CN106526156A - 一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,本发明涉及检测、筛选及鉴定代谢生物标记物的方法。本发明是要解决现有技术不能确定肾阳虚证的生物标记物的问题,而提出的一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法。该方法是通过复制肾阳虚证大鼠模型;评价肾阳虚证大鼠模型;制备得到大鼠尿液或血液QC样本;得到尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物;大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定鉴定得到尿液生物标记物33个,血液生物标记物17个等步骤实现的。本发明应用于检测、筛选及鉴定代谢生物标记物领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法。
背景技术
中医的藏象是“藏居于内,形见于外”,临床上则以“证”为表现。“证”本质是机体失衡而致的代谢或其网路的改变,该特征性表型是通过脏器分泌到血液或尿液中的内源性代谢成分(小分子代谢物)表达谱的改变而被客观地反映出来。而代谢组学正是研究机体受外界因素干扰后,其代谢产物(内源代谢物质)的种类、数量及其变化规律的科学。因此,代谢组学的兴起提供了一条从系统层面将多层次多维度数据进行整合分析的方法,用现代科学语言表述了中医药的特性。代谢组学以其整体、动态、重视整体功能变化等特点,与中医证候对病理状态的表达理念不谋而合。
肾阳虚证是中医临床常见病证,也是影响现代人类健康的多种常见病的共性基础性病理,临床主要表现为畏冷肢寒、精神不振、头晕目眩、阳痿阴缩、夜尿频多、宫寒不孕等症状。因此补肾阳作用研究在防病治病方面具有重要意义。大量研究表明肾阳虚证可在下丘脑-垂体-靶腺轴、能量代谢、免疫系统、细胞信号系统、心脏和肾脏有不同程度的紊乱现象,是多种系统和器官功能的综合表现。其中,下丘脑-垂体-靶器官(肾上腺、性腺和甲状腺)轴的功能紊乱是肾阳虚证的共同特征。
“证”本质上是指机体失衡而致的代谢或其网路的改变,该特征性表型是通过血液或尿液等生物样本的内源性小分子代谢物及大分子蛋白表达谱的改变而被客观地反映出来的。而代谢组学正是研究机体受外界因素干扰后内源代谢物质的种类、数量及其变化规律的科学。因此,代谢组学的兴起提供了一个从系统层面将多层次多维度数据进行整合分析的方法和用现代生物学语言表述中医证候特性的手段。但是现有技术不能确定肾阳虚证的生物标记物。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术不能确定肾阳虚证的生物标记物的问题,而提出的一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法。
上述的发明目的是通过以下技术方案实现的:
步骤一、复制肾阳虚证大鼠模型;将正常组的每只清洁级大鼠皮下注射橄榄油溶液,将模型组的每只清洁级大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液;采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本、血液样本和脏器样本;
步骤二、评价肾阳虚证大鼠模型;计算血清和尿液样本的各生化指标的相应浓度、大鼠体重数据、脏器指数以及免疫组织化学指标;根据各指标具有极显著性差异,确定复制的肾阳虚证大鼠模型以及皮质酮诱导的肾阳虚大鼠模型;
步骤三、将大鼠原始浓度尿液制备得到大鼠尿液QC样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本制备得到大鼠的尿液样本;
步骤四、将大鼠原始浓度血液制备得到大鼠血液QC样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的血液样本制备得到大鼠血液样本;
步骤五、分别将步骤三得到的大鼠尿液QC样本和大鼠的尿液样本以及步骤四得到的大鼠血液QC样本和大鼠血液样本进行高效液相色谱柱梯度洗脱得到大鼠样本的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物;
步骤六、将步骤五中计算得到的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物分别进行正离子扫描模式和正离子扫描模式下的质谱分析,得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息;
步骤七、利用模式识别分析-主成分分析方法将步骤六得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息进行分析得到正常组大鼠尿液、模型组大鼠尿液、正常组大鼠血液以及模型组大鼠血液的代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图;
步骤八、根据步骤七得到的正常组大鼠尿液与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定肾阳虚证大鼠尿液的代谢轮廓信息;
步骤九、根据步骤七得到的正常组大鼠与模型组大鼠血液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图获得肾阳虚证大鼠血液的的代谢轮廓信息;
步骤十、鉴定肾阳虚证潜在生物标记物,根据肾阳虚证大鼠尿液和肾阳虚证大鼠血液潜在生物标记物保留时间和质核比信息进行代谢物库的匹配;通过高效液相色谱以及质核比MS/MS数据来确定标记物的化学结构;共鉴定得到尿液生物标记物33个,血液生物标记物17个;
所述33个尿液代谢物鉴定结果分别为:12-羟基十二烷酸、乙酰基-L-酪氨酸、N-乙酰血清素、黄尿酸、马尿酸、二碘羟基喹啉、氢化肉桂酸、牛磺酸、烟酰胺、11β,21-二羟基-5β-孕酮-3,20-二酮、肌酐、胸苷、胞嘧啶、3-甲醛吲哚、醛赖氨酸、犬尿酸、3-甲氧基肾上腺素、羟苯基乙酰甘氨酸、N-丁二酰-L-谷氨酸-半醛、L-缬氨酸、3-羟基十二碳二酸、泛酸、癸二酸、苯丙酮酸、尿酸、α-亚麻酸、苯乙酰甘氨酸、葡萄糖醛酸内酯、N-乙酰-L-精氨酸、酮戊二酸、尿囊素、N-乙酰神经氨酸、吡咯啉羧酸;
所述17个血液代谢物鉴定结果分别为:9,12,15-十八碳三烯酸甲酯、皮质酮、亚麻酸、L-色氨酸、棕榈酰胺、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、PC(17:1(9Z)/0:0)、表脱氧胆酸、硫酸吲哚酚、棕榈酰肉碱、1-磷酸-鞘氨醇、尿苷、牛磺胆酸、PE(19:0/0:0)、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE(18:0/0:0);
其中,匹配原则:一级质量数结合质谱IDA采集得到的二级数据与代谢物库进行匹配。
发明效果
本发明基于UPLC-MS技术快速鉴定皮质酮诱导肾阳虚大鼠模型的生物标记物。
(1)采用糖皮质激素建模法建立皮质酮诱导的肾阳虚证大鼠模型,运用经典临床化学、组织形态学和免疫组织化学等方法对模型进行综合评价;(2)应用超高效液相色谱串联四级杆/飞行时间质谱(UHPLC-MS/MS)技术获取模型大鼠尿液中的内源性小分子成分;应用多变量模式识别技术筛选并鉴定肾阳虚证代谢生物标记。
1.肾阳虚证大鼠模型的复制与评价
模型组大鼠血清中CRH、T3、T4、T、ACTH、cGMP、cAMP、cAMP/cGMP和尿17-OHCS呈显著下降趋势;模型组大鼠的下丘脑神经细胞和肾上腺束状带均出现了明显的萎缩,甲状腺腺泡萎缩及间质增生。
