CN112147344B - 动脉粥样硬化性脑梗死的代谢标志物及其在诊疗中的应用 - Google Patents

动脉粥样硬化性脑梗死的代谢标志物及其在诊疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了动脉粥样硬化性脑梗死的代谢标志物及其在诊疗中的应用，具体涉及代谢标志物SM(d18:0/24:1(15Z))。与对照相比，SM(d18:0/24:1(15Z))在动脉粥样硬化性脑梗死中的水平降低。本发明同时公开了以SM(d18:0/24:1(15Z))作为检测变量，ROC曲线具有较高的曲线下面积，提示SM(d18:0/24:1(15Z))应用于动脉粥样硬化性脑梗死的诊断具有较高的准确性。

Description

动脉粥样硬化性脑梗死的代谢标志物及其在诊疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及动脉粥样硬化性脑梗死的代谢标志物及其在早期诊断中的应用。
背景技术
脑血管疾病是绝大多数国家导致人类死亡的常见疾病，近年来在我国全死因序位明显前移。脑梗死约占所有脑血管疾病的70％-80％，是最常见的脑血管疾病。一直以来认为神经功能损伤是不可逆的，神经损伤的治疗是多种神经系统疾病治疗的共同关键，也是临床上的难题。因此，研究如何预防及早期诊断脑梗死具有重要意义。
脑梗死有很多种分型，依据局部脑组织发生缺血缺氧坏死机制的分型，最常见的一种类型是脑血栓形成，而动脉粥样硬化(AS)是脑血栓形成最常见的病因。这种病变主要累及大动脉和中动脉，它使内膜隆起，形成纤维斑块造成血管管腔狭窄、组织器官缺血，继发斑块破裂、斑块破裂则诱发血栓形成，即引起严重的临床事件—脑梗死。
代谢组学(metabonomics)是研究生物体系受刺激或扰动后其代谢产物一内源性代谢物质种类、数量及其变化规律的科学。生命机体在病证状态和各类药物作用下，亦同样会引起全身水平的内源性代谢物及代谢网络变化。运用代谢组学技术考察和分析这些代谢物的变化，对于探究病证本质，阐明药物作用机理有极大的助益。
本发明通过检测动脉粥样硬化性脑梗死患者与动脉粥样硬化患者的代谢组学，探讨代谢物时是否参与动脉粥样硬化性脑梗死发病的病理生理过程。为动脉粥样硬化性脑梗死的预防、早期诊断、病情评估提供新的靶标及理论依据。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与动脉粥样硬化性脑梗死相关的代谢标志物，通过检测代谢标志物的水平，可以判断患者是否患有动脉粥样硬化性脑梗死，从而为动脉粥样硬化性脑梗死的早期诊断提供一种新的手段。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了代谢物在制备早期诊断动脉粥样硬化性脑梗死的试剂盒中的应用，所述代谢物包括SM(d18:0/24:1(15Z))。
进一步，所述试剂盒包括检测样本中代谢物水平的试剂。
进一步，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法检测样本中代谢物含量的试剂。其中样本是生物学样本。生物来源的样本(即生物学样本)通常包含多种代谢物。待用于本发明方法的优选实验样本是来自体液，优选来自血液、血浆、血清、淋巴、汗、唾液、眼泪、精液、阴道液体、粪便、尿液或脑脊液的样本，或来自例如通过活体解剖来自细胞、组织或器官的样本。这也包括包含亚细胞区室或细胞器(如线粒体、高尔基体网络或过氧化物酶体)的样本。此外，生物学样本也包括气体样本，如生物体的挥发物。生物学样本来自如此处其他地方具体说明的受试者。用于获得上述不同类型生物学样本的技术为本领域所熟知。例如，通过血液采集获得血液样本，通过尿液采集获得尿液样本。
优选地，在上述样本用于本发明方法前将其预处理。所述预处理可包括释放或分离化合物，或去除多余物质或废物所需要的处理。合适的技术包含离心、萃取、分馏、纯化和/或富集化合物。此外，进行其他预处理以提供适合于化合物分析的形式或浓度的化合物。例如，如果气相层析偶联质谱用于本发明的方法，将需要在所述气相层析前衍生化化合物。合适并必要的预处理依赖于进行本发明方法的工具并为本领域技术人员所熟知。如前描述的预处理的样本也包含在如本发明所用的术语“样本”中。
进一步，所述样本选自血液、血清、血浆。
进一步，当受试者中的SM(d18:0/24:1(15Z))的水平下调时，受试者患有动脉粥样硬化性脑梗死或者存在患动脉粥样硬化性脑梗死的风险。
在从已知未患有动脉粥样硬化性脑梗死的受试者或群体中获得参考结果的情况下，可以基于从试验样本中获得的试验结果与上述参考结果的差异，即基于关于至少一种代谢物的定性或定量组成中的差异来诊断所述疾病或易感性。差异可以是代谢物绝对或相对量的增加(有时称作代谢物上调)或代谢物所述量的减少或无可检测的量(有时称作代谢物下调)。优选地，相对或绝对量的差异是显著的，即在45到55百分位数、40到60百分位数、30到70百分位数、20到80百分位数、10到9百分位数、5到95百分位数的参考值区间外。相对量改变的优选值(即“倍数”变化)或改变类型(即导致更高或更低相对量和/或绝对量的“上”调或“下”调)。如果指定代谢物在受试者中是“上调的”，相对和/或绝对量将增加，如果其为“下调的”，代谢物的相对和/或绝对量将减少。此外，“倍数”变化表示增加或减少的程度，例如，2倍的增加指与参考相比，所述量是代谢物量的两倍。
因此，在优选实施方案中包括来自已知患有动脉粥样硬化性脑梗死的受试者或组的参考，或已知具有其易感性的受试者或组的参考。最优选地，试验样本和所述参考的相同或相似结果(即所述至少一种代谢物相似的相对或绝对量)在该情况下指示动脉粥样硬化性脑梗死或其易感性。在本发明另一个优选实施方案中，所述参考来自已知未患有动脉粥样硬化性脑梗死的受试者或已知不具有其易感性的受试者，或者所述参考是可计算参考。
本发明提供了一种诊断动脉粥样硬化性脑梗死的试剂盒，所述试剂盒包括检测样本中代谢物SM(d18:0/24:1(15Z))水平的试剂。
