CN110068618B - 一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法 - Google Patents

一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法，涉及分析化学在临床医学研究中的应用。具体步骤为，取血清样本，加入甲醇，涡旋提取代谢物，取上清冻干后用少体积甲醇水溶液复溶，经液相色谱三重四级杆质谱联用仪检测分析。本发明的检测方法简便快捷，重复性好，灵敏度高，能够准确对血清中与肾病相关的肠道菌群代谢物进行定量，可以为肾病发生发展与肠道菌群代谢物的变化研究提供帮助。

Description

一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法
技术领域
本发明涉及临床医学与分析化学领域，具体涉及一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法，利用简便、快捷的前处理方法及液相色谱-三重四级杆质谱串联的检测技术对与肾病相关的肠道菌群代谢物进行定量的检测方法。
背景技术
人类肠道微生物通过与宿主细胞共同代谢，参与宿主细胞的各项生命活动，具有多种重要病理生理意义。通过研究肠道菌群代谢物的变化来研究疾病发生发展与菌群代谢的关系，以期找到疾病的治疗靶点成为现代科学研究的热点之一。肾脏是人体的重要器官，负责过滤血液中的杂质、维持体液和电解质的平衡。肾脏疾病是世界范围内的公共健康问题，发病率高，治愈难。对肾病的研究具有重要的生理意义及病理意义。有关报道称三甲胺N-氧化物、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、硫酸吲哚酚，马尿酸，对甲酚硫酸盐是肾病代谢紊乱的标志物。选择以上几种与肾病代谢紊乱相关的代谢物，建立简便稳定的方法，可以为糖尿病肾病研究提供技术支撑。
近年来发展的液相色谱三重四级杆质谱联用技术，综合了液相色谱的分离能力，三重四级杆质谱的高选择性、优质的检测灵敏度、稳定的定量重现性，是靶向分析中权威的分析仪器。不同文献中关于这几种代谢物的检测方法多是基于液相色谱质谱联用仪器。报道中对马尿酸、硫酸吲哚酚、对甲酚硫酸盐的液相分离采用C18色谱柱分离，但是三甲胺N-氧化物在此分析条件下没有保留。对三甲胺N-氧化物的分离采用亲水色谱柱，可是亲水色谱柱对其他代谢物检测的峰型又不尽如人意。文章中报道的对马尿酸、硫酸吲哚酚、对甲酚硫酸盐的质谱检测采用负离子模式，三甲胺N-氧化物、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸采用正离子模式。同时分离分析这几种代谢物，需要兼顾代谢物不同的极性，质谱电离模式等影响因素。迄今为止，尚未见到同时检测这几种代谢物的方法。
发明内容
本发明针对现有的与肾病相关的肠道菌群代谢物检测方法不足，提出了利用五氟苯基色谱柱分离代谢物，采用三重四级杆质谱正负离子同时检测的模式，与三重四级杆质谱优越的定量性能相结合，适用于与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测。该方法可以排除其他物质对被测代谢物的干扰，灵敏度高，重现性好，实现了同时对三甲胺N-氧化物、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、硫酸吲哚酚，马尿酸，对甲酚硫酸盐的分离分析。
本发明的技术方案如下：
(1)取血清样本50μL，加入200μL含内标提取剂甲醇，该甲醇中溶解有浓度为0.25μg/mL左旋肉碱-d3及1μg/mL马尿酸-d5作为内标，涡旋30s，离心机转速设置为14000rpm，在4℃下离心15min，吸取180μL上清液冻干；内标左旋肉碱-d3用于校正与其极性相似的三甲胺N-氧化物，马尿酸-d5用于校正其余代谢物，以保证整个检测过程的准确性。
(2)向冻干物中加入50μL含10％甲醇水溶液复溶，离心，转速为14000rpm，温度为4℃，时间为10min，取全部上清液后利用液相色谱质谱联用仪分析。
液相色谱分离条件为：液相分离各代谢物通过五氟苯基色谱柱，规格为150mm×2.1mm×3μm，流速0.25mL/min，柱温40℃，为了检测低含量的苯乙酰甘氨酸及肉桂酰甘氨酸，进样量为5μL，其余代谢物的检测，进样量为0.1μL；流动相A相为水溶液，B相为乙腈溶液，分别含有0.1％体积甲酸。采用梯度洗脱，起始流动相为0％B相，维持2min，在3min内线性升高到25％B，接着在6min内继续升高到35％B，然后在4min内继续升高到95％B，维持3min，在0.1min内恢复到0％B，平衡4min。
质谱检测条件为：质谱检测器为三重四级杆，电喷雾源作为离子源，源接口电压4.0kV，雾化气为氮气，流速3L/min，干燥气同为氮气，流速为10L/min，加热气为空气，10L/min，碰撞气为氩气，压力为270KPa，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度400℃，多反应监测模式采集参数为：三甲胺N-氧化物离子对76>58.15，碰撞能-22V，N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺离子对265.1>129.95，碰撞能-14V，马尿酸离子对180.1>105.05，碰撞能-13V，苯乙酰甘氨酸离子对194.1>91.05，碰撞能-26V，肉桂酰甘氨酸离子对206.1>131.05，碰撞能-11V，硫酸吲哚酚离子对212>79.9，碰撞能20V，对甲酚硫酸盐离子对187>106.95，碰撞能20V，左旋肉碱-d3离子对165.1>85.15，碰撞能-21V及马尿酸-d5离子对185.2>110.2，碰撞能-13V，其中三甲胺N-氧化物，N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺，马尿酸，苯乙酰甘氨酸，肉桂酰甘氨酸采用正离子模式采集，硫酸吲哚酚与对甲酚硫酸盐采用负离子模式。