2.肾阳虚证模型大鼠的生物标记物鉴定
共鉴定出对肾阳虚证模型具有显著贡献率的33个尿液潜在标记物和17个血液潜在标记物。通过逐步聚焦并明确了肾阳虚证的核心代谢标记物为11β,21-二羟基-5β孕烷-3,20-二酮、皮质酮、表脱氧胆酸、牛磺酸、N-乙酰血清素、黄尿酸、犬尿酸、苯丙酮酸、苯乙酰甘氨酸、N-乙酰神经氨酸、尿酸、胞嘧啶、α-亚麻酸、1-磷酸鞘氨醇、肌酐等,涉及了亚麻酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,苯丙氨酸代谢,色氨酸代谢,嘧啶代谢,甘油磷脂代谢,甾体激素合成,精氨酸和脯氨酸代谢,鞘脂类代谢,初级胆汁酸生成等。这些标记物的生物学意义与文献报导的肾阳虚证患者临床表现出神经内分泌免疫系统紊乱及肾脏损伤等密切相关。
本发明采取长期皮下注射大剂量皮质酮的方法建立肾阳虚证相关的大鼠模型,结合检测临床化学指标及观察组织病理学的改变,与临床肾阳虚证的评价标准进行比较,建立肾阳虚证大鼠模型的评价体系,同时采用UPLC-MS手段检测实验大鼠的尿液和血液样本,利用代谢组学技术分析肾阳虚证大鼠模型发生、发展中整体代谢轮廓的动态变化,并阐明这些标记物的生物学意义,为开展相关药物评价和药效物质基础研究奠定基础。
附图说明
图1为实施例提出的正常大鼠和皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠临床生化指标结果示意图;其中,CRH为促肾上腺皮质激素释放激素;ACTH为促肾上腺皮质激素;CORT为皮质酮;17-OHCS为17-羟基类固醇;T3为三氟甲状原氨酸;T4为甲状腺素;T为睾酮;cAMP为环磷酸腺苷;cGMP为环磷酸鸟苷;1正常组;2模型组*P<0.05,**P<0.01vs正常组;#P<0.05,##P<0.01vs模型组由图1可知,与正常组比较,模型组大鼠尿中17-OHCS和血清中T含量有明显降低趋势,具有极显著性差异(P<0.01);血清中CRH、T3、T4、ACTH、血浆cGMP和cAMP含量亦有降低趋势,具有显著性差异(P<0.05);cAMP/cGMP的比值降低,具有显著性差异(P<0.05)。血清中CORT含量有明显升高趋势,具有显著性差异(P<0.05)。
图2为实施例提出的基于METPA的肾阳虚证标记物代谢通路分析图;其中,1亚麻酸代谢;2牛磺酸和亚牛磺酸代谢;3缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸代谢;4苯丙氨酸代谢;5烟酸烟酰胺代谢;6色氨酸代谢;7柠檬酸代谢;8嘧啶代谢;9丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢;10甘油磷脂代谢;11甾体激素合成;12精氨酸和脯氨酸代谢;13鞘脂类代谢;14初级胆汁酸生成;15嘌呤代谢;16泛酸盐和辅酶A生成;
注释:将已鉴定的肾阳虚证生物标记物的英文名称或KEGG或HMDB号导入代谢通路分析网站(http://www.metaboanalyst.ca)进行分析后,有29个代谢通路发生扰动,以impact大于0的通路为标准,得到与肾阳虚证密切相关的16个代谢通路;
图3为实施例提出的皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠血液和尿液核心标记物含量水平示意图;注释:通过对皮质酮诱导的肾阳虚证具有显著贡献的潜在生物标记物阐述后,发现17个标记物与肾阳虚证的临床表现密切相关,参与了肾阳虚证的发生与发展过程,可以作为评价肾阳虚证的核心生物标记物;*P<0.05,**P<0.01vs正常组。
图4(a)为实施例提出的正常组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠下丘脑HE染色形态观察示意图;由图4(a)结果可见,实验第22天,正常组下丘脑神经元细胞胞浆饱满;
图4(b)为实施例提出的模型组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠下丘脑HE染色形态观察示意图;由图4(b)结果可见,实验第22天,模型组下丘脑神经元细胞出现不同程度的萎缩,部分神经元细胞核固缩。
图5(a)为实施例提出的正常组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠垂体HE染色形态观察示意图;由图5(a)实验第22天,正常组垂体细胞形态正常,嗜酸细胞、嗜碱细胞和中性细胞排列均匀,分界清晰;
图5(b)为实施例提出的模型组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠垂体HE染色形态观察示意图;图5(b)实验第22天,)模型组垂体嗜碱细胞明显减少,部分细胞核固缩,间隙较大并存有大量红细胞,伴有充血现象。
图6(a)为实施例提出的正常组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠甲状腺HE染色形态观察示意图;实验第22天,正常组皮质、髓质界限清楚,球状带、束状带、网状带细胞排列均匀,髓质细胞排列成团、成索;
图6(b)为实施例提出的模型组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠甲状腺HE染色形态观察示意图;实验第22天,模型组皮质增生明显,细胞密度增高,球状条增厚,束状条透明变,网状带变窄,细胞变小,颜色变深,且毛细管充血。
图7(a)为实施例提出的正常组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠肾上腺HE染色形态观察示意图;实验第22天,正常组甲状腺腺泡饱满多呈立方形,间质清晰,上皮细胞呈柱形;
图7(b)为实施例提出的模型组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠肾上腺HE染色形态观察示意图;实验第22天,模型组腺泡萎缩,上皮扁平,间质细胞纤维增生。
图8(a)为实施例提出的正常组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠睾丸HE染色形态观察示意图;
图8(b)为实施例提出的模型组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠睾丸HE染色形态观察;实验第22天,模型组睾丸组织与正常组比较无明显区别,生精小管横切面可见精原细胞及不同发育阶段的精母细胞、精子细胞和精子;
图9(a)为实施例提出的正常组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠下丘脑CRH免疫组织化学染色分析示意图;
图9(b)为实施例提出的模型组显微镜下(×200)皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠和正常大鼠下丘脑CRH免疫组织化学染色分析示意图;图9(a)和图9(b)所述下丘脑神经元细胞胞浆、胞体及突起部位的CRH免疫反应阳性产物呈棕黄色斑块状。与正常组比较,模型组大鼠下丘脑神经元染色浅且阳性染色细胞少,部分神经元镜下呈正常形态但是无阳性表达,经显微定量分析发现,下丘脑的CRH阳性表达面密度明显降低,具有极显著性差异(P<0.01);
图10(a)为实施例提出的正离子模式2D图;正常组大鼠与肾阳虚证模型组大鼠不同时间第0天尿液样本正、负离子模式PCA Scores plot轨迹图;
图10(b)为实施例提出的负离子模式2D图;正常组大鼠与肾阳虚证模型组大鼠不同时间第7天尿液样本正、负离子模式PCA Scores plot轨迹图;