进一步，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法检测样本中代谢物水平的试剂。
进一步，所述色谱法包括GC，CE，LC，HPLC和UHPLC；光谱法包括UV/Vis，IR，NIR和NMR；其中，GC＝气相色谱，CE＝毛细管电泳，LC＝液相色谱，HPLC＝高度液相色谱，UHPLC＝超高效液相色谱，UV-Vis＝紫外可见，IR＝红外，NIR＝近红外，NMR＝核磁共振。
质谱法包括例如串联质谱法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法、MALDI-TOF-TOF质谱法、MALDI四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱法、电喷射离子化(ESI)-TOF质谱法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-离子阱质谱法、ESI三重四极杆质谱法、ESI傅立叶变换质谱法(FTMS)、MALDI-FTMS、MALDI-离子阱-TOF和ESI-离子阱TOF。以其最基本的水平，质谱法涉及使分子电离和随后测量所得离子的质量。由于分子以公知的方式电离，可以精确地由离子的质量确定分子的分子量。
串联质谱法涉及首先获得所关注的离子的质谱，随后破碎该离子并获得片段的质谱。串联质谱法因此提供分子量信息和破碎谱，其可一起结合分子量信息使用以识别肽或蛋白质或小分子(低于1500道尔顿)的确切序列
本发明提供了代谢物在构建预测动脉粥样硬化性脑梗死的计算模型中的应用，所述代谢物包括SM(d18:0/24:1(15Z))。
本发明提供了一种系统，包含：
1)用于测定样本中代谢物SM(d18:0/24:1(15Z))特征值的工具；
2)比较样本中代谢物特征值的工具；
3)数据存储介质。
本发明中的数据存储介质存储数据集合，术语“数据集合”指在物理上和/或逻辑上集合的数据集合。因此，数据集合可落实到单个数据存储介质中或彼此有效连接的物理上分离的数据存储介质中。优选地，数据集合落实到数据库中。因此，如此处所用的数据库包含在合适的存储介质上的数据集合。此外，数据库优选还包含数据库管理系统。数据库管理系统优选为基于因特网的分级数据库管理系统或面对对象数据库管理系统。此外，数据库可以是联合数据库或集成数据库。更优选地，数据库将落实为分布式(联合)系统，例如Client-Server-System。更优选地，构造数据库以允许搜索算法来比较试验数据组和包含数据集合的数据组。尤其是，通过使用此类算法，可以搜索数据库(即查询搜索)得到指示动脉粥样硬化性脑梗死或其易感性的相似或相同数据组。因此，如果可以在数据集合中鉴定到相同的或相似的数据组，试验数据组将与动脉粥样硬化性脑梗死或其易感性相关。结果，从数据集合中获得的信息可以基于从受试者获得的试验数据组用于诊断动脉粥样硬化性脑梗死或其易感性。更优选地，数据集合包含上文记载的任何一组包含的所有代谢物的特征值。
术语“数据存储介质”包括基于单个物理实体如CD、CD-ROM、硬盘、光存储介质或磁盘的数据存储介质或者云盘。此外，所述术语还包括由物理分离实体组成的数据存储介质，所述物理分离实体以提供上述数据集合的方式，优选以查询搜索的合适方式彼此有效连接。
本发明中的“系统”涉及彼此有效连接的不同工具。所述工具可落实到单个装置中或可以是彼此有效连接的物理上分离的装置。用于比较代谢物特征值的工具优选基于用于比较的算法而进行运作。数据存储介质优选包含上述数据集合或数据库，其中存储数据组的每一组指示动脉粥样硬化性脑梗死或其易感性。因此，本发明的系统允许鉴定存储在数据存储介质中数据集合是否包含试验数据组。结果，本发明的系统可用作诊断动脉粥样硬化性脑梗死或其易感性的诊断工具。
在系统的优选实施方案中，包含用于测定样本代谢物特征值的工具。
术语“用于测定代谢物特征值的工具”优选涉及用于测定代谢物的如质谱分析装置、NMR装置，或进行代谢物化学或生物测定的装置。
此外，本发明涉及诊断工具，其包含用于测定选自上述提及组中任何一组的至少一种代谢物的工具。
本发明提供了代谢物在制备治疗动脉粥样硬化性脑梗死的药物组合物中的应用，所述代谢物为SM(d18:0/24:1(15Z))。
进一步，所述药物组合物包括代谢物的促进剂，促进剂是指能够使差异代谢物恢复到正常水平的物质。
术语“代谢物”是指代谢的中间产物和最终产物，(也有时称为具有小于1500道尔顿的分子量的小分子或分析物)。代谢物被分类为直接参与正常生长、发育和繁殖的初级代谢物。次级代谢物不直接参与后面的过程，但可以具有重要的生态学功能(例如，抗生素、色素)。代谢物的示例性生物学功能包括作为生物合成途径中的中间或终点产物或作为细胞信号分子。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了与动脉粥样硬化性脑梗死相关的代谢标志物-SM(d18:0/24:1(15Z))，通过检测上述代谢标志物的水平，可以判断受试者是否患有动脉粥样硬化性脑梗死以及患动脉粥样硬化性脑梗死的风险，以期实现动脉粥样硬化性脑梗死的早期的诊断，从而在动脉粥样硬化性脑梗死早期进行干预治疗，提高患者的生存质量。
附图说明
图1是OPLS-DA统计分析图，其中图A是反向色谱正离子统计分析图；图B是反向色谱负离子统计分析图；图C是亲水色谱正离子统计分析图。
图2是SM(d18:0/24:1(15Z))在不同群组中的水平图。
图3是以SM(d18:0/24:1(15Z))作为检测变量的诊断效能图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例动脉粥样硬化脑梗死相关代谢物的筛选及效能判断
1、样本收集
收集21例动脉粥样硬化脑梗死患者及21例动脉粥样硬化患者的血液样本。
动脉粥样硬化脑梗死组纳入标准：
1)受试者已签署知情同意书
