HUT67208A - Anticoagulants and processes for preparing such - Google Patents
Anticoagulants and processes for preparing such Download PDFInfo
- Publication number
- HUT67208A HUT67208A HU9302732A HU9302732A HUT67208A HU T67208 A HUT67208 A HU T67208A HU 9302732 A HU9302732 A HU 9302732A HU 9302732 A HU9302732 A HU 9302732A HU T67208 A HUT67208 A HU T67208A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- groups
- saccharide
- sulfated
- ppm
- glucosamine
- Prior art date
Links
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 19
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 title abstract description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 55
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 83
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 23
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical group O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 claims description 21
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims description 15
- 230000001180 sulfating effect Effects 0.000 claims description 13
- AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N l-iduronic acid Chemical group O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical group N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 claims description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 8
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 claims description 7
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical group O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 claims description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 51
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 49
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 49
- 239000000047 product Substances 0.000 description 47
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 20
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 20
- AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N sulfur trioxide Chemical compound O=S(=O)=O AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 17
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical class CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 15
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-2-(4,4-dimethyl-2-oxoimidazolidin-1-yl)-n-[3-(trifluoromethyl)phenyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1NC(C)(C)CN1C(N=C1N)=NC=C1C(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 229910000377 hydrazine sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000012493 hydrazine sulfate Substances 0.000 description 10
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 8
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 8
- FBPINGSGHKXIQA-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-(2-carboxyethylsulfanyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CSCCC(O)=O FBPINGSGHKXIQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical group OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 alkali metal salts Chemical class 0.000 description 6
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 6
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 5
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N L-idopyranuronic acid Chemical group OC1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Chemical group CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100450563 Mus musculus Serpind1 gene Proteins 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical class CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 230000001858 anti-Xa Effects 0.000 description 3
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylmethanamine;sulfur trioxide Chemical compound CN(C)C.O=S(=O)=O DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- GACDQMDRPRGCTN-KQYNXXCUSA-N 3'-phospho-5'-adenylyl sulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O GACDQMDRPRGCTN-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100021079 Ornithine decarboxylase Human genes 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUCIJNAGGSZNQT-JHSLDZJXSA-N (R)-amygdalin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H](C#N)C=2C=CC=CC=2)O1 XUCIJNAGGSZNQT-JHSLDZJXSA-N 0.000 description 1
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-BKJPEWSUSA-N N-acetyl-D-hexosamine Chemical group CC(=O)NC1C(O)O[C@H](CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-BKJPEWSUSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000029082 Pelvic Inflammatory Disease Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108090001033 Sulfotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004896 Sulfotransferases Human genes 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940089837 amygdalin Drugs 0.000 description 1
- YZLOSXFCSIDECK-UHFFFAOYSA-N amygdalin Natural products OCC1OC(OCC2OC(O)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1OC(C#N)c3ccccc3 YZLOSXFCSIDECK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N beta-melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- YGHHWSRCTPQFFC-UHFFFAOYSA-N eucalyptosin A Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(OC(C#N)C=2C=CC=CC=2)OC(CO)C(O)C1O YGHHWSRCTPQFFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010048322 heparin-glucosamine 3-O-sulfotransferase Proteins 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001867 inorganic solvent Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003049 inorganic solvent Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- OMMDZUOUNBXSBC-UHFFFAOYSA-M sodium 3-hydroxybutan-2-one 2-oxopropanoate Chemical compound OC(C(C)=O)C.C(C(=O)C)(=O)[O-].[Na+] OMMDZUOUNBXSBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001474 sodium thiosulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- OESFSXYRSCBAQJ-UHFFFAOYSA-M sodium;3-carboxy-3,5-dihydroxy-5-oxopentanoate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC([O-])=O OESFSXYRSCBAQJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108010045269 tryptophyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Zoology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
A találmány tárgyát antikoagulánsként használható multimer vegyületek, valamint az előállításukat célzó eljárások képezik.
Az enzimatikusan módosított poliszacharidokat, amelyek váltakozva egymás után következő D-glükuronsav és N-acetil-Dglükózamin egységekből állnak, alaposan vizsgálták, a heparin és heparin-szulfát bioszintézisével kapcsolatban [lásd például HEPARIN - Chemical and biological properties, clinical applications, D. Lane and U. Lindahl Editors, published by Edward Arnold, 159-190 (1989); és U. Lindahl et al., TIBS, 11, 221 (1986 május)]. Az ilyen enzimatikus módosítások tartalmazzák a glükózamin egységek N-dezacetilezését, a keletkező szabad aminocsoportok ezt követő N-szulfatálását, a D-glükuronát csoportok C5-epimerizálását L-iduronát csoportokká, és az Oszulfatálást a különböző pozíciókban (elsődlegesen az iduronsav C-2 pozíciójában és a glükózamin egységek C-6 pozíciójában). A további enzimatikus O-szulfatálás érintheti a glükózamin csoportok 3-as pozíciójában található OH csoportokat.
A mai napig csak mikro méretekben lehetett ezeket a enzimatikus lépéseket végrehajtani, ami csak kísérleti célokra alkalmas, annak utánzására, ami az emlősök emlősejtjeiben történik a heparin és a heparán-szulfát bioszintézise során. A heparin és a heparán-szulfát közötti biológiai különbségeket közölték már [Casu et al., Arz. Forsch. , 33, 135 (1983)].
A szakirodalomban azoknak a módszereknek a leírása is megtalálható, amelyekkel a poliszacharid molekulákban található N-acetil-hexózamin csoportok N-dezacetilezése végrehajtható [L. Thunberg et al., Carbohydrate Rés., 100. 393 (1982); Shaklee et al., Biochem. J., 217, 187 (1987)], illetve azoknak a módszereknek a leírása, amelyekkel az N- és O-szulfatálás végrehajtható [Levy et al., Proc. Soc. Exp. Bioi., Med. , 109, 901 (1962)].
Az EP-A-333243 számú bejelentésben olyan vegyületek leírása található meg, amelyek az Escherichia coli törzsekből izolált K5 szacharid kimerítő szulfatálásából származnak.
A találmány tárgyát K5-ből készített vegyületek előállítása képezi, amelyek hasznos antikoaguláns/antitrombotikus aktivitással rendelkeznek, és amelyeket nagyobb mennyiségben lehet előállítani, mint amit a tudomány mai állása lehetővé tesz.
A találmány tárgyát képezi továbbá az Escherichia coli K5 szacharidból készített antikoaguláns/antitrombotikus anyagok előállítása, ezzel lehetővé válik a különösen jó aktivitással rendelkező termékek nagymennyiségű előállítása.
A jelen találmány tárgya egy dezacetilezett K5
Escherichia coli szacharid, amelyben a dezacetilezés a természetben előforduló K5 acetilcsoportjainak legalább 35%-át érinti.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrák leírását.
A mellékletben megadott ábrák (1-32-es ábrák) a különböző, a találmány szerinti vegyületek NMR spektrumát mutatják.
A találmány tárgyát képezi további az előzőkben ismertetett módosított K5 szacharid, amelyben az összes, vagy lényegében az összes dezacetilezett K5 pozíciót szulfát * * · csoporttal helyettesítjük. Az ilyen pozíciók közé tartoznak azok, amelyektől normális körülmények között elvárható, hogy acetilezve legyenek, főleg a glükózamin, különösen a Dglükózamin aminocsoportjai.
A találmány tárgyát képezi egy, a fentiekben meghatározott K5, amelyben a glükuronsav csoportoknak legalább egy részét L-iduronsawá epimerizáljuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá a meghatározás szerinti módosított K5, amelyben a szabad hidroxilcsoportoknak legalább egy részét, különösen a glükózamin 6-os pozícióiban levő csoportjait, és/vagy, ahol megfelelő, az iduronsav csoportok 2-es pozícióiban levő csoportokat szulfatáljuk, előnyösen legalább 25%-ban.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan szacharid, vagy annak származéka, amely lényegében glükuronsav és glükózamin csoportokat tartalmaz, főleg az olyan szacharid, amelyben az ilyen egységek váltakoznak, és az előzőekben a K5-re meghatározott módon módosítva vannak.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá bármely, az előzőekben definiált módosított vegyület, amelyben a csoportoknak legalább egy része 3-0-szulfatálva van.
A jelen találmány tárgya továbbá a találmány szerinti vegyületek alkalmazása a terápiában.
A jelen találmány tárgya továbbá a találmány szerinti bármelyik hatóanyag alkalmazása egy, antitrombotikus vagy antikoaguláns aktivitást igénylő körülmények kezelésére alkalmas gyógyszer előállításában.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a fentiekben ·· · · · · • ··· · ··· ··· ·· ···· ·· leírt bármely vegyület előállítására szolgáló eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás az alábbi lépések közül egyet vagy többet tartalmaz:
a) a megfelelő kiindulási anyagot N-dezacetilezési eljárásnak vetjük alá;
b) a szabad aminocsoportokat szulfátéijuk, különösen ha azok az a) pontban keletkeztek;
c) a b) pontban keletkező termékeket epimerizáljuk, oly módon hogy a D-glükuronsav csoportoknak legalább egy részét Liduronsav csoportokká alakítjuk; és
d) bármely keletkező vegyületben a szabad hidroxil csoportok egy részét szulfatáljuk.
Az említett eljárás előnyösen abból áll, hogy a különböző molekulasúlyú poliszacharidokat (amelyeket a továbbiakban K5 poliszacharidok néven említünk) bizonyos Escherichia coli törzsekből kivonjuk, majd kémiai és enzimatikus lépések sorozatának vetjük alá, amelyet az alábbi sémával lehet leírni:
a) a K5 szacharidokat, amelyek lényegében váltakozva Dglükuronsavat és N-acetil-D-glükózamint tartalmazó lineáris szekvenciák, kémiai dezacetilezési eljárásnak vetjük alá;
b) az a) pontban kapott termékek szabad NH2 csoportjait megfelelő szulfatáló ágens segítségével szulfatáljuk;
c) ab) pontban kapott termékeket D-glükuronil-Liduronil-C5 epimerázzal inkubáljuk, amelyet szarvasmarha májból lehet kivonni, hogy a D-glükuronsav csoportok egy bizonyos részét L-iduronsav csoportokká alakítsuk;
d) a c) pontban kapott termékeket megfelelő szulfatáló • · * ágensekkel reagáltatjuk, ezzel a poliszacharid láncban levő szabad hidroxilcsoportok hidrogénjeinek egy részét lecseréljük, szulfát csoportokra.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát alternáló uronsav és glükózamin csoportok szekvenciájából álló újszerű poliszacharidok képezik, azzal jellemezve, hogy bennük az N-szulfatált csoportok százaléka 35 és 100 százalék között változik, az N-acetilezett csoportok százaléka 0 és 65% között változik, az L-iduronsav százaléka 0 és 65 % között változik, a 6-O-szulfatált csoportok minimálisan 25 %-ban vannak jelen, és a vegyületet az jellemzi továbbá, hogy a többi uronsav lényegében D-glükuronsav csoport. Az ilyen vegyületeket az alábbi eljárások segítségével lehet előállítani:
a) egy K5 szacharidot, amely lényegében D-glükuronsav és N-acetil-D-glükózamin alternáló lineáris szekvenciájából áll, hidrazin/hidrazin-szulfát elegyével kezeljük 0,5-6 óra hosszat, 80-110°C-on;
b) az a) pontban kapott vegyületeket kén-trioxid és szerves nitrogénbázisok által létrehozott komplexek közül választott szulfatáló ágenssel kezeljük, 4565°C közötti hőmérsékleten, maximum 24 óra hosszat;
c) a b) pontban kapott vegyületeket, amelyek lényegében különböző arányban acetilamino- és szulfaminocsoportokat tartalmazó, alternáló D-glükuronsav- és D-
-glükózamin-csoportokat tartalmaznak, a D-glükuronilL-iduronil-C5-epimeráz enzimmel reagáltatjuk körülbelül szobahőmérsékleten, maximum két napra terjedő időtartamig;
• »9
d) A c) pontban kapott vegyületeket a megfelelő szerves nitrogéntartalmú bázisokkal képezett sókká alakítjuk, majd ezt követően egy, kén-trioxid és szerves nitrogénbázisok által létrehozott komplexek közül választott szulfatáló ágenssel kezeljük szervetlen oldószerben, körülbelül -5 és +60°C közötti hőmérsékleten, maximum 24 óra hosszat;
az eljárást az jellemzi még a továbbiakban, hogy néhány, a d) pontban kapott vegyületet adott esetben a b) lépésben ismertetett szulfatálási eljárásnak vetünk alá.