图10(c)为实施例提出的正离子模式3D图正常组大鼠与肾阳虚证模型组大鼠不同时间第14天尿液样本正、负离子模式PCA Scores plot轨迹图;
图10(d)为实施例提出的负离子模式3D图正常组大鼠与肾阳虚证模型组大鼠不同时间第22天尿液样本正、负离子模式PCA Scores plot轨迹图;
图10(a)~图10(d)模型组大鼠尿液不同时间点尿液样本明显分开,并且随着时间的推移,向着远离第0天尿液样本的方向变化,以第22天偏离程度最大;说明模型大鼠正常的代谢网络逐步受到干扰,从而造成了其代谢轨迹的变化;经注射皮质酮造模21天,大鼠的代谢轮廓产生影响,且正常组大鼠与模型组大鼠开始有明显的远离趋势。
图11(a)为实施例提出的正离子模式下正常组和模型组大鼠第22天尿液PCA模式识别分析Scores plot图;
图11(b)为实施例提出的负离子模式下正常组和模型组大鼠第22天尿液PCA模式识别分析Scores plot图;
图12(a)为实施例提出的正离子模式正常组和模型组大鼠第22天血液PCA模式识别分析Scores plot图;
图12(b)为实施例提出的负离子模式正常组和模型组大鼠第22天血液PCA模式识别分析Scores plot图;
图13(a)为实施例提出的正离子模式下正常组和模型组大鼠第22天尿液OPLS-DA分析Scores plot图;
图13(b)为实施例提出的负离子模式下正常组和模型组大鼠第22天尿液OPLS-DA分析Scores plot图;
图14(a)为实施例提出的POS(正离子模式)正常组和模型组第22天尿液样本VIP图;
图14(b)为实施例提出的NEG正常组和模型组第22天尿液样本VIP图;NEG(负离子模式)
图15(a)为实施例提出的正离子模式下正常组和模型组大鼠血液OPLS-DA分析后的Scores plot图;
图15(b)为实施例提出的负离子模式下正常组和模型组大鼠血液OPLS-DA分析后的Scores plot图;
图16(a)为实施例提出的POS正常组和模型组血液样品VIP散点图;
图16(b)为实施例提出的NEG正常组和模型组血液样品VIP散点图;
图17(a)为实施例提出的尿液生物标记物皮质酮诱导肾阳虚证模型大鼠及正常大鼠的尿液和血液生物标记物含量水平示意图;
图17(b)为实施例提出的血液生物标记皮质酮诱导肾阳虚证模型大鼠及正常大鼠的尿液和血液生物标记物含量水平示意图;
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式的一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,具体是按照以下步骤制备的:
步骤一、复制肾阳虚证大鼠模型;将正常组的每只清洁级大鼠皮下注射橄榄油溶液,将模型组的每只清洁级大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液;采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本、血液样本和脏器样本;
步骤二、评价肾阳虚证大鼠模型;肾阳虚证的临床定位为神经内分泌免疫网络的抑制,而神经内分泌免疫网络中所涉及到的相应激素水平和靶器官的功能状态可以反映其是否处于抑制状态;因此,采用检测血清CRH、CORT、ACTH、T3、T4、T、cAMP、cGMP和尿17-OHCS临床化学指标并观察下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺和睾丸的组织病理学形态改变,对肾阳虚证大鼠模型进行综合评价;
计算血清和尿液样本的各生化指标的相应浓度、大鼠体重数据、脏器指数以及免疫组织化学指标;根据各指标具有极显著性差异,确定复制的肾阳虚证大鼠模型以及皮质酮诱导的肾阳虚大鼠模型;
所述确定免疫组织化学指标具有极显著性差异具体过程为:详见实施例步骤二中2.3.4;
脏器指数为脏器组织的改变,详见实施例步骤二中2.2.3;
免疫组织化学指标,详见实施例步骤二中2.3.3;
血清各生化指标包括内容和尿液样本的生化指标详见实施例中步骤二3.1中的临床化学指标结果;
步骤三、将大鼠原始浓度尿液(未经注射药物的大鼠采集的尿液)制备得到大鼠尿液QC(质控)样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本制备得到大鼠的尿液样本;
步骤四、将大鼠原始浓度血液(未经注射药物的大鼠采集的血液)制备得到大鼠血液QC样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的血液样本制备得到大鼠血液样本;
步骤五、分别将步骤三得到的大鼠尿液QC样本和大鼠的尿液样本以及步骤四得到的大鼠血液QC样本和大鼠血液样本进行高效液相色谱柱梯度洗脱得到大鼠样本的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物;
步骤六、将步骤五中计算得到的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物分别进行正离子扫描模式和正离子扫描模式下的质谱分析,得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息;
步骤七、利用模式识别分析-主成分分析方法将步骤六得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息进行分析得到正常组大鼠尿液、模型组大鼠尿液、正常组大鼠血液以及模型组大鼠血液的代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图;
步骤八、根据步骤七得到的正常组大鼠尿液与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定肾阳虚证大鼠尿液的代谢轮廓信息;
步骤九、根据步骤七得到的正常组大鼠与模型组大鼠血液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图获得肾阳虚证大鼠血液的的代谢轮廓信息;
步骤十、鉴定肾阳虚证潜在生物标记物,根据肾阳虚证大鼠尿液和肾阳虚证大鼠血液潜在生物标记物保留时间和质核比信息进行代谢物库的匹配;对软件所给出的可能结构进行标记,同时导出含有相对峰强度的鉴定结果列表,进行二次鉴定。二次鉴定主要是通过HMDB(http://www.hmdb.ca/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)和Massbank(http://www.massbank.jp/)等检索数据库,并结合MSMS数据进行验证,通过高效液相色谱保留行为以及质核比MS/MS数据来确定标记物的化学结构;共鉴定得到尿液生物标记物33个,血液生物标记物17个;
所述33个尿液代谢物鉴定结果分别为:12-羟基十二烷酸、乙酰基-L-酪氨酸、N-乙酰血清素、黄尿酸、马尿酸、二碘羟基喹啉、氢化肉桂酸、牛磺酸、烟酰胺、11β,21-二羟基-5β-孕酮-3,20-二酮、肌酐、胸苷、胞嘧啶、3-甲醛吲哚、醛赖氨酸、犬尿酸、3-甲氧基肾上腺素、羟苯基乙酰甘氨酸、N-丁二酰-L-谷氨酸-半醛、L-缬氨酸、3-羟基十二碳二酸、泛酸、癸二酸、苯丙酮酸、尿酸、α-亚麻酸、苯乙酰甘氨酸、葡萄糖醛酸内酯、N-乙酰-L-精氨酸、酮戊二酸、尿囊素、N-乙酰神经氨酸、吡咯啉羧酸;
所述17个血液代谢物鉴定结果分别为:9,12,15-十八碳三烯酸甲酯、皮质酮、亚麻酸、L-色氨酸、棕榈酰胺、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、PC(17:1(9Z)/0:0)、表脱氧胆酸、硫酸吲哚酚、棕榈酰肉碱、1-磷酸-鞘氨醇、尿苷、牛磺胆酸、PE(19:0/0:0)、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE(18:0/0:0);