2)符合《中国急性缺血性脑卒中诊疗指南(2014版)》急性脑梗死诊断标准。
3)病因分型为动脉粥样硬化型脑梗死。
4)年龄18-65周岁。
5)BMI 18.5-23.9kg/m2。
6)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。
7)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。
排除标准：
1)合并其他疾病：神经系统疾病(既往脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化系统疾病，3个月内患有急性消化系统疾病；循环系统疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿系统疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液系统疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。
2)既往有输血史、消化系统疾病手术史及外伤史。
3)心电图异常的患者。
4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药。
5)3个月内服用益生菌制剂。
6)本次发病前应用抗血小板及他汀类药物。
7)进行静脉溶栓和血管内介入治疗的患者。
8)妊娠期或哺乳期妇女。
9)本研究期间，患者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。
动脉粥样硬化组纳入标准：
1)受试者已签署知情同意书。
2)颈部血管超声和/或颈部血管影像学表现为颅内外血管动脉粥样硬化。
3)年龄18-65周岁。
4)BMI 18.5-23.9kg/m2。
5)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。
6)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。
排除标准：
1)存在其他疾病：神经系统疾病(脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化系统疾病，3个月内患有急性消化系统疾病；循环系统疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿系统疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液系统疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。
2)既往有输血史、消化系统疾病手术史及外伤史。
3)心电图异常。
4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药、抗血小板药物及他汀类药物。
5)3个月内服用益生菌制剂。
6)妊娠或哺乳期妇女。
7)本研究期间，受试者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。
2、非靶向代谢组学检测
2.1血清样本制备
2.1.1反相色谱分析血清样本处理方法
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。
2)取40μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的甲醇和1ml甲基叔丁基醚。
3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
2.1.2亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。
2)取50μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入150μl的乙腈。
3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
2.2色谱条件
色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对血清样本进行分析。
2.2.1反相色谱分离条件
色谱柱:waters UPLC HSS T3(1.8μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(乙腈/水4:6，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；
洗脱程序：见表1；
流速：0.3ml/min；
进样量为1.0μL；
柱温：50℃。
表1 C18反相色谱测定洗脱程序
Figure BDA0002752786170000091
2.2.1亲水色谱分离条件
色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(乙腈，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(水，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；
洗脱程序：见表2；
流速：0.3ml/min；
进样量：1.0μL；
柱温：40℃。
表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序
Figure BDA0002752786170000101
2.3质谱条件