A fentiekben leírt eljárás előnyösen tartalmazza azt a lépést, hogy az eredetileg meghatározott termékeket 3-0-szulfotranszferáz hatásának tesszük ki.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá olyan K5 szacharidok, amelyek lényegében az (I) képlettel jellemezhető Dglükuronsav és N-acetil-D-glükózamin alternáló lineáris szekvenciájából állnak, átlagos molekulasúlyuk 1000 és 100000 Dalton között változik, vagy lehet több is, a 13C-NMR spektrumukban 104, 98 és 55 ppm-nél jellegzetes csúcsokat mutatnak, valamint olyan poliszacharidok is a találmány tárgyát képezik, amelyek D-glükuronsav és D-glükózamin alternáló szekvenciájából állnak, azzal jellemezve, hogy körülbelül 35-100 %-ban N-szulfatált csoportokat tartalmaznak, körülbelül 0-65%ban N-acetilezett csoportokat tartalmaznak, és a 13C-NMR spektrumban jellegzetes csúcsokkal rendelkeznek 104, 60 és 24 ppm-nél.
Egyéb, a találmány szerinti poliszacharidok közé tartozó poliszacharidok lényegében D-glükuronsav és D-glükózamin egységek lineáris váltakozó szekvenciájából állnak, azzal jellemezve, hogy körülbelül 35-100% N-szulfatált csoportokat, minimum körülbelül 25% 6-0 szulfátéit csoportokat tartalmaz, és a vegyületet a továbbiakban az jellemzi, hogy a szulfát/karbonsav csoportok aránya 1,0 és 2,7 között változik, az optikai rotáció +55° és +65° között változik, és affinitással rendelkezik az antitrombin III-hoz. Ezeket a vegyületeket a fenti eljárások alapján állíthatjuk elő, a megfelelő sorrendben, azaz a) és b), a), b) és d), és hasonlók.
A találmány szerint előállított új poliszacharidok, valamint az egyes reakciólépések közbenső termékei kinyerhetők szabad savak vagy sóik azaz alkáli fémsók vagy alkáli földfémsók, például nátrium, kálium, kalcium vagy magnézium sóik formájában, amelyekből a vegyületek előállíthatok például ásványi vagy szerves savakkal való kezeléssel.
A kémiai és enzimatikus lépéseknek a jelen találmány szerinti kombinációja új, és korábban nem hajtották végre bakteriális eredetű poliszacharidokból kiindulva.
A fenti a) lépés szerint a K5 szacharidokat, amelyek molekulatömege 1000 és körülbelül 100000 Dalton, vagy még több között változik HPLC-vel meghatározva, hidrazin-szulfátot tartalmazó hidrazinnal kezelhetjük, amely előnyösen 10 tömeg% hidrazin-szulfátot tartalmaz, előnyösen egy lepecsételt csőben, 30 perc és 6 óra között változó időtartamig, 80 és körülbelül 110°C között változó hőmérsékleten.
Ezzel az eljárással a glükózamin egységek N-acetil csoportjainak bizonyos százalékát eltávolítjuk, és a b) lépés szerint a keletkező vegyületeket megfelelő szulfatáló ágenssel • ·· kezeljük, abból a célból, hogy a szabad aminocsoportokat szulfaminocsoportokká alakítsuk. A megfelelő szulfatáló ágenseket a kén-trioxidból és nitrogén-tartalmú szerves bázisokból álló komplexek közül választhatjuk ki, azaz lehet például tri(Ci_4alkil)-amin.kén-trioxid, piridin.kén-trioxid és ezek analógjai. Általában előnyös, de nem lényeges ha vízmentes ágenseket használunk, mivel a legkisebb mennyiségű víz is képes befolyásolni a végtermék minőségét. Más szulfatáló ágensek, amelyek képesek egy SO3 csoportot bejuttatni a kiválasztott részbe, szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Az N-szulfatálási reakciót előnyösen 45-65°C között hőmérséklet-tartományban végezzük, és attól az időtartamtól függően, ameddig a reakciót végezzük, az N-szulfatálás többé vagy kevésbé extenzív. Általában 6-24 óra elegendő ahhoz, hogy a szabad aminocsoportok legnagyobb része szulfatálódjon.
A keletkező poliszacharidokat, amelyek általában lényegében váltakozó D-glükuronsav és D-glükózamin egységekből állnak, és különböző arányban tartalmaznak acetilamino- és szulfaminocsoportokat, ezután enzimatikus kezelésnek vethetjük alá, például a fenti c) lépés szerint, abból a célból, hogy a poliszacharid lánc D-glükuronsav csoportjainak bizonyos részeit L-iduronsav csoportokká alakítsuk. Az epimerizációt legelőnyösebben a D-glükuronil-L-iduronil-C5-epimeráz enzimmel érhetjük el, amelyet H. Prihar és munkatársai eljárásával állíthatunk elő szarvasmarha májából [Biochemistry, 19, 495 (1980)] .
Az előnyös gyakorlat szerint a b) pontban kapott poliszacharidokat az enzimmel inkubáljuk szobahőmérsékleten, • ·
- 10 olyan körülmények között, amelyek a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóak, néhány órától két napig terjedő időtartamig. Ismét, a használt szubsztráttól és az inkubálási időtől függően, olyan poliszacharidok kaphatók, amelyekben a Dglükuronsav csoportok különböző mennyisége alakult át Liduronsavvá. A d) lépést lényegében A. Ogamo és munkatársai leírása szerint hajthatjuk végre [Carbohydrate Rés., 193, 165 (1989)], illetve az alábbiakban ismertetett módon.
A c) lépésben kapott poliszacharidokat előnyösen először a megfelelő, szerves nitrogéntartalmú bázisokkal kialakuló sókká alakítjuk, azaz például a trimetilamin, trietilamin vagy tributilamin sókká, majd ezt követően a megfelelő szulfatáló ágensekkel, például a b), N-szulfatálási lépésben használt ágensekkel kezeljük. A reakciót előnyösen vízmentes, semleges szerves oldószerben hajtjuk végre, azaz például dimetilformamid, dimetilacetamid, dimetilszulfoxid illetve ezek elegye jelenlétében.
Az O-szulfatálás mértéke függ a használt szubsztráttól, valamint a reakciókörülményektől.
A jelen találmány céljából ezt a reakciót maximum 24 óráig futtatjuk, -5°C és +60°C közötti hőmérsékleten.
Az előre meghatározott szulfatáló ágensből általában körülbelül 5-20 ekvivalensnyi mennyiséget használunk, amit az Ndezacetilezett-N-szulfatált K5 szacharid mennyisége alapján számítunk ki.
A részleges N-deszulfatálás előfordulhat ebben a reakcióban. Ha szükséges, akkor a d) lépésben keletkező terméket ugyanannak az N-szulfatálási lépésnek vethetjük alá, mint amit a ·♦ ·« ·· ♦ · * · ··♦ · ·«· • · · · ·
b) lépésben leírtunk.
Az így előállított poliszacharidokat a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel nyerhetjük ki, azaz például a reakcióelegy dializálásával majd ezt követő liofilezésével, és 13C-NMR illetve ÍH-NMR spektroszkópiával jellemezhetjük, amely képes specifikus ujjlenyomatot adni a glikozaminoglikánokról [A.S. Periin, Methods of Carbohydrate Chemistry, 7, 94 (1976); L. Ayotte et al., Carb. Rés., 145, 267 (1980)]. Más jellemzési technikák is előnyösen használhatók, például a HPLC.
Még pontosabban, az 1H-NMR spektrumok lehetővé teszik, hogy azonosítsuk és mennyiségileg meghatározzuk a nem-szulfatált L-iduronsav és D-glükuronsav csoportokat, az 5. és 7., valamint a 11-16. ábrákon közölt spektrumok 5,35 ppm-nél és 4,55 ppm-nél található csúcsai alapján [Lásd B.CASU: HEPARIN, Chemical and biological properties, published by Edward Arnold, Ed's D. Lane and U. Lindahl, 25-49 (1986)].
Más minor csúcsok a 13C-NMR spektrumokban mutathatók ki, amelyek a végcsoportokkal vannak kapcsolatban, azaz, a 90-95 és 95-98 ppm-nél található redukáló anomer szénatomokkal [1. Táblázat, A.S. Periin and B.Casu: The polysaccharides, j., 133, Academic Press, New York (1982)], valamint a telítetlen terminális uronsav csoportokkal 110 ppm-nél [C.Casu et al., Biochem. J., 187, 599 (1981); B.Casu, Nouv. Rév. Fragment. Haematol., 26, 211 (1984); J.R. Linhardt, Journal of Biological Chemistry, 261, 14448 (1986)].
A D-glükuronsav és L-iduronsav csoportok relatív százaléka is meghatározható a C5-epimerizált poliszacharidok » · « ···
- 12 dezaminatív hasításával kapott diszacharidok papírkromatográfiájával, J. Jacobsson et al. leírása szerint [Biochem. J., 179, 77 (1979)]. A megfelelő kromatogrammokat a 13. ábrán mutatjuk be.
Az NMR spektrumok és a papír-kromatogrammok elemzése azt mutatja, hogy a jelen találmány szerinti új poliszacharidokban az N-szulfatált csoportok százaléka 35-100% között van, az Ndezacetilezett csoportok százaléka 0-65% között van, az Liduronsavak százaléka, az összes uronsav alapján számolva körülbelül 10-25% között van, a 6-O-szulfatált csoportok százaléka körülbelül 25%.
A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy azok a poliszacharidok, amelyekben az N-szulfatált csoportok alacsonyabb százalékkal, az N-acetilezett csoportok magasabb százalékkal szerepelnek, az iduronsav százaléka magasabb mint 25%, és a 6-O-szulfatált csoportok minimális százaléka alacsonyabb 25%-nál, szintén előállíthatok a fenti eljárással. Az említett vegyületek, valamint a megfelelő közbenső termékek a különböző reakciólépésekben, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
Amint a fentiekben kijelentettük, ezek az új poliszacharidok érdekes és hasznos biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, főleg mint antitrombotikumok és antikoagulánsok, és az egyes, a találmány szerinti vegyületeket a 14. és 15. példákban adjuk meg.