其中,匹配原则:一级质量数结合质谱IDA采集得到的二级数据与代谢物库进行匹配,以得分高低排序,得分越高,结构确定的准确性越大。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本具体为:
(1)、将清洁级大鼠完全随机分成2组,即正常组和模型组;
(2)、正常组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射橄榄油溶液,模型组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液,
(3)、采集每只大鼠12h的尿样,将新鲜尿液样于4℃、13000rpm离心10min条件下在-80℃贮存,进行分析之前室温解冻。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的血液样本具体为:
1)每只大鼠均于腹主动脉采集血液,在离心4℃,4000r/min,10min条件下分离血清;
2)分装后冻存于-80℃冰箱,进行分析之前室温解冻。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的脏器样本具体为:
①采集每只大鼠经腹主动脉血样后,迅速取出肾上腺、胸腺、睾丸并用分析天平称重,计算各脏器的脏器指数;
②下丘脑与垂体在大鼠灌注4%多聚甲醛溶液后,将下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺和睾丸(均取左侧)共同置于4%多聚甲醛溶液固定备用。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:步骤三中将大鼠原始浓度尿液制备得到大鼠尿液QC(质控)样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本制备得到大鼠的尿液样本具体为:
步骤三一、按照步骤一尿液样本的采集方法采集大鼠尿液,从大鼠原始浓度尿液中各取200μL,混合后涡旋10s后分装后得到大鼠尿液待处理样本,-80℃保存;
步骤三二、在室温下解冻步骤三一的大鼠尿液待处理样本和步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本,并利用4倍体积的蒸馏水进行稀释,涡旋10s后,在4℃、13000rpm条件下离心10min,过0.22μm滤膜,得到大鼠尿液质控QC样本和大鼠的尿液样本。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是:步骤四中将大鼠原始浓度血液制备得到大鼠血液QC样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的血液样本制备得到大鼠血液样本具体过程为:
步骤四一、按照步骤一血液样本采集方法从大鼠血液样本中各取50μL,混合后涡旋10s后得到大鼠血液QC待处理样本;
步骤四二、在室温下解冻步骤四一血液QC待处理样本和步骤一得到的采集正常组和模型组清洁级大鼠的血液样本后,涡旋10s,取200μL上层血清置于1.5mL离心管中,加800μL甲醇,涡旋10s,超声1min,13000rpm离心10min,取上清液850μL,于40℃水浴下氮气吹干,残渣用200μL 80%甲醇复溶,4℃、13000rpm离心10min,过0.22μm滤膜,取上清液即得大鼠血液QC样本和处理后的血液样本。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是:步骤五所述进行高效液相色谱柱梯度洗脱采用的色谱条件为:
色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm)(Waters集团公司,美国);流动相:流动相A的质量百分比为0.1%甲酸-水,流动相B的质量百分比为0.1%甲酸-乙腈;柱温:40℃;流速:0.4ml/min;进样量:3μL。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是:步骤六中所述的正离子扫描模式条件为:离子喷雾电压:5.5KV;离子源温度:600℃;解簇电压(DP):100V;碰撞能量(CE):35eV;氮气为雾化气和辅助气:雾化气55psi,辅助气55psi,气帘气35psi;在质核比m/z在100-1200amu质量范围ESI正离子模式下进行全扫描,积累时间250ms;
自动关联扫描IDA采用标准:详见实施例步骤三中2.1.3.2质谱条件
负离子扫描模式:离子喷雾电压:4.0KV;离子源温度:600℃;解簇电压(DP):100V;碰撞能量(CE):35eV;氮气为雾化气和辅助气:雾化气65psi,辅助气65psi,气帘气35psi;在m/z为100-1200amu质量范围ESI正离子模式下进行全扫描,积累时间250ms;IDA采用标准:每个分析物,超过100cps的八个最强的碎片离子在100~1200amu质量范围内进行子离子扫描,累积时间为100ms;碰撞电压差为15eV,动态背景扣除DBS开启;自动校准系统(CDS)对MS和MS/MS自动进行调节和校正;数据获取和处理分析采用2.1软件、MasterView软件和ProgenisisQI 1.0软件;工作站为 TF1.6软件。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是:步骤八中根据步骤七得到的正常组大鼠尿液与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定肾阳虚证大鼠模型尿液生物标记物具体过程为:
步骤八一、在确认实验第22天PCA得分图中显示正常组大鼠与模型组大鼠尿液代谢数据完全分离后,对正常组与模型组的代谢数据矩阵进行模式识别分析-正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial Least Squares Analysis,OPLS-DA)方法,选取一定VIP((vriable importance in the projection,变量投影重要性)值进行潜在生物标记物的初步筛查;
步骤八二、将初步筛查的潜在标记物在每天样本的含量变化趋势进行绘制,以代谢物微观含量变化趋势一致且满足正常组与模型组组间大鼠尿液各代谢物具有显著性差异P<0.05的原则,将潜在生物标记物进行第二次筛选获得第二次潜在标记物,
步骤八三,获得的初步筛查的潜在标记物和第二次潜在标记物为肾阳虚证大鼠模型尿液潜在生物标记物。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是:步骤九中根据步骤七得到的正常组大鼠与模型组大鼠血液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图获得肾阳虚证大鼠模型血液生物标记物具体过程为:
步骤九一、在确认实验第22天PCA得分图显示两组完全分离后,对正常组与模型组的代谢数据矩阵进行模式识别分析方-正交偏最小二乘法分析(Orthogonal PartialLeast Squares Analysis,OPLS-DA),通过VIP值进行潜在生物标记物的初步筛查;
步骤九二、满足正常组与模型组组间大鼠血液各代谢物具有显著性差异(P<0.05)的原则进行第二次潜在标记物筛选,
