐｉ ｌこおいて明白であり、それらは末端のウロン酸残基に関連する（図４．５、お よび７）。

種々の反応工程の中間体は抗血栓特性および抗凝固特性を有し、本発明の範囲に 入る。

特に、工程ｂ）によって得られる多糖類は、さらに、実質的には工程ｄ）につい て記載したように行われる、〇−硫酸化（こ供され得る。

再度、必要に応じて反応の過程の間に、部分的Ｎ−説硫酸化が起ごり得る。所望 であれば、〇−硫酸化に続０てＮ−再硫酸イヒが、上述のように行われ得る。得 られた化合物は、驚（Ｘたことに、抗トロンビン目ｌに対する親和性を有する。

以前（こ（まＬ−イズロン酸残基の存在が活性に必須であると考えられて（Ａた ので、この結果は予想外である。従って、エピマー化されていないが抗トロンビ ア　ＩＩ＋に対する親和性を示すこれらのイし合物は、本発明の特に好ましい特 徴を形成する。

このクラスの多糖類は、交互に存在するＤ−グルクロン酸およびＤ−グルコサミ ン残基、約３５から約１００の間で変化する含有百分率のＮ−硫酸化基、約０か ら約６５の間で変化する含有百分率のＮ−アセチル化基、および２５の最小含有 百分率の６−〇−硫酸化基を有することによって特徴づけられ得る。

このことは、Ｄ−グルコサミン残基のＮ−および６罰−硫酸化基に典型的な、６ ｏおよび６９ｐｐｍの固有シグナルを有する”　Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図１７ から３２を参照）によって再度水され得る。

これらの化合物はさらに、約１．０から約２．７０間で変化する硫酸基／カルボ キシル基の比率、および約＋５５°から約＋６５゜の間で変化する旋光度によっ て特徴づけられる。交互に存在するＤ−グルクロン酸およびＤ−グルコサミン残 基を有し、より低い含有百分率のＮ−硫酸化基、より高い含有百分率のドアセチ ル化基、２５より低い最小含有百分率の６−〇−硫酸化基、ならびに抗トロンビ ンＩ１１に対する親和性をさらに有する多糖類もまた調製され得、そして本発明 の範囲に入り得ることもまた、当業者に明白である。

従って、本発明は、広範囲の有用な多糖類を、それらを調製するための好都合な 方法とともに提供することが、認められる。

天然の多糖類を得るための抽出操作は、多くの場合繁雑かつ高価であり、そして 純粋な天然の物質を得るための種々の分別および解重合の方法は、いつも再生可 能な生成物を提供し得るとは限らない。

粗製の動物性抽出物に依存する（それは、動物の疾病、伝染病などに固有の危険 を冒す）ことを含むこれらの不利益は本発明によって克服され、本発明において は、微生物が事実上無制限の開始物質源を提供し、所望の生成物を大量に合成し 続ける間、入念に制御された条件下に微生物が維持され得る。

本発明の化合物は、必要に応じてＮ−硫酸化された化合物を含み、Ｄ−グルコサ ミン残基の３−位において、ある種のヒドロキシ基が対応する〇−硫酸化基に変 換されていることによって、次の酵素反応の開始物質として働き得る。そのよう な化合物もまた、上述されている。

そのような反応は、下記の調製例１に記載したように調製され得る酵素、３−〇 −スルホトランスフェラーゼの存在下で行われることが好ましい。

多糖類は、次に、当該分野で周知の条件下で酵素とともにインキュベートされ、 ３−〇−硫酸化され得る。

本発明で開始物質として用いられるに５糖類は、適切な発酵培地中のＥｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの培養株によって好気性条件下で調製され得る。得られ た糖類の性質は正確に予測され得ないが、より高レベルの炭素源、特にグルコー スが、より高分子量型のに５多糖類を生じる傾向があることがわかっている。

本発明の目的に用いられ得るＥ、　ｃｏｌｉの株は、Ｋ５莢膜多糖抗原の存在を 示し、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎおよびｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｆａ　 Ｃｅｎｔｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔａｔｅｎｓ　５ｅｒｕ＋＊　１ｎｓｔｉｔｕ ｔ　ｏｆ　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋを含むいくつかの異なる供 給源から入手可能である。

本発明の目的に用いられ得る他のＥ、　ｃｏ且の株は、いくつかの異なる株の収 集物から再度人手され得るか、または、主として腎孟腎炎および尿路感染症がら 臨床的に単離されたものであり得る。それらは、ＡＰＩ　ＳＹＳＴＥＭ　２０ｇ を介Ｌｒ、Ｗ、　Ｍｉｓｓｉｃｈら、Ｚ、Ｇｅｓａｍｔｅ　Ｆｌｙｇ、、１−５ 、（１ｏ）、５１１３　（１９８９）、またはり、Ｓ、Ｄｕｐｔｅら、Ｓｅｔ　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、■、７５　（１９８２）に従って、Ｋ ５莢膜多糖抗原の存在を示す株として特徴づけられ得る。

これらの臨床的に単離されたＥ、　ｃｏｌｉ２株のいくっがは、ブダペスト条約 の規定に基づいて、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏ 。

ｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　Ｇ＋ｓｂＨ，Ｍａｓ ｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ｌｂ。

Ｄ−３３００、Ｇｅｒｍａｎｙに１９９１年２月２７日付で寄託されている。こ れラノ株は、受託番号ＤＳＭ　６３７１、ＤＳＭ　６３７２オヨびＤＳＭ　６３ ７３を付与された。それらの特徴は、実施例によって以下に報告される： （以下余白） ＋＝陽性　−＝陰性　同上＝前例と同様これらのＥ、　ｃｇＪ１株は、上記で測 定されたようにに５莢膜多糖抗原の存在を示した。本発明に有用なＥ、　ｃｏｌ ｉ株は、標準寒天（Ｍｅｒｃｋ　＋）、Ｌｏｅｂ寒天、またはＥ、　ｃｏｌｔに 適切な任意の培地上で保存され得る。

Ｋ５の調製およびＦ、、　ｃｏｌｉの培養を、下記調製例２に例示する。

以下の実施例および調製例は本発明をより詳しく説明する目的のためにのみ提供 されるものであり、何ら本発明を限定すると解釈されるべきものではない。

１髪匠」 ３−０−スルホトランスフェラーゼの ３−０−スルホトランスフェラーゼは、Ｓｗｅｄｉｓｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 　。

ｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｈｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃ ａｌ　Ｃｅｎｔｒｅ、Ｂｏｘ　５７５５−７５１２３　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗ ｅｄｅｎから入手可能な、マウスから抽出されるＦｕｒｔｈ肥満細胞腫瘍から調 製され得る。Ｆｕｒｔｈ肥満細胞腫瘍は、Ｊ、　Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ、　Ｓ ｏｃ、　ＥＸｐ、　Ｂｉｏｌ、、■、８２４（１９５７）に記載されたように、 正常なマウスの系統で発生し得る。

