CN112630330B

CN112630330B - 小分子物质在脑梗死诊断中的应用

Info

Publication number: CN112630330B
Application number: CN202011444296.8A
Authority: CN
Inventors: 张祥建; 张聪; 张培培
Original assignee: Second Hospital of Hebei Medical University
Current assignee: Second Hospital of Hebei Medical University
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2040-12-08
Also published as: CN112630330A

Abstract

本发明涉及小分子物质在脑梗死诊断中的应用，具体的涉及小分子物质吲哚乙酸和PC(14:0/18:2(9Z,12Z))在脑梗死诊断中的应用，本发明通过实验证明了以吲哚乙酸和PC(14:0/18:2(9Z,12Z))作为检测指标，具有较高的区分脑梗死患者的效能。

Description

小分子物质在脑梗死诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及小分子物质在脑梗死诊断中的应用。

背景技术

脑卒中作为一种比较严重的脑血管事件，其可以导致多种神经功能障碍的症状，致残率、死亡率以及复发率也很高，是个人、家庭乃至人类社会的健康和经济负担。随着经济的飞速发展、社会的不断进步、医疗水平的日益提高以及民众健康意识的逐渐完善，尽管目前对于脑卒中患者的治疗手段取得了各种实质性的进步，但其仍然是全球成年人死亡以及获得性残疾的主要原因。脑卒中又分为缺血性脑卒中(又称为脑梗死)和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占所有脑卒中的70-80％，因此临床上对于急性缺血性脑卒中患者的准确诊断和适当管理在挽救患者的生命中至关重要。缺血性脑卒中的发病与环境、遗传以及各种危险因素之间有着密不可分的关系。由于脑梗死的高致残率、高发病率以及随着生活水平提高、饮食结构变化等因素的影响而出现的发病年龄的年轻化，所以脑梗死的早期诊断、早期干预以及降低发病率显得尤为重要。

代谢组学，是“后基因组学”时代的一门新兴学科和技术，是当今世界上生命科学研究最为活跃的领域之一。其根据研究的对象和目的不同，代谢组学可分为以下几种研究层次：(1)基于目标化合物定量的代谢物靶标分析，其是对某个或某几个特定组分的分析；(2)基于某个或某几个代谢通路中多种代谢物同时分析的代谢轮廓分析；(3)基于无歧视分析的代谢物指纹分析；(4)基于限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量的代谢组学分析。自代谢组学的概念提出以来，引起了各国科学家的极大兴趣，现已广泛应用于临床医学、药学研究、营养学、食品安全、环境科学、毒理学、植物微生物学等重要领域。研究脑梗死与代谢组学之间的相关性，对于揭示脑梗死的发病机制，实现疾病的早期诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明所述的脑梗死小分子物质是使用代谢组学谱分析技术发现的。一般来说，确定来自被诊断为患有脑梗死的人类受试者以及来自一个或多个其它组的人类受试者(例如患有健康对照受试者)的生物样品的代谢谱。将来自患有脑梗死的受试者的生物样品的代谢谱与来自一个或多个其它组的受试者的生物样品的代谢谱相比较。与另一组(例如患有健康对照受试者)相比，在来自患有脑梗死的受试者的样品的代谢谱中差异存在的分子，包括以具有统计显著性的水平差异存在的分子被鉴定为生物标志物以辨别那组。

具体地，本发明提供了如下技术方案:

本发明提供了检测样本中小分子物质的试剂在制备评估脑梗死的产品中的应用，所述小分子物质选自吲哚乙酸或PC(14:0/18:2(9Z,12Z))中的一种或两种。

进一步，所述小分子物质为吲哚乙酸和PC(14:0/18:2(9Z,12Z))的组合。

进一步，所述产品包括用于色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法检测标志物的试剂。

质谱(MS)分析主要包括液相色谱－质谱联用(LC－MS)和气相色谱－质谱联用(GC－MS)，液相色谱又分为超高效液相色谱(UPLC)和高效液相色谱(HPLC)。作为可选择的实施方式，色谱可选择与飞行时间(TOF)、静电轨道阱(Orbitrap)、离子阱飞行时间(IT－TOF)、四极杆－飞行时间(Q－TOF)等质谱联用；靶向性代谢组学的分析，色谱可与三重四极杆(QQQ)或四极杆离子阱(Q－Trap)等质谱串联，用多反应监测器(MRM)进行检测。