步骤九三、初步筛查的潜在标记物和第二次潜在标记物做为肾阳虚证大鼠模型血液潜在生物标记物。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果:
实施例一:
本实施例一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,具体是按照以下步骤制备的:
一肾阳虚证大鼠模型的复制;
1.Wistar大鼠(清洁级),雄性,体重250g±10g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2012-0001。饲养温度24±22℃,湿度65%-75%,12h避光,12h光照,自由摄食饮水。
2.2实验分组及造模方法;将大鼠完全随机分成2组,即正常组、模型组,每组8只,各组开始实验前于代谢笼适应环境一周。参照沈自尹等建立肾阳虚证大鼠模型方法:正常组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射橄榄油溶液,模型组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液,连续21天。
2.3样本采集;2.3.1尿液样本采集
从实验第0天到实验第22天,每间隔7天收集每只大鼠12h的尿样,新鲜尿液样4℃、13000rpm离心10min后于-80℃贮存,进行分析之前室温解冻。
2.3.2血液样本采集:实验第22天,每只大鼠均于腹主动脉采集血液,离心(4℃,4000r/min,10min)分离血清,分装后冻存于-80℃冰箱,进行分析之前室温解冻。
2.3.3脏器样本采集:实验第22天,每只大鼠经腹主动脉采集血样后,迅速取出肾上腺、胸腺、睾丸并用分析天平称重,计算各脏器的脏器指数;下丘脑、垂体在大鼠灌注4%多聚甲醛溶液后,与肾上腺、甲状腺和睾丸(均取左侧)共同置于4%多聚甲醛溶液固定备用。
二、评价肾阳虚证大鼠模型;肾阳虚证的临床定位为神经内分泌免疫网络的抑制,而神经内分泌免疫网络中所涉及到的相应激素水平和靶器官的功能状态可以反映其是否处于抑制状态。因此,采用检测血清CRH、CORT、ACTH、T3、T4、T、cAMP、cGMP和尿17-OHCS临床化学指标并观察下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺和睾丸的组织病理学形态改变,对肾阳虚证大鼠模型进行综合评价。
1.2试剂:促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)放免试剂盒、皮质酮(CORT)放免试剂盒、促肾上腺皮质激素(ACTH)放免试剂盒(北京华英生物有限公司提供);三氟甲状原氨酸(T3)放免试剂盒、甲状腺素(T4)放免试剂盒、睾酮(T)放免试剂盒放免试剂盒(潍坊三维生物工程有限公司提供);环磷酸腺苷(cAMP)活性分析试剂盒、环磷酸鸟苷(cGMP)活性分析试剂盒、17-羟基类固醇(17-OHCS)活性分析试剂盒(南京建成有限公司提供)。
2.2组织病理学指标评价;
2.2.2脏器组织HE染色:按照苏木素-伊红的染色方法说明书对相应组织进行染色。
2.2.3组织染色切片的图像采集:采用显微镜照相系统在200倍视野下进行镜下观察各组织染色切片,同时重点观察文献报导的肾阳虚证大鼠模型相关脏器组织的改变,包括下丘脑神经元细胞、垂体嗜酸性细胞和嗜碱性细胞、甲状腺腺泡和间质、肾上腺皮质以及睾丸生精细胞等,采集高清图像信息。
2.2.4数据分析:实验所得各组大鼠体重数据、脏器指数利用SPSS18.0软件进行独立样本T检验,计算P值,P值小于0.05为显著性差异,P值小于0.01为极显著性差异。
2.3免疫组织化学指标评价;2.3.1组织蜡块的制备:与HE染色共用同一蜡块。
2.3.2免疫组织化学染色方法:按照SABC免疫组化染色方法说明书对相应组织进行染色。
2.3.3组织染色切片的图像采集:采用显微镜照相系统在200倍视野下进行镜下观察各组织染色切片,阳性表达的细胞核、细胞浆或者间质着色呈棕黄色,则随机10个视野,显微摄像系统拍摄高清图像信息。
2.3.4数据分析:利用Motic Medical 6.0图像分析软件对每张免疫组织化学染色切片照片进行显微定量分析,分析组织片上的阳性面密度值,计算各组大鼠下丘脑切片的CRH阳性目标面密度,作为其阳性表达的定量分析结果。利用SPSS18.0软件对实验所得定量结果数据进行独立样本T检验,计算P值,P值小于0.05为显著性差异,P值小于0.01为极显著性差异。
3.结果与讨论;3.1临床化学指标结果:
由临床生化指标测定结果(表1和图1)可知,与正常组比较,模型组大鼠尿中17-OHCS和血清中T含量有明显降低趋势,具有极显著性差异(P<0.01);血清中CRH、T3、T4、ACTH、血浆cGMP和cAMP含量亦有降低趋势,具有显著性差异(P<0.05);其中cAMP/cGMP的比值降低,具有显著性差异(P<0.05)。血清中CORT含量有明显升高趋势,具有显著性差异(P<0.05)如图1。
表1正常大鼠和皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠临床生化指标分析结果(Mean±SD n=8)
表1(续)
*P<0.05,**P<0.01vs正常组
3.3.2脏器组织形态观察结果
由图4(a)和(b)结果可见,实验第22天,正常组下丘脑神经元数目多且细胞胞浆饱满;模型组下丘脑神经元细胞出现不同程度萎缩,部分神经元细胞核固缩。
由图5(a)和(b)结果可见,实验第22天,正常组垂体细胞形态正常,嗜酸细胞、嗜碱细胞和中性细胞排列均匀,分界清晰;模型组垂体嗜碱细胞明显减少,部分细胞核固缩,间隙较大并存有大量红细胞,伴有充血现象。
由图6(a)和(b)结果可知,实验第22天,正常组皮质、髓质界限清楚,球状带、束状带、网状带细胞排列均匀,髓质细胞排列成团、成索;模型组皮质增生明显,细胞密度增高,球状条增厚,束状条透明变,网状带变窄,细胞变小,颜色变深,且毛细管充血。
由图7(a)和(b)结果可见,实验第22天,正常组甲状腺腺泡饱满多呈立方形,间质清晰,上皮细胞呈柱形;模型组腺泡萎缩,上皮扁平,间质细胞纤维增生。
由图8(a)和(b)可以说明,实验第22天,模型组睾丸组织与正常组比较无明显区别,生精小管横切面可见精原细胞及不同发育阶段的精母细胞、精子细胞、精子。
3.3免疫组织化学指标结果
下丘脑神经元细胞胞浆、胞体及突起部位的CRH免疫反应阳性产物呈棕黄色斑块状(见图9(a)和(b))。与正常组比较,模型组大鼠下丘脑神经元染色浅且阳性染色细胞少,部分神经元镜下呈正常形态但是无阳性表达,经显微定量分析发现,下丘脑的CRH阳性表达面密度明显降低,具有极显著性差异(P<0.01)(见表2)。
表2皮质酮诱导的肾阳虚证模型大鼠及正常大鼠下丘脑CRH阳性表达分析结果
*P<0.05,**P<0.01vs正常组
4.实验小结:通过长期皮下注射大剂量皮质酮方法建立的大鼠肾阳虚证大鼠模型,经过21天制备周期,模型组大鼠肾上腺和胸腺脏器指数降低;下丘脑神经元细胞和肾上腺皮质束状带均出现了明显萎缩,甲状腺腺泡萎缩间质增生,表明模型组大鼠下丘脑-垂体-靶器官的组织生理结构已经发生变化;模型组大鼠血清CRH、T3、T4、T、ACTH、cGMP、cAMP、cAMP/cGMP和尿17-OHCS的变化趋势较正常大鼠呈明显降低,成功地复制了皮质酮诱导的肾阳虚大鼠模型。
三、肾阳虚证模型大鼠的代谢轮廓及生物标记物分析
采集肾阳虚证大鼠模型复制过程中的尿液样本和血液样本进行代谢组学研究,利用模式识别结合网络数据库的方法鉴定肾阳虚证模型大鼠血液和尿液的代谢生物标记物。
