CN105527350A - 细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对少量细胞(10³-10⁴个)的胞内代谢轮廓高通量分析方法，包括简便、高效的细胞淬灭及代谢物提取，代谢物衍生化，以及质谱检测等步骤。本发明公开的胞内代谢轮廓高通量分析方法具有简便快速，灵敏度高且重复性好的特点，适合于96孔板内培养的细胞以及收获量少的细胞的代谢组高通量分析，如药物的大规模筛选、评价以及干细胞研究等。

Description

细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，是一种针对少量细胞的胞内氨基酸代谢轮廓高通量分析方法。

背景技术

在系统生物学的理论框架下，借助代谢轮廓分析，将代谢表型及代谢通路的扰动与其内在的病理生理机制联系起来的“多组学”研究已越来越多地被用于癌症研究,干细胞和药效及药物毒理研究中。细胞代谢轮廓分析是实现上述研究目的的重要工具。在细胞代谢轮廓分析中，细胞培养耗时多、预处理步骤繁杂等一直是限制分析通量提高的主要因素。利用96孔组织培养板可以实现少量细胞(约10³-10⁴个)的快速培养及高通量操作。此外，在干细胞的研究中，可用于代谢轮廓分析的干细胞数目相对较少，常规的分析策略难以获得丰富的代谢组数据。因此，实现少量细胞的代谢轮廓分析方法具有重要意义。

虽然UPLC-MS分析灵敏度有了很大提高，但目前在检测胞内代谢组时常需要大量细胞(>10⁶cells)。由于代谢物种类繁多、结构多样，在少量细胞中代谢物整体含量较低，因此在代谢物分析的覆盖率及灵敏度之间需要一个合适的平衡点。因此，我们采用了“分而治之”的策略，即针对不同类代谢物分别采用不同的预处理方法，提高其检测灵敏度，实现对特定代谢通路的覆盖。氨基酸在细胞中具有非常重要的功能，既是蛋白质的基本组成单元，也是重要的代谢调节分子。如谷氨酰胺是某些癌细胞的必需氨基酸，同时也用于维持三羧酸循环。同时，氨基酸可以通过代谢回补通路来进出三羧酸循环，从而参与糖和脂类代谢，因而氨基酸代谢轮廓可以部分反映中心碳代谢对内外源干预的响应。

我们选择针对96孔板培养的细胞为研究对象，并首先以检测胞内氨基酸为目标来研发高通量、高灵敏的96孔板细胞胞内代谢轮廓分析方法。提出的具体实验方案包括从细胞预处理到LC-MS分析的全部流程。通过开发简便的细胞淬灭提取程序，可以在简化预处理步骤的同时，提高提取的重复性。选用丹磺酰氯作为衍生化试剂，对氨基酸进行化学修饰，可以增加极性较高的氨基酸类、其他含氨基或酚羟基化合物在液相上的保留，减少离子抑制，改善分析精度，提高其检测灵敏度。

针对96孔板接种培养的细胞的胞内氨基酸类代谢轮廓分析，我们开发了简便的细胞淬灭提取程序，同时结合丹酰化修饰来提高氨基酸的分析灵敏度，该方法可以实现对96孔板接种培养的10³-10⁴个细胞的胞内代谢物的高灵敏度、高通量检测。这一结果突破了目前胞内代谢物检测中需要10⁶-10⁷量级细胞的限制，可用于高通量的代谢物功能阐释，还可用于新药快速筛选，及无法获得大量细胞的干细胞等相关研究中。我们将这一方法初步应用于脂肪酸对HepG2细胞的干预实验中，验证了其实用性。

发明内容

本发明的目的在于建立一种针对96孔组织培养板上生长的细胞胞内代谢轮廓分析方法，实现在少量细胞基础上的高灵敏、高通量的代谢轮廓分析，同时该方法也具有代谢淬灭和代谢物提取简便的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)96孔组织培养板中生长的细胞用冷PBS清洗后，利用冷甲醇/水对细胞进行代谢淬灭和代谢物静置提取。样品淬灭、提取一步完成，预处理过程简单，无须冻融、超声等细胞破碎过程；

(2)上清液或滤液用丹磺酰氯进行衍生，离心或过滤后上清用于上样分析。采用短柱分析，并优化分离检测条件，可实现10³-10⁴个细胞的胞内氨基酸及更多含氨基及酚羟基化合物的轮廓分析。