詳細な調製方法は以下の通りである。

肥満細胞腫瘍（組織約７０ｇ）を、プロテアーゼインヒビター：　１０Ｍｇ／＋ ａｌノヘブスタチン、２ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭ　ＰＭＳＦ（Ｓｉｇ＋＊ ａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ）、を含有する０、　０５Ｍ　ｌ−リス−１χトリト ン（Ｔｒｉｔｏｎ”）　Ｘ−１００，ｐＨ７，４，２００ｍ１中テホモシナイス シタ。

ホモジネートを４℃で１時間緩やかに攪拌し、次に１１０００００ｘで１時間遠 心分離した。上清をグラスファイバーフィルターに通し、以下の精製プロトコル に供した：１）　ヘパリン−セファロースの３１ｍ１カラム：これは初めに緩衝 液Ａ　（０，０５Ｍト！Ｊ　ス−０，１％　ｌ−リド：／　Ｘ−１００、ｐＨ７ ，４、ｌμｇ／ｍｌのペプスタチン、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２０％のグリセロー ル（０，１５Ｍ　ＮａＣ１含有））で洗浄され、次に緩衝液Ａ中の０．１５−１ ．　ＯＭ　ＮａＣ１の直線濃度勾配（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い て溶出された。　４ｍｌの溶出画分を、実質的にＪａｎｓｓｏｎらによってＢｉ ｏｃｈｅ＋ｉ、　Ｊ、、ｕｌ、４９（１９７５）に記載された手順に従って、０ −スルホトランスフェラーゼ活性を測定した。〇−説硫酸化ヘバリンを、硫酸受 容体として用いた。１０μｇの受容体、５μＣｉの”Ｓ　ＰＡＰＳ、および５０ ＋ＩＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２．１ｈＭ　ＭｇＣ＋２、Ｓ ｅＭ　ＣａＣｌ２．３．５μＭＮａＦ、１％　トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）　Ｘ− １００”、ｐＨ７，４、からなる総容量１００μｌの酵素タンパク質を、３７℃ で３０分間インキュベートした。１．３％の酢酸ナトリウムを含有する４００μ ｍのエタノールを０．４＋ｎｇの担体ヘパリンとともに加えて反応を終了し、試 料を一２０℃で一晩放置した。遠心分離（１３０００ｒｐｍで１０分間）の後、 上清を捨て、ペレットを１００μｍの水に溶解した。

３５Ｓで標識された多糖類を、以下のようにセフアゾ・２クスを介する遠心分離 を用いて、導入されなかった標識の残留物から分離した。シリンジ（５ｃｍｘＯ ，９ｃｍ　ｉ、ｄ、）に極細粒のセファデックスＧ−２５を充填し、０．２Ｍ　 ＮＨａＨＣＯ３で平衡化し、そして次に２００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し、そ して円錐形の遠心分離管中に懸濁して、はとんどの液体を排除した。充填され、 そして遠心分離されたシリンジに試料（１００μｌ）を加え、次に、再び同様に して遠心分離した。標識された多糖類を管に収集された溶出液中に回収した。但 し、低分子量の標識された化合物は、ゲルに保持された。溶出液を、シンチレー ション測光法を用いて分析した。活性画分をプールし、０．１５ＭのＮａＣ１を 含有する緩衝液Ａに対して透析した。

２）セファロ−スプルー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｂｌｕｅ）の４１＋ｉｌカラム 、流速１５１７時間。試料を加えた後、Ｏ，ＩＳＭ　ＮａＣ１を含有する緩衝液 Ａでカラムを洗浄し、０．１５から１．０ＭのＮａＣ１の直線塩勾配を用いて再 度溶出し、酵素活性の最後の部分を得た。５＠ｌの画分の〇−スルホトランスフ ェラーゼ活性を上述のようにアッセイした。

活性画分をプールし、約１ｈｌに濃縮し、緩衝液Ａ−０，０７５Ｍ　ＮａＣ＋に 対して透析した。次に、β−メルカプトエタノールを試料に加えて、１２ｍＭ濃 度とした。

得られた純度は１５０倍であり、０−スルホトランスフェラーゼ活性は見かけ上 １００％回復していた。セファロ−スプルーを通した精製によって得られた試料 は、グルコサミニル６−〇−スルホトランスフェラーゼ、イズロノシル２−０− スルホトランスフェラーゼおよびグルコサミニル３−０−スルホトランスフェラ ーゼを明らかに含有していた。

臣賢匠」 Ｅ、　ｃｏｌｔの立　およびに５の　゛６培養培地 に５糖類を製造するために、Ｆ、ｃＵｉｉは、好気性条件下で、炭素；窒素；お よび無機塩類の同化可能な元素源を含有する水性栄養培地中で培養され得る。培 養培地は、発酵技術で用いられる多数の栄養培地の中の任意の１つであり得、そ して発酵の収率を向上するとともに所望の平均分子量のに５糖類を得るために、 その組成物は、当業者の経験によって調製され得る。

好ましい炭素源は、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびペプトンであ る。好ましい窒素源は、アンモニア、硝酸塩、粗びき大豆粉、ペプトン、肉エキ ス、酵母エキス、トリプトンおよびアミノ酸である。培養培地中に加えられる好 ましい無機塩としては、ナトリウム、カリウム、鉄、亜鉛、コバルト、マグネシ ウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、炭酸、リン酸、リン酸水素、リン酸 二水素および硝酸のアニオンを生じ得る通例の可溶性の塩がある。

（以下余白） 通常、Ｋ５糖類製造株を振盪フラスコ中で前培養し、次にその培養物を、上記糖 類を大量生産するためにジャーファーメンタ−に移す。前培養にも用いられ得る 典型的かつ代表的な発ｉｎ地は、１リツトルにつき以下の組成を有する：に、Ｈ ＰＯａ　３．６　ｇ ＫＨ２ＰＯ４１，２ｇ カザミノ酸　２０　ｇ クエン酸ナトリウムニ水和物　０．５ｇ硫酸アンモニウム　１ｇ グルコース　４ｇ Ｍｇ５Ｏａ　０．１５　ｇ 水１．０Ｏｎｌ中の１００ｇの酵母エキスの透析可能な部分（水に対する透析、 膜透過限界：　１５０００　Ｄ）　１リツトル培地のｐＨは７．２である。

肚 ａ）　肛且ＩＬｏｅｂ寒天プレートから得た１ループのＬｍを、５ＩｌｌのＭｅ ｒｃｋ標準１培地に懸濁し、ｐＨ約７．２で、３７℃で６時間インキュベートす る。次に、混合物を上記培養培地７００■ｌ中に移し、同じ条件で一晩インキコ ベートした。