在确定所述样品中所述小分子物质的水平之后，将所述水平与脑梗死阳性和/或脑梗死阴性参考水平相比较以诊断或帮助诊断所述受试者是否患有脑梗死。样品中所述小分子物质的水平与脑梗死阳性参考水平相匹配(例如与参考水平相同、与参考水平基本上相同、高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值、和/或在参考水平的范围内的水平)指示了所述受试者有脑梗死的诊断。样品中所述小分子物质的水平与脑梗死阴性参考水平相匹配(例如与参考水平相同、与参考水平基本上相同、高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值、和/或在参考水平的范围内的水平)指示了所述受试者没有脑梗死的诊断。此外，与脑梗死阴性参考水平相比，所述样品中差异存在(特别是以具有统计显著性的水平)的小分子物质的水平指示了所述受试者有脑梗死的诊断。与脑梗死阳性参考水平相比，所述样品中差异存在(特别是以具有统计显著性的水平)的小分子物质的水平指示了所述受试者没有脑梗死的诊断。

可以使用各种技术将所述小分子物质的水平与脑梗死阳性和/或脑梗死阴性参考水平相比较，所述技术包括简单比较(例如手动比较)所述生物样品中所述小分子物质的水平与脑梗死阳性和/或脑梗死阴性参考水平。还可以使用一种或多种统计分析(例如t检验、韦尔奇氏T检验、Wilcoxon秩和检验、随机森林(Random Forest)、T分数、Z分数)或使用数学模型(例如算法、统计模型、混合效应模型)将所述生物样品中所述小分子物质的水平与脑梗死阳性和/或脑梗死阴性参考水平相比较。

进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。

术语“样本”或“生物样本”意指从受试者分离的生物材料。所述生物样本可以含有适用于检测所期望的生物标志物的任何生物材料，并且可以包含来自受试者的细胞材料和/或非细胞材料。所述样本可以从任何合适的生物流体中分离，所述生物流体例如像血液、血浆、血清、尿液、或脑脊髓液(CSF)。

进一步，所述样本选自血液、血浆或血清。

进一步，受试者样本中的PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))水平降低指示所述受试者患有脑梗死或存在患脑梗死的风险。

进一步，所述受试者样本选自血液、血浆或血清。

本发明提供了一种评估脑梗死的产品，所述产品包括检测样本中小分子物质吲哚乙酸，和/或PC(14:0/18:2(9Z,12Z))的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片。

进一步，所述产品通过检测来自受试者的样本中的小分子物质的水平，并与参考代谢物谱进行比较，进而指示受试者是否患有脑梗死或存在患脑梗死的风险。

作为一种可选择的实施方式，试剂盒的组分可以被包装在一个或多个容器如一个或多个小瓶中。除了代谢物标准物，试剂盒优选进一步包括用于存储的防腐剂或缓冲剂。此外，试剂盒可以包含使用说明书。

作为一种可选择的实施方式，芯片具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种代谢物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样品中吲哚乙酸，和/或PC(14:0/18:2(9Z,12Z))的含量或浓度；如上所述，在患有脑梗死的受试者的样品中发现该小分子物质的水平降低。芯片可被配置成使得仅当该代谢物的含量或浓度超过阈值时才提供可检测的输出(例如颜色变化)，所述阈值被选择或区分指示健康受试者的代谢物浓度与指示患有或易患脑梗死的代谢物的含量或浓度。因此，可检测到的输出(诸如颜色变化)的存在立即表明样品包含显著增加水平的该代谢物，表明受试者患有或易患脑梗死。

本发明提供了小分子物质在制备用于鉴定和评估药剂和/或手术治疗和/或物理治疗对抗脑梗死的效果的产品中的应用。

在本发明中，进行筛选差异的小分子物质时，所述小分子物质可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。生物标志物优选地以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10，如使用韦尔奇氏T检验(Welch's T-test)或威氏秩和检验(Wilcoxon's rank-sum Test)所确定)的水平差异地存在。

在本发明中，“代谢物”或“小分子物质”意指存在于细胞中的有机分子和无机分子。所述术语不包括大的高分子，如大的蛋白质(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的蛋白质)、大的核酸(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的核酸)、或大的多糖(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的多糖)。细胞的小分子物质一般被发现是在细胞质或其它细胞器，如线粒体中的溶液中游离的，其中它们形成可以被进一步代谢或用于产生被称作高分子的大分子的中间体池。术语“小分子物质”包括将源自于食物的能量转化成有用的形式的化学反应中的信号转导分子和中间体。小分子物质的实例包括糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、细胞过程期间形成的中间体、以及存在于细胞内的其它小分子物质。

