CN102199175A - 硫酸类肝素二糖的制备纯化方法及其纯化产品 - Google Patents

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魏峥
林江慧
魏可镁
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Abstract

本发明涉及一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法及其纯化产品，所述方法是以肝素二糖为原料，经过阳离子交换树脂洗脱，吡啶调节洗脱液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶二糖；所述的肝素吡啶二糖分别与1-甲基-2-吡咯烷酮的水溶液，乙酸酐，Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体反应，反应液经凝胶树脂分离，纯化得到游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。本发明的纯化方法简单，解决了长期以来特定的二糖结构不能大量制备，制备步骤繁多，并且产品价格昂贵的问题。同时，该问题的解决也将使硫酸类肝素特殊结构和功能之间关系的研究得以进一步开展。

Description

硫酸类肝素二糖的制备纯化方法及其纯化产品
技术领域
本发明属于天然产物制备纯化领域，更具体涉及一种硫酸类肝素二糖的制备和纯化方法及其纯化产品。
背景技术
硫酸类肝素是由三种不同硫酸化程度的区域交替组成的：N-乙酰化区域（NA）是由完全无硫酸化的 GlcNAc-GlcUA二糖单元组成；N-硫酸化区域（NS）是由高度硫酸化的GlcNS(±6S)-IdoUA(2S)二糖组成，每个二糖有2-3个硫酸基；而N-乙酰化/N-硫酸化区域（NA/NS）是个过渡区域，同时含有无硫和含硫的二糖并且交叉的排列，其序列大致为GlcNAc-GlcUA-GlcNS-IdoA。硫酸类肝素中存在的12种代表性的二糖结构如图1所示，其中含GlcNAc、GlcNSO3残基的二糖为主要存在形式，而带正电荷的GlcNH3 +残基二糖的含量微少。
至今为止关于肝素化学修饰的主要文献有 Inoue Y等，使用5％水(或甲醇)/二甲亚砜溶液可选择性地脱除肝素吡啶盐中N位上的硫酸基团；jaseja M等，通过pH=12．5—12．8的Na0H水溶液，a-L-艾杜糖醛酸片段上2S可以定量地脱除；Ayotte L等，使用9：1的Me2SO-水，Hanno B 等使用N-甲基吡咯烷酮水溶液可脱去6S。以上都是基于对长链肝素的修饰。
现有的商品化的硫酸类肝素二糖都是由肝素及其衍生物制备得到的。首先通过对完整肝素链的修饰，然后经过肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，它们能特异性地裂解肝素链上具有特殊修饰的结构，从而产生不同的寡糖片段。但是这种方法不能制备大量的特定所需的二糖结构，且制备的步骤繁多，价格比较昂贵。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种硫酸类肝素二糖的纯化方法，通过肝素二糖Hex(2S)-NS(6S) 来制备硫酸类肝素中的游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖，将促进硫酸类肝素中特殊结构的研究。
本发明是通过如下技术方案实施的：
一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法是以肝素二糖为原料，经过阳离子交换树脂洗脱，吡啶调节洗脱液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶二糖；所述的肝素吡啶二糖分别与1-甲基-2-吡咯烷酮的水溶液，乙酸酐，Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体反应，反应液经凝胶树脂分离，纯化得到游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。
所述的肝素吡啶二糖的制备方法包括：
1）在2-5℃中，将肝素二糖水溶液通过阳离子交换树脂，之后再用1-3倍树脂体积的蒸馏水洗脱；
2）在室温中，用吡啶将所得的洗脱液在搅拌的状态下，中和至PH为6～6.5；
3）将中和后的溶液放至在-70℃下冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述的肝素吡啶二糖。
所述的游离氨基二糖是通过如下的制备纯化方法：
