CN107014939B - 离子排斥-离子交换柱切换联用测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法 - Google Patents

离子排斥-离子交换柱切换联用测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种离子排斥‑离子交换柱切换联用法测定尿液中的γ‑羟基丁酸的方法，首先，通过离子排斥法将尿液中强阴离子与γ‑羟基丁酸分离；然后，通过柱切换离子交换法将γ‑羟基丁酸与七氟丁酸分离。通过离子排斥‑离子交换柱切换联用法实现了尿液中γ‑羟基丁酸的快速和准确检测；与现有气质联用方法相比，该离子色谱法无需尿液的酯化前处理、可以直接上样，方法具有快速、操作简单、灵敏度高的优点。

Description

离子排斥-离子交换柱切换联用测定尿液中的γ-羟基丁酸的 方法
技术领域
本发明涉及一种离子排斥-离子交换柱切换联用法测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法。
背景技术
γ-羟基丁酸又称4-羟基丁酸(4-Hydroxybutanoic acid)，或GHB，是一种中枢神经抑制剂，具有强的镇静和健忘效果而受到不法人群的青睐，滥用现象越来越严重，如用作迷奸等，带来严重的社会问题。因此，在许多国家γ-羟基丁酸被认定为毒品。历史上，γ-羟基丁酸曾被用作常用镇静剂，用于治疗失眠、抑郁症、发作性嗜睡病和酗酒，也被用于提高运动员成绩；在实际使用中，通常使用γ-羟基丁酸的钾盐或钠盐。γ-羟基丁酸，是一种在中枢神经系统中发现的天然物质，亦存在于葡萄酒、牛肉、柑橘属水果中，也少量存在于几乎所有动物体内。γ-丁内酯(GBL)和1,4-丁二醇(1,4-BD)是GHB的前体，被看作摄取后转化为GHB的相关物质；GBL在酶催化条件下或是增高pH的情况下，很快转化为GHB；1,4-BD在人体内很快代谢为GHB，在国外GBL和1，4-BD的滥用比较严重；GBL和1,4-BD在摄入人体内后会很快转化为GHB，因此在人体内可以仅考虑GHB的含量。同时，γ-羟基丁酸可在人体细胞内合成，结构上与酮体β-羟基丁酸酯相似；γ-羟基丁酸可在哺乳动物大脑内自然合成，并发挥神经递质的作用，琥珀酸半醛脱氢酶缺乏症可造成GHB在血液中累积，造成麻醉效果；γ-羟基丁酸也可由发酵产生，因此也存在于一些啤酒或葡萄酒中。
γ-羟基丁酸分子量小，具有羟基和羧基两个极性较大的基团，因此其具有较强的极性和水溶性。目前，气相色谱法(GC)、气相-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱法(LC)、液相-质谱联用法(LC-MS)、傅立叶红外光谱法(FTIR)和毛细管电泳法(CE)已经用于GHB的检测，但都首先需要液液萃取和固相萃取等前处理方法将其从检材中提取出来。γ-羟基丁酸是一种内生性生物物质，据统计，内生GHB在尿液中的含量小于10mg L-1，全血和血浆中含量小于4mg L-1；对于GHB服用者，相应尿液和血液中的含量可增长到10-1000倍；由于GHB在人体内代谢速度快，服用后8-12h内，相应体液中的含量就可降至内生浓度水平。值得注意的是GHB酸尿症病人的血清和尿液的内源性GHB浓度分别可高达100mg L-1和250mg L-1。
γ-羟基丁酸是一种低分子量的有机弱酸，可以采用离子色谱法进行分离检测。在生物样品如血液、尿液、头发和组织等中，尿液是最具有价值的样本。现有的GC、GC-MS、LC、LC-MS法都需要对尿液进行前处理，首先GHB在强酸条件下进行酯化反应生成GBL然后再用有机溶剂将其提取出来进行仪器测试。
发明内容
本发明针对现有测定尿液中γ-羟基丁酸的GC、GC-MS、LC、LC-MS法都需要对尿液进行前处理(GHB在强酸条件下进行酯化反应生成GBL然后再用有机溶剂将其提取出来进行仪器测试)，操作复杂、繁琐，回收率低的缺点；开发一种离子排斥-离子交换柱切换法来直接测定尿液中的γ-羟基丁酸，尿液无需酯化可以直接进行离子色谱检测。离子排斥法可以直接实现γ-羟基丁酸的分离检测，但是该方法检测灵敏度低；离子交换测定尿液中的γ-羟基丁酸受基质影响较大，但通过与离子排斥法联用柱切换可以提高γ-羟基丁酸测定的灵敏度，进而满足尿液中γ-羟基丁酸检测要求。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种离子排斥-离子交换柱切换联用法测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，它如图1所示，它包括如下步骤：