1.实验材料;1.1仪器:ekspert ultra LC100液相色谱仪(AB Sciex集团公司,美国);AB Sciex Triple TOF 5600+质谱仪(AB Sciex集团公司,美国);Progenesis QI(Waters集团公司,美国);KDC-160HR型高速低温离心机(科大创新股份公司,中国);VX-Ⅱ多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司,中国);PB1501-N型电子分析天枰(梅特勒·托利多仪器(上海)有限公司,中国);KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,中国);SL-1000XLS型移液器(梅特勒·托利多仪器(上海)有限公司,中国)(规格:100-1000μL)。
1.2试剂:校正液(AB Sciex集团公司,美国);乙腈,色谱级,(Merck技术有限公司,德国);甲醇,色谱级,(Merck技术有限公司,德国);甲酸,色谱级,(科密欧化学试剂有限公司,中国);蒸馏水,(广州屈臣氏食品饮料公司,中国)。
2.实验方法2.1样本制备与采集;2.1.1尿液分析样本的制备:详见上述步骤三二的记载;
2.1.2血液分析样本的制备:详见上述步骤四二;
2.1.3尿液分析样本的采集方法;2.1.3.1色谱条件;详见上述步骤五梯度洗脱方法见表3。
表3大鼠尿液样品UPLC流动相梯度洗脱方法
A:0.1%甲酸水;B.0.1%乙腈水
2.1.3.2.质谱条件:详见上述步骤六
IDA(自动关联扫描)采用标准:每个分析物,超过100cps的八个最强的碎片离子在100~1200amu质量范围内进行子离子扫描,累积时间为100ms。碰撞电压差为15eV,动态背景扣除DBS开启。自动校准系统(CDS)对MS和MS/MS自动进行调节和校正。数据获取和处理分析采用2.1软件、MasterView软件和Progenisis QI 1.0软件。工作站为 TF 1.6软件。
负离子扫描模式:详见上述步骤六
2.1.4血液分析样本的采集方法;2.1.4.1色谱条件:详见上述步骤五;
表4血液样品的流动相梯度洗脱方法
A:0.1%甲酸水;B.0.1%乙腈水
2.1.4.2质谱条件;2.2.尿液和血液的代谢组学数据分析;2.2.1尿液的代谢组学数据分析;
2.2.1.1尿液代谢轮廓分析
取实验第0天、7天、14天和22天各组大鼠尿液样本,按照尿液样品制备方法处理,利用已建立的分析方法进行对上述尿液样品正负离子模式全扫描,得到每组每只大鼠尿液样本的代谢轮廓信息。
2.2.1.2大鼠尿液代谢轮廓轨迹分析
将实验第0天、7天、14天和22天各组大鼠尿液样本代谢轮廓数据导入ProgenisisQI软件进行峰匹配、峰提取、标准化、数据降维和质谱矩阵信息获取。进一步利用EZinfo软件模块对各给药组不同时间点数据进行模式识别分析-主成分分析(PrincipalComponents Analysis,PCA),绘制正常组大鼠与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图,明晰造模因素诱导正常大鼠向模型大鼠的转变过程。
2.2.2血液的代谢组学数据分析;2.2.2.1血液代谢轮廓分析:
取实验第22天各组大鼠血液样本,按照血液样品制备方法处理,利用已建立的分析方法进行对上述血液样品正负离子模式全扫描,得到每组每只大鼠尿液样本的代谢轮廓信息。
2.2.1.2大鼠血液代谢轮廓分析:将实验第22天大鼠血液样本代谢轮廓数据导入Progenisis QI软件进行峰匹配、峰提取、标准化、数据降维和质谱矩阵信息获取。进一步利用EZinfo软件模块对各给药组不同时间点数据进行模式识别分析-主成分(PrincipalComponents Analysis,PCA)分析,绘制正常组大鼠与模型组大鼠代谢轮廓PCA得分图。
2.3肾阳虚证潜在生物标记物的发现与鉴定;2.3.1肾阳虚证大鼠模型尿液生物标记物的发现:
在确认实验第22天PCA得分图显示两组完全分离后,对正常组与模型组的代谢数据矩阵进行模式识别分析-正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial Least SquaresAnalysis,OPLS-DA)分析,通过VIP值进行潜在生物标记物的初步筛查,进一步对这些潜在标记物在每天样本的含量变化趋势进行绘制,以代谢物微观含量变化趋势一致且满足正常组与模型组组间各代谢物具有显著性差异(P<0.05)的原则进行第二次潜在标记物筛选,获得肾阳虚证大鼠模型血液潜在生物标记物。
2.3.2肾阳虚证大鼠模型血液生物标记物的发现
在确认实验第22天PCA得分图显示两组完全分离后,对正常组与模型组的代谢数据矩阵进行模式识别分析方-正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial LeastSquares Analysis,OPLS-DA)分析,建立VIP文件,选取一定VIP值进行潜在生物标记物的初步筛查,且满足正常组与模型组组间各代谢物具有显著性差异(P<0.05)的原则进行第二次潜在标记物筛选,获得肾阳虚证大鼠模型血液潜在生物标记物。
2.3.3肾阳虚证潜在生物标记物的鉴定
将所得到的肾阳虚证尿液和血液潜在生物标记物保留时间和质核比信息,导入Progenisis QI软件生成的代谢物鉴定模块下并设定成标签,进行代谢物库的匹配。匹配原则:一级质量数结合质谱IDA采集得到的二级数据与代谢物库进行匹配,以得分高低排序,得分越高,结构确定的准确性越大。对软件所给出的可能结构进行标记,同时导出含有相对峰强度的鉴定结果列表,进行二次鉴定。二次鉴定主要是通过HMDB(http://www.hmdb.ca/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)和Massbank(http://www.massbank.jp/)等检索数据库,并结合MSMS数据进行验证,最终通过色谱保留行为以及MS/MS数据来确定标记物的化学结构。
2.4生物标记物的代谢通路分析;将已鉴定的肾阳虚证生物标记物的英文名称、KEGG或HMDB号导入代谢通路分析网站(http://www.metaboanalyst.ca)进行分析后,以impact大于0的标准筛选关注代谢途径,并绘制相应代谢通路示意图。
2.5肾阳虚证相关核心标记物的生物信息分析与阐述:
首先,对所得到的生物标记物及代谢通路进行归纳,分类。然后以生物标记物名称、疾病名称、靶点名称等与肾阳虚证相关的关键词进行文献搜寻,获得临床和实验研究结果,结合肾阳虚证临床化学指标和组织病理学指标,综合分析其生物学信息,并获得与肾阳虚证的发生发展相关的核心标记物。最终阐述这些标记物在这个肾阳虚证发生与发展过程的指示与作用。
3结果与讨论;3.1尿液和血液的代谢组学数据分析结果;3.1.1尿液的代谢组轮廓数据分析结果:
由图10(a)~(d)和图11(a)和(b)发现模型组大鼠尿液不同时间点尿液样本明显分开,并且随着时间的推移,向着远离第0天尿液样本的方向变化,以第22天偏离程度最大。说明模型大鼠正常的代谢网络逐步受到干扰,从而造成了其代谢轨迹的变化。经注射皮质酮造模21天,大鼠的代谢轮廓产生影响,且模型组大鼠与正常组组大鼠开始有明显的远离趋势。为了观察肾阳虚证大鼠质谱代谢轮廓的动态变化,将不同时间点的正常组大鼠和模型组大鼠的第0天、7天、14天、22天的质谱代谢轮廓数据图11(a)和(b)导入Ezinfo 2.0软件进行PCA分析,得出模型组大鼠质谱代谢轮廓变化轨迹图(如图10(a)~(d))。
3.1.2血液的代谢轮廓数据分析结果