鉴定针对脑梗死的小分子物质允许诊断(或帮助诊断)表现出与存在脑梗死相符的一个或多个症状的受试者的疾病，并且包括对先前未被鉴定为患有脑梗死的受试者进行初步诊断以及对先前针对脑梗死接受治疗的受试者的疾病的复发进行诊断。一种诊断(或帮助诊断)受试者是否患有脑梗死的方法包括：

分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中脑梗死的小分子物质的水平；以及

将所述样品中所述的小分子物质的水平与所述小分子物质的脑梗死阳性和/或脑梗死阴性参考水平相比较以诊断(或帮助诊断)所述受试者是否患有脑梗死。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与脑梗死相关的小分子物质，通过检测小分子物质的水平，可以判断受试者是否患有脑梗死以及患脑梗死的风险，以期实现脑梗死早期的诊断，从而在脑梗早期进行干预治疗，提高患者的生存质量。

附图说明

图1是各组色谱总离子流图，其中，图A是反向色谱正离子各组总离子流图，图B是反向色谱负离子各组总离子流图，图C是亲水色谱正模式各组总离子流图；图A、B、C中的上部分为脑梗死的总离子流图，下部分为健康对照的总离子流图。

图2是OPLS-DA统计分析图，其中图A是反向色谱正离子统计分析图；图B是反向色谱负离子统计分析图；图C是亲水色谱正离子统计分析图。

图3是吲哚乙酸和PC(14:0/18:2(9Z,12Z))在不同群组中的水平图，其中，图A是吲哚乙酸的水平图，图B是PC(14:0/18:2(9Z,12Z))的水平图。

图4是小分子物质的诊断效能图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例脑梗死相关代谢物的筛选及效能判断

1、样本收集

收集21例脑梗死患者及18例健康对照的血液样本。

脑梗死组纳入标准：

1)受试者已签署知情同意书

2)符合《中国急性缺血性脑卒中诊疗指南(2014版)》急性脑梗死诊断标准。

3)年龄18-65周岁。

4)BMI 18.5-23.9kg/m²。

5)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。

6)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。

排除标准：

1)合并其他疾病：神经系统疾病(既往脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化系统疾病，3个月内患有急性消化系统疾病；循环系统疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿系统疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液系统疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。

2)既往有输血史、消化系统疾病手术史及外伤史。

3)心电图异常的患者。

4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药。

5)3个月内服用益生菌制剂。

6)本次发病前应用抗血小板及他汀类药物。

7)进行静脉溶栓和血管内介入治疗的患者。

8)妊娠期或哺乳期妇女。

9)本研究期间，患者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。

健康对照组纳入标准：

1)受试者已签署知情同意书。

2)年龄18-65周岁。

3)BMI 18.5-23.9kg/m²。

4)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。

5)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。

排除标准：

1)存在其他疾病：神经系统疾病(脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化系统疾病，3个月内患有急性消化系统疾病；循环系统疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿系统疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液系统疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。

2)既往有输血史、消化系统疾病手术史及外伤史。

3)心电图异常。

4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药、抗血小板药物及他汀类药物。

5)3个月内服用益生菌制剂。

6)妊娠或哺乳期妇女。

7)本研究期间，受试者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。

2、非靶向代谢组学检测

2.1血清样本制备

2.1.1反相色谱分析血清样本处理方法

1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。

2)取40μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的甲醇和1ml甲基叔丁基醚。

3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。

2.1.2亲水色谱分析血清样本处理方法：

1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。

2)取50μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入150μl的乙腈。

2.2色谱条件

色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对血清样本进行分析。

2.2.1反相色谱分离条件

色谱柱:waters UPLC HSS T3(1.8μm 2.1mm*100mm)；

流动相:A(乙腈/水4:6，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；

洗脱程序：见表1；

流速：0.3ml/min；

进样量为1.0μL；

柱温：50℃。

表1 C18反相色谱测定洗脱程序

2.2.1亲水色谱分离条件

色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7μm 2.1mm*100mm)；

流动相:A(乙腈，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(水，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；

洗脱程序：见表2；

流速：0.3ml/min；

进样量：1.0μL；

柱温：40℃。

表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序

2.3质谱条件

质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪。正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV。毛细管加热温度320℃。翘气压力30psi，辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃。翘气和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr。一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×10⁶，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50-1500。液质系统由Xcalibur 2.2SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作。