1）将肝素吡啶二糖溶于1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液中，在水浴中反应8-12h，水浴温度为60-70℃，所述的1-甲基-2-吡咯烷酮与水的体积比为：8-9:1-2；
2）将反应后的溶液冷却，加入NaOH溶液，置于－4℃的条件下过夜；
3）将过夜后的反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为游离氨基二糖。
所述的肝素吡啶二糖的加入量为1-4mg,所述的1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液的体积为1-3mL；所述步骤2）NaOH溶液的浓度为0.05-0.02mol/L，加入体积为10-30μL。
所述的N-乙酰二糖是通过如下方法制备纯化：
1）将游离氨基二糖加入到PH为7-8的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系中，在4℃时恒温反应0.5-1小时；
2）在搅拌下逐渐加入相当于样品两倍摩尔量的乙酸酐，反应10-20分钟；
3）将反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-乙酰二糖。
所述的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系的摩尔浓度为0.2-0.3mol/L，添加量为1-3mL，所述的游离氨基二糖的2-3 mg。
所述的N-硫酸化二糖的制备是通过如下纯化方法：
1）在游离氨基二糖中加入1-3mL超纯水， 再加入分别相当于固体样品两倍质量的的Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体，在水浴中反应8-12h；
2）将反应后的溶液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
3）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-硫酸化二糖。
所述的游离氨基二糖的添加量为2-3 mg。
所述的凝胶树脂包括Sephadex-G-15树脂柱。
所述的纯化产品包括游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。
本发明的优点为：本发明的纯化方法简单，解决了长期以来特定的二糖结构不能大量制备，制备步骤繁多，并且产品价格昂贵的问题。同时，该问题的解决也将使硫酸类肝素特殊结构和功能之间关系的研究得以进一步开展。
附图说明
图1为硫酸类肝素中存在的12种代表性的二糖结构图,其中1,2,7,8为N-乙酰二糖，3,4,5,6为N-硫酸化二糖，9,10,11,12为游离氨基二糖。
具体实施方式
1.吡啶二糖的制备
⑴.根据说明书中树脂的交换量E，计算1克H型阳离子交换树脂（Amberlite IR-120 H型）能交换的钠离子量（mol）；
⑵.计算交换1克HS二糖所需树脂量。HS典型二糖分子量约为649，一分子二糖中有4个钠离子。计算方法如下：
1克HS二糖含有钠离子的量（mol）（1g/649）x4=0.0062mol
所需树脂量（g）：0.0062/E=Y克
⑶.选取径高比为1比20的玻璃柱。将Y克树脂浸泡在纯水中，反复冲洗直至中性后装柱。
⑷.将100mg的HS二糖溶解于10mL蒸馏水，将其与300mL 蒸馏水以及填装好的树脂柱放在4℃过夜。
⑸在4℃中，将HS二糖溶液通过H型阳离子交换树脂，之后再用2倍树脂体积的蒸馏水洗。用酸度计所得溶液的PH值。
⑹室温中用吡啶将所得溶液中和至PH6～6.5（在磁力搅拌下进行），
⑺将溶液转移至-80℃冰箱冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥。得到硫酸类肝素吡啶二糖固体样品（样品为棕色）。
2.游离氨基二糖的制备
⑴取2mg的Hex(2S)-NS(6S)-吡啶样品溶于1mL 90%1-甲基-2-吡咯烷酮/水中混匀。在水浴中反应10h，水浴温度分别为65℃。
⑵反应结束后反应液先冷却，然后加入0.1M 的NaOH 20μL，置于－4℃冰箱中过夜。
⑶将Sephadex-G-15树脂浸泡于纯水中，使树脂充分膨胀。将树脂填装于1.2x50cm 的玻璃层析柱中，其装填量为柱体积的90%。
⑷反应液通过Sephadex-G-15柱，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min.数控计滴自动部分收集器收集分离后的反应液.
⑸紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测每根收集管中的溶液吸光度（OD值）.以Y轴为吸光度，X轴为管号做图。收集第一个峰范围的样品，为目标产物游离氨基二糖，第二和第三个峰是反应后的1-甲基-2-吡咯烷酮.