质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪。正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV。毛细管加热温度320℃。翘气压力30psi，辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃。翘气和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr。一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50-1500。液质系统由Xcalibur 2.2SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作。
3、靶向代谢组学检测
3.1血清样本处理方法
1)血浆样本于4℃放置30min解冻。
2)取50μl血浆样本至1.5ml离心管中，加入150μl的甲醇(含有吲哚乙酸-D2500ppb，吲哚丙酸-D2 50ppb组成)，旋涡震荡30min。
3)12000rpm离心5min，取上清液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
3.2色谱条件
色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高压液相色谱系统，色谱分离条件如下：
色谱柱:Waters UPLC BEH C8(1.7μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(水，0.5Mm NH4F)和B(甲醇)；
洗脱梯度：见表3；
流速：0.3ml/min；
进样量：1.0μL；
柱温：45℃。
表3洗脱程序
Figure BDA0002752786170000111
3.3质谱条件
质谱分析仪器为Waters公司XEVO TQ-XS型串联四级杆质谱仪。正离子离子源电压为3kv，锥孔电压为20V。去溶剂温度550℃，源温度150℃。去溶剂气流速1000L/Hr，锥孔气流速7L/h。
3.4靶向代谢组数据处理
靶向代谢组数据峰面积计算采用masslynx定量软件，保留时间允许误差15s。浓度计算采用单点同位素内标法获取定量结果。
4、数据处理
4.1数据质控
为了评价样品采集过程中系统的稳定性和重复性，使用了质控样本。质控样本是所有样本均移取固定体积混合均匀后得到的。指控样本的前处理方法和其他样品一样。为了得到可信赖的且可重复性的代谢物，三个因素需要考虑：1)保留时间，2)信号强度，3)质量准确度。本次实验首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6-8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性。同时计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除。
4.2PCA分析
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至16和1至12min。各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征。代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配。
4.3OPLS-DA分析
为了获得在动脉粥样硬化性脑梗死组(BL)和在动脉粥样硬化组(AS)组呈现显著差异的代谢物信息，进一步采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)对两组样本进行统计分析。
采用OPLS-DA模型的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(HMDB)(比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass，误差限制0.01Da)。
4.4 ROC分析
根据代谢物的水平，绘制受试者工作特征曲线(ROC)，计算二项精确置信空间，分析差异代谢物的诊断效能。
5、结果
质控结果显示，质控样本相对聚集在一起，系统重复性较好，所采集的数据可以进行进一步的研究。
反向色谱正离子、反向色谱负离子、亲水色谱正离子的结果分别如表4和图1所示。
表4 OPLS-DA分析模型参数
Figure BDA0002752786170000131
差异分析结果显示，与动脉粥样硬化组相比，SM(d18:0/24:1(15Z))在动脉粥样硬化脑梗死组的水平显著降低(图2)。
以SM(d18:0/24:1(15Z))的含量作为检测变量判断诊断效能，结果显示，曲线下面积为0.853，截断值为151745560.550，敏感性为0.762，特异性为0.857(图3)，具有较高的敏感性和特异性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.检测样本中代谢物水平的试剂在制备早期诊断动脉粥样硬化性脑梗死的试剂盒中的应用，其特征在于，所述代谢物包括SM(d18:0/24:1(15Z))，所述样本选自血液、血清、血浆。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法检测样本中代谢物含量的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，当受试者中的SM(d18:0/24:1(15Z))的水平下调时，受试者患有动脉粥样硬化性脑梗死或者存在患动脉粥样硬化性脑梗死的风险。
4.样本中的代谢物在构建预测动脉粥样硬化性脑梗死的计算模型中的应用，其特征在于，所述代谢物包括SM(d18:0/24:1(15Z))，所述样本选自血液、血清、血浆。
5.增加血液中代谢物水平的促进剂在制备治疗动脉粥样硬化性脑梗死的药物组合物中的应用，其特征在于，所述代谢物为SM(d18:0/24:1(15Z))。
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