具体步骤如下(图1)：

(1)在96孔组织培养板中生长的细胞，先用150-250μL0-4℃PBS快速洗涤培养于96孔板每一孔中的细胞三次。(2)然后于96孔板每一孔中迅速加入30-50μL淬灭溶液(0-4℃，含30-60％甲醇的水溶液，其中含浓度为0.1-2.5μg/mL同位素内标Ala-d⁴,Val-d⁸和Trp-d⁵)进行细胞代谢淬灭；继而在4℃下静置提取30-60min.(3)将96孔板每一孔中提取液离心或用96孔过滤板过滤后，取40-70μL上清或滤液用于衍生。

(4)向96孔板每一孔的上清或滤液中加入等体积的0.1-0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲盐溶液，再加入与从96孔板每一孔中所得的上清或滤液等体积的0.5-5mg/mL丹磺酰氯或d⁶-丹磺酰氯的乙腈溶液，充分涡旋混合。混合物在50-70℃,130-160转每分(rpm)条件下反应40-60min。再向上述混合物中加入20-40μL,50-500μM丁胺，同样条件下反应20-30min来终止丹酰化反应。

(5)设置离心转速为13,000rpm，离心10min，取上清进行96孔板每一孔中衍生液LC-MS分析。

(6)LC/MS分析：选用柱长为5cm短柱作为分析柱(2.1mm内径,1.7μm粒径)，同时柱前连接预柱进行柱保护。预柱和分析柱的填充材料分别为高强度硅胶基质的辛基和十八烷基键合颗粒。

样品分析时，进样量为5μL。柱温设定为40-60℃。流动相A为0.1％甲酸/水(v/v)，流动相B为纯乙腈。梯度洗脱程序为：0-1min,2％B；1-2min线性升至20％B,维持0.5min；在5min和6min，相继升至55％B和60％B；8min处升至100％B并维持1min.每针运行时间为12min,包括预平衡的3min.流动相流速为0.3mL/min.

信号采集利用高分辨质谱在正离子模式下实现。质荷比扫描范围为200-1000Da,质谱分辨率设为15K。离子源参数设置如下：鞘气和辅助气流速分别为35和5个单位。I喷雾电压和毛细管电压分别为4.5kV和49V；毛细管温度为350℃；离子传输管电压设为100V.

细胞提取物衍生溶液进样分析时，化合物信息提取及结构初判：含氨基或酚羟基的代谢物，在质谱正离子模式下能够形成两种特征离子：(M+234.059)⁺；(M+307.148)⁺。在将细胞提取物的辅助衍生溶液与衍生溶液等体积混合进样分析，可辅助代谢物的结构判断。相邻保留时间内出现成对的双峰：代谢物的辅助衍生峰相对于衍生峰，质荷比理论上高出6.036Da，并且在液相上提前出峰，双峰的保留时间差值为6-15秒。某代谢物的谱图模式如果符合上述特点，即可判断该代谢物含氨基或酚羟基。

发明效果：本发明开发的针对96孔板培养的细胞胞内氨基酸等含氨基和酚羟基化合物的代谢轮廓分析方法，代谢物丹酰化后在液相上保留增强，质谱检测时离子抑制减少，引入丹酰化基团后正离子模式下代谢物离子化效率提高2-3个数量级，可实现对10³-10⁴个左右细胞胞内代谢物的高灵敏度分析。

利用96孔组织培养板进行细胞培养及干预，试剂和材料消耗大幅降低，细胞培养和操作通量高，经济又高效。其中针对96孔板上培养的细胞，将细胞从孔中转移出来进行预处理或直接在板上进行原位提取都存在困难的问题，开发了针对少量细胞的代谢淬灭和提取一步完成的预处理方法，减少了预处理步骤，操作简单、高效、避免了通过刮板或胰酶消化等细胞收集方法对胞内代谢的影响，也无需复杂的反复冻融及超声等即可实现同等的提取效率，具有较佳的提取重复性和回收率。

对细胞胞内代谢提取物分别利用d⁶-丹磺酰氯及丹磺酰氯标记，等量混合后进行液相色谱-质谱分析，可根据含氨基或酚羟基代谢物特征的提取质谱谱图辅助未知代谢物的鉴定。

附图说明

图1高通量96孔板组织培养板培养细胞胞内代谢轮廓分析策略。

图2辅助定性示例：如苏氨酸的由⁶d-丹磺酰氯和普通丹磺酰氯标记的双峰洗脱顺序及质荷比差值。

图3氨基酸提取效率比较：4℃下简单提取(无填充)与反复冻融三次补充冰水浴中超声提取30分钟(斜线填充)。

图4基于所有氨基酸的主成分分析情况，所有变量作单一方差标度化。对照(绿色圆点)；棕榈酸(PA)处理(三角形)；棕榈油酸(POA)处理(菱形)；棕榈酸-棕榈油酸(PA-POA)联合干预(黄色圆点)。