3.N-乙酰化二糖制备
⑴0.25M PH7.5的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系配制：
先分别配制A：0.5M NaH2PO4  100mL   B:  0.5M Na2HPO4  100mL
取XmL的B 加A调PH值为7.5 ，在磁力搅拌，酸度计中进行。
⑵上述制备的A游离氨基二糖固体样品加入1mL 缓冲液 放置在4℃的恒温层析柜中。
⑶加入样品两倍量的（mol）的乙酸酐（在搅拌下逐渐加入）反应15分钟后。
⑷反应液通过Sephadex-G-15柱，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min数控计滴自动部分收集器收集分离的反应液。
⑹紫外分光光度计检测波长置于232nm处测每根收集管中的溶液吸光度（OD值）.以Y轴为吸光度，X轴为管号做图。收集第一个峰范围的样品，为目标产物B。
4.N-硫酸化二糖制备
⑴将游离氨基二糖加1mL的超纯水，加入固体样品两倍量的（mg）的Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体。55℃水浴中反应10h。
⑵冷却后，反应液通过Sephadex-G-15树脂柱，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min数控计滴自动部分收集器收集分离的反应液。
⑶紫外分光光度计检测波长置于232nm处测每根收集管中的溶液吸光度（OD值）.以Y轴为吸光度，X轴为管号做图。收集第一个峰范围的样品，为目标产物C。
上述制备的样品经过液相色谱分离，收集每个样品所对应的峰。
色谱条件为：流动相: A液相色谱级水（盐酸调PH至3.5）; B 2M NaCl（盐酸调PH至3.5）  色谱条件： 色谱柱： ProPac PA-1 semi-prep(9x250mm)；柱温：室温；检测器： UV检测器；检测波长：232nm；流速： 4mL/min；进样量：1mL；样品进样后先用8.4mL PH3.5水冲洗2.1分钟。之后用NaCl线性洗脱，从0～0.5M(2.1-35.1min) 和0.5～1.0M（35.1-57.1min）柱子能分离的最大样品量不超过5mg.
收集的样品用透析袋 （MWCO：100）脱盐。脱盐要在磁力搅拌下进行。每天换两次透析用水。透析三天后，溶液置于-80℃冰箱冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥。分析制备的二糖，和标准二糖图谱对照。表明制备了10种硫酸类肝素二糖。
实施例1
所述的肝素吡啶二糖的制备方法包括：
1）在2℃中，将肝素二糖水溶液通过阳离子交换树脂，之后再用1倍树脂体积的蒸馏水洗脱；
2）在室温中，用吡啶将所得的洗脱液在搅拌的状态下，中和至PH为6～6.5；
3）将中和后的溶液放至在-70℃下冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述的肝素吡啶二糖。
所述的游离氨基二糖是通过如下的制备纯化方法：
1）将肝素吡啶二糖溶于1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液中，在水浴中反应8h，水浴温度为60℃，所述的1-甲基-2-吡咯烷酮与水的体积比为：8:2；
2）将反应后的溶液冷却，加入NaOH溶液，置于－4℃的条件下过夜；
3）将过夜后的反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为游离氨基二糖。
所述的肝素吡啶二糖的加入量为1mg,所述的1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液的体积为1mL；所述步骤2）NaOH溶液的浓度为0.05mol/L，加入体积为10μL。
所述的N-乙酰二糖是通过如下方法制备纯化：
1）将游离氨基二糖加入到PH为7-8的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系中，在4℃时恒温反应0.5小时；
2）在搅拌下逐渐加入相当于样品两倍摩尔量的乙酸酐，反应10分钟；
3）将反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-乙酰二糖。
所述的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系的摩尔浓度为0.2mol/L，添加量为1mL，所述的游离氨基二糖的2mg
所述的N-硫酸化二糖的制备是通过如下纯化方法：
1）在游离氨基二糖中加入1mL超纯水， 再分别加入相当于固体样品两倍质量的的Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体，在水浴中反应8h；
2）将反应后的溶液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
3）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-硫酸化二糖。
所述的游离氨基二糖的添加量为2mg。
所述的凝胶树脂包括Sephadex-G-15树脂柱。
实施例2
所述的肝素吡啶二糖的制备方法包括：
1）在5℃中，将肝素二糖水溶液通过阳离子交换树脂，之后再用3倍树脂体积的蒸馏水洗脱；
2）在室温中，用吡啶将所得的洗脱液在搅拌的状态下，中和至PH为6～6.5；
3）将中和后的溶液放至在-70℃下冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述的肝素吡啶二糖。
所述的游离氨基二糖是通过如下的制备纯化方法：
1）将肝素吡啶二糖溶于1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液中，在水浴中反应8-12h，水浴温度为60-70℃，所述的1-甲基-2-吡咯烷酮与水的体积比为： 9:1；
2）将反应后的溶液冷却，加入NaOH溶液，置于－4℃的条件下过夜；
3）将过夜后的反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为游离氨基二糖。
所述的肝素吡啶二糖的加入量为4mg,所述的1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液的体积为3mL；所述步骤2）NaOH溶液的浓度为0.02mol/L，加入体积为30μL。