ｂ）魚群　有効ｐＨ６，８で好気性条件下、３７°Ｃで、約１から１０時間の間 で時間を変化させて発酵を行う。

１０リツトルの培地を含有するジャーファーメンターエＩｈＨＰＯ４３６ｇ にｔ１２ＰＱａ　１２　ｇ カザミノ酸　２００　ｇ クエン酸ナトリウムニ水和物　５ｇ 硫酸アンモニウム　ｔｏ　ｇ グルコース　４０　ｇ ＭｇＳＯ蟲　１．５ｇ 水１リットル中の１０００ｇの酵母エキスの透析可能な部分（水に対する透析、 膜透過限界：　１５０００　Ｄ）　１０１を用いる。

グルコースもしくは他の炭素源を、指示された量よりも低いか、または約５％Ｗ ／Ｖまでの量で含有する、類似の発酵培地もまた、有利に用いられ得る。

■優皿■ ｕ　ＫＳ多糖類を、ｂ）の条件下、Ｗ、　１ｒａｎｎら、Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、、出、３５９　（１９１１１１＞に記載された手順に従うか、または 以下のようにして、発酵培地から回収する。

発酵ブイヨンを５２０Ｏｒｐｍで約３５分間遠心分離する。得られた沈澱物をリ ン酸緩衝液約８００ｍ１に懸濁し、得られた懸濁液を１ｌ１００Ｏｒｐで１５分 間遠心分離し、上清を除去する。沈澱物を、ｐＨ７，３の５０ｍＭ　）リス５ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ緩衝液８００ｍ１　（３７℃で予備加温した）中に懸濁し、そして 懸濁液を３７℃で３０分間水浴中に静置する。懸濁液を、次に、９０００ｒｐｍ で２０分間遠心分離する。上清を除去し、そして抽出を３回繰り返す。

トリス／ＥＤＴＡ−抽出の上清を合わせ、ＣＥＴＡＶＬＯＮ　（商標）の１０％ 水溶液を、沈澱がもはや観察されなくなるまで加え、混合物を室温で一晩静置し た。混合物を８００Ｏｒｐｍで、２０　”Ｃで１ｏ分間遠心分離し、沈澱物をＩ Ｍ　ＮａＣ１水溶液約１０１０−２Ｏに溶解し、少なくとも８倍容量のエタノー ルで溶液を希釈し、遠心分離する。

粗製のに５糖類からなる固形物を収集し、ＬＭ　ＮａＣ１約１０−２０冒１に再 溶解し、少なくとも８倍容量のエタノールを加える。沈澱物を遠心分離により収 集し、水に溶解し、そして透過限界が３５００ダルトンの透析バッグを用いて２ ４時間透析する。透析された溶液を９（ｌＱＯｒｐｍで、４°Ｃで２０分間遠心 分離し、沈澱物を捨てる。得られた、精製されたに５多糖類からなる上清を、凍 結乾燥する。

得られた精製に５糖類を水に溶解して２−３％の濃度にし、得られた溶液を４５ ００Ｏｒｐｍで、４℃で４時間遠心分離することによりリポ多糖類を除去する。

痕跡量の残留リポ多糖類の存在は開始物質のプロセシングに影響しない。Ｅ、　 ｃｏｌｉ、のリポ核酸を除去するために、得られた溶液をＭｇＣＭｇＣ１２（１ ０を含有するリン酸緩衝液中のりボヌクレアーゼ（Ｓｉｇ＋＋ａ）で２４時間処 理し、次に、３５００ダルトンの透過限界を有する透析バッグで脱イオン水に対 して２４時間透析し、そして凍結乾燥する。この手順により培養物１０１当り生 成物的０．８−１ｇを得る。

上記手順に従って調製された代表的なに５糖類は、以下のとおりである。

Ａ）　ＨＰＬＣにより測定された平均分子量約５ｏｏｏダルトンを有するに５糖 類。このに５糖類は、図１に報告する”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有し、Ｗ、　 Ｖａｎｎらによる、Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｕｌ、３５９　（１９８ １）に教示のように、１１０４ｐｐにおけるＤ−グルクロン酸、ならびに５５お よび９８ｐｐｍにおけるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンユニ。

トのメジャーシグナル、ならびに１３　Ｃａ５ｕらによるＢｔｏｃｈｅｍ。

Ｊ３．１９７．５９９　（１９８１）に教示のように、Ｄ−グルクロン酸に由来 する末端残基に帰する、１１０および１１０３ｐｐにおける典型的なマイナーシ グナルを示す。

Ｂ）　ＨＰＬＣにより測定された平均分子量約５００００ダルトンを有するに５ 糖類。このに５糖類は、図２に示す”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有し、１１０４ ｐｐ＋におけるＤ−グルクロン酸、ならびに５５および９８ｐｐｍにおけるＮ− アセチル−Ｄ−グルコサミンユニ、トのメジャーシグナルを示す。

Ｃ）　ＨＰＬＣ測定による平均分子量約１０００００ダルトンを有するに５糖類 。このに５糖類は、図３に示された”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。Ｄ−グ ルクロン酸、ならびにＮ−アセチル−〇−グルコサミンユニットの典型的なメジ ャーシグナルは、１１０４ｐｐにおいて、ならびに５５および９８ｐｐｍにおい てそれぞれ示される。

上記の測定により、開始に５糖類が以下の三糖ユニ・ｙ）の繰り返しを有するこ とが確認される： 本発明の多工程製造法に従って調製された化合物の’　３Ｃ−ＮＭＲおよび’　 Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、開始に５糖類のスペクトルとともに、Ｂｒｕｋｅｒ　 ＣＸＰ−３００光度計を用いてＤ２０溶液から記録した。例外として、実施例８ Ｄの化合物のみ、Ｂｒｕｋｅｒ光度計ＡＭＸ５００を用いてＤ２０溶液から”Ｃ −ＮＭＲスペクトルを記録した。

Ｋ５糖類の分子量のＨＰＬＣによる決定を、０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌｐＨ８緩 衝液中のＩＭ　ＮａＣｌで平衡化した５ｕｐｅｒｏｓｅ　６　（商標）および５ ｕｐｅｒｏｓｅ　１２　（商標）カラムを用いて行った。本発明の化合物の純度 （多糖類含量）および関連する中間体を、カルバゾール法（Ｔ、　Ｂｉｔｔｅｒ およびＨ，Ｍ、　Ｍｕｉｒ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ム、３３０［１ ９６２］）によって分析した。純度は、一般に、９Ｂより高かった。旋光度は、 １％濃度の水溶液で、ＪＡＳＣＯＤＩＰ３７０旋光計を用いて室温で測定した。

被験試料の純度を考慮して、測定値を引き続き調整した。

（以下余白） 実ｍ Ｋ５　Ａか゛のＮ−アセチル　−Ｎ−のＯ」らＬグ上υ− Ａ）　バイアル中で、Ｋ５糖類Ａ　１００ｍｇおよび硫酸ヒドラジン１３８ｍｇ を、ヒドラジン１．３８ｓｌに溶解した。この溶液を窒素雰囲気下に保ちながら 、バイアルを液体窒素中に置いて溶液を凍結した。次にバイアルを密閉し、徐々 に室温に戻し、次に９６℃で５時間加熱した。次にバイアルを液体窒素で再凍結 し、開封し、徐々に室温に戻した。この溶液を丸底の容器に注ぎ込み、トルエン ５ｍｌでバイアルを洗浄した。