具体实施方式

实施例1

少量细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法考察：

1)在96孔板上接种培养HepG2细胞

在175cm²的细胞培养瓶中贴壁培养HepG2细胞：给予10％FBS的DMEM高糖培养基，并在37℃，5％CO2的恒定条件下令细胞汇合生长至60-70％。

用胰蛋白酶消化细胞，细胞重悬于含10％FBS的DMEM培养基中。进行细胞计数，制备密度为2×10⁴细胞/毫升的细胞悬液用于接种96孔板。

在96孔板中，每孔接种100μL上述HepG2细胞悬液(悬浮液用10％FBS的DMEM培养基配置而成)，并保持在37℃及5％CO2的条件下培养48h。

2)细胞淬灭和胞内代谢物提取

HepG2细胞生长48h后，先将96孔板每一孔中生长的细胞用200μL冰冷PBS洗三次，迅速加入50μL21：79(v/v)，甲醇/水(4℃)对细胞进行代谢淬灭。迅速加入50μL80％的甲醇水溶液，其中含浓度为0.5μg/mL同位素内标Ala-d⁴,Val-d⁸和Trp-d⁵，4℃下静置提取30min.将提取混合物离心后，取50μL上层清液用于衍生。

3)标样溶液组成及配置

首先将每个氨基酸标准品浓度分别配制为约2mg/mL(19种氨基酸见表2)，然后每个标准品取等体积混合，配置成浓度为100μg/mL的氨基酸标准品混合溶液，作为母液用于贮存(-20℃)。首先，配置浓度为5μg/mL氨基酸标准品混合物，分装为2份，各50μL，分别用于⁶d-丹磺酰氯和丹磺酰氯标记；其次，对氨基酸标准品混合物作线性稀释，浓度包括1.25，2.5，5，10，20，100ng/mL，1，5，10，20，50，100μg/mL。各浓度下分别取50μL，用于衍生来作线性评价；配置浓度为500ng/mL的标准品混合物，用作丹酰化及LC-MS分析的日内精密度(n＝6)和日间精密度(n＝6*3)考察。

4)标样混合溶液或提取液衍生化

衍生反应中，先向50μL标样混合溶液或细胞提取液中加入50μL，0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，再加入50μL,5mg/mL丹磺酰氯后，将溶液充分涡旋混合。混合物在60℃,160rpm条件下反应1小时后，加入30μL,0.5M丁胺水溶液，相同条件下反应半小时以终止丹酰化反应。在13,000rpm下离心10min,上清即可用于LC-MS分析。

5)LC-MS分析

色谱分离采用5cmHSST3柱(2.1mm内径,1.7μm粒径)(Waters,Milford,MA)，同时使用C8预柱(Waters,Milford,MA)进行柱保护。进样量为5μL.柱温设定为50℃.流动相A为0.1％甲酸/水(v/v)，流动相B为纯乙腈。液相洗脱梯度为：0-1min,2％B；1-2min线性升至20％B,维持0.5min；在5min和6min，相继升至55％B和60％B,8min处升至100％B并维持1min.单次样品运行时间为12min,其中包括预平衡的3min.流动相流速为0.3mL/min.

MS在正离子模式下进行信号采集，质荷比扫描范围为200-1000道尔顿(Da)。质谱分辨率设为15K。离子源参数设置如下：鞘气和辅助气流速分别为35和5个单位。I喷雾电压和毛细管电压分别为4.5kV和49V；毛细管温度为350℃；离子传输管电压设为100V.