3、靶向代谢组学检测

3.1血清样本处理方法

1)血浆样本于4℃放置30min解冻。

2)取50μl血浆样本至1.5ml离心管中，加入150μl的甲醇(含有吲哚乙酸-D2500ppb，吲哚丙酸-D2 50ppb组成)，旋涡震荡30min。

3)12000rpm离心5min，取上清液100μl，置于200μl内衬管中，待测。

3.2色谱条件

色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高压液相色谱系统，色谱分离条件如下：

色谱柱:Waters UPLC BEH C8(1.7μm 2.1mm*100mm)；

流动相:A(水，0.5Mm NH₄F)和B(甲醇)；

洗脱梯度：见表3；

流速：0.3ml/min；

进样量：1.0μL；

柱温：45℃。

表3洗脱程序

3.3质谱条件

质谱分析仪器为Waters公司XEVO TQ-XS型串联四级杆质谱仪。正离子离子源电压为3kv，锥孔电压为20V。去溶剂温度550℃，源温度150℃。去溶剂气流速1000L/Hr，锥孔气流速7L/h。

3.4靶向代谢组数据处理

靶向代谢组数据峰面积计算采用masslynx定量软件，保留时间允许误差15s。浓度计算采用单点同位素内标法获取定量结果。

4、数据处理

4.1数据质控

为了评价样品采集过程中系统的稳定性和重复性，使用了质控样本。质控样本是所有样本均移取固定体积混合均匀后得到的。指控样本的前处理方法和其他样品一样。为了得到可信赖的且可重复性的代谢物，三个因素需要考虑：1)保留时间，2)信号强度，3)质量准确度。本次实验首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6-8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性。同时计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除。

4.2 PCA分析

所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至16和1至12min。各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征。代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配。

4.3 OPLS-DA分析

为了获得在脑梗死组和在健康对照组呈现显著差异的代谢物信息，进一步采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)对两组样本进行统计分析。

采用OPLS-DA模型的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(HMDB)(比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass，误差限制0.01Da)。

4.4 ROC分析

根据代谢物的水平，使用SPSS绘制受试者工作特征曲线(ROC)，计算二项精确置信空间，分析差异代谢物的诊断效能。

5、结果

脑梗死组与健康对照组各组反相色谱正离子和负离子、亲水色谱正的总离子流图如图1所示。

质控结果显示，质控样本相对聚集在一起，系统重复性较好，所采集的数据可以进行进一步的研究。

反向色谱正离子、反向色谱负离子、亲水色谱正离子的结果分别如表4和图2所示。

表4 OPLS-DA分析模型参数

生物信息学分析结果显示，与健康对照组相比，吲哚乙酸或PC(14:0/18:2(9Z,12Z))在脑梗死组的水平显著降低(图3)。

使用ROC曲线来分析吲哚乙酸、PC(14:0/18:2(9Z,12Z))、以及吲哚乙酸和PC(14:0/18:2(9Z,12Z))的诊断效能，其ROC曲线以及相应的曲线下面积分别如图4和表5所示，其cutoff值分别0.314、0.636、0.558，说明以吲哚乙酸、PC(14:0/18:2(9Z,12Z))单独或者联合作为检测脑梗死的标志物具有较高的诊断效能，尤其是两者联合，具有较高的准确性、敏感性和特异性。

表5小分子物质的曲线下面积

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积＝0.5

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.检测样本中小分子物质的试剂在制备评估脑梗死的产品中的应用，其特征在于，所述小分子物质选自PC(14:0/18:2(9Z,12Z))，或PC(14:0/18:2(9Z,12Z))与吲哚乙酸的组合，所述样本选自血液、血浆或血清。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子物质为吲哚乙酸和PC(14:0/18:2(9Z,12Z))的组合。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括用于色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法检测标志物的试剂。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品还包括处理样本的试剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，受试者样本中的小分子物质水平降低指示所述受试者患有脑梗死或存在患脑梗死的风险。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品通过检测来自受试者的样本中的小分子物质的水平，并与参考代谢物谱进行比较，进而指示受试者是否患有脑梗死或存在患脑梗死的风险。

8.小分子物质在制备用于鉴定和评估药剂和/或手术治疗和/或物理治疗对抗脑梗死的效果的产品中的应用，其特征在于，小分子物质选自PC(14:0/18:2(9Z,12Z))，或PC(14:0/18:2(9Z,12Z))与吲哚乙酸的组合。