A találmány szerinti vegyületeket naponta egyszer vagy kétszer lehet beadni, egységes injekciózható dózisokban, ezek mérete például 30-300 mg között változhat.
A jelen találmány tárgyát kiemelten képezi egy olyan
9 • ♦··
- 13 termék előállítása, amelyet gazdaságos méretekben lehet előállítani. Ez foglalkozik az összes, ipari méretekre vonatkozó szempontokkal, a termékek alkalmazásával kapcsolatban, amely a humán terápiás alkalmazásokra vonatkozó szabadalomból származik, például az antitrombotikus és antikoaguláns ágensek alkalmazásából. Ebből a célból a jelen találmány tárgyát képező vegyűleteket szokványos technikákkal formulázhatjuk, a parenterális alkalmazásokhoz megfelelő gyógyászati készítmények számára megfelelő töltőanyagok és más adalékanyagok alkalmazásával .
A parenterális alkalmazásokhoz megfelelő készítmény lehet például ampullákban levő steril oldat, ez tartalmazhat olyan anyagokat, amelyek például az oldatot a testfolyadékkal izotóniássá teszik.
A találmány szerinti eljárás különböző lépéseiben kapott köztitermékeket izoláljuk és jellemezzük, de a későbbi transzformációs lépésekben is használhatók. A jellemzést ^-H-NMR és 13C-NMR spektroszkópiával végezzük, vagy bármely más megfelelő eszközzel, amint azt az előzőkben a vég-poliszacharidoknál közöltük.
így például a b) lépésben készített vegyületek lehetnek poliszacharidok, amelyek lényegében alternáló D-glükuronsav és D-glükózamin egységekből állnak, körülbelül 35-100% N-szulfatált csoportot és körülbelül 0-65% N-acetilezett csoportot tartalmaznak. A 13C-NMR spektrumuk jellegzetes csúcsokkal rendelkezik 104 ppm-nél, amely a D-glükuronsavra jellemző, illetve jellegzetes csúcsokat mutat 60 és 24 ppm-nél, amelyek az N-szulfatált és Nacetilezett csoportokra jellemzők (4·, 5. és 7-11. ábrák).
• »
- 14 A fenti spektrumukban kimutatható más minor csúcsok 109 és 103 ppm-nél találhatók, és a terminális uronsav csoportokkal vannak kapcsolatban (4. 5. és 7. ábra).
A különböző reakciólépések közbenső termékei antitrombotikus és antikoaguláns tulajdonságokkal rendelkeznek, és a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
Pontosabban, a b) lépésben kapott poliszacharidokat a továbbiakban O-szulfatálásnak vethetjük alá, amit lényegében a d) lépésben leírt módon hajtunk végre.
Ismét elmondható, hogy ebben a reakcióban véletlenszerűen részleges N-deszulfatálás léphet fel. Ha szükséges, akkor az O-szulfatálást egy N-reszulfatálás követheti, a fentiekben leírt módon. Azt figyeltük meg, hogy a keletkező vegyületek, meglepő módon az antitrombin III-hoz való affinitással rendelkeznek. Ez egy meglepő eredmény, mivel az L-iduronsav csoportok jelenlétét korábban az aktivitáshoz elengedhetetlenül szükségesnek véltük. Ennek megfelelően, ezek a vegyületek, amelyeket nem epimerizáltunk, de amelyek nagy affinitással rendelkeznek az antitrombin III-hoz, a jelen találmány egy különösen fontos részét képezik.
A poliszacharidoknak ezt az osztályát azzal jellemezhetjük, hogy alternáló D-glükuronsav és D-glükózamin csoportokból állnak, 35-100% N-szulfatált csoportot és körülbelül 0-65% N-acetilezett csoportot, valamint minimum 25%
6-O-szulfatált csoportot tartalmaznak.
Ezt ismét 13C-NMR spektrumokkal lehet igazolni (lásd a 17-32. ábrákat), a jellegzetes csúcsok 60 és 69 ppm-nél jelentkeznek, ezek az N- és 6-O-szulfatált csoportokra jellemzők a D-glükózamin csoportokban.
Ezeket a vegyületeket a továbbiakban a szulfátcsoportok/karboxil-csoportok 1,0-2,7 aránya jellemzi, az optikai rotációs értékük pedig +55°-tól körülbelül +65°-ig változik. Ismét, a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy azok a poliszacharidok, amelyek alternáló D-glükuronsav és D-glükózamin csoportokkal rendelkeznek, valamint alacsonyabb százalékban tartalmaznak N-szulfatált csoportokat, magasabb százalékban tartalmaznak N-acetilezett csoportokat , a 6-0szulfatált csoportok százalékaránya 25% alatt van, az Antitrombin III-hoz affinitással rendelkeznek, szintén előállíthatok, és a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
Az tehát nyilvánvaló, hogy a jelen találmány nagyszámú hasznos poliszacharidot ír le, valamint kényelmes módszereket közöl az előállításukra.
A ternészetes poliszacharid előállításának extrakciós módszerek gyakran nehézkesek és drágák, és a tisztított natív vegyületek előállítását célzó különböző frakcionálási és depolimerizálási technikák nem mindig képesek reprodukálható minőségű termék előállítására.
Ezeket a hátrányokat, beleértve azokat, amelyek a nyers állati kivonatok alkalmazásából származnak (amelyek az állati betegségekből, járványokból, stb. eredő kockázatokat hordozzák), a jelen találmány szerinti eljárással le lehet küzdeni, mivel a mikroorganizmusok a kiindulási anyagok korlátlan forrását nyújtják, gondosan ellenőrzött körülmények között tarthatók, miközben a kiválasztott termékeket nagy mennyiségben szintetizáljuk.
A találmány szerinti vegyületek, amelyek közé adott esetben azok is beletartoznak, amelyeket még N-szulfatáltunk, kiindulási anyagként szolgálhatnak egy következő enzimatikus reakcióban, amelynek segítségével a D-glükózamin csoportok 3-as pozícióban levő bizonyos hidroxilcsoportjait a megfelelő 0szulfatált csoportokká alakítjuk. Ezeket a vegyületeket is meghatározzuk az alábbiakban.
Az ilyen reakciókat előnyös a 3-0-szulfotranszferáz enzim jelenlétében hajtjuk végre, amelyet az alábbi 1. Preparatív példában leírt módon hajthatunk végre.
A poliszacharidokat a szakterületen jártas szakember számára ismert körülmények között inkubálhatjuk, hogy ezzel lehetővé tegyük a 3-O-szulfatálás lejátszódását.
A jelen találmányban kiindulási anyagként használt K5 szacharidokat Escherichia coli törzsek szaporításával állíthatjuk elő, levegőztetett körülmények között, megfelelő fermentációs táptalajban. Azt találtuk, hogy jóllehet a keletkező szacharid természetét nem lehet pontosan megjósolni, de magasabb koncentrációjú szénforrás, főleg glükóz jelenlétében a K5 poliszacharid magasabb molekulasúlyú formája keletkezik.
A jelen találmány céljaira alkalmazható Escherichia coli törzsek azok, amelyek a K5 kapszuláris poliszacharid antigén jelenlétét mutatják, és számos különböző forrásból hozzáférhetőek, beleértve az American Type Culture Collection-t és a Statens Serum Institute (Koppenhága, Dánia) International Escherichia Centre-t.
Más, a jelen találmány céljaira használható Escherichia coli törzsek szintén hozzáférhetők különböző törzsgyűjtemények17 bői, illetve lehetnek klinikai izolátumok, főleg vese- és vesemedence-gyulladásból és húgyúti fertőzésből származhatnak. Ezeket az API SYSTEM 20 epszilonnal lehet jellemezni, valamint mint olyan törzseket, amelyek a K5 kapszuláris poliszacharid antigén jelenlétét mutatják [W. Nimmich et al., Z.Gesamte Hyg., 35(10), 583 (1989); D.S. Dupte et al., Sem. Microbiol. Letters, 14, 75 (1982)]. Ezek közül a klinikai Escherichia coli izolátumok közül néhányat letétbe helyeztünk a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-nál, Mascheroder Weg lb, D-3300, Németország, 1991 február 27. a Budapesti Egyezmény alapján. Ezek a törzsek a DSM 6371, DSM 6372 és DSM 6373 szám alatt helyeztük letétbe. Példaként megmutatjuk néhány jellemzőjüket:
| TESZT | SZUBSZTRÁT | REAKCIÓ/ENZIM | DSM | DSM | DSM |
| 6372 | 6371 | 6373 | |||
| ONPG | O-nitro-fenil- | ||||
| B-galaktozid | β-galaktoz idáz | + | + | + | |
| ADH | arginin | arginin-dehidroláz | - | - | - |
| LDC | lizin | lizin-dekarboxiláz | + | + | + |
| ODC | ornitin | ornitin-dekarboxiláz | - | + | + |
| CIT | nátrium-citrát | citrát-hasznosítás | - | - | - |
| h2s | nátrium-tio- | ||||
| szulfát | H2S termelés | - | - | - | |
| URE | karbamid | ureáz | - | - | - |
| TDA | triptofán | triptofán-dezamináz | - | - | - |
| IND | triptofán | indol termelés | + | + | + |
| VP | nátrium-piruvát | acetoin termelés | - | - | - |
• ·
| GÉL | Kohn zselatin | zselatináz | — | — | |
| GLU | glükóz | erjesztés | + | + | + |
| MÁN | mannitol | erjesztés-oxidálás | + | + | + |
| INO | inozit | erjesztés-oxidálás | - | - | - |
| SOR | szorbit | erjesztés-oxidálás | + | + | + |
| RHA | ramnóz | erjesztés-oxidálás | + | + | + |
| SAC | szacharóz | erjesztés-oxidálás | - | + | + |
| MEL | melibióz | erjesztés-oxidálás | + | - | + |
| AMY | amigdalin | erjesztés-oxidálás | - | - | - |
| ARA | arabinóz | érj esztés-oxidálás | + | + | + |
| OX | szűrőpapír | citokróm-oxidáz | - | - | - |
| NO 3 | glükóz cső | N02 termelés | + | + | + |
| no2 | glükóz cső | N02 redukciója N2-vé | - | - | - |
| MOB | APIM | mobilitás | + | + | + |
| (mikroszkóp) | |||||
| MAC | MacConkey | tenyésztés | + | + | + |
| agar | fermentációval | ||||
| OF | glükóz (API OF) | olaj alatt | + | + | + |
| OF | glükóz (API OF) | fermentáció (levegő) | + | + | + |
+ = pozitív - = negatív
Ezek az Escherichia coli törzsek a K5 kapszuláris poliszacharid jelenlétét mutatták, a fentiekben leírt módon meghatározva. A jelen találmány szempontjából fontos Escherichia coli törzsek standard agaron (Merek I). Loeb agaron vagy bármely, az Escherichia coli számára alkalmas táptalajon fenntarthatok.
A K5 készítését és az Escherichia coli tenyésztését az alábbiakban, a 2. Preparatív példában írjuk le.
Az alábbi példákat és preparatív példákat csak azért adjuk meg, hogy általuk jobban illusztráljuk a jelen találmányt, nem tekinthetők úgy, mint amelyekkel a jelen találmány érvényességi körét bármely módon korlátozni lehet.