步骤1、进样：尿样首先进入离子排斥色谱柱，所述的离子排斥色谱柱采用ICE AS-6色谱柱，进行离子分离，γ-羟基丁酸被保留在离子排斥色谱柱上，如图1a所示；
步骤2、洗脱和进样：洗脱液采用0.1-0.6mM的七氟丁酸，洗脱温度为15-25℃，使γ-羟基丁酸和其它阴离子分离，洗脱下的γ-羟基丁酸和七氟丁酸进入离子交换柱，如图1b所示；
步骤3、分离和检测：所述的离子交换柱采用AS11-HC色谱柱，洗脱液为1.0-3.0mmol/L的NaOH溶液，洗脱温度为15-25℃，采用抑制电导检测，电导抑制液为5mM四甲基氢氧化铵，如图1c所示。
上述的测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，步骤2所述的洗脱液七氟丁酸溶液的流速为1.0-2.0mL/min。
上述的测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，离子交换体系的柱切换时间为16-20min，样品收集环体积为0.8-1.5mL。
上述的测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，步骤3所述的洗脱液NaOH溶液的流速为0.6-2.0mL/min。
上述的测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，检出限为0.08mg L-1(取3倍信噪比)，定量限为0.2mg L-1(取10倍信噪比)，通过计算，尿液中γ-羟基丁酸在0.5-100mg L-1范围内显示良好的线性，线性相关系数(R2)大于0.999。
本发明具有如下优点：
本发明首次建立离子色谱法检测γ-羟基丁酸，实现了尿液的直接进样、无需进行酯化萃取前处理，极大地简化了操作步骤。
本发明提供的离子排斥-离子交换柱切换方法分离效果可以通过改变流动相组成、流速、温度和柱切换时间等进行控制。
本发明提供的离子色谱方法简单可靠，可重复性强。
本发明提出的离子色谱法对测定尿液中的γ-羟基丁酸具有广阔的应用前景和实际应用意义。
附图说明
图1是离子排斥-离子交换切换体系示意图(a)上样，(b)离子排斥分离和离子交换样品收集，(c)离子交换分离；其中：1为第一淋洗液；2为第一泵；3为第一六通阀；4为第一定量环；5为阴离子交换柱；6为阴离子交换抑制器；7为第一电导检测器；8为第二淋洗液；9为第二泵；10为第二六通阀；11为第二定量环；12为离子排斥柱；13为离子排斥抑制器；14为第二电导检测器；15为样品；16为废液；
图2是尿液的离子排斥分离色谱图(a)尿液和(b)尿液加标，淋洗液:0.2mmol/L-1七氟丁酸；抑制电导检测，峰:1,γ-羟基丁酸；
图3是柱切换后离子交换分离色谱图(a)尿液和(b)尿液加标，淋洗液:1.0mmol/L-1氢氧化钠；抑制电导检测，峰:1,γ-羟基丁酸；2,七氟丁酸；
具体实施方式
本发明提供一种尿液中γ-羟基丁酸的离子色谱分析方法，包括离子排斥和离子交换柱切换。具体技术方案如下：
a.采用离子排斥法将γ-羟基丁酸与尿液中的其他阴离子进行分离；
以七氟丁酸为淋洗液、四甲基氢氧化铵五水合物水溶液抑制电导检测、ICE-AS b色谱柱为分离柱，在适当的流速、温度条件下实现γ-羟基丁酸的分离；
b.采用离子交换法将γ-羟基丁酸与七氟丁酸进行分离；
将分离出的γ-羟基丁酸通过离子交换法，在AS11-HC等阴离子交换色谱柱上实现γ-羟基丁酸与七氟丁酸的分离；
本发明提供的尿液中γ-羟基丁酸的离子色谱分析方法，是以离子排斥和离子交换联用为基础来实现尿液中γ-羟基丁酸的快速、有效检测。
下面结合附图，通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步地详细说明：
实施例1：尿液中γ-羟基丁酸的离子色谱法分析检测步骤为：
1、将待测尿液通过尼龙滤头除去其中的固体颗粒；尿液采样后加入1％的氟化钠，在冰箱中4℃条件下保存，24h内进行分析；取志愿者(男，30岁)尿液10mL于15mL离心管中，加入2mL乙腈，涡旋震荡3min；放入离心机在7830rpm条件下离心10min；取上清液，氮吹法除掉乙腈；然后用0.22μm尼龙水系膜过滤除去固体颗粒后直接进样。
2、先通过离子排斥法将γ-羟基丁酸与尿液中的其他阴离子分离，淋洗液为0.2mM的七氟丁酸；抑制电导检测(四甲基氢氧化铵五水合物水溶液进行抑制)，体系温度为19℃，流速1.0mL/min(如图2)；