6)数据处理

原始数据导入软件Seive进行峰匹配，参数设置如下:m/z窗口设为10ppm；保留时间窗口为1min；最大的峰个数设为1000；最小峰强度阈为1000.其他参数为默认值。在上述自动峰匹配中，同时对目标氨基酸进行靶向提取。靶向提取时峰的起止时间设为保留时间减加0.5min.所得的化合物色谱峰面积导出至Excel中用于后续分析。

6.1氨基和酚羟基化合物的丹酰化

取两份浓度为5μg/mL氨基酸标准品混合物，分别用⁶d-丹磺酰氯和丹磺酰氯标记，将氘代和非氘代丹磺酰氯标记的氨基酸混合物等量混合后进样分析。成对峰的质量差值为6.036Da,保留时间差异为6-10s,图2显示了苏氨酸(Thr)的成对峰。化合物的⁶d-标记形式比其丹磺酰氯标记形式在液相上早洗脱出来，核对MS模式可以确认丹酰化反应的发生。类似地，对细胞提取物作了同样处理，以辅助鉴定胞内含氨基或酚羟基的代谢物。除20种常见氨基酸外，在96孔板培养的细胞提取物中初步鉴定了31种含氨基或酚羟基的代谢物(表1)。

对衍生化方法和LC-MS分析进行线性、日内精密度和日间精密度考察：对氨基酸标准品混合物的线性稀释溶液丹酰化后进行液相色谱-质谱分析。衍生化方法线性考察结果如下：19个氨基酸混标衍生的线性回归系数为0.983-0.998，线性范围在3-4个数量级(表2)。

对浓度为500ng/mL的标准品混合物，作丹酰化及LC-MS分析的日内精密度(n＝6)和日间精密度(n＝6*3)考察。日内精密度结果为：18个氨基酸(leu和Ile在色谱上未分离，合并计算)的RSD范围为1.6％-10.1％，Lys的RSD较大为21.6％，19个氨基酸平均RSD为5.1％。日间精密度结果：18个氨基酸的RSD为7.1％-18.5％，Tyr的RSD为28.6％，19个氨基酸平均RSD为11.9％。

6.2高通量细胞预处理方法

在4)，5)中稳健的丹酰化及LC-MS分析基础上，我们对96孔板培养细胞的高通量预处理方法，即4℃下静置提取法，进行了评价，包括提取效率的比较和重复性考察。为了评价该方法的提取效率，分别利用4℃下静置提取方法和冻融-超声提取方法对平行接种于两块96孔板中的HepG2细胞(n＝12)进行胞内氨基酸提取。

具体方法如下：分别在两块96孔板上平行接种HepG2细胞。对第一块96孔板中生长的细胞(接种方法及培养条件与同1)中所述)先用200μL冰冷PBS洗三次，迅速加入50μL21：79(v/v)，甲醇/水(4℃)对细胞进行代谢淬灭。然后，迅速加入50μL80％的甲醇水溶液，4℃下静置提取30min.第二块孔板中的细胞用冻融-超声法提取，即先用200μL冰冷PBS洗板三次，加入50μL体积比为21：79的甲醇/水(4℃)进行代谢淬灭，于-80℃及室温下反复冻融三次(每个冻融循环为-80℃下冷冻10min,随即室温溶解10min)，再加入50μL80％的甲醇/水，继续在冰水浴中超声提取30min(n＝12)。两种方法的氨基酸响应和代谢组总峰面积无显著差异(图3)，说明二者具有相同的提取效率。而在此同等提取效率下，我们提出的4℃静置提取方法更为简便易行。因此推荐用体积比为1:1，甲醇/水(4℃)进行一步淬灭和提取。6个复孔中的HepG2细胞衍生溶液中三个同位素内标Ala-d4,Val-d8和Trp-d5，相对标准偏差为:4.4％,3.4％和3.0％。证明了该预处理方法具有很好的重复性。

6.3方法分析特性的评价

进一步对96孔板接种的HepG2细胞的淬灭、提取、衍生化和LC-MS分析全过程的分析精度和回收率进行整体考察。为评价整个分析过程，包括96孔板细胞接种、生长、细胞预处理、丹酰化过程和LC-MS分析的精度，在6个复孔中评价了批内变异系数。为评价提取的回收率，在提取前，各取10μL浓度分别为0.5,5和50μg/mL同位素标记的氨基酸混合物(Ala-d⁴,Val-d⁸和Trp-d⁵)加入至100μL不含同位素内标的提取液中(体积比为1:1的甲醇/水直接用于淬灭和提取)(n＝4)；在提取后，将5μL上述同位素标记的氨基酸混合物加入至细胞提取物的上清中。低(0.05μg/mL)、中(0.5μg/mL)和高浓度(5μg/mL)下测定三个氨基酸的回收率。除特殊说明外，各步骤中的具体实验方法参见实施例1中1)、2)、4)、5)和6)。