1. Preparatív példa
A 3-O-szulfotranszferáz izolálása
A 3-O-szulfotranszferázt Furth emlősejt tumorból lehet izolálni, egerekből kivonva. Ezek a Swedish University of Agricultural Sciences, The Biomedical Centre-nél férhetők hozzá (Box 575 s-751 23 Uppsala, Svédország). A Furth emlősejt tumort normál egerekben lehet kifejleszteni [J. Furth et al., Proc. Soc. Exp. Bioi., 95, 824 (1957)]. Egy specifikus előállítási módját az alábbiakban adjuk meg.
Masztocitóma tumorokat (körülbelül 70 g szövetet) 200 ml 0,05 mol/1 TRISZ-1% Triton X-100, pH=7,4, proteáz inhibitorokat tartalmazó (10 Mg/ml pepsztatin, 2 mmol/1 EDTA és 1 mmol/1 PMSF Sigma Chemical Co) oldatban homogenizálunk.
A homogenizátumot óvatosan kevertetjük 1 óra hosszat 4°C-on, majd 1 óra hosszat 100000 x g-vel centrifugáljuk. A felülúszót üvegszálas szűrőn engedjük át, majd az alábbi tisztítási eljárásnak vetjük alá:
1) Heparin-Sepharose-t (31 ml-es oszlop), amelyet először A pufferrel mosunk (0,05 mol/1 - 0,1% Triton X-100, pH=7,4, 1 Mg/ml pepsztatin, 2 mmol/1 EDTA, 20%, 0,15 mol/1 NaClt tartalmazó glicerinO, majd egy lineáris gradienssel eluálunk (0,15-1,0 mol/1 NaCl A pufferben). 4 ml-es eluens frakciókban • · · · · · • ··« · ··· vizsgáljuk az O-szulfotranszferáz aktivitás jelenlétét, lényegében Jansson és munkatársai leírása szerint [Biochem. J., 149, 49 (1975)]. Az O-deszulfatált heparint használjuk szulfátakceptorként. Tíz pg akceptort, 5/iCi 35S PAPS-t, és enzim fehérjét 100 μΐ 50 mmol/1 HEPES, 10 mmol/1 MnCl2, 10 mmol/1 MgCl2, 5 mmol/1 CaCl2, 3,5 μπιοί/ΐ NaF, 1% TRITON X-100R, pH=7,4 inkubálunk 37°C-on 1 óra hosszat. A reakciókat 400 μΐ etanol hozzáadásával állítjuk le, amely 1,3% nátrium-acetátot tartalmaz, 0,4 mg hordozó heparinnal együtt, majd a mintákat éjszakán át -20°C-on hagyjuk állni. Centrifugálás után (13000/perc, 10 perc) a felülúszókat elöntjük, és az üledékeket 100 μΐ vízben oldjuk.
A 35S-jelzett poliszacharidot elválasztjuk a maradék beépületlen jelöléstől, Sephadex-en keresztül való centrifugálással, az alábbiak szerint. Fecskendőket (5x0,9 cm) töltünk Sephadex G-25-tel (szuperfinom minőség), 0,2 mol/1 NH4HCO3-mal hozzuk egyensúlyba, majd 2000/perc fordulatszámmal 5 percig centrifugáljuk, utána kúpos centrifugacsövekben szuszpendáljuk, hogy a folyadék legnagyobb részét elimináljuk. A 100 μΐ-es mintákat a töltött és centrifugált fecskendőkre visszük, amelyeket azután ismét az előzőkben leírt módon centrifugálunk. A jelzett poliszacharidokat a csövekben összegyűlő átfolyó folyadékban gyűjtjük össze, míg az alacsony molekulasúlyú jelzett vegyületek visszamaradnak a gélben. Az aktív frakciókat egyesítjük,, majd 0,15 mol/1 NaCl-t tartalmazó A pufferrel szemben dializáljuk.
2) Sepharose Blue, 41 ml-es oszlop, áramlási sebesség 15 ml/óra.
A minta felvitele után az oszlopot 0,15 mol/1 NaCl-t tartalmazó A pufferrel mossuk, majd ismét eluáljuk egy lineáris sógradienssel (0,15 - 1,0 mol/1 NaCl), hogy az enzimaktivitás utolsó részét is megkapjuk. 5 ml-es frakciókban vizsgáljuk az 0szulfotranszferáz aktivitást, az előzőkben leírt módon. Az aktív frakciókat egyesítjük, körülbelül 10 ml-re töményítjük be, majd ismét 0,075 mol/1 NaCl-t tartalmazó A pufferrel szemben dializáljuk. A mintához ezt követően β-merkapto-etanolt adunk 12 mmol/1 koncentrációban.
Ilymódon 150-szeres tisztítást tudunk elérni, az 0szulfotranszferáz aktivitás 100%-nak látszólagos kinyerésével. A Sepharose Blue-n való tisztítással kapott minta kimutatható glükózaminil-6-O-szulfotranszferáz, iduronozil-2-0szulfotranszferáz és glükózaminil-3-O-szulfotranszferáz aktivitást tartalmaz.
2. Preparatív példa
Escherichia coli tenyésztése és a K5 termelése
Tenyésztő táptalaj
A K5 szacharidok előállításához az Escherichia coli-t aerob körülmények között vizes tápközegben tenyészthetjük, amely asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmaz, valamint szervetlen sókat. A tenyésztő táptalaj lehet egy a fermentációs iparban alkalmazott sok táptalaj közül, és ennek összetételét egy gyakorlott technikus tapasztalatainak megfelelően változtatni, módosítani lehet, azzal a céllal, hogy a kívánt átlagos molekulasúlyú K5 szacharidokat kapjuk, valamint azért, hogy a fermentáció termelési hozamát növeljük. Az előnyös szénforrások a glükóz, mannóz, galaktóz és a pepton. Az előnyös • · nitrogénforrások az ammónia, a nitrátok, szójaliszt, pepton, húskivonat, élesztőkivonat, tripton és az aminosavak. A tenyésztő táptalajba bevitt szervetlen sók széles határok között változtatható összetételű sók, azzal a feltétellel, hogy szolgáltassák a nátrium, kálium, vas, cink, kobalt, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, foszfát, hidrogénfoszfát, dihidrogénfoszfát és nitrát ionokat.
Normális körülmények között a K5 szacharidot termelő törzseket egy rázott lombikban előtenyésztjük, majd a tenyészeteket laboratóriumi fermentorba tesszük, hogy a fenti szacharidőkből jelentős mennyiséget állítsunk elő. Egy tipikus, jellemző fermentációs táptalaj, amelyet az előtenyésztés során is alkalmazhatunk, a következő összetétellel rendelkezik (1 literre számítva):
K2HPO4
KH2PO4
3,6 g
1,2 g
Kazaminosav g
Nátrium-citrát-dihidrát
0,5 g
Ammónium-szülfát
Glükóz
MgSO4
0,15 g
100 g élesztőkivonat dializálható része 100 ml vízben (dializálás vízzel szemben, a membrán vágási értéke: 15000 D)
A táptalaj pH-ja 7,2.
liter
Fermentáció
a) Előtenyésztés
Egy kacsnyi Escherichia coli sejtet leveszünk egy Loeb agarlemezről, majd 5 ml Merek Standard 1 táptalajban szuszpendáljuk, és 6 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk körülbelül pH=7,2 értéknél. A szuszpenziót ezután 700 ml fenti összetételű táptalajba tesszük, és éjszakán át az előzőekkel azonos körülmények között inkubáljuk.
b) Fermentáció
A fermentációt aerob körülmények között 37°C-on vezetjük
Egy üvegfermentor 10 litert tartalmaz az alábbi összetételű táptalajból
K2HPO4 kh2po4
Kazaminosav
200
Nátrium-citrát-dihidrát
Ammónium-szulfát
Glükóz
MgSO4
1,5
1000 g élesztőkivonat dializálható része
1000 ml vízben (dializálás vízzel szemben, a membrán vágási értéke: 15000 D) liter
Analóg fermentációs táptalaj, amely glükózt vagy egyéb szénforrást tartalmaz kisebb mennyiségben mint amennyit az
«*« · a ··«· · · előzőkben jeleztünk, illetve egészen 5 tömeg/térf %-ig, is előnyösen alkalmazható.
A K5 extrakciója
Extrakció A K5 szacharidokat a b) pontban leírtak szerint nyerjük ki a fermentációs táptalajból, a W. Vann és munkatársai által közölt eljárás alkalmazásával [European Journal of Biochemistry, 116, 359 (1981)], illetve az alábbiak szerint.
A fermentációs táptalajt körülbelül 35 percig 5200/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A kapott üledékeket körülbelül 800 ml foszfát pufferben szuszpendáljuk, majd a keletkező szuszpenziót 15 percig 8000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk, és a felülúszót eltávolítjuk. Az üledéket 800 ml, 37°C-ra előmelegített 50 mmol/1 TRIS, 5 mmol/1 EDTA pufferben (pH=7,3) szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót 30 percig 37°C-on tartjuk egy vízfürdőben. A szuszpenziót ezután 20 percig 9000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, és az extrakciót háromszor megismételjük.
A TRIS/EDTA extrakciókból kapott felülúszókat egyesítjük, majd addig adjuk hozzá CETAVLON (márkanév) 10%-os vizes oldatát, ameddig csapadékképződés már nem figyelhető meg, majd a keveréket éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk. Az elegyet 10 percig 20°C-on centrifugáljuk 8000/perc fordulatszámmal, a csapadékot körülbelül 10-20 ml vizes 1 mol/1 koncentrációjú NaCl oldatban oldjuk, az oldatot legalább 8 térfogat etanollal hígítjuk, majd centrifugáljuk. A szilárd anyagot, amely a nyers K5 szacharidból áll, kinyerjük, majd újból feloldjuk körülbelül 10-20 ml vizes 1 mol/1 koncentrációjú NaCl oldatban, és legalább 8 térfogat etanolt adunk hozzá. A csapadékot centrifugálással kinyerjük, vízben oldjuk, majd 24 óra hosszat dialízis-zacskóban dializáljuk (a zacskó vágási értéke 3500 Dalton). A dializált oldatot 20 percig centrifugáljuk 9000/perc fordulatszámmal 4°C-on, majd a csapadékot eldobjuk. A kapott felülúszót, amely a tisztított K5 szacharidot tartalmazza, fagyasztva szárítjuk.
A lipopoliszacharidokat úgy távolítjuk el, hogy a kapott tisztított K5 szacharidot vízben oldjuk 2-3% koncentrációban, majd a kapott oldatot 45000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 4 óra hosszat 4°C-on. A maradék lipopoliszacharidok nyomainak jelenléte nem érinti a kiindulási anyag feldolgozását. Az Escherichia coli ribonukleinsavak eltávolítása céljából a keletkező oldatot 24 óra hosszat ribonukleázzal (Sigma) kezeljük foszfát pufferben, amely 10 mmol/l MgC12~ot tartalmaz, majd 24 óra hosszat ismét egy dialízis zacskóban (vágási értéke 3500 Dalton) ionmentes vízzel szemben dializáljuk, majd liofilezzük. Ezzel az eljárással körülbelül 0,8-lg szacharidot lehet előállítani 10 liter tenyészetből.