この溶液を減圧下で濃縮し、操作を２回繰り返しくそれぞれトルエン２０ｍ１を 用いた）で、大部分のヒドラジンを（トルエンとともに）留去した。蒸留水Ｓｈ ｌを次に残留物に加え、得られた溶液を３７％塩酸水溶液を用いて中性とし、次 に透過限界３５００ダルトンの膜を通して、塩化ナトリウム溶液および水に対し て５日間（第１白目、０．５Ｍ　ＮａＣ１（２ｘ２１）、第２８目、０．２ＭＮ ａＣ＋（２Ｘ２　＋）、第３８目、０．１Ｍ　ＮａＣ１（２Ｘ　２１）、第４お よび５日目、Ｈ２Ｏ（２Ｘ２１））　、透析した。次に減圧下で溶液を濃縮し、 ６５ｍ１の蒸留水に溶解した。

得られた溶液のｐＨを、固形の重炭酸ナトリウムを加えて９に調整し、そして液 温を５５°Ｃに上昇させた。この温度で、攪拌を続けながら、トリメチルアミン 、三酸化硫黄の付加物６５ａ＋１を溶液に加え、この温度に１時間保った後、同 じ付加物をさらに６５＋ａｌ加え、そして全体を、さらに５時間反応させた。こ の溶液を、濃度が低下してい＜　（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎｓ）塩化ナトリウム水溶液および水に対して、上述のように透析した。

透析された溶液を最終的に凍結乾燥し、図４の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有す る生成物８０ｍｇを得た。

この生成物は、以下の固有シグナルを示す：１見ヱ１土至： ６０ｐｐｍ％Ｎ−硫酸化基 ６２ｐｐｍ、グルコサミン残基の未置換の６−ヒドロキシル基９ａｐｐ論、グル コサミン残基 １０９および１０３ｐｐ＋＊、末端のグルクロン酸残基１００−１１０１）Ｉ） ＩＩ領域中のすべてのアノマー性（Ｃ−１）炭素のシグナルの面積に対する２４ ｐｐｍのシグナルの面積の比から、’　３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで決定されたＮ −アセチル化基含有百分率は、約５であった。Ｎ−硫酸化基の含有百分率は、約 ９５であった。遊離の−ＮＯ２基に起因するシグナルは、観察されなかった。

Ｂ）　上述の調製法と同様の手順に従い、１０ｈｇのに５糖類Ａから出発し、硫 酸ヒドラジン／ヒドラジンによる反応を３時間に制限して、実施例ＩＡの生成物 の場合と同様にＩ３Ｃ−ＮＭＲにより決定された、含有百分率約１５のＮ−アセ チル化基、および含有百分率約８５のＮ−硫酸化基を有する、生成物７７ｍｇを 得た。　図５の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、以下の固有シグナルを示す：２４ および５５ｐｐｍ　（弱）二Ｎ−アセチル化基６０ｐｐｍ　（強）二Ｎ−硫酸化 基 ６２ｐｐｍ　（強）：グルコサミン残基の未置換の６−ヒドロキシル基 ９８ｐｐｍ　（強）＝Ｄ−グルコサミン残基１０４ｐｐＨ（強）＝Ｄ−グルクロ ン酸残基１０３および１１０９ｐｐ　（弱）：末端のグルクロン酸残基遊離の− ＮＨ２基のシグナルは存在しない。

Ｃ）実施例ＩＡの生成物の調製法と同様の手順に従（為、Ｋ５糖類Ａ）　１００ ＋ｍｇから出発し、硫酸ヒドラジン／ヒドラジンによる反応を１時間に制限して 、生成物７５Ｂを得た。この生成物は２．ｌｐｐｍにおけるＮ−アセチル化基の シグナルの面積とアノマー性水素（５１）Ｉ）Ｉ１１＋！：６１）Ｉ）ｌとの間 ）のシグナルの総面積との比からの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図６）、および実 施例ＩＢの化合物と同じ固有シグナルを示す図７の”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルで 決定されるよう１こ、含有百分率約３０のＮ−アセチル化基を有する。この化合 物Ｃヨ、約７０のＮ−硫酸化基含有百分率を有する。遊離のＮ１３基（ご固有の シグナルは存在しない。

（以下余白） 実ｍ Ｋ５　Ｂか゛の−アセチル　ｍ−の− 吐旦よ堕Ｕと に５糖類Ｂ　１００ｍｇから出発し、実施例ＩＡの生成物の調製法に記載したと 同様の手順に従い、硫酸ヒドラジン／ヒドラジンによる反応を５時間行い、実施 例ＩＡの生成物の場合と同様に、１３Ｃ−ＮＭＲ（図８）によって決定された、 含有百分率が５より低いＮ−アセチル化基、および含有百分率が９５より高いＮ −硫酸化基を有する、生成物７５ｍｇを得た。図８の”　Ｃ−ＮＭＲスペクトル は、実施例ＩＡの化合物と同じ固有シグナルを示す。遊離のＮ１３基に固有のシ グナルは存在しない。

支監匠」 Ｋ２Ｏか゛のＮ−アセチル　−Ｎ−の Ｏ」しくグ１Ｄ− に５糖類Ｃ）　１００ｍｇから出発し、実施例ＩＡの調製法に例示した手順と同 様の手順に従い、硫酸ヒドラジン／ヒドラジンによる反応を異なる時間行い、以 下の多糖類を調製した。

Ａ）　硫酸ヒドラジン／ヒドラジンによる反応時間＝５時間。収率：上記のよう に”Ｃ−ＮＭＲ（図９）によって決定された、含有百分率約２のドアセチル化基 、および含有百分率約９８のＮ−硫酸化基を有する、生成物１１５＋Ｉ１ｇｏ　 スペクトルは、実施例ＩＡの化合物と同じ固有シグナルを示す。

Ｂ）硫酸ヒドラジン／ヒドラジンによる反応時間＝２．５時間。

収率：図１０の目Ｃ−ＮＭＲスペクトルによって上記のように決定すれた、含有 百分率約２３のＮ−アセチル化基、および含有百分率約７７のＮ−硫酸化基を有 する、生成物１１０１ｇｏ　スペクトルは、実施例ＩＢの化合物と同じ固有シグ ナルを示す。

Ｃ）硫酸ヒドラジン／ヒドラジンによる反応時間＝８０分。収率　図１１の”Ｃ −ＮＭＲスペクトルによって上記のように決定された、含有百分率約４８のＮ− アセチル化基、および含有百分率約５２のＮ−硫酸化基を有する、生成物７５ｍ ｇｏ　スペクトルは、実施例ＩＣの化合物と同じ固有シグナルを示す。