整个过程的分析精度为在19个检测到的胞内氨基酸中，有14个氨基酸RSD<10％，2个氨基酸RSD为10％-20％,Gln,Arg和Lys的RSD分别为20.6％,23.5％和33.2％。低(0.05μg/mL)、中(0.5μg/mL)和高浓度(5μg/mL)下三个氨基酸的回收率分别为：102.2-106.3％,89.7-95.7％和97.2-99.0％。

表1从96孔板培养细胞的胞内代谢物中鉴定出的其他31个含氨基或酚羟基的化合物。

^a鉴定结果用化学标准品验证过的化合物。

表2丹酰化衍生氨基酸的线性响应和精密度。

实施例2

脂肪酸干预的HepG2细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析：

1)HepG2细胞培养和脂肪酸干预

在175cm²的细胞培养瓶中贴壁培养HepG2细胞：给予10％FBS的DMEM高糖培养基，并在37℃，5％CO2的恒定条件下令细胞汇合生长至60-70％。

用胰蛋白酶消化细胞，细胞重悬于10％FBS的DMEM培养基中。进行细胞计数，制备密度为2×10⁴细胞/毫升的细胞悬液用于接种96孔板。

在96孔板中，每孔接种100μL上述HepG2细胞悬液(悬浮液用10％FBS的DMEM培养基配置而成)，并保持在37℃及5％CO2的条件下培养24h。

细胞生长24h后，对其进行脂肪酸干预。施加的脂肪酸为棕榈酸(PA,C16:0)，棕榈油酸(POA,C16:1)及二者联合。脂肪酸干预的方法如下：PA首先在70℃下用乙醇溶解，然后加入至5％BSA中，终浓度为2mM，超声1min,在55℃下孵育30min.POA首先用乙醇稀释，然后加入至5％BSA中，终浓度为1.2mM,在42℃下孵育15min.将上述脂肪酸-BSA溶液用0.22μM无菌滤膜过滤，再用10％FBS-DMEM培养基稀释。细胞分别暴露于终浓度为100μM和60μM的PA和POA及二者联合溶液。对照组细胞培养基中乙醇浓度为0.005％.

2)基于96孔板的细胞预处理

2.1细胞淬灭和胞内代谢物提取

脂肪酸干预48h后，96孔板每一孔中生长的细胞先用200μL冰冷PBS洗三次，迅速加入50μL21：79(v/v)，甲醇/水(4℃)对细胞进行代谢淬灭。再迅速加入50μL80％的甲醇水溶液，其中含浓度为0.5μg/mL同位素内标Ala-d⁴,Val-d⁸和Trp-d⁵，4℃下静置提取30min.将提取混合物离心后，取50μL上层清液用于衍生。

2.2提取液衍生化

衍生反应中，先向50μL提取物中加入等体积的0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，再加入50μL,5mg/mL丹磺酰氯后，将溶液充分涡旋混合。混合物在60℃,160rpm条件下反应1小时后，加入30μL,0.5M丁胺水溶液，相同条件下反应半小时以终止丹酰化反应。在13,000rpm下离心10min,上清即可用于LC-MS分析。

3)LC-MS分析

色谱分离采用5cmHSST3柱(2.1mm内径,1.7μm粒径)(Waters,Milford,MA)，同时使用C8预柱(Waters,Milford,MA)进行柱保护。进样量为5μL.柱温设定为50℃.流动相A为0.1％甲酸/水(v/v)，流动相B为纯乙腈。液相洗脱梯度为：0-1min,2％B；1-2min线性升至20％B,维持0.5min；在5min和6min，相继升至55％B和60％B,8min处升至100％B并维持1min.单次样品运行时间为12min,其中包括预平衡的3min.流动相流速为0.3mL/min.

MS在正离子模式下进行信号采集，质荷比扫描范围为200-1000道尔顿(Da)。质谱分辨率设为15K。离子源参数设置如下：鞘气和辅助气流速分别为35和5个单位。I喷雾电压和毛细管电压分别为4.5kV和49V；毛细管温度为350℃；离子传输管电压设为100V.