采用已建立的代谢组学分析技术,对实验第22天正常大鼠和肾阳虚证模型大鼠的血清样本数据进行代谢组学分析,结合尿液代谢组学数据,综合分析由皮质酮诱导的肾阳虚证大鼠模型的潜在性标记物。经皮质酮诱导的大鼠血液代谢组经PCA分析后获得Scoresplot图。由图12(a)和(b)可发现,正负离子模式下正常组均聚类在同一区域,说明实验操作对代谢轮廓影响较小,而长期注射皮质酮后的大鼠远离正常组大鼠区域,与正常组大鼠间已发生离散属于不同的生命状态,这是由于外界因素皮质酮长期作用引起正常大鼠代谢轮廓的变化导致。
3.2肾阳虚证潜在生物标记物的发现与鉴定结果;3.2.1尿液代谢组学数据模式识别结果:对模型组与正常组大鼠尿液代谢轮廓数据进行方-正交偏最小二乘判别分析(Orthonal Partial Least Square-Discriminate Analysis,OPLS-DA)分析,获得能够直观反映对代谢轮廓轨迹变化贡献率的VIP-Plot、图13(a)和(b)和图14(a)和(b)。在VIP散点图中,离子碎片呈V型排列,底部离子(VIP值小)对代谢轮廓轨迹产生变化的贡献率小;顶端离子(VIP值大)对代谢轮廓轨迹产生变化的贡献率大。在S-Plot和Loading plot中,依据载荷图中距离原点越远,离子对代谢轮廓轨迹产生变化的贡献越大。同时对各组所获得计量资料信息数据进行统计学分析,比较两组间差别是否具有统计学意义,基于P值小于0.05作为筛查条件,作为潜在生物标记物集合。
于Ezinfo选取VIP值贡献值大于1的保留时间质荷比数据,然后通过Loadingplot模块将数据导回到Progenesis QI软件并设定成标签,并对其中P小于0.05的潜在生物标记物进行同时标记,以VIP大于1和P值小于0.05的标签为目标,进行代谢物库的匹配。
3.2.2血液代谢组学数据模式识别结果
进一步挖掘对代谢组分群起关键作用的血液内源性代谢产物,将实验第22天血液样本代谢轮廓进行OPLS-DA分析,得到相应的VIP得分图(见图15(a)和(b)和图16(a)和(b)),进行潜在生物标记物的筛选。与尿液生物标记物处理方法一致。
3.2.3肾阳虚证潜在生物标记物的鉴定结果
对上述得到的潜在生物标记物进行化合物结构鉴定,鉴定结果见表5所示,共鉴定得到尿液生物标记物33个,血液生物标记物17个上述步骤十所述。各个生物标记物的微观含量变化见图17。
表5肾阳虚证大鼠模型尿液(U)和血液(S)生物标记物详细信息
3.3生物标记物的代谢通路分析将已鉴定的肾阳虚证生物标记物的KEGG或HMDB号导入代谢通路在线网站(http://www.metaboanalyst.ca)进行分析后,有29个代谢通路发生扰动,以impact大于0的通路为标准,得到与肾阳虚证密切相关的16个代谢通路,包括α-亚麻酸的代谢,甘油磷脂的代谢,牛磺酸和牛磺酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,苯丙氨酸代谢,烟酸和烟酰胺的代谢,色氨酸代谢,泛酸和辅酶A的生物合成,嘧啶代谢,柠檬酸循环(TCA循环),丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,原发性胆汁酸的生物合成,类固醇激素的生物合成,精氨酸和脯氨酸代谢,嘌呤代谢,鞘脂类代谢。这些结果说明这些内源性代谢产物在整个代谢轨迹中产生了强烈的扰动并且与与肾阳虚证模型密切相关,代谢路径网络中各代谢路径详细内容(见图2和表6)。
表6基于METPA的肾阳虚证标记物代谢通路分析结果
4.实验小结
采用OPLS-DA模式识别方法结合统计学分析,并通过整合数据库检索和多级质谱辨识分析,已鉴定其中对整体代谢谱贡献的50个代谢产物如图3。利用生物信息学和相关数据库追踪上述关键代谢产物的代谢轨迹变化,重点考察与之相关联的代谢通路的变化规律,以及这种代谢通路变化与肾阳虚证的临床症状的关联程度,明确了尿中33个关键代谢产物是与肾阳虚证的临床定位和症状体现直接相关系的代谢标记物。同理,明确了血中17个关键代谢产物是与肾阳虚证的临床定位和症状体现直接相关联的核心代谢标记物。这些代谢产物参与的类固醇激素的生物合成(糖皮质激素合成途径)、酪氨酸代谢和苯丙氨酸代谢(神经递质和激素合成途径)、色氨酸代谢(神经递质合成和犬尿氨酸途径)、牛磺酸和牛磺酸代谢(神经递质合成途径)、嘧啶代谢(嘌呤代谢途径)、精氨酸代谢(肌酐代谢途径)与肾阳虚证密切相关。
Claims (10)
1.一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于,该方法具体是按照以下步骤进行的:
步骤一、复制肾阳虚证大鼠模型;将正常组的每只清洁级大鼠皮下注射橄榄油溶液,将模型组的每只清洁级大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液;采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本、血液样本和脏器样本;
步骤二、评价肾阳虚证大鼠模型;计算血清和尿液样本的各生化指标的相应浓度、大鼠体重数据、脏器指数以及免疫组织化学指标;根据各指标具有极显著性差异,确定复制的肾阳虚证大鼠模型以及皮质酮诱导的肾阳虚大鼠模型;
步骤三、将大鼠原始浓度尿液制备得到大鼠尿液QC样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本制备得到大鼠的尿液样本;
步骤四、将大鼠原始浓度血液制备得到大鼠血液QC样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的血液样本制备得到大鼠血液样本;
步骤五、分别将步骤三得到的大鼠尿液QC样本和大鼠的尿液样本以及步骤四得到的大鼠血液QC样本和大鼠血液样本进行高效液相色谱柱梯度洗脱得到大鼠样本的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物;
步骤六、将步骤五中计算得到的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物分别进行正离子扫描模式和正离子扫描模式下的质谱分析,得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息;
步骤七、利用模式识别分析-主成分分析方法将步骤六得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息进行分析得到正常组大鼠尿液、模型组大鼠尿液、正常组大鼠血液以及模型组大鼠血液的代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图;
步骤八、根据步骤七得到的正常组大鼠尿液与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定肾阳虚证大鼠尿液的代谢轮廓信息;
步骤九、根据步骤七得到的正常组大鼠与模型组大鼠血液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图获得肾阳虚证大鼠血液的的代谢轮廓信息;
步骤十、鉴定肾阳虚证潜在生物标记物,根据肾阳虚证大鼠尿液和肾阳虚证大鼠血液潜在生物标记物保留时间和质核比信息进行代谢物库的匹配;通过高效液相色谱以及质核比MS/MS数据来确定标记物的化学结构;共鉴定得到尿液生物标记物33个,血液生物标记物17个;
所述33个尿液代谢物鉴定结果分别为:12-羟基十二烷酸、乙酰基-L-酪氨酸、N-乙酰血清素、黄尿酸、马尿酸、二碘羟基喹啉、氢化肉桂酸、牛磺酸、烟酰胺、11β,21-二羟基-5β-孕酮-3,20-二酮、肌酐、胸苷、胞嘧啶、3-甲醛吲哚、醛赖氨酸、犬尿酸、3-甲氧基肾上腺素、羟苯基乙酰甘氨酸、N-丁二酰-L-谷氨酸-半醛、L-缬氨酸、3-羟基十二碳二酸、泛酸、癸二酸、苯丙酮酸、尿酸、α-亚麻酸、苯乙酰甘氨酸、葡萄糖醛酸内酯、N-乙酰-L-精氨酸、酮戊二酸、尿囊素、N-乙酰神经氨酸、吡咯啉羧酸;