実施例１．２および３で調製された多糖類のＮＭＲスペクトルは、開始に５糖類 の構造の他の改変が起こり得なかったことを、明瞭に示している。

支敷匠」 Ｃ５−エピマー　−Ｎ−ル　の−１０ Ａ）実施例ＩＡの生成物１０ｍｇを、Ｈ，Ｐｒ１ｈａｒに記載のようにしてウシ 肝臓から得られた（上記参照）、Ｄ−グルクロニル−し−イズロニルー０５−エ ピメラーゼを含有する調製物８ｍｇとともに、５０ｍＭ塩化カリウム、１５ｍＭ 　ＥＤＴＡおよび！駕のトリトンＸ−１００Ｒを含有するｐＨ７，４のＱ、　０ ５Ｍヘペス（Ｈｅｐｅｓ）　１ｔａｌ中でインキュベートした。

混合物を２日間室温に保ち、次に所望のエピマー化生成物を、ＤＥＡＥセルロー スのイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離した。生成物？ｆｆ１ｇを得た 。

’Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１２）の低磁場領域は、Ｌ−イズロン酸残基に典型 的な４，７および４．９５ｐｐｍにおけるシグナル（ＰｅｒｌｉｎＡ、　Ｓ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第Ｖｌ １巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　［１９７６］、９ ４ページ）を明瞭に示し、その面積は、ウロン酸の総面積の１８％に相当する。

同様の結果を、Ｊ、　Ｊａｃｏｂｓｓｏｎらの記載のように行ったペーパークロ マトグラフ（図１３）を用いて得（上記参照）、それによりＬ−イズロン酸の含 有百分率１８を測定した。

Ｂ）実施例２で得られた生成物１０ｍｇを、上記Ａ）の手順に従ってエピマー化 した。生成物７ｍｇを得た。’　Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１４）は、Ｌ−イズ ロン酸残基に典型的な４．７および４．９５ｐｐｍのシグナルを示し、その面積 は、ウロン酸の総面積の２２％に相当する。

図１３は、上記記載のように行ったペーパークロマトグラフに関し、それにより Ｌ−イズロン酸の含有百分率２ｏが決定される。

Ｃ）　実施例３ｃで得られた生成物１０ｍｇを、上記Ａ）の手順に従ってエビマ ー化した。図１３のペーパークロマトグラムを有する生成物７ｍｇを得、それに よりＬ−イズロン酸の含有百分率１９が決定された。

実施例４Ａおよび４Ｂで調製された多糖類のＮＭＩ？スペクトルは、Ｃ５エピマ ー化以外の構造の改変が起こり得なかったことを、明瞭に示している。開始基質 およびエピマー化の手順を考慮すると、実施例４ｃの生成物に関する他の構造上 の改変もまた、起こっていない。

実１ｕ【」 ０−　−Ｎ−−Ｃ５−エピマー　の−ｄＡ）実施例４Ａで調製された生成物１０ ０ｍｇを水２０ｍ１に溶解し、室温でアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）　 （登録商標＞　ＩＲ−１２０Ｈ’カラムに通した。次にカラムを水２０ｍ１で洗 浄した。溶出液を収集し、トリブチルアミンの１０％エタノール溶液を用いて＋ １）１を５，５にした。それぞれ４０ｍ　ｌのジエチルエーテルで過剰のトリブ チルアミンを３回抽出し、そして実施例４Ａの生成物のトリブチルアミン塩を含 有する水溶液を凍結乾燥した。得られた生成物ｔｏｏ＋ａｇを、無水ジメチルホ ルムアミド３２ｍ１に溶解し、無水ジメチルホルムアミド１５ｍ１に溶解したピ リジン、二酸化硫黄付加物７６５Ｂをその溶液に加え、そして得られた混合物を 、０℃に１時間保った。等容量の水を加え、４％水酸化ナトリウム水溶液を用い てｐＨ９にし、この液全体を、実施例ＩＡに記載したように、濃度が低下してい く塩化ナトリウム水溶液および水に対して透析した。

透析された溶液を凍結乾燥し、対応するトリブチルアミン塩に置換して得られた 生成物を、本実施例と同じ条件下で反応させた。生成物１８０ｍｇを得、その生 成物を最終的に、トリメチルアミン、三酸化硫黄付加物と実施例ＩＡに記載した と同様に反応させた。

図１５に示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する表題の化合物１８０Ｂを得、そ のスペクトルは、６０ｐｐｍ　（強）：Ｎ−硫酸化基；　６２ｐｐ穏（強）＝Ｄ −グルコサミン残基の未置換の６−ヒドロキシ基；６９ｐｐｍ　（中程度）　： 　６−０−硫酸化基；　９８ｐｐａ＋　（強）：グルコサミン残基；　９９ｐｐ ｍ　（中程度）：弗硫酸化Ｌ−イズｏｙ酸残基；　１０１０４ｐｐ強）：Ｄ−グ ルクロン酸残基の、固有シグナルを示した。

この生成物は、６９ｐｐａ＋における同一のシグナルの面積から決定された、６ −〇−硫酸化基の最小含有百分率５２を有する。

Ｂ）上記実施例５Ａの手順に従い、実施例４Ｂの生成物１００ｍｇを用いて開始 し、図１６の”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有し、そして、実施例５Ａに従ってＲ復 された化合物と同じ固有シグナルを示す生成物１６０ｍｇを得た。

この生成物は、６９ｐｐｍのシグナルの面積から決定された、６−〇−硫酸化基 の最小含有百分率４４を冑する。

Ｃ）　上記実施例５Ａの手順に従い、実施例４Ｃの生成物Ｓｍｇを用いて開始し 、生成物９ｍｇを得た。

開始基質および硫酸化の手順を考慮すると、実施例ＳＣの生成物に関する他の構 造上の改変は起こっていない。

（以下余白） 爽１」」 エピマー　Ｎ−および〇−硫　の一 実施例ＩＡにて調製した生成物１００ｍｇを水２０＋ｅｌに溶解し、室温でアン バーライト（登録商標）　ＩＲ−１２０Ｈ’カラムに通した。カラムを水２０■ ｌで洗浄した。溶出液を回収し、トリブチルアミン溶液（エタノール中１０％） 　３ｍｌを用いｐＨ５，５に調整した。余剰なトリブチルアミンをエチルエーテ ル４０ｍ１で抽出しく３回）、実施例ＩＡの生成物のトリブチルアミン塩を含有 する溶液を凍結乾燥した。

この得た塩１８０ｍｇを無水ジメチルホルムアミド３２ｍ１中に溶解した。この 溶液に、無水ジメチルホルムアミドｔｓｍｉ中にｔｇ解させた無水ピリジン、二 酸化硫黄付加物７６５＋ｅｇを添加し、この混合物を１時間θ℃に保持した。反 応混合物を等量の水と混合し、４％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを７．０に調整した。