3、通过柱切换离子交换法将γ-羟基丁酸与七氟丁酸分离，淋洗液为1mM的氢氧化钠；抑制电导检测，体系温度为19℃，流速1.0mL/min(如图3)。
4、通过在尿液中加入0.1-500mg L-1γ-羟基丁酸标准溶液对建立的离子排斥-离子交换柱切换法的检测限、定量限和线性进行了评价。通过γ-羟基丁酸峰面积(y)和溶液浓度(x,mg L-1)建立线性回归方程，每个浓度的峰面积数值取五次测定的平均值，计算得到γ-羟基丁酸在0.5-100mg L-1范围内显示良好的线性，线性相关系数(R2)大于0.999；同时，该方法的检出限为0.08mg L-1(取3倍信噪比)，方法的定量限为0.2mg L-1(取10倍信噪比)。
实施例2：参照实施例1的方法和步骤
1、将待测尿液通过尼龙滤头除去其中的固体颗粒；
2、先通过离子排斥法将γ-羟基丁酸与尿液中的其他阴离子分离，淋洗液为0.1mM的七氟丁酸；抑制电导检测(四甲基氢氧化铵五水合物水溶液进行抑制)，体系温度为15℃，流速1.5mL/min；
3、通过柱切换离子交换法将γ-羟基丁酸与七氟丁酸分离，淋洗液为1mM的氢氧化钠；抑制电导检测，体系温度为15℃，流速1.5mL/min；
4、结果与实施例1相一致。
实施例3：参照实施例1的方法和步骤
1、将待测尿液通过尼龙滤头除去其中的固体颗粒；
2、先通过离子排斥法将γ-羟基丁酸与尿液中的其他阴离子分离，淋洗液为0.4mM的七氟丁酸；抑制电导检测(四甲基氢氧化铵五水合物水溶液进行抑制)，体系温度为15℃，流速2.0mL/min；
3、通过柱切换离子交换法将γ-羟基丁酸与七氟丁酸分离，淋洗液为1.0mM的氢氧化钠；抑制电导检测，体系温度为15℃，流速2.0mL/min；
4、结果与实施例1相一致。
实施例4：参照实施例1的方法和步骤
1、将待测尿液通过尼龙滤头除去其中的固体颗粒；
2、先通过离子排斥法将γ-羟基丁酸与尿液中的其他阴离子分离，淋洗液为0.6mM的七氟丁酸；抑制电导检测(四甲基氢氧化铵五水合物水溶液进行抑制)，体系温度为25℃，流速1.0mL/min；
3、通过柱切换离子交换法将γ-羟基丁酸与七氟丁酸分离，淋洗液为1.0mM的氢氧化钠；抑制电导检测，体系温度为25℃，流速1.0mL/min；
4、结果与实施例1相一致。
以上列举的仅是本发明的部分具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种离子排斥-离子交换柱切换联用法测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，其特征是它包括如下步骤：
步骤1、进样：尿样首先进入离子排斥色谱柱，所述的离子排斥色谱柱采用ICE AS-6色谱柱，进行离子分离，γ-羟基丁酸被保留在离子排斥色谱柱上；
步骤2、洗脱和进样：洗脱液采用0.1-0.6mM的七氟丁酸，洗脱温度为15-25℃，使γ-羟基丁酸和其它阴离子分离，洗脱下的γ-羟基丁酸和七氟丁酸进入离子交换柱；
步骤3、分离和检测：所述的离子交换柱采用AS11-HC色谱柱，洗脱液为1.0-3.0mmol/L的NaOH溶液，洗脱温度为15-25℃，使γ-羟基丁酸与七氟丁酸阴离子分离，最后采用抑制电导检测，电导抑制液为5mM四甲基氢氧化铵。
2.根据权利要求1所述的测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，其特征是：步骤2所述的洗脱液七氟丁酸溶液的流速为1.0-2.0mL/min。
3.根据权利要求1所述的测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，其特征是：离子交换体系的柱切换时间为16-20min，样品收集环体积为0.8-1.5mL。
4.根据权利要求1所述的测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，其特征是：步骤3所述的洗脱液NaOH溶液的流速为0.6-2.0mL/min。
5.根据权利要求1所述的测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法，其特征是：检出限为0.08mg L-1，定量限为0.2mg L-1，尿液中含γ-羟基丁酸在0.5-100mg L-1。
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