本方法综合了分析化学中的利用有机溶剂沉淀蛋白并提取目标化合物，利用五氟苯基色谱柱将各代谢物分离，三重四级杆串联质谱正负离子同时采集的多反应检测技术，可以同时对三甲胺N-氧化物、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、硫酸吲哚酚，马尿酸，对甲酚硫酸盐进行定量检测。由于在各代谢物的最佳色谱质谱条件下检测，其检测限在0.1ng/mL-0.6ng/mL；将代谢物标准品配置成各浓度点，以浓度为横坐标，各浓度点对应的仪器响应与内标响应的比值做为纵坐标，线性相关系数R2>0.99。文献中只有关于这几种代谢物的分别报道，分析三甲胺N-氧化物、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、硫酸吲哚酚，马尿酸，对甲酚硫酸盐需要应用亲水色谱柱和反相色谱柱两类色谱柱，且需要分析完正离子模式再切换到负离子模式分析。本方法能够利用一根色谱柱对各代谢物同时进行检测，缩短了分析时间，该方法操作简便，灵敏度高，重复性好，能够准确对血清中与肾病相关的肠道菌群代谢物进行定量，可以为肾病发生发展与肠道菌群代谢物的变化研究提供帮助。
附图说明
图1为实施例1各代谢物的标准样品谱图；
图2为实施例2各代谢物在血清样品中检出的谱图。
具体实施方式
实施例一与肾病相关的肠道菌群代谢物检测方法的评价
吸取各代谢物标准样品配制成标准混合样品，其中三甲胺N-氧化物5μg/mL、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺0.5μg/mL、马尿酸5μg/mL，苯乙酰甘氨酸5μg/mL、肉桂酰甘氨酸5μg/mL、硫酸吲哚酚0.5μg/mL，对甲酚硫酸盐50μg/mL，用体积浓度为10％甲醇稀释配置成6个浓度标品，稀释倍数分别为5倍、10倍、50倍、100倍、500倍。分别取50μL不同浓度标品加入200μL含内标甲醇提取剂，其内标浓度为0.25μg/mL左旋肉碱-d3及1μg/mL马尿酸-d5，涡旋30s，离心14000rpm，4℃，15min，吸取上清液180μL冻干，然后用体积浓度10％甲醇复溶，进行液相色谱质谱仪分析检测。以各代谢物的浓度为横坐标，及各浓度点对应的仪器响应与内标响应的比值做为纵坐标绘制标准曲线，其线性相关系数R2在0.994-1之间(表1)，满足分析要求。
表1各代谢物的检测限，定量限，线性范围及相关系数
Figure BDA0001556400220000031
实施例二、糖尿病肾病与健康人中肠道菌群代谢物血清水平比较
取50μL健康人及50μL糖尿病肾病患者血清样本，分别加入200μL含内标0.25μg/mL左旋肉碱-d3及1μg/mL马尿酸-d5甲醇提取剂，涡旋30s，在4℃，14000rpm离心机转速下离心15min，吸取上清液180μL冻干；向冻干物中加入50μL含体积浓度10％甲醇水溶液复溶，在4℃，14000rpm离心机转速下离心10min，取全部上清液后利用液相色谱质谱联用仪分析。液相分离采用规格为150mm×2.1mm×3μm五氟苯基色谱柱，流速0.25mL/min，柱温40℃，进样体积为5μL，用以检测低含量的苯乙酰甘氨酸及肉桂酰甘氨酸，进样0.1μL，用于检测其余代谢物，流动相A，B相分别为添加有0.1％体积甲酸的水，乙腈溶液。采用梯度洗脱，起始流动相为0％B相并维持2min，在3min内线性升高到25％B，紧接着6min内升高到35％B，然后在4min内继续升高到95％B，维持3min，在0.1min内恢复到0％B，平衡4min。质谱检测器采用三重四级杆质谱仪，采用电喷雾源正负离子同时采集模式，离子源接口电压4.0kV，雾化气为流速3L/min氮气，干燥气为流速10L/min氮气，加热气为流速10L/min空气，碰撞气为压力270KPa氩气，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度400℃，三甲胺N-氧化物离子对76>58.15，碰撞能-22V，N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺离子对265.1>129.95，碰撞能-14V，马尿酸离子对180.1>105.05，碰撞能-13V，苯乙酰甘氨酸离子对194.1>91.05，碰撞能-26V，肉桂酰甘氨酸离子对206.1>131.05，碰撞能-11V，硫酸吲哚酚离子对212>79.9，碰撞能20V，对甲酚硫酸盐离子对187>106.95，碰撞能20V，左旋肉碱-d3离子对165.1>85.15，碰撞能-21V及马尿酸-d5离子对185.2>110.2，碰撞能-13V。采用内标法定量，发现这几种与肾病相关的代谢物在肾病病人血清中较正常人明显升高，可见肾病发生发展过程中肠道菌群代谢异常，该简便可靠的检测方法可以为肾病异常代谢研究提供技术手段。