A fenti eljárással előállított K5 szacharidok az alábbiak:
A) K5 szacharid, átlagos molekulatömege HPLC-vel meghatározva körülbelül 5000 Dalton. Ez a K5 szacharid az 1. ábrán bemutatott i^C-NMR spektrum szerint a D-glükuronsavakra jellemző fő csúcsokat mutatja 104 ppm-nél, valamint az Nacetil-D-glükózaminokra jellemző fő csúcsokat mutatja 55 és 98 ppm-nél [W.Vann et al., European Journal of Biochemistry, 116, • · ·
359 (1981)], valamint jellemző minor csúcsokat is mutat, amelyek a D-glükuronsavból származó terminális csoportok jelenlétére utalnak [Casu et al., Biochem. J., 197, 599 (1981)].
Β) K5 szacharid, átlagos molekulatömege HPLC-vel meghatározva körülbelül 50000 Dalton. Ez a K5 szacharid a 2. ábrán bemutatott 13C-NMR spektrum szerint a D-glükuronsavakra jellemző fő csúcsokat mutatja 104 ppm-nél, valamint az Nacetil-D-glükózaminokra jellemző fő csúcsokat mutatja 55 és 98 ppm-nél.
C) K5 szacharid, átlagos molekulatömege HPLC-vel meghatározva körülbelül 100000 Dalton. Ez a K5 szacharid a 3. ábrán bemutatott 13C-NMR spektrum szerint a D-glükuronsavakra jellemző fő csúcsokat mutatja 104 ppm-nél, valamint az Nacetil-D-glükózaminokra jellemző fő csúcsokat mutatja 55 és 98 ppm-nél.
A fenti meghatározások megerősítik, hogy a kiindulási K5 szacharidok az (I) képletű ismétlődő diszacharid egységekből állnak.
A jelen találmány szerinti többlépéses eljárás szerint készített vegyületek 13C-NMR és 1H-NMR spektrumait, valamint a kiindulási K5 szacharidok spektrumait D20-ban vettük fel, egy Bruker CXP-300 spektrométerrel, a 8D vegyület kivételével, amelynek a 13C-NMR spektrumát Bruker AMX500 spektrométerrel vettük fel D2O-ban oldva.
A K5 szacharidok molekulatömegenak HPLC-vel való meghatározását Superose 6 (márkanév) és Superose 12 (márkanév) oszlopon végeztük, amely oszlopokat 0,05 mol/1 TRIS-HC1 pH=8 pufferben oldott 1 mol/1 NaCl-dal hoztunk egyensúlyba. A • · ·
- 27 találmány szerinti vegyületek, és a releváns intermedierek tisztaságát a karbazol módszerrel határozzuk meg [T. Bittér and H.M. Muir, Analytical Biochemistry, 4, 330 (1962)]. A tisztaság mértéke általában 90%-nál nagyobb. Az optikai forgatóképességet szobahőmérsékleten határozzuk meg 1%-os vizes oldatban, JASCO DIP370 polariméter alkalmazásával. A meghatározott értékeket ezt követően korrigáljuk, figyelembe véve a vizsgált minta tisztasági fokát.
1. Példa
N-dezacetilezett-N-szulfatált poliszacharidok készítése
K5 A szacharidból (a és b lépések)
A) Egy csőben 100 mg K5 A szacharidot és 138 mg hidrazin-szulfátot oldunk 1,38 ml hidrazinban. Az oldatot lefagyasztjuk, oly módon hogy a csövet folyékony nitrogénbe helyezzük, míg az oldatot nitrogén-atmoszféra alatt tartjuk. A csövet ezután lezárjuk, majd lassan szobahőmérsékletre melegítjük, utána 5 percig 96°C-on tartjuk. A csövet ezután újra lefagyasztjuk folyékony nitrogénben, kinyitjuk, majd lassan szobahőmérsékletre melegítjük. Az oldatot egy kerek aljú lombikba visszük, majd a csövet 5 ml toluollal mossuk.
Az oldatot csökkentett nyomáson töményítjük, majd a műveletet kétszer megismételjük (mindannyiszor 20 ml toluollal), hogy a hidrazin legnagyobb részét (a toluollal együtt) elpárologtassuk. A maradékot ezután 50 ml desztillált vízbe tesszük, majd a kapott oldatot semlegesítjük vizes, 37%-os sósav hozzáadásával, majd 5 napig dializáljuk nátrium-klorid
• · oldatokkal és vízzel szemben (2x2 liter, 0,5 mol/1 NaCl az első napon, 2 x 2 1, 0,2 mol/1 NaCl a második napon, 2x21, 0,1 mol/1 NaCl a harmadik napon, 2x21 H2O a negyedik és ötödik napon). Az oldatot ezután csökkentett nyomáson töményítjük, majd 65 ml desztillált vízben oldjuk.
A kapott oldat pH-ját 9-re állítjuk szilárd nátriumhidrogén-karbonát hozzáadásával, majd a hőmérsékletét 55°C-ra emeljük. Ezen a hőmérsékleten, folyamatos kevertetés közben 65 ml trimetilamin.kén-trioxid adduktumot adunk az oldathoz, amelyet ezen a hőmérsékleten tartunk egy óra hosszat, majd további 65 ml-t adunk hozzá az előző adduktumból, és az egészet további 5 óra hosszat reagáltatjuk egymással. Az oldatot a fentiekben leírt módon csökkenő koncentrációjú vizes nátrium-klorid oldattal és vízzel szemben dializáljuk. A dializált oldatot végül fagyasztva szárítjuk, így kapunk 80 mg terméket, amelynek a 13C-NMR spektruma a 4. ábrán látható.
A termék az alábbi jellemző csúcsokat mutatja:
erős jelek:
ppm, N-szulfatált csoportok ppm, helyettesítetlen 6-hidroxi csoportok a glükózamin csoportokból ppm, glükózamin csoportok
104 ppm, glükuronsav csoportok;
gyenge jelek:
109 és 103 ppm, terminális glükuronsav csoportok;
nagyon gyenge jelek:
ppm, maradék N-acetilezett csoportok.
Az N-acetilezett csoportok százalékos mennyiségét 13c• · ·
- 29 NMR-rel határozzuk meg, a 24 ppm-nél található jel területének és az összes anomer (C-l) szénatom 100-110 ppm-nél látható jeleinek területe arányaként, ennek értéke körülbelül 5. Az Nszulfatált csoportok százalékos mennyisége körülbelül 95. Nem figyelhető meg a szabad -NH2 csoportokhoz rendelhető jel.
B) Az előzőkben leírt előállítási eljárást követjük, kiindulva 100 mg K5 A szacharidból és a hidrazinszulfát/hidrazinos reakciót 3 órára korlátozva, 77 mg terméket kapunk, amelyben az N-acetilezett csoportok százaléka körülbelül 15, 13C-NMR-rel meghatározva (5. ábra) (ez az 1A példa termékére vonatkozik), az N-szulfatált csoportok százalékaránya körülbelül 85. Az 5. ábrán látható 13C-NMR spektrum az alábbi jellegzetes csúcsokat mutatja:
és 55 ppm (gyenge): N-acetilezett csoportok ppm (erős): N-szulfatált csoportok ppm (erős): helyettesítetlen 6-hidroxi csoportok a Dglükózamin egységekből ppm (erős): D-glükózamin csoportok
104 ppm (erős): D-glükuronsav csoportok
103 és 109 ppm (gyenge): terminális D-glükuronsav csoportok.
A szabad -NH2-re jellemző csúcsok nem figyelhetők meg.
C) Az 1A példában leírt előállítási eljárást követjük, kiindulva 100 mg K5 A szacharidból és a hidrazinszulfát/hidrazinos reakciót 1 órára korlátozva, 75 mg terméket kapunk, amelyben az N-acetilezett csoportok százaléka körülbelül 30, 13C-NMR-rel • · · meghatározva (6. ábra).Az N-acetilezett csoportok százalékos mennyiségét 13C-NMR-rel határozzuk meg, a 2,1 ppm-nél található jel területének és az összes anomer (C-l) szénatom 5 és 6 ppmnél látható jeleinek területe arányaként, ennek értéke körülbelül 5. A 7. ábrán látható 3-3C-NMR spektrumban ugyanazok a jellegzetes csúcsok találhatók meg mint az 1B példa vegyületeinél. Az N-szulfatált csoportok százalékos mennyisége körülbelül 70. Nem figyelhető meg a szabad -NH2 csoportokhoz rendelhető jel.
2. Példa
N-dezacetilezett-N-szulfatált poliszacharid készítése a
K5 C szacharidból (a és b lépések)
Az 1A példában szereplő termék előállítására leírt előállítási eljárást követjük, kiindulva 100 mg K5 B szacharidból és a hidrazinszulfát/hidrazinos reakciót 5 óráig végezve, 75 mg terméket kapunk, amelyben az N-acetilezett csoportok százaléka kisebb mint 5, 13C-NMR-rel meghatározva (8 ábra) (ez az 1A példa termékére vonatkozik), az N-szulfatált csoportok százalékaránya magasabb mint 95. A 8. ábrán látható 13C-NMR spektrum ugyanazokat a jellemző csúcsokat tartalmazza mint az 1A példában szereplő vegyület spektruma. A szabad -NH2 csoportokra jellemző csúcsok nem figyelhetők meg.
3. Példa
N-dezacetilezett-N-szulfatált poliszacharid készítése a K5 C szacharidból (a és b lépések)
Az 1A példában szereplő termék előállítására leírt előállítási eljárást követjük, kiindulva 100 mg K5 C szacharidból, a hidrazin-szulfát/hidrazinos reakciót különböző ideig végezve az alábbi poliszacharidokat állítjuk elő.
A) Reakcióidő a hidrazin-szulfát/hidrazin eleggyel: 5 óra. Kitermelés: 85 mg termék, amelyben az N-acetilezett csoportok mennyisége körülbelül 2%, az N-szulfatált csoportok mennyisége körülbelül 98%, a fentiekben leírt módon 43C-NMR-rel meghatározva (9. ábra). A spektrum azt mutatja, hogy ugyanazok a jellegzetes csúcsok találhatók benne mint az 1A példában szereplő vegyületben.
B) Reakcióidő a hidrazin-szulfát/hidrazin eleggyel: 2,5 óra. Kitermelés: 80 mg termék, amelyben az N-acetilezett csoportok mennyisége körülbelül 23%, az N-szulfatált csoportok mennyisége körülbelül 77%, a fentiekben leírt módon 43C-NMR-rel meghatározva (10. ábra). A spektrum azt mutatja, hogy ugyanazok a jellegzetes csúcsok találhatók benne mint az 1B példában szereplő vegyületben.
C) Reakcióidő a hidrazin-szulfát/hidrazin eleggyel: 80 perc. Kitermelés: 75 mg termék, amelyben az N-acetilezett csoportok mennyisége körülbelül 48%, az N-szulfatált csoportok mennyisége körülbelül 52%, a fentiekben leírt módon 13C-NMR-rel meghatározva (11. ábra). A spektrum azt mutatja, hogy ugyanazok a jellegzetes csúcsok találhatók benne mint az IC példában szereplő vegyületben.
Az 1., 2. és 3. példában előállított poliszacharidok spektruma világosan mutatja, hogy a kiindulási K5 szacharidok szerkezetében egyéb változás nem tapasztalható.