所述17个血液代谢物鉴定结果分别为:9,12,15-十八碳三烯酸甲酯、皮质酮、亚麻酸、L-色氨酸、棕榈酰胺、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、PC(17:1(9Z)/0:0)、表脱氧胆酸、硫酸吲哚酚、棕榈酰肉碱、1-磷酸-鞘氨醇、尿苷、牛磺胆酸、PE(19:0/0:0)、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE(18:0/0:0);
其中,匹配原则:一级质量数结合质谱IDA采集得到的二级数据与代谢物库进行匹配。
2.根据权利要求1所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:在步骤一中,所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本具体为:
(1)、将清洁级大鼠完全随机分成2组,即正常组和模型组;
(2)、正常组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射橄榄油溶液,模型组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液,
(3)、采集每只大鼠12h的尿样,将新鲜尿液样于4℃、13000rpm离心10min条件下在-80℃贮存,进行分析之前室温解冻。
3.根据权利要求2所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:在步骤一中,所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的血液样本具体为:
1)每只大鼠均于腹主动脉采集血液,在离心4℃,4000r/min,10min条件下分离血清;
2)分装后冻存于-80℃冰箱,进行分析之前室温解冻。
4.根据权利要求1、2或3所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:在步骤一中,所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的脏器样本具体为:
①采集每只大鼠经腹主动脉血样后,迅速取出肾上腺、胸腺、睾丸并用分析天平称重,计算各脏器的脏器指数;
②下丘脑与垂体在大鼠灌注4%多聚甲醛溶液后,将下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺和睾丸共同置于4%多聚甲醛溶液固定备用。
5.根据权利要求4所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:步骤三中将大鼠原始浓度尿液制备得到大鼠尿液QC样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本制备得到大鼠的尿液样本具体为:
步骤三一、按照步骤一尿液样本的采集方法采集大鼠尿液,从大鼠原始浓度尿液中各取200μL,混合后涡旋10s后分装后得到大鼠尿液待处理样本,-80℃保存;
步骤三二、在室温下解冻步骤三一的大鼠尿液待处理样本和步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本,并利用4倍体积的蒸馏水进行稀释,涡旋10s后,在4℃、13000rpm条件下离心10min,过0.22μm滤膜,得到大鼠尿液质控QC样本和大鼠的尿液样本。
6.根据权利要求1或5所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:步骤四中将大鼠原始浓度血液制备得到大鼠血液QC样本;将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的血液样本制备得到大鼠血液样本具体过程为:
步骤四一、按照步骤一血液样本采集方法从大鼠血液样本中各取50μL,混合后涡旋10s后得到大鼠血液QC待处理样本;
步骤四二、在室温下解冻步骤四一血液QC待处理样本和步骤一得到的采集正常组和模型组清洁级大鼠的血液样本后,涡旋10s,取200μL上层血清置于1.5mL离心管中,加800μL甲醇,涡旋10s,超声1min,13000rpm离心10min,取上清液850μL,于40℃水浴下氮气吹干,残渣用200μL 80%甲醇复溶,4℃、13000rpm离心10min,过0.22μm滤膜,取上清液即得大鼠血液QC样本和处理后的血液样本。
7.根据权利要求6所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:步骤五所述进行高效液相色谱柱梯度洗脱采用的色谱条件为:
流动相:A为0.1%甲酸-水,B为0.1%甲酸-乙腈;柱温:40℃;流速:0.4ml/min;进样量:3μL。
8.根据权利要求1或7所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:步骤六中所述的正离子扫描模式条件为:离子喷雾电压:5.5KV;离子源温度:600℃;解簇电压(DP):100V;碰撞能量:35eV;氮气为雾化气和辅助气:雾化气55psi,辅助气55psi,气帘气35psi;在质核比m/z在100-1200amu质量范围ESI正离子模式下进行全扫描,积累时间250ms;
负离子扫描模式:离子喷雾电压:4.0KV;离子源温度:600℃;解簇电压(DP):100V;碰撞能量:35eV;氮气为雾化气和辅助气:雾化气65psi,辅助气65psi,气帘气35psi;在m/z为100-1200amu质量范围ESI正离子模式下进行全扫描,积累时间250ms;IDA采用标准:每个分析物,超过100cps的八个最强的碎片离子在100~1200amu质量范围内进行子离子扫描,累积时间为100ms;碰撞电压差为15eV。
9.根据权利要求8所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:步骤八中根据步骤七得到的正常组大鼠尿液与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定肾阳虚证大鼠模型尿液生物标记物具体过程为:
步骤八一、在PCA得分图中显示正常组大鼠与模型组大鼠尿液代谢数据完全分离后,对正常组与模型组的代谢数据矩阵进行模式识别分析-正交偏最小二乘法分析方法,选取一定VIP值进行潜在生物标记物的初步筛查;
步骤八二、以代谢物微观含量变化趋势一致且满足正常组与模型组组间大鼠尿液各代谢物具有显著性差异P<0.05的原则,将潜在生物标记物进行第二次筛选获得第二次潜在标记物,
步骤八三,获得的初步筛查的潜在标记物和第二次潜在标记物为肾阳虚证大鼠模型尿液潜在生物标记物。
10.根据权利要求1或8所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法,其特征在于:步骤九中根据步骤七得到的正常组大鼠与模型组大鼠血液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图获得肾阳虚证大鼠模型血液生物标记物具体过程为:
步骤九一、在确认PCA得分图显示两组完全分离后,对正常组与模型组的代谢数据矩阵进行模式识别分析方-正交偏最小二乘法分析,通过VIP值进行潜在生物标记物的初步筛查;
步骤九二、满足正常组与模型组组间大鼠血液各代谢物具有显著性差异(P<0.05)的原则进行第二次潜在标记物筛选,
步骤九三、初步筛查的潜在标记物和第二次潜在标记物做为肾阳虚证大鼠模型血液潜在生物标记物。
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