次に混合物を、実施例ＩＡに記載したように濃度が低下してい＜　ＮａＣ１溶液 に対して透析した。

透析した溶液を凍結乾燥し、得た生成物を対応するトリブチルアミン塩に置換さ せるにあたり、本実施例（ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔＥｘａｍｐｌｅ）と同条件下 で反応させた。生成物９０ｍｇを得た。これを実施例ＩＡと同条件下で、トリメ チルアミン、二酸化硫黄付加物で処理した。”Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図１７） における６９ｐｐｍでのシグナル領域から決定された６−〇−硫酸化基の最小含 有百分率が３５であり、そして実施例ＩＡの生成物と同じ特性のシグナルを有す る生成物が得られた。

裏１」ヒ エピマー　−および０−　の 実施例ＩＡの化合物のトリブチルアミン塩を、実施例６　ニ記載したように調製 し、この塩１８（１＋＋ｇを無水ジメチルホルムアミド３２ｍ１中に溶解した。

溶液を０℃に冷却し、そして無水ジメチルホルムアミド１５ｍ１中で０℃で調製 した無水ピリジン、二酸化硫黄溶液７６５＋＊ｌを添加した。得た混合物を１時 間０℃に保持し、続いて等量の蒸留水と混合した。４％の水酸化ナトリウムを用 いてｐＨを９に調整し、酢酸ナトリウムで飽和させたエタノールを４倍量添加し た。混合物を一晩４℃に保持して、沈澱物を得、この沈澱物を蒸留水５０ｍ１中 に溶解した。得た溶液を３日間蒸留水に対し透析しく毎日３ｘ２リツトル、力・ ノドオフ１４０００　Ｄ）、最後に凍結乾燥した。

上述の手順を繰り返して以下の化合物を得た：Ａ）収量：　８５＋ａｇ、この化 合物は、Ｎ−硫酸化基の含有百分率が約９５および６−０−硫酸化基の含有百分 率が約１００であり（図１８のＩ３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける６ｏおよび６ ９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）、５（ｈ−／Ｃ００−の比が約２．１、およ び［α］ｏが＋５５．４”テあった。

８）収量：　９４Ｂ、この化合物は、Ｎ−硫酸化基および６−０−硫酸化基の含 有百分率が化合物７Ａと同様で（図１９の”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける６ ０および６９ｐｐｍ（７）それぞれでのシグナル）　、５０３−／ＣＯＯ−の比 が約２．２であった。

Ｃ）収量：　８２＋ｍｇ、この化合物は、Ｎ−硫酸化基および６−０−硫酸化基 の含有百分率が化合物７Ａと同様で（図２０の”　Ｃ−ＮＭＲｘベクトルにおけ る６０および６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）　、ＳＯ３−／ＣＯＯ−の比 が約２．２であった。

Ｄ）収量：　９５ｍｇ、この化合物は、Ｎ−硫酸化基の含有百分率が約９５およ び６−〇−硫酸化基の含有百分率が約８５であり（図２１の”　Ｃ−ＮＭＲスペ クトルにおける６０および６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）、ＳＯ３−／Ｃ ＯＯ−の比が約１．８であった。

支」■ エピマー　Ｎ＝および〇−硫　の−１ 実施例７の手順を繰り返した。ただし、実施例ＩＡの化合物のトリブチルアミン 塩を開始物質として用い、２つの溶液の混合物を前とは異なる時間０°Ｃに保持 した。上述の手順を繰り返して以下の化合物を調製した： Ａ）収量：　８０ｍｇｏ反応時間：２０分間。この化合物は、Ｎ−硫酸化基の含 有百分率が約９５および６−０−硫酸化基の含有百分率が約７０であり（図２２ の”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける６０および６９ｐｐ＋＊のそれぞれでのシ グナル）、ＳＯ３−／Ｃｏｏ−の比が約１．６であった。

Ｂ）収量：　９２Ｂｏ反応時間二４０分間。この化合物は、Ｎ−硫酸化基の含有 百分率が約９５および６−〇−硫酸化基の含有百分率が約７５であり（図２３の １３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける６０および６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナ ル）、５（ｈ−／Ｃｏｏ−の比が約１，７であった。

Ｃ）収量：　９ｈｇ０反応時間：４時間。この化合物は、Ｎ−硫酸化基および６ −〇−硫酸化基の含有百分率が化合物７Ａと同様で（図２４の　Ｃ−ＮＭＲスペ クトルにおける６ｏおよび６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）、５（ｈ−／Ｃ ＯＯ−の比が約２．３、および［ａ　］ｏが＋６２．４・であった。

Ｄ）収量：　９５Ｉｇ０反応時間：５．５時間。Ｎ−再硫酸化を実施例１＾に記 載したように行った。この化合物は、Ｎ−硫酸化基および６−〇−硫酸化基の含 有百分率が化合物７Ａと同様で（図２５の１３０−ＮＭＲスペクトルにおける６ ｏおよび６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）、ＳＯ３−／ＣＯＯ−の比が約２ ．５２であった。

裏差」■ エピマー　Ｎ−および〇−硫　の一 実施例７の手順を繰り返した。ただし、実施例ＩＡの化合物のトリブチルアミン 塩を開始物質として用い、そして無水物に調製しなかった、ピリジン、二酸化硫 黄付加物を用いた。上述の手順を繰り返して以下の化合物を調製した：Ａ）収量 ：　８３ｍｇ、この化合物は、Ｎ−硫酸化基および６−０−硫酸化基の含有百分 率が化合物７Ａと同様で（図２６の”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける６０およ び６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）　、ＳＯ３−／ＣＯＯ−の比が約１．９ 、および［（Ｚ］Ｄが＋５６．４’であった。

Ｂ）収ｊｌ：　７５ｗ＋ｇ、この化合物は、Ｎ−硫酸化基および６−０−硫酸化 基の含有百分率が化合物７Ａと同様で（図２７の”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルにお ける６０および６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）　、　ＳＯ３−／ＣＯＯ− の比が約１．９、および［ａ］ｏが＋５６．２’であった。

Ｃ）収量：　７０ｍｇｏ　この化合物は、Ｎ−硫酸化基および６−〇−硫酸化基 の含有百分率が化合物７Ａと同様で（図２８の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけ る６ｏおよび６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）、ＳＯ３−／ｃｏｏ−の比が 約２．０５、および［α］ＣＩが＋５６．７°であった。

支１匠且 エピマー　Ｎ−および〇−硫　の−１ 実施例ＩＡの化合物のトリブチルアミン塩を実施例６に記載のように調製し、こ の塩１８０ｍｇを室温で無水ジメチルホルムアミド３２＋＊ｌ中に溶解した。そ の溶液を室温で保持し、室温で無水ジメチルホルムアミド３ｈｌ中に調製したピ リジン、二酸化硫黄無水付加物１．５３ｇの溶液を添加した。得た混合物を室温 で５．５時間保持し、続いて等容量（ｃｏｌｕｉｅ）の蒸留水と混合した。