4. Példa • · • · ·
C5-epimerizált-N-szulfatált poliszacharidok készítése (c lépés)
A) Az 1A példa termékéből 10 mg-ot inkubálunk a szarvasmarha májból izolált készítménnyel [H. Prihar, Biochemistry, 19 , 495 (1980) ] amely a D-glükuronil-L-iduronilC5-epimerázt tartalmazza, 1 ml 0,05 mol/1 HEPES (pH=7,4) pufferben, amely 50 mmol/1 kálium-kloridot, 15 mmol/1 EDTA-t és 1% Triton X-100R-t tartalmaz. Az elegyet szobahőmérsékleten tartjuk 2 napig, majd a keresett epimerizált terméket ioncserélő kromatográfiával izoláljuk DEAE cellulózon. A termékből 7 mg-ot kapunk.
Az alacsony térerősségű ^H-NMR spektrum régió (12. ábra) világosan mutatja, hogy az L-iduronsavra jellemző csúcsok találhatók 4,7 és 4,95 ppm-nél [Periin A.S. in Methods in CArbohydrate Chemistry, Vol. VII, 94. old., Academic Press, New York (1976)], amely terület az uronsavak összes területe 18%-nak felel meg. Hasonló eredményeket kapunk papírkromatográfiával (13. ábra) [J. Jacobsson et al.,Biochem. J., 179, 77 (1979)], amelyből az iduronsav százalékos tartalmára 18% határozható meg.
B) A 2. példában kapott termékből 10 mg-ot epimerizálunk az A) pontban közölt eljárás szerint. Hét mg terméket kapunk. Az 1H-NMR spektrumban (14. ábra), 4,7 és 4,95 ppm-nél az Liduronsav csoportokra jellemző csúcsokat mutat, amelyek területe az uronsavak össz-területe 22%-nak felel meg.
A 13. ábrán a fentiekben leírt módon végrehajtott papírkromatográfia eredménye látható, amelyből 20% L-iduronsav tartalom határozható meg.
C) A 3C példában kapott termékből 10 mg-ot epimerizálunk • · ·
- 33 az A) pontban közölt eljárás szerint. Hét mg terméket kapunk, amelynek a papírkromatogramja a 13. ábrán látható, amelyből 19% L-iduronsav tartalom határozható meg.
A 4A és 4B példákban előállított poliszacharidok NMR spektruma világosan mutatja, hogy a C5 epimerizáción kívül nincs más módosulás a szerkezetben. A kiindulási szubsztrát és az epimerizációs eljárás fényében egyiknek sincs más szerkezeti módosulása a 4C példában.
5. Példa
O-szulfatált-N-szulfatált-C5-epimerizált poliszacharid készítése (d lépés)
A) A 4A példában előállított termékből 100 mg-ot oldunk 20 ml vízben, majd Amberlit (Regisztrált márkanév) IR-120 H+ oszlopon bocsátjuk át szobahőmérsékleten. Az oszlopot ezt követően 20 ml vízzel mossuk. Az eluátumokat összegyűjtjük, majd pH-jukat 10%-os tributilamin etanolos oldatával 5,5-re állítjuk. A tributilamin felesleget háromszor extraháljuk 40-40 ml dietiléterrel, majd a vizes oldatot, amely a 4A példa termékének tributilamin sóját tartalmazza, fagyasztva szárítjuk. A kapott termékből 100 mg-ot 32 ml vízmentes dimetilformamidban oldunk, az oldathoz 765 mg, 15 ml vízmentes dimetilformamidban oldott piridin.kén-trioxid adduktumot adunk, és a kapott elegyet 1 óra hosszat 0°C-on tartjuk. Azonos térfogatú vizet adunk hozzá, az oldat pH-ját 4%-os vizes nátrium-hidroxid oldattal 9-re állítjuk, majd az egészet csökkenő koncentrációjú nátrium-klorid oldatokkal és vízzel szemben dializáljuk, az 1. példában leírtak .t .·' .··. .
alapján.
A dializált oldatot fagyasztva szárítjuk, majd a kapott terméket, miután a megfelelő tributilamin sóvá alakítottuk, a jelen példában ismertetett körülmények szerint reagáltatjuk. 180 mg terméket kapunk, amelyeket az 1A példában leírt módon reagáltatunk a trimetil-amin.kén-trioxid addukttal.
180 mg címben szereplő vegyületet kapunk, ennek 13C-NMR spektrumát a 15 ábrán mutatjuk be, amely az alábbi jellegzetes csúcsokat mutatja:
ppm (erős)
N-szulfatált csoportok ppm (erős) a D-glükózamin csoportok helyettesítetlen 6-hidroxi csoportjai ppm (közepes)
6-0-szulfatált csoportok ppm (erős) glükózamin csoportok ppm (közepes) nem-szulfatált L-iduronsav csoportok
1-4 ppm (erős)
D-glükuronsav csoportok.
A termék minimális 6-0-szulfatált csoport tartalma 52%, a 69 ppm-nél található csúcs területe alapján.
B) Az előző, 5A példában közölt eljárás alapján, a 4B példa termékéből 100 mg-ból kiindulva, 160 mg terméket kapunk, amelynek 13C-NMR spektruma a 16. ábrán látható, és ugyanazokat a jellemző csúcsokat mutatja, mint amelyeket az 5A példa szerint előállított vegyület.
A termék minimális 6-0-szulfatált csoport tartalma 44%, a 69 ppm-nél található csúcs területe alapján számítva.
C) Az előző, 5A példában közölt eljárást követve, a 4C példa termékének 5 mg-jából kiindulva 9 mg terméket kapunk.
A kiindulási szubsztrát és aszulfatálási eljárás » · • · ·
- 35 fényében egyik terméknek sincs más szerkezeti módosulása a 5C példában.
6. Példa
A nem-epimerizált N- és O-szulfatált poliszacharid készítése
A) Az 1A példában előállított termékből 100 mg-ot oldunk 20 ml vízben, majd Amberlit (Regisztrált márkanév) IR-120 H+ oszlopon bocsátjuk át szobahőmérsékleten. Az oszlopot ezt követően 20 ml vízzel mossuk. Az eluátumokat összegyűjtjük, majd pH-jukat 3 ml 10%-os tributilamin etanolos oldatával 5,5-re állítjuk. A tributilamin felesleget háromszor extraháljuk 40-40 ml dietiléterrel, majd a vizes oldatot, amely az 1A példa termékének tributilamin sóját tartalmazza, fagyasztva szárítjuk.
A kapott termékből 100 mg-ot 32 ml vízmentes dimetilformamidban oldunk, az oldathoz 765 mg, 15 ml vízmentes dimetilformamidban oldott piridin.kén-trioxid adduktumot adunk, és a kapott elegyet 1 óra hosszat 0°C-on tartjuk. Azonos térfogatú vizet adunk hozzá, az oldat pH-ját 4%-os vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,0-ra állítjuk, majd az egészet csökkenő koncentrációjú nátrium-klórid oldatokkal és vízzel szemben dializáljuk, az 1A. példában leírtak alapján.
A dializált oldatot fagyasztva szárítjuk, majd a kapott terméket, miután a megfelelő tributilamin sóvá alakítottuk, a jelen példában ismertetett körülmények szerint reagáltatjuk. 90 mg terméket kapunk, amelyet az 1A példában leírt módon reagáltatunk a trimetil-amin.kén-trioxid addukttal. A kapott termék minimális 6-0-szulfatált csoport tartalma 35%, a 13C-NMR • · • · * ···
- 36 spektrumban (17. ábra) 69 ppm-nél megjelenő csúcs területe alapján számítva, és a spektrum ugyanazokat a jellegzetes csúcsokat tartalmazza mint az 1A példában keletkező vegyület.
7. Példa
Nem-epimerizált N- és O-szulfatált poliszacharidok előállítása
Az 1A példában szereplő vegyület tributilamin sóját a 6. példában leírtak alapján állítjuk elő, és ebből a sóból 180 mgot oldunk 32 ml vízmentes dimetilformamidban. Az oldatot 0°C-ra hűtjük, majd 0°C-on 15 ml vízmentes dimetilformamidban készített, 765 mg vízmentes piridin.kén-trioxidot tartalmazó oldatot adunk hozzá. A kapott elegyet 1 óra hosszat 0°C-on tartjuk, majd azonos térfogatú desztillált vízzel elegyítjük. A pH értékét 4%-os nátrium-hidroxiddal 9-re állítjuk, majd 4 térfogat, nátrium-acetáttal telített etanolt adunk hozzá. Az elegyet éjszakán át 4°C-on tartjuk, eközben csapadékot kapunk, ezt 50 ml desztillált vízben oldjuk. A kapott oldatot 3 napig desztillált vízzel szemben dializáljuk (3x21 mindegyik napon, vágási érték 14000 D), majd fagyasztva szárítjuk.
A fenti eljárás ismétlésével az alábbi vegyületeket kapjuk:
A) Kitermelés: 85 mg. A vegyület körülbelül 95% Nszulfatált csoportot és körülbelül 100% 6-0-szulfatált csoportot tartalmaz (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 18. ábrán szereplő 13C-NMR spektrumban), az SO3-/COO- arány körülbelül 2,1, az [a]p értéke +55,4°.
B) Kitermelés: 94 mg. A vegyület körülbelül annyi N• · • · *
- 37 szulfátéit csoportot és körülbelül annyi 6-O-szulfatált csoportot tartalmaz, mint a 7A vegyület (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 19. ábrán szereplő ^3C-NMR spektrumban), az SO3-/COO“ arány körülbelül 2,2.
C) Kitermelés: 82 mg. A vegyület körülbelül annyi Nszulfatált csoportot és körülbelül annyi 6-O-szulfatált csoportot tartalmaz, mint a 7A vegyület (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 20. ábrán szereplő ^-3C-NMR spektrumban), az SO3-/COO- arány körülbelül 2,2.
D) Kitermelés: 95 mg. A vegyület körülbelül 95% Nszulfatált csoportot és körülbelül 85% 6-O-szulfatált csoportot tartalmaz (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 21. ábrán szereplő 13C-NMR spektrumban), az SO3_/COO“ arány körülbelül 1,8.
8. Példa
Nem-epimerizált N- és O-szulfatált poliszacharidok előállítása
A 7. példában szereplő eljárást ismételjük meg, az 1A példában szereplő vegyület tributil-amin sóját használva kiindulási anyagként, és a két oldat elegyét különböző ideig 0°C-on tartva. Az eljárás ismétlésével az alábbi vegyületeket állítottuk elő.
A) Kitermelés: 85 mg. Reakcióidő: 20 perc. A vegyület körülbelül 95% N-szulfatált csoportot és körülbelül 70% 6-Oszulfatált csoportot tartalmaz (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 22. ábrán szereplő 13C-NMR spektrumban), az SO3~/COO arány körülbelül 1,6.
B) Kitermelés: 92 mg. Reakcióidő: 40 perc. A vegyület
körülbelül 95% N-szulfatált csoportot és körülbelül 75% 6-0szulfatált csoportot tartalmaz (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 23. ábrán szereplő 13C-NMR spektrumban), az S03-/C00“ arány körülbelül 1,7.
C) Kitermelés: 90 mg. Reakcióidő: 4 óra. A vegyület körülbelül annyi N-szulfatált csoportot és körülbelül annyi 6-0szulfatált csoportot tartalmaz mint a 7A vegyület (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 24. ábrán szereplő 13C-NMR spektrumban), az SO3_/COO~ arány körülbelül 2,3, az [a]B értéke 62,4°.