所述的N-乙酰二糖是通过如下方法制备纯化：
1）将游离氨基二糖加入到PH为7-8的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系中，在4℃时恒温反应1小时；
2）在搅拌下逐渐加入相当于样品两倍摩尔量的乙酸酐，反应20分钟；
3）将反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-乙酰二糖。
所述的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系的摩尔浓度为0.3mol/L，添加量为3mL，所述的游离氨基二糖的2-3 mg
所述的N-硫酸化二糖的制备是通过如下纯化方法：
1）在游离氨基二糖中加入1-3mL超纯水， 再分别加入相当于固体样品两倍质量的的Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体，在水浴中反应12h；
2）将反应后的溶液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
3）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-硫酸化二糖。
所述的游离氨基二糖的添加量为3 mg。
所述的凝胶树脂包括Sephadex-G-15树脂柱。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述方法是以肝素二糖为原料，经过阳离子交换树脂洗脱，吡啶调节洗脱液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶二糖；所述的肝素吡啶二糖分别与1-甲基-2-吡咯烷酮的水溶液，乙酸酐，Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体反应，反应液经凝胶树脂分离，纯化得到游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。
2.根据权利要求1所述的一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述的肝素吡啶二糖的制备方法包括：
1）在2-5℃中，将肝素二糖水溶液通过阳离子交换树脂，之后再用1-3倍树脂体积的蒸馏水洗脱；
2）在室温中，用吡啶将所得的洗脱液在搅拌的状态下，中和至PH为6～6.5；
3）将中和后的溶液放至在-70℃下冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述的肝素吡啶二糖。
3.根据权利要求1所述的一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述的游离氨基二糖是通过如下的制备纯化方法：
1）将肝素吡啶二糖溶于1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液中，在水浴中反应8-12h，水浴温度为60-70℃，所述的1-甲基-2-吡咯烷酮与水的体积比为：8-9:1-2；
2）将反应后的溶液冷却，加入NaOH溶液，置于－4℃的条件下过夜；
3）将过夜后的反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为游离氨基二糖。
4.根据权利要求3所述的一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述的肝素吡啶二糖的加入量为1-4mg,所述的1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液的体积为1-3mL；所述步骤2）NaOH溶液的浓度为0.05-0.02mol/L，加入体积为10-30μL。
5. 根据权利要求1所述的一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述的N-乙酰二糖是通过如下方法制备纯化：
1）将游离氨基二糖加入到PH为7-8的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系中，在4℃时恒温反应0.5-1小时；
2）在搅拌下逐渐加入相当于样品两倍摩尔量的乙酸酐，反应10-20分钟；
3）将反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-乙酰二糖。
6.根据权利要求5所述的一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系的摩尔浓度为0.2-0.3mol/L，添加量为1-3mL，所述的游离氨基二糖的2-3 mg。。
7.根据权利要求1所述的一种硫酸类肝素二糖的纯化方法，其特征在于：所述的N-硫酸化二糖的制备是通过如下纯化方法：
1）在游离氨基二糖中加入1-3mL超纯水， 再加入分别相当于固体样品两倍质量的的Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体，在水浴中反应8-12h；
2）将反应后的溶液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；
3）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-硫酸化二糖。
8.根据权利要求7所述的一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述的游离氨基二糖的添加量为2-3 mg。
9. 根据权利要求1、3、5或7所述的一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述的凝胶树脂包括Sephadex-G-15树脂柱。
10. 一种如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的硫酸类肝素二糖的纯化方法得到的纯化产品，其特征在于：所述的纯化产品包括游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。
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