Claims (7)

1.一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下流程步骤：
(1)取血清样本40-100μL，加入160-400μL提取剂甲醇，该提取剂甲醇中溶解有左旋肉碱-d3及马尿酸-d5内标，涡旋，离心吸取上清液冻干；
(2)向冻干物中加入50-100μL甲醇水溶液复溶，离心取上清液后利用液相色谱质谱联用仪分析；
步骤(2)中采用的液相色谱分离条件为：采用五氟苯基色谱柱，规格为长度150mm、内径2.1mm、粒径3μm，流速0.2-0.35mL/min，柱温35-45℃，进样体积为0.1-5μL；流动相A相为含0.1％体积甲酸的水溶液，B相为含0.1％体积甲酸的乙腈溶液，采用梯度洗脱，起始流动相为体积浓度0％B，维持2min，然后在3min内线性升高到25％B，接着在6min内继续升高到35％B，然后在4min内继续升高到95％B，维持3min，然后在0.1min内恢复到0％B，平衡4min；
步骤(2)中采用的质谱为三重四级杆串联质谱，质谱检测条件为：采用电喷雾源正负离子同时采集模式，离子源接口电压4.0kV，雾化气为氮气，流速3L/min，干燥气同为氮气，流速为10L/min，加热气为空气，10L/min，碰撞气为氩气，压力为270KPa，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度400℃，多反应监测模式采集参数为：三甲胺N-氧化物离子对76>58.15，碰撞能-22V，N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺离子对265.1>129.95，碰撞能-14V，马尿酸离子对180.1>105.05，碰撞能-13V，苯乙酰甘氨酸离子对194.1>91.05，碰撞能-26V，肉桂酰甘氨酸离子对206.1>131.05，碰撞能-11V，硫酸吲哚酚离子对212>79.9，碰撞能20V，对甲酚硫酸盐离子对187>106.95，碰撞能20V，左旋肉碱-d3离子对165.1>85.15，碰撞能-21V及马尿酸-d5离子对185.2>110.2，碰撞能-13V。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)所用提取剂甲醇中含有0.1-0.5μg/mL左旋肉碱-d3及0.5-2μg/mL马尿酸-d5作为内标。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中血清经提取、离心后，用于冻干的上清液量为血清样本量3-4倍。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)冻干物复溶所用甲醇水的量与步骤(1)中血清样本量相同，复溶剂中甲醇与水的体积比例为1:10-1:8。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：液相色谱进样体积为0.1-5μL。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：肠道菌群代谢物采用内标法定量，左旋肉碱-d3作为三甲胺N-氧化物内标，马尿酸-d5作为N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、马尿酸、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、硫酸吲哚酚、对甲酚硫酸盐六种物质内标，根据线性曲线进行定量计算与肾病相关的肠道菌群代谢物三甲胺N-氧化物、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、马尿酸、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、硫酸吲哚酚、对甲酚硫酸盐的含量。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：线性曲线的建立过程为配置各肠道菌群代谢物的浓度为0.5-50μg/mL，用体积浓度为5％-20％甲醇稀释配置成6-10个浓度标品，逐级稀释5-50000倍,其余步骤同权利要求1中血清样本处理过程。
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