D) Kitermelés: 90 mg. Reakcióidő: 5,5 óra. Nreszulfatálást hajtunk végre az 1A példában leírtak alapján. A vegyület körülbelül annyi N-szulfatált csoportot és körülbelül annyi 6-O-szulfatált csoportot tartalmaz mint a 7A vegyület (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 25. ábrán szereplő 13C-NMR spektrumban), az S03-/C00“ arány körülbelül 2,52. 9
9. Példa
Nem-epimerizált N- és O-szulfatált poliszacharidok előállítása
A 7. példában szereplő eljárást ismételjük meg, ismét az 1A példában szereplő vegyület tributil-amin sóját használva kiindulási anyagként, és olyan piridin.kén-trioxid adduktumot használva,amelyet nem vízmentes körülmények között készítettünk. Az eljárás ismétlésével az alábbi vegyületeket állítottuk elő.
A) Kitermelés: 83 mg. A vegyület körülbelül annyi Nszulfatált csoportot és körülbelül annyi 6-O-szulfatált csoportot tartalmaz, mint a 7A vegyület (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 26. ábrán szereplő 10 * * 13C-NMR spektrumban) , az SO3“/COO“ arány körülbelül 1,9, az [a]p értéke 56,4°.
B) Kitermelés: 75 mg. A vegyület körülbelül annyi Nszulfatált csoportot és körülbelül annyi 6-0-szulfatált csoportot tartalmaz, mint a 7A vegyület (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 27. ábrán szereplő 13C-NMR spektrumban), az SO3 —/COO“ arány körülbelül 1,9, az [a]p értéke 56,2°.
C) Kitermelés: 70 mg. A vegyület körülbelül annyi Nszulfatált csoportot és körülbelül annyi 6-O-szulfatált csoportot tartalmaz, mint a 7A vegyület (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 28. ábrán szereplő 13C-NMR spektrumban), az SO3 _/COO“ arány körülbelül 2,05 az [a]p értéke 56,7°.
10. Példa
Egy nem-epimerizált N- és O-szulfatált poliszacharid előállítása
Az 1A példában szereplő vegyület tributil-amin sóját a 6. példában leírtak alapján állítjuk elő, majd ebből a sóból 180 mg-ot oldunk 32 ml vízmentes dimetil-formamidban szobahőmérsékleten. Miközben az oldatot szobahőmérsékleten tartjuk, 30 ml, szobahőmérsékleten vízmentes dimetil-formamidban készített, 1,53 g vízmentes piridin.kén-trioxidot tartalmazó oldatot adunk hozzá. A kapott elegyet 5,5 óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk, majd ezt követően azonos térfogatú desztillált vízzel elegyítjük. A pH-t 9-re állítjuk 4%-os nátrium-hidroxiddal, majd a vegyűletet a 7. példában leírtak alapján kinyerjük. A kapott anyagot N-reszulfatálásnak vetjük alá, az 1A példában leírtak • · · • · · • ··· • · · ··· ·· ···· · ·
- 40 alapján. A reakcióelegyet 4 térfogat, nátrium-acetáttal telített etanollal hígítjuk, majd a végterméket a 7. példában leírtak alapján kinyerjük.
Az N-szulfatált és 6-O-szulfatált csoportok százalékos mennyisége hasonló a 7A példában szereplő vegyületével (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 29. ábrán látható 12 13C-NMR spektrumban), az SO3-/COO“ arány körülbelül 2,5 az értéke
59,4°. Kitermelés: 86 mg.
11. Példa
Egy nem-epimerizált N- és O-szulfatált poliszacharid előállítása
A 10. példában közölt eljárást ismételjük meg, azzal az eltéréssel, hogy a két oldatot 55°C-on készítjük el, elegyítjük, majd ezen a hőmérsékleten tartjuk 24 óra hosszat. A kapott vegyületben az N-szulfatált és 6-O-szulfatált csoportok százalékaránya hasonló a 7A példában leírt vegyület százalékarányához (csúcsok 60 és 69 ppm-nél, a 30. ábrán látható 13C-NMR spektrumban) az SO3-/COO~ arány körülbelül 2,7. Kitermelés: 77 mg.
12. Példa
Nem-epimerizált N- és O-szulfatált poliszacharidok előállítása
A 3A, 3B és 3C példában szereplő vegyületek tributil-amin sóit a 6. példában leírtak alapján állítjuk elő. Ezeket a sókat a piridin.kén-trioxid vízmentes adduktumával kezeljük, majd a reakcióelegyből kinyerjük, a 7. példában leírtak alapján. Az • · ·
- 41 alábbi vegyületeket állítjuk elő a fenti eljárás ismétlésével.
A) Kitermelés: 80 mg. A kiindulási tributil-amin só a 3A példában szereplő vegyület sója. A vegyületben az SO3-/C00“ arány körülbelül 2.
B) Kitermelés: 72 mg. A kiindulási tributil-amin só a 3B példában szereplő vegyület sója. A vegyületben az N-szulfatált csoportok százalékaránya körülbelül 77, a 6-O-szulfatált csoportok százalékaránya körülbelül 100 (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 31. ábrán látható 13C-NMR spektrumban), az SO3-/COO“ arány körülbelül 1,8.
B) Kitermelés: 90 mg. A kiindulási tributil-amin só a 3C példában szereplő vegyület sója. A vegyületben az N-szulfatált csoportok százalékaránya körülbelül 52, a 6-O-szulfatált csoportok százalékaránya körülbelül 100 (a 60 és 69 ppm-nél látható csúcsok alapján, a 32. ábrán látható 13C-NMR spektrumban), az SO3-/COO“ arány körülbelül 1,5.
13. Példa
Enzimatikus 3-O-szulfatálás ml reakcióelegyet készítünk az alábbi adalékanyagok felhasználásával: 2 mg az 5B példában szereplő vegyületből; 0,4 ml, az 1. preparatív példa szerint előállított enzim készítmény (körülbelül 1,6 mg fehérjének felel meg); 1 mmol/1 PAPS o,o5 mol/1 Hepes-ben; 10 mmol/1 MnCl2 - 5 mmol/1 CaCl2 - 10 mmol/1 MgCl2 - 3,5 Mmol/l NaF - (0,5-1%) Triton X-100 pH=7,4. A reakcióelegy 2 óra hosszat inkubáljuk 37°C-on, majd a reakciót 2 perces, 100°C-ra való melegítéssel állítjuk le. A denaturált * · fehérjéket centrifugálással eltávolítjuk, majd a felülúszót egy oszlopon bocsátjuk át (0,8 x 100 cm Sephadex G-15), amelyet 0,2 mol/1 NH4NC>3-mal hozunk egyensúlyba. Az eluált anyagot fagyasztva szárítjuk.
Az így előállított anyagból egy 500 vg-os mintát oldunk 500 μΐ 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4; 0,5 mol/1 NaCl összetételű pufferben, ezt egy 3 ml-es antitrombin III - Sepharose oszlopra visszük, amelyet ugyanezzel a pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot ezután 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4; 2 mol/1 NaCl összetételű pufferrel eluáljuk. Az eluátum az összes felvitt anyag 10%-át tartalmazza.
14. Példa
A találmány szerinti vegyületek aktivitása
Néhány, a találmány szerinti vegyület aktivitását in vitro módszerekkel vizsgáljuk, az alábbi tesztek felhasználásával:
a) anti-Xa aktivitás [A.N. Teien et al., Thrombosis Rés., 8, 413 (1976)];
b) heparin kofaktor (HCII) aktivitás [Dupoy et al., Thromb. Haem., 60(2), 237 (1988)];
c) APTT [W.N. Bell et al., Natúré, 174, 880 (1954)], azzal az eltéréssel, hogy a plazma-mintát 1:1 arányban hígítjuk sóoldattal, és
d) TT [C. Eika et al., Láncét II, 376 (1972)], azzal az eltéréssel, hogy a plazma mintát 1:1 arányban hígítjuk sóoldattal.
A kapott eredményeket az alábbi táblázatban foglaljuk
| össze: | IN VITRO | 1. Táblázat AKTIVITÁSI | PROFIL | ||
| Vegyület | Anti-Xa | HCII | APTT | TT | |
| IC50* | IC50* | IC200** | IC200** | ||
| 5A | példából | 11 | 0,4 | 20 | 4 |
| 5B | példából | 56 | 0,46 | 39 | 13 |
| 5C | példából | 59,7 | 0,05 | 3,55 | 1,2 |
* Az 50%-os gátláshoz szükséges koncentráció (Mg/ml) ** A koagulációs idő megkettőzéséhez szükséges koncentráció (Mg/ml)
Ezek a vizsgálatok a jelen találmány szerinti poliszacharidok antitrombotikus és antikoaguláns hatású anyagokként való klinikai alkalmazhatóságát bizonyítják.
15. Példa
A különböző példákban szereplő, nem-epimerizált, N-, 0szulfatált vegyületek tulajdonságait mutatjuk be az alábbi, 2.
táblázatban.
2. Táblázat
IN VITRO AKTIVITÁSI PROFIL
| Vegyület | Anti-Xa | HCII | APTT | TT |
| IC50* | IC50* | IC200** | IC200** | |
| 6. példából | 5,7 | 0,26 | 8 | 2,5 |
| 7A példából | 5,06 | 0,25 | - | - |
| 7C példából | 5,4 | 0,51 | - | - |
| 8C | példából | 2,7 | 0,57 | — | — |
| 8D | példából | 2,2 | 0,05 | - | - |
| 9B | példából | 8,7 | 0,31 | - | - |
| 9C | példából | 8,2 | 0,35 | - | - |
| 10 | példából | 1,7 | 0,99 | - | - |
| 11 | példából | 6,1 | 0,62 | - | — |
* Az 50%-os gátláshoz szükséges koncentráció ^g/ml) ** A koagulációs idő megkettőzéséhez szükséges koncentráció (^g/ml)
Claims (14)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Dezacetilezett K5 Escherichia coli szacharid, azzal jellemezve, hogy a természetes K5-ben előforduló acetilcsoportoknak legalább a 35%-a dezacetilezéssel eltávolított.
- 2. Az 1. igénypont szerinti szacharid, azzal jellemezve, hogy a K5-ön az összes, vagy lényegében az összes dezacetilezett pozíció szulfátcsoporttal van helyettesítve.
- 3. A 2. igénypont szerinti szacharid, azzal jellemezve, hogy az említett pozíciók közé azok is beletartoznak, amelyekről a természetben előforduló K5 szacharidok esetében elvárható, hogy acetilezve legyenek.
- 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti szacharid, azzal jellemezve, hogy a pozíciók a glükózamin csoportok amincsoportjai.
- 5. Bármelyik előző igénypont szerinti szacharid, azzal jellemezve, hogy a glükuronsav csoportoknak legalább egy része L-iduronsav csoportokká van epimerizálódva.
- 6. Bármelyik előző igénypont szerinti szacharid, azzal jellemezve, hogy a szabad hidroxilcsoportoknak legalább egy része szulfátéivá van.
- 7. A 6. igénypont szerinti szacharid, azzal jellemezve, hogy a szabad hidroxilcsoportok lényegében a D-glükózamin csoportok 6-os pozíciójában található csoportok.
- 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti szacharid, azzal jellemezve, hogy a csoportoknak legalább 25%-a szulfátéivá van.