４％の水酸化ナトリウムを用いてｐＨを９に調整し、化合物を実施例７に記載し たように回収した。得た物質を実施例ＩＡに記載したように行ってＮ−再硫酸化 に供した。酢酸ナトリウムで飽和させたエタノールを４倍量用いて反応混合物を 蒸留し、最終生成物を実施例７に記載したように回収した。

Ｎ−硫酸化基および６−〇−硫酸化基の含有百分率は化合物７ａと同様−あり（ 図２９の”Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける６０および６９ｐｐｍのそれぞれでの ／グナル）　、ＳＯ３−／Ｃｏｏ−の比は約２．５、および［α］Ｄは＋５９， ４°であると検出された。収量：　８６ｍｇ。

（以下余白） 実ｌ■１ｕ エピマー　Ｎ−および０−ル　の　１ ２つの溶液を５５℃で調製し、混合し、この温度で２４時間保持した以外は、実 施例１ｏの手順を繰り返した。得た化合物は、Ｎ−硫酸化基および６−０−硫酸 化基の含有百分率が化合物７Ａと同様で（図３０の”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルに おける６ｏおよび６９ｐｐ謹のそれぞれでのシグナルン、ＳＯ３−／Ｃｏｎ−の 比が約２．７であった。収量：　７７ｍｇ。

実１ｕｔは エピマー　Ｎ−および〇−硫　の−１ 実施例３Ａ、　３Ｂおよび３ｃの化合物のトリブチルアミン塩を実施例６に記載 したように調製した。実施例７に記載したように、これらの塩をピリジン、三酸 化硫黄無水付加物で処理し、反応培地から回収した。上述の手順を繰り返して以 下の化合物を調製した： Ａ）収量：　８０＋ｓｇｏ開始剤のトリブチルアミン塩は実施例３Ａの化合物の ものであった。この化合物は、５ｏ３−／Ｃ００−ｆ）比が約２であった。

０収１：　７２ＩＩ＋ｇ、開始剤のトリブチルアミン塩は実施ｆｌ１３Ｂの化合 物のものであった。この化合物は、Ｎ−硫酸化基の含有百分率が約７７．６−〇 −硫酸化基の含有百分率が約１ｏｏであり（図３１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル における６ｏおよび６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）、そしてＳＯ３−／Ｃ ｏｏ−の比が約１．８であった。

Ｃ）収量：　９０Ｂｏ開始剤のトリブチルアミン塩は実施例３ｃの化合物のもの であった。この化合物は、Ｎ−硫酸化基が約５２および６−〇−硫酸化基の含有 百分率が約１ｏｏであり（図３２の”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける６ｏおよ び６９ｐｐｍのそれぞれでのシグナル）、ＳＯ３−／ＣＯＯ−の比が約１．５で あった。

支血五且 による３−０−ル 以下の成分を用いて反応混合物２ｍｌを調製した：実施例５Ｂの化合物２ｒａｇ ；調製Ｐ１１の手順に従って調製した酵素調製物□、４ｍ１（タンハク實約１． ６ｍｇニ相当）；ｏ、０５Ｍノヘヘス中ＰＡＰＳを１ｍＭ；　１０ｍＭのＭｎＣ ｌ２−５ｃ＋Ｍ（７）　ＣａＣＩ２ＣａＣｌ２−１ＯＭｇＣ＋２−３．５　μＭ のＮａＦ−（０，５−１％）トリトンＸ−１００（ｐＨ７，４）。反応混合物を ２時間３７℃でインキニヘートシ、次ニ、１００　’Ｃで２分間加熱することに より、反応を終了させた。変性したタンパク質を遠心分離により取り除き、上清 を０．２ＭのＨａＮＮＯ３で平衡させたセファデックスＧ−１５のカラム（０， ８Ｘ　１００ｃ＋ｍ）に通した。溶出させた物質を凍結乾燥した。

このように調製し、５０ｍＭ　）リス−０，５ＭのＮａＣ１（ｐＨ７，４）　５ ００μｌ中に溶解した物質である試料（５０ｏｔｚｇ）を、同緩衝液中で平衡化 させた抗トロンビン目１−セファロースの３ｍｌカラムに供した。次にカラムを 、トリス−２ＭのＮａＣ１（ｐＨ７，４）　５０１１Ｍテ溶出した。溶出物は全 物質の１０％を含有していた。

尖１ｕ」Ｈ 本発明の化合物の活性 本発明の特定の化合物の活性を以下のテストを用いてインビトロで評価した： ａ）抗Ｘａ活性、Ａ、　Ｎ、　Ｔｅ１ｅｎら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、 、８．４１３　（１９７６）によって記載されたように行った；ｂ）ヘパリンコ ファクター１１活性、Ｄ、　Ｄｕｐｏｙら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅ■、、６０ （２）、２３７　（１９８８）によって記載されたように行った；ｃ）ＡＰＴＴ 、　Ｗ、　Ｎ、　Ｂｅ１ｌら、Ｎａｔｕｒｅ、　１７４．８８０　（１９５４） によって記載されたように実質的には行ったが、この血漿試料は食塩水を用いて １：ｌで希釈しである；およびｄ）ＴＴ、　Ｃ，Ｅｉｋａら、［、ａｎｃｅ　Ｉ ＋、３７６　（１９７２）によって記載されたように実質的には行ったが、この 血漿試料は食塩水を用いて！＝１で希釈しである。

（以下余白） 得られた結果を次の表にまとめた： 表１ インビトロ°　ブロア　−ル 実施例　抗Ｘａ　ＨＣＩＩ　ＡＰＴＴ　ＴＴの化合物　１ｃ５０’　ＩＣ５０’ 　ＩＣ２００”　ＩＣ２００”５Ａ　１１　０．４　２０　４ ５Ｂ　５６　０．４６　３９　１３ ５Ｃ５９，７０，０５３，５５１，２ ＄５０％阻害するために必要な濃度（μｇ／ｇ＋１）＊ネ凝固時間を２倍にする ために必要な濃度（μｇ／■ｌ）結果は、本発明の多糖類が抗血栓剤および抗凝 固剤として臨床上有用であることを示している。

（以下余白） 実ＪＬｔ■ 本実施例の種々の非エピマー化、Ｎ−１〇−硫酸化化合物の特性を次の表２に示 す。

表２ ６　５．７　０．２６　８　２．５ ７Ａ　５．０６　０．２５ ８Ｄ　２．２　Ｑ、Ｏ５− ９Ｂ　８．７　０．３１　− ９Ｃ８，２０，３５− 傘５０％阻害するために必要な濃度（μｇ／ｌｉ　１　）！中凝固時間を２倍に するために必要な濃度（μｇ／■１）特表千７−５０１６８４　（１６） 特表千７−５０１６８４　（１Ｂ） 特表千７−５０１６８４　（１９） 特表千７−５０１６８４　（２０） 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１３」ｌ【皿 １．交互に存在するウロン酸およびＤ−グルコサミン残基からなる糖類であって 、該ウロン酸残基が約１０から約２５％のし一イズロン酸残基を含有し、他方が 主にＤ−グルクロン酸残基を含有し、 約３５から約１００％Ｎ−硫酸化され、約０％と約６５％との間の割合でＮ−ア セチル化されている、糖類。

２、交互に存在するウロン酸およびＤ−グルコサミン残基からなる糖類であって 、該Ｄ−グルコサミン残基の実質的に全てがＮ−硫酸化されている、糖類。

３、抗トロンビンＩＩ＋に対して親和性を有する、請求項２に記載の糖類。

４、少なくとも２５％が６−〇−硫酸化されている、請求項１がら３のいずれか に記載の糖類。

５、Ｋ５　Ｅ、　ｃｏｌｉの糖類を特徴とする請求項ｌから４のいずれかに記載 の糖類。

６、Ｄ−グルコサミンユニットの実質的に全てがＮ−説アセチル化されている、 変性に５　Ｅ、　ｃｏｌｔ糖類０７、前記Ｄ−グルコサミンユニットの遊離アミ ン基の実質的に全てが硫酸化されている、請求項６に記載の変性に５　Ｅ。

刈■糖類。

８、ｆｌ請求項に記載の化合物を調製する方法であって、該化合物が、少なくと も２５％６−〇−硫酸化され、Ｋ５　Ｌ　ｃｇ９糖類由来であり、 以下の工程を包含する方法： ａ）少なくとも３５％の遊離ＮＯ３基を得るために、ＫＳＬ」且■糖類をＮ−説 アセチル化プロセスに供す工程；ｂ）該工程ａ）で生成した該遊離Ｎ８２基を硫 酸化する工程；Ｃ）前記Ｄ−グルクロン酸残基の少なくとも１０％をＬ−イズロ ン酸残基に置換するために該工程ｂ）の生成物をエピマー化する工程；および ｄ）該工程Ｃ）の生成物の少なくとも２５％の遊離ヒドロキシ基を硫酸化する工 程。

９゜請求項２に記載の化合物を調製する方法であって、該化合物が、少なくとも ２５％６−〇−硫酸化され、Ｋ５　Ｅ、　ｃ３１ＪＪ、。

糖類由来であり、 以下の工程を包含する方法： ａ）実質的に１００％の遊離ＮＯ３基を得るために、Ｋ５　Ｅ、　吐糖類をＮ− 説アセチル化プロセスに供す工程；ｂ）該工程ａ）で生成した該遊離ＮＩ＋２基 を硫酸化する工程；Ｃ）該工程Ｃ）の生成物の少なくとも２５％の遊離ヒドロキ シ基を硫酸化する工程。

、、、、−、、、、、Ｎ、　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１００５７１国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、Ｍ Ｇ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳ （７２）発明者　ヤン、バーバラ ドイツ連邦共和国　デー−７８０８ヴアルトキルヒ、タンネンヴエーク　４７ （７２）発明者　カス、ベニート イタリア共和国　イー２０１３３　ミラノ、８１／アー、ビア　ジュゼッペ　コ ロンボ （７２）発明者　ドーリ、ジャンジャコモイタリア共和国　イー２０１３３　ミ ラノ、８１／アー、ビア　ジュゼッペ　コロンボ （７２）発明者　ナッジ、アンナマリーアイタリア共和国　イー２００２５　レ ニャーノ。

３１、ビア　モンテ　ネポーゾ （７２）発明者　グラツィオーリ、ジョルダーナイタリア共和国　イー２００４ ０　コルネートダッダ、１４．ビア　レオパルディ （７２）発明者　リンダール、ウルフ スウェーデン　ニス−７５６４６ウプサラ。

トーグファーゲン　７ （７２）発明者　ハネッソン、ヘルギ　ハーマンスウェーデン　ニス−７５４２ ２ウプサラ。

ファクターガタン　２０デー （７２）発明者　クシェ、マリオン スウェーデン　ニス−７５３２０ウプサラ。

エスキルスガタン　４　ビー （７２）発明者　ラジ、ナヒド スウェーデン　ニス−７５４２２ウプサラ。

ファクターガタン　３６シー：４１１ （７２）発明者　ゾペッティ、ジョルジョイタリア共和国　イー２０１５５　ミ ラノ、４３゜ビア　プリンチペ　エウジェーニョ （７２）発明者　オレステ、パスクア イタリア共和国　イー２０１５５　ミラノ、４３゜ビア　ブリンチベ　エウジェ 一二ョ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．脱アセチル化されたＫ５Ｅ．ｃｏｌｉ糖類であって、該脱アセチル化の量が 天然に生じたＫ５のアセチル基の少なくとも３５％である、糖類。
2. ２．脱アセチル化されれたＫ５の位置の全てまたは実質的に全てが硫酸基によっ て置換されている、請求項１に記載の糖類。
3. ３．前記位置が天然に生じたＫ５糖類中で通常アセチル化されていると予測され るものを含む、請求項２に記載の糖類。
4. ４．前記位置がグルコサミン残基のアミン基である、請求項２または３に記載の 糖類。
5. ５．グルクロン酸残基の少なくともいくつかがしイズロン酸残基にエピマー化さ れている、請求項１から４のいずれかに記載の糖類。
6. ６．遊離ヒドロキシル基の少なくともいくつかが硫酸化されている、請求項１か ら５のいずれかに記載の糖類。
7. ７．前記遊離ヒドロキシル基が実質的にはＤ−グルコサミン残基の６位にある、 請求項６に記載の糖類。
8. ８．前記残基の少なくとも２５％が硫酸化されれている、請求項６または７に記 載の糖類。
9. ９．本質的にグルクロン酸およびグルコサミンユニットからなる、請求項１から ８のいずれかに定義されたように変性した、糖類またはその誘導体。
10. １０．交互に存在する前記グルクロン酸およびグルコサミンユニットからなる、 糖類またはその誘導体。
11. １１．前記残基の少なくともいくつか、好ましくは大部分が３−Ｏ−硫酸化され ている、請求項１から１０のいずれかに記載の化合物。
12. １２．請求項１から１１のいずれかに記載の化合物の治療での使用。
13. １３．抗血栓性または抗凝固性の活性を必要とする状態の治療または予防のため の薬剤の製造における、請求項１から１１のいずれかに記載の化合物の使用。
14. １４．請求項１から１１のいずれかに記載の化合物を調製する方法であって、 以下の工程の１つまたはそれ以上を包含する方法：ａ）適切な開始物質をＮ−脱 アセチル化プロセスに供す工程；ｂ）該工程ａ）で生成した遊離ＮＨ２基を硫酸 化する工程；ｃ）前記Ｄ−グルクロン酸残基の少なくともいくつかをＬ−イズロ ン硝残基に置換するようにｂ）の生成物をエピマー化する工程；および ｄ）得られた化合物の遊離ヒドロキシ基の少なくともいくつかを硫酸化する工程 。