4)数据处理

原始数据导入软件Seive进行峰匹配，参数设置如下:m/z窗口设为10ppm；保留时间窗口为1min；最大的峰个数设为1000；最小峰强度阈为1000.其他参数为默认值。在上述自动峰匹配中，同时对目标氨基酸进行靶向提取。靶向提取时峰的起止时间设为保留时间减加0.5min.氨基酸校正至相应样本的总峰面积后进行后续的统计分析。氨基酸代谢轮廓比较采用主成分分析(PCA)。显著性分析采用Student’st检验。

通过主成分分析(图4)，发现PA干预组与对照组在氨基酸代谢轮廓上无明显区分，POA和PA-POA干预组具有相似的氨基酸代谢轮廓，且远离对照组。这表明在稍高于生理浓度的脂肪酸干预下，氨基酸池对POA干预更为敏感。与对照组比，POA与PA-POA联合干预组的胞内Asp,Gln,Glu,Ser,Ala,Pro,Lys,Arg和Thr显著降低，仅Asn含量有所增高(表3)。PA干预组胞内氨基酸与对照组无显著差异，可能是由于PA浓度稍高于10％FBS-DMEM培养基中PA的浓度，不足以引起氨基酸代谢的扰动。

表3棕榈油酸及联合干预组中与对照组具有显著差异的氨基酸

本发明公开的胞内代谢轮廓高通量分析方法具有简便快速，灵敏度高且重复性好的特点，适合于96孔板内培养的细胞以及收获量少的细胞的代谢组高通量分析，如药物的大规模筛选、评价以及干细胞研究等。

Claims (10)

1.细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法，所述方法包括：

(a)取洗去培养基的细胞，利用冷甲醇水溶液对细胞进行代谢淬灭和低温静置提取，离心或过滤，得细胞胞内代谢物提取液；

(b)采用丹磺酰氯作为衍生化试剂，对提取液中含氨基及酚羟基代谢物进行衍生，终止衍生后，离心或过滤，收集衍生后的溶液；

(c)采用液相色谱-质谱联用的方法，在正离子模式下对衍生后溶液中的细胞胞内代谢物进行检测。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(c)采用高效液相色谱-质谱法进行代谢轮廓分析；

以PBS清洗去除培养基后的细胞，得洗去培养基的细胞；PBS为预冷至0-4℃的PBS缓冲盐溶液。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：冷甲醇水溶液为预冷至0-4℃，体积含量30-60％甲醇的水溶液，甲醇的水溶液中还含有同位素内标，同位素内标分别为浓度0.1-2.5μg/mL的Ala-d⁴、Val-d⁸和Trp-d⁵；

采用冷甲醇水溶液对细胞淬灭后，进行低温静置代谢物提取，提取条件为：细胞淬灭后的混合液静置于0-4℃环境下30-60分钟。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：用于细胞代谢物衍生的试剂包括：缓冲盐溶液，衍生化试剂以及终止衍生化反应试剂；终止衍生后，离心或过滤，收集衍生后的溶液；

所述缓冲盐溶液指的是0.1-0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲盐溶液；

采用0.5-5mg/mL丹磺酰氯的乙腈溶液作为衍生化试剂；

缓冲盐溶液、衍生化试剂和提取液的体积比为1:1:1，衍生化反应温度为50-70℃,反应时间为40-60min。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于：

以d⁶-丹磺酰氯作为参照衍生化试剂，进行辅助鉴定；用于细胞代谢物辅助衍生的试剂包括：缓冲盐溶液，参照衍生化试剂以及终止衍生化反应试剂；终止衍生后，离心或过滤，收集辅助衍生后的溶液；

所述缓冲盐溶液指的是0.1-0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲盐溶液；

即采用0.5-5mg/mLd⁶-丹磺酰氯的乙腈溶液作为辅助衍生化试剂，对提取液中含氨基及酚羟基代谢物进行辅助衍生化；

缓冲盐溶液、附助衍生化试剂与提取液的体积比为1:1:1，衍生化反应温度为50-70℃,反应时间为40-60min。

6.根据权利要求1、3或4所述方法，其特征在于：所述终止衍生化反应试剂指的是50-500μM丁胺水溶液，于每150μL衍生体系或辅助衍生体系中终止衍生化反应试剂加入量为20-40μL。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于：辅助鉴定时，将辅助衍生后的溶液与衍生后的溶液按等体积混合后再进行步骤(c)的检测分析过程。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

所测标本为细胞，步骤(a)所取细胞数量在10³-10⁴之间。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：经衍生的含氨基及酚羟基代谢物，在正离子模式下，形成质荷比为M(分子量)+234.059，M+307.148。

10.根据权利要求1或8所述方法，其特征在于：所测标本为96孔板培养的细胞，96孔板每一孔中培养的细胞为一个独立的分析样本。