- 9. Egy szacharid, vagy annak származéka, azzal jellemezve, hogy lényegében bármelyik előző igénypont szerinti módosított glükuronsav és glükózamin egységeket tartalmaz.• · · « · · • *«· · ··· • · 4 · · · ··· ·4 «··· ··
- 10. Egy 9. igénypont szerinti szacharid, vagy annak származéka, azzal jellemezve, hogy a glükuronsav és glükózamin csoportok váltakozva vannak jelen.
- 11. Bármelyik előző igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy legalább néhány, előnyösen a legtöbb csoport 3O-szulfatálva van.
- 12. Bármely előző igénypont szerinti vegyület alkalmazása a terápiában.
- 13. Bármely előző igénypont szerinti vegyület alkalmazása antitrombotikus vagy antikoaguláns aktivitást igénylő állapotok kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer hatóanyag előállítására.
- 14. Eljárás bármely előző igénypont szerinti hatóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépések közül egyet vagy többet alkalmazunk:a) a megfelelő kiindulási anyagot egy N-dezacetilezési eljárásnak vetjük alá;b) az előző, a) lépésben keletkező szabad NH2 csoportokat szulfatáljuk;c) a b) lépésben keletkező termékeket epimerizáljuk, oly módon hogy a D-glükuronsav csoportok közül legalább néhányat Liduronsav csoportokká alakítunk át; ésd) bármely keletkező vegyületben a szabad hidroxilcsoportok közül legalább néhányat szulfatálunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9106757A GB2254083A (en) | 1991-03-28 | 1991-03-28 | Anticoagulants from e.coli saccharide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9302732D0 HU9302732D0 (en) | 1994-01-28 |
| HUT67208A true HUT67208A (en) | 1995-02-28 |
Family
ID=10692438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9302732A HUT67208A (en) | 1991-03-28 | 1992-03-30 | Anticoagulants and processes for preparing such |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07501684A (hu) |
| AU (1) | AU1430892A (hu) |
| CA (1) | CA2107124A1 (hu) |
| FI (1) | FI934141A0 (hu) |
| GB (2) | GB2286193A (hu) |
| HU (1) | HUT67208A (hu) |
| IE (1) | IE920982A1 (hu) |
| IT (1) | IT1254564B (hu) |
| PT (1) | PT100316A (hu) |
| TW (1) | TW209225B (hu) |
| WO (1) | WO1992017507A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA922313B (hu) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2684385B1 (fr) * | 1991-11-28 | 1997-08-01 | Sanofi Elf | Heparosanes-n,o-sulfates de haute masse moleculaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. |
| IT1270823B (it) * | 1993-06-04 | 1997-05-13 | Italfarmaco Spa | Polisaccaridi ad elevata attivita' antitrombotica e anticoagulante |
| US5700787A (en) * | 1994-09-02 | 1997-12-23 | Brigham & Women's Hospital, Inc. | Capsular polysaccharide immunomodulator |
| IT1271057B (it) * | 1994-11-04 | 1997-05-26 | Inalco Spa | Polisaccaridi aventi un elevato contenuto di acido iduronico |
| IT1282994B1 (it) * | 1996-05-10 | 1998-04-03 | Inalco Spa | Derivati del polisaccaride k5 aventi elevata attivita' anticoagulante |
| AUPO556297A0 (en) | 1997-03-11 | 1997-04-10 | Australian National University, The | Sulfated oligosaccharides having anticoagulant/ antithrombotic activity |
| ITMI991465A1 (it) * | 1999-07-02 | 2001-01-02 | Inalco Spa | Processo per la preparazione dei polisaccaridi k4 e k5 da escherichiacoli |
| US20020062019A1 (en) | 2000-03-30 | 2002-05-23 | Pasqua Oreste | Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation |
| SV2003000753A (es) | 2000-12-05 | 2003-06-16 | Brigham & Womens Hospital | Uso de polisacaridos zwitterionicos para la especifica modulacion del progreso inmunologico |
| ITMI20010397A1 (it) | 2001-02-27 | 2002-08-27 | Giorgio Zoppetti | Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione |
| ITMI20010779A1 (it) * | 2001-04-12 | 2002-10-12 | Giorgio Zoppetti | Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi |
| PL375087A1 (en) | 2002-06-18 | 2005-11-14 | Glycores 2000 S.R.L. | Low molecular weight oversulfated polysaccharide |
| US20120253029A1 (en) | 2002-06-18 | 2012-10-04 | Pasqua Anna Oreste | Process for the preparation of highly o-sulfated epimerized derivatives of k5 polysaccharide and intermediates therein |
| EP1638581A2 (en) | 2003-03-31 | 2006-03-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Zwitterionic immunomodulators for the treatment of asthma and allergy |
| WO2007092451A2 (en) | 2006-02-06 | 2007-08-16 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Zwitterionic polysaccharides for promotion of immune system maturation and health |
| EP2217250A4 (en) | 2007-11-09 | 2011-01-05 | California Inst Of Techn | IMMUNOREGULATORY COMPOUNDS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS |
| ITMI20091445A1 (it) * | 2009-08-07 | 2011-02-08 | Inalco S P A A Socio Unico | Derivati semi-sintetici del polisaccaride k5 per la prevenzione ed il trattamento del danno tissutale associato a ischemia e/o riperfusione |
| EP2555753B1 (en) | 2010-04-07 | 2018-08-01 | California Institute of Technology | Vehicle for delivering a compound to a mucous membrane and related compositions, methods and systems |
| WO2011146910A1 (en) | 2010-05-20 | 2011-11-24 | Round June L | Antigen specific tregs and related compositions, methods and systems |
| CN102199175A (zh) * | 2011-04-07 | 2011-09-28 | 福州大学 | 硫酸类肝素二糖的制备纯化方法及其纯化产品 |
| US9539281B2 (en) | 2011-07-12 | 2017-01-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lipid-containing PSA compositions, methods of isolation and methods of use thereof |
| EP2994161B1 (en) | 2013-05-10 | 2020-10-28 | California Institute of Technology | Probiotic prevention and treatment of colon cancer |
| US11331335B2 (en) | 2015-06-10 | 2022-05-17 | California Institute Of Technology | Sepsis treatment and related compositions methods and systems |
| CN108135167B (zh) | 2015-08-19 | 2021-07-09 | 哈佛学院院长及董事 | 脂化psa组合物和方法 |
| WO2018014012A1 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | President And Fellows Of Harvard College | Glycolipid compositions and methods of use |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2504535B1 (fr) * | 1981-04-28 | 1987-08-14 | Choay Sa | Disaccharides derives d'un acide uronique et d'une glucosamine et compositions pharmaceutiques les contenant pour le controle de la coagulation sanguine |
| FR2548189B1 (fr) * | 1983-07-01 | 1986-04-11 | Choay Sa | Nouveaux produits contenant des oligosaccharides, leur preparation et leurs applications biologiques et biochimiques |
| EP0333243A3 (en) * | 1988-03-10 | 1989-09-27 | Akzo N.V. | Sulphated k5 antigen and sulphated k5 antigen fragments |
| IT1217458B (it) * | 1988-05-02 | 1990-03-22 | Crinos Ind Farmacoriologica S | Sulfoamino derivati di condroitin solfati,del dermatan solfato e dell' acido ialuronico e loro proprieta' farmacologiche |
| FR2669932B1 (fr) * | 1990-12-03 | 1994-07-01 | Sanofi Sa | Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent. |
-
1991
- 1991-03-28 GB GB9508157A patent/GB2286193A/en not_active Withdrawn
- 1991-03-28 GB GB9106757A patent/GB2254083A/en not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-03-26 IT ITMI920722A patent/IT1254564B/it active
- 1992-03-27 PT PT100316A patent/PT100316A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-03-27 IE IE098292A patent/IE920982A1/en unknown
- 1992-03-30 ZA ZA922313A patent/ZA922313B/xx unknown
- 1992-03-30 HU HU9302732A patent/HUT67208A/hu unknown
- 1992-03-30 CA CA002107124A patent/CA2107124A1/en not_active Abandoned
- 1992-03-30 AU AU14308/92A patent/AU1430892A/en not_active Abandoned
- 1992-03-30 WO PCT/GB1992/000571 patent/WO1992017507A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-03-30 JP JP4506945A patent/JPH07501684A/ja active Pending
- 1992-05-11 TW TW081103646A patent/TW209225B/zh active
-
1993
- 1993-09-22 FI FI934141A patent/FI934141A0/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9302732D0 (en) | 1994-01-28 |
| CA2107124A1 (en) | 1992-09-29 |
| ITMI920722A0 (it) | 1992-03-26 |
| WO1992017507A1 (en) | 1992-10-15 |
| FI934141A (fi) | 1993-09-22 |
| GB2286193A (en) | 1995-08-09 |
| PT100316A (pt) | 1993-07-30 |
| AU1430892A (en) | 1992-11-02 |
| IT1254564B (it) | 1995-09-25 |
| FI934141A0 (fi) | 1993-09-22 |
| JPH07501684A (ja) | 1995-02-23 |
| GB9508157D0 (en) | 1995-06-07 |
| ITMI920722A1 (it) | 1993-09-26 |
| IE920982A1 (en) | 1992-10-07 |
| ZA922313B (en) | 1993-08-02 |
| GB2254083A (en) | 1992-09-30 |
| TW209225B (hu) | 1993-07-11 |
| GB9106757D0 (en) | 1991-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT67208A (en) | Anticoagulants and processes for preparing such | |
| RU2099353C1 (ru) | N,о-сульфатированные гепарозаны, способ их получения и фармацевтическая композиция, обладающая антитромботической активностью | |
| US5384398A (en) | High molecular mass N,O-sulphated heparosans, process for their preparation and the pharmaceutical compositions which contain them | |
| EP0789777B1 (en) | Polysaccharides having a high iduronic acid content | |
| RU2361881C2 (ru) | Производные полисахаридов с высокой антитромботической активностью в плазме | |
| JP4267916B2 (ja) | 多糖体ｋ５から誘導された高度のアンチトロンビン活性を有するグリコサミノグリカン及びその製法 | |
| EP0897393A1 (en) | Derivatives of k5 polysaccharide having high anticoagulant activity | |
| CN111154819B (zh) | 一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用 | |
| JP2013503606A (ja) | Ｋ５ヘパロサン発酵および精製 | |
| Guezennec et al. | Sulfation and depolymerization of a bacterial exopolysaccharide of hydrothermal origin | |
| US8513407B2 (en) | Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained | |
| JP2003528945A (ja) | 高い抗凝血活性と抗血栓活性を有するｋ５多糖由来のグリコサミノグリカンおよびその調製方法 | |
| EP1694714B1 (en) | Low molecular weight polysaccharides having antithrombotic activity | |
| Manzoni et al. | Production of K5 polysaccharides of different molecular weight by Escherichia coli | |
| WO1994029352A1 (en) | Polysaccharides having high antithrombotic and anticoagulant activity | |
| EP0577665A1 (en) | Anticoagulants and processes for preparing such | |
| JP4768936B2 (ja) | 硫酸基を有するオリゴ糖 | |
| JPH0616687A (ja) | ヘパリン不飽和４糖およびその製造法 | |
| RU2333222C2 (ru) | Эпимеризованные производные полисахарида к5 с высокой степенью сульфатирования |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |