CN108802210A - 睾丸损伤相关差异性内源性标志物及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种睾丸损伤生物标志物,是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)、L‑乙酰肉碱(L‑Acetylcarnitine)或棕榈酸(Palmitic acid)等差异性内源性标志物的组合物。本发明还提供所述睾丸损伤标志物组合物在制备睾丸损伤检测试剂中的应用,以及睾丸损伤标志物的筛选方法。本发明的方法能够筛选出具有较强的灵敏性和特异性的睾丸损伤生物标志物,所述标志物可以在睾丸组织病理尚未出现明显损伤的情况下表现出显著性差异,能够更好的用于睾丸损伤的预防和发现。
Description
技术领域
本发明涉及一种内源性代谢标志物,尤其涉及一种与睾丸损伤相关的差异性内源性标志 物,及其筛选方法和在检测睾丸损伤中的应用。
背景技术
睾丸是男性主要的生殖器官,睾丸的主要功能是生精作用和刺激生殖器官的生长发育等, 近年来,男性生殖系统疾病发病率的逐年上升,主要是因为睾丸已经成为毒性物质损害的主 要靶器官。由于睾丸的功能受损是一个隐蔽而长期的过程,只有出现病理和生理的变化才能 判断睾丸受到损伤,特别是在胚胎发育或胎儿期性腺发育时期睾丸发育受到干扰,直接造成 男性生殖功能异常,但由于缺乏特异性和敏感性发现睾丸损伤的研究方法,目前亟需我们建 立一种能够早期、准确的睾丸损伤评价方法,以弥补现有检测方法的不足。
代谢组学是研究生物体自身生理病理状态和生物体对外源性物质的生化效应的有力手段, 它所关注的是代谢通路中分子量小于1000的小分子代谢物的变化。代谢组学应用核磁共振、 液相色谱质谱联用和气相色谱质谱联用等平台来检测内源性代谢物的改变可以跨过广泛的生 化通路,强调毒性作用机制并鉴定出睾丸毒性的潜在生物标识物。
因此,有必要利用代谢组学技术发现睾丸损伤生物,使睾丸损伤的发现较现有检测方法 提前,能够更好地用于睾丸损伤的预防和发现,可以提前进行相关治疗,弥补现有检测方法 的不足。
发明内容
本发明的一个目的在于:提供一种睾丸损伤生物标志物,能够有效用于睾丸损伤的预防 和发现。
本发明的另一个目的在于:提供所述睾丸损伤标志物组合物在制备睾丸损伤检测试剂中 的应用。
本发明的再一个目的在于:提供一种筛选睾丸损伤标志物的方法及其筛选模型的建立方 法,能够筛选出具有较强的灵敏性和特异性的睾丸损伤生物标志物。
本发明实现上述目的的方案如下:
首先,本发明提供一种睾丸损伤生物标志物,它是以下代谢物中的任意两种以上的组合 物:二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)、L-乙酰肉碱 (L-Acetylcarnitine)或棕榈酸(Palmitic acid);具体的组合物可以是:
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)和亚油酸(Linoleic acid)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)和L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物,
亚油酸(Linoleic acid)和L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)的组合物,
L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物,
亚油酸(Linoleic acid)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)和L-乙酰肉碱 (L-Acetylcarnitine)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)和棕榈酸 (Palmitic acid)的组合物的组合物,
亚油酸(Linoleic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)和棕榈酸(Palmiticacid)的组 合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)和棕榈酸(Palmitic acid) 的组合物,
或者,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物。
本发明优选的睾丸损伤生物标志物,进一步包括反油酸(Elaidic acid)和/或缬氨酸(Valine)。
本发明更优选的睾丸损伤生物标志物,更进一步包括以下代谢物中的任意一种或两种以 上的组合物:硬脂酸(Stearic acid)、乳酸(Lactic acid)、亮氨酸(Leucine)、琥珀酸(Succinic acid)或亚麻酸(Linolenic Acid)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid)、花生四烯酸 (Arachidonic acid)、芥酸(Erucic acid)、肌酸(Creatine)、精素(Spermin)或牛磺酸(Taurine)。
本发明最优选的所述睾丸损伤生物标志物,是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid)、 亚油酸(Linoleic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)、棕榈酸(Palmiticacid)、反油酸(Elaidic acid)、缬氨酸(Valine)、硬脂酸(Stearic acid)、乳酸(Lacticacid)、亮氨酸(Leucine)、琥 珀酸(Succinic acid)、亚麻酸(Linolenic Acid)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid)、花 生四烯酸(Arachidonic acid)、芥酸(Erucic acid)、肌酸(Creatine)、精素(Spermin)和牛 磺酸(Taurine)的组合物。
本发明进一步提供所述的生物标志物在制备检测睾丸损伤的试剂盒中的应用;所述的应 用,是将本发明所述的生物标志物作为检测目标来制备检测睾丸损伤的试剂盒。
本发明还提供一种检测睾丸损伤的试剂盒,其中含有用于检测本发明所述的生物标志物 的试剂。
本发明还提供一种睾丸损伤生物标志物筛选方法,是利用高分辨质谱建立包括脂肪类、 糖类、激素类、神经递质类和脏器损伤相关物质的数据库,建立各类内源性物质的检测方法, 利用Tracefounder软件定性分析睾丸样品中的内源性物质,最后利用MetaboAnalyst3.0网站 分析睾丸内源性代谢物的差异,绘制PCA和PLS-DA模型图,根据VIP>1选出具有显著性差 异的内源性代谢物,作为睾丸损伤的标志性内源性代谢物。
本发明所述的筛选方法具体包括样品前处理、数据采集、内源性代谢物的鉴定、多元统 计数据处理;步骤如下:
1)按照常规方法处理睾丸样品,使其符合LC-MS/MS2分析进样条件;
2)将步骤1)处理后的样品做LC-MS/MS2分析,完成代谢物谱图数据采集,获得代谢物色谱保留时间和质荷比;其中,
使用特征色谱条件为:色谱条件:A:水(2mmoL/L甲酸铵),D:乙腈;梯度洗脱,梯 度洗脱程序:0-1.0min,5%D;1.0-5.0min,5%-60%D;5.0-8.0min,60%-100%D;8.0-11.0min, 100%D;11.0-14.0min,100%-60%D;14.0-15.0min,60%-5%D;15.0-18.0min,5%D,分析时间 0~18min,进样量5μL,流速0.25mL/min,色谱柱:ACQUITY BEH C18 1.7μm,2.1×50mm;
使用特征质谱条件为:离子源:ESI(±),离子源参数:喷雾电压:2800V;蒸发温度:350℃;鞘气:35Arb;辅助气:10Arb;毛细管温度:350℃;S-lens RF:50;化合物参数: 一级全扫描(Full scan):分辨率:70000;AGC target:1e6;Maximun TT:100ms;扫描范围: 70-1050m/z;
3)针对步骤2)得到的代谢物谱数据进行内源性代谢物的鉴定,建立内源性代谢物的数 据库;
4)对步骤3)建立的内源性代谢物的数据库进行多元统计数据处理,找出睾丸损伤与否 的代谢模式差异和明显的分类趋势,最后按照常规方法进行差异代谢物筛选。
本发明所述的筛选方法中,步骤3)所述的内源性代谢物的鉴定优选利用高分辨质谱 mzCloud获取每一个内源性代谢物的小数点5位的精确质量数,并通过每个内源性代谢物的 分子式来识别,再利用Tracefinder软件建立内源性代谢物的数据库。
本发明所述的筛选方法中,步骤4)所述的多元统计数据处理优选利用Tracefinder软件 建立的数据库自动采集相应内源性代谢物的峰面积,再利用MetaboAnalyst3.0网站分析,绘 制PCA和PLS-DA模型图,找出睾丸损伤与否的代谢模式差异和明显的分类趋势,最后根据 VIP>1的标准选出具有显著性差异的内源性代谢物。
本发明还提供一种睾丸损伤早期诊断模型的建立方法,具体包括样品前处理、数据采集、 内源性代谢物的鉴定、多元统计数据处理;步骤如下:
1)收集不少于100例的睾丸组织样品,每个样品按照常规方法处理至符合LC-MS/MS2分析进样条件;
2)将步骤1)处理后的样品做LC-MS/MS2分析,完成代谢物谱图数据采集,获得代谢物色谱保留时间和质荷比;其中,
使用特征色谱条件为:色谱条件:A:水(2mmoL/L甲酸铵),D:乙腈;梯度洗脱,梯 度洗脱程序:0-1.0min,5%D;1.0-5.0min,5%-60%D;5.0-8.0min,60%-100%D;8.0-11.0min, 100%D;11.0-14.0min,100%-60%D;14.0-15.0min,60%-5%D;15.0-18.0min,5%D,分析时间 0~18min,进样量5μL,流速0.25mL/min,色谱柱:ACQUITY BEH C18 1.7μm,2.1×50mm;
使用特征质谱条件为:离子源:ESI(±),离子源参数:喷雾电压:2800V;蒸发温度:350℃;鞘气:35Arb;辅助气:10Arb;毛细管温度:350℃;S-lens RF:50;化合物参数: 一级全扫描(Full scan):分辨率:70000;AGC target:1e6;Maximun TT:100ms;扫描范围: 70-1050m/z;
3)针对步骤2)得到的代谢物谱数据进行内源性代谢物的鉴定,建立内源性代谢物的数 据库;
4)对步骤3)建立的内源性代谢物的数据库进行多元统计数据处理,找出睾丸正常的样 品与睾丸损伤的样品代谢模式的差异和明显的分类趋势,筛选出睾丸损伤样品中差异性内源 性代谢物作为睾丸损伤标志物,并基于这些标志物的数据建立睾丸损伤早期诊断模型。
本发明所述的模型建立方法中,步骤3)所述的内源性代谢物的鉴定优选利用高分辨质 谱mzCloud获取每一个内源性代谢物的小数点5位的精确质量数,并通过每个内源性代谢物 的分子式来识别,再利用Tracefinder软件建立内源性代谢物的数据库。
本发明所述的模型建立方法中,步骤4)所述的多元统计数据处理优选利用Tracefinder 软件建立的数据库自动采集相应内源性代谢物的峰面积,再利用MetaboAnalyst3.0网站分析, 绘制PCA和PLS-DA模型图,找出睾丸损伤与否的代谢模式差异和明显的分类趋势,根据 VIP>1的标准选出具有显著性差异的内源性代谢物,最终基于这些代谢物建立睾丸损伤早期 诊断模型。
与现有技术相比,本发明通过优化数据采集中的特征色谱和特征质谱条件,使采集到的 样本数据更加准确,为进一步的筛选差异性内源性物质奠定基础,再结合高分辨质谱的灵敏 度和正负离子全扫描的特点,使筛选出的睾丸损伤生物标志物具有较强的灵敏性和特异性, 它们可以在睾丸组织病理尚未出现明显损伤的情况下表现出显著性差异,能够更好的用于睾 丸损伤的预防和发现。
附图说明
图1A是实施例1中动物实验高分辨质谱检测所得正离子全扫描总离子流图。
图1B是实施例1中动物实验高分辨质谱检测所得负离子全扫描总离子流图。
图1C是实施例1中动物实验高分辨质谱检测所得缬氨酸色谱图。
图1D是实施例1中动物实验高分辨质谱检测所得缬氨酸相应的精确质量数和分子式。
图2a是实施例1中动物实验睾丸损伤各染毒组多元统计分析的PCA得分图。
图2b是实施例1中动物实验睾丸损伤各染毒组多元统计分析的PLS-DA三维得分图。
图3A是实施例1中动物实验正常对照组睾丸组织切片图。
图3B是实施例1中动物实验DEHP组睾丸组织切片图。
具体实施方式
除非特殊定义,本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符 号及缩写符号可以与其全名互换使用。
除非特殊指明,本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通 常使用的技术和方法,可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或 供应商提供的说明书进行。
实施例1.
一种筛选睾丸损伤生物标志物筛选方法,以实验动物的筛选为例,方案如下:
1.试剂:DEHP购自Sigma-Aldrich公司,75%乙醇购自上海振兴化工一厂,色谱级乙腈、 甲醇和甲酸购自Sigma-Aldrich公司。
2.动物实验:Male 5-6w old C57BL/6小鼠常规喂养,自由饮水,饲养室光10h,黑暗14h, 温度21-25℃,湿度30%-70%,24只小鼠随机分为2组,每组12只,分别为正常对照组 和500mg/kg灌胃染毒组(DEHP组),正常对照组给予等体积的溶媒,每天1次,连续35天。灌胃35天后,小鼠通过乙醚麻醉后取血,用全自动生化仪检测生化指标(见下表1),然后 通过二氧化碳吸入法处死小鼠,取出睾丸,并称重睾丸重量,记录脏器系数(见下表2)。部 分睾丸用10%福尔马林浸泡用于病理切片,剩余睾丸冻存于液氮中用于代谢组学检测。
表1
表2
3.睾丸样品的高分辨质谱检测
色谱条件:A:水(2mmoL/L甲酸铵),D:乙腈;梯度洗脱,梯度洗脱程序:0-1.0min,5% D;1.0-5.0min,5%-60%D;5.0-8.0min,60%-100%D;8.0-11.0min,100%D;11.0-14.0min, 100%-60%D;14.0-15.0min,60%-5%D;15.0-18.0min,5%D,分析时间0~18min,进样量5μL, 流速0.25mL/min,色谱柱:ACQUITY BEH C18 1.7μm,2.1×50mm。质谱条件:离子源: ESI(±),离子源参数:喷雾电压:2800V;蒸发温度:350℃;鞘气:35Arb;辅助气:10Arb; 毛细管温度:350℃;S-lens RF:50。化合物参数:一级全扫描(Full scan):分辨率:70000; AGC target:1e6;Maximun TT:100ms;扫描范围:70-1050m/z。小鼠睾丸样品用超纯水(含 50%乙腈)按1:10的质量体积比进行匀浆,取匀浆液50μL,加入含内标的(甲醇:乙腈=1:1) 沉淀剂450μL,涡旋混匀60s,13000rpm离心10min,吸取5μL进行测定。正离子内标为普 萘洛尔,负离子内标为甲苯磺丁脲。测定得正离子全扫描总离子流图(图1A)、负离子全扫 描总离子流图(图1B)、缬氨酸色谱图(图1C)和缬氨酸相应的精确质量数和分子式(图1D)。
4.数据分析:利用Tracefinder软件建立的数据库自动采集相应内源性代谢物的峰面积, 再利用MetaboAnalyst3.0网站分析,绘制PCA得分图(图2a)和PLS-DA模型图(图2b), 从图2a、2b可以看出,对照组和DEHP组能够明确分开,说明两组实验动物在代谢模式上表 现出了显著性差异并体现出分类趋势。
最后根据VIP>1的标准选出如下具有显著性差异的内源性代谢物(见表5)。
表5
由上表中可见,按照本实施例的筛选方法筛选得到17种与睾丸损伤的内源性代谢标志物, 现有研究已经证实这些代谢物与睾丸的多种代谢通路密切相关,其VIP值越大对应睾丸损伤 的机率越大,17种标志物中,二十二碳六烯酸、亚油酸、L-乙酰肉碱和棕榈酸的VIP值均高 达4.9以上,属于与睾丸损伤高度相关的代谢标志物,其余标志物的VIP值也都高于1.5,能 够对睾丸的损伤起到很好的标志作用。
病理研究:小鼠采用二氧化碳吸入法处死后取冲洗干净的睾丸放入10%中性福尔马林溶 液中固定,依次经组织修切,石蜡包埋,常规切片,HE染色,酒精梯度脱水,透明,封片进 行光学显微镜组织病理学观察,病理学切片如图3A和图3B所示,其中图3A体现了正常对 照组的睾丸组织微观结构,图3B体现了DEHP组睾丸组织微观结构,C箭头指示的是精母细胞,D箭头指示的是精子细胞。由图3A和图3B比较可以看出,DEHP组小鼠睾丸中精母 细胞和精子数量明显减少,验证了睾丸损伤的发生。
Claims (10)
1.一种睾丸损伤生物标志物,它是以下代谢物中的任意两种以上的组合物:二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)或棕榈酸(Palmitic acid)。
2.权利要求1所述的睾丸损伤生物标志物,它是以下各组合物中的任意一种:
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)和亚油酸(Linoleic acid)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)和L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物,
亚油酸(Linoleic acid)和L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)的组合物,
L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物,
亚油酸(Linoleic acid)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)和L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物的组合物,
亚油酸(Linoleic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)和棕榈酸(Palmiticacid)的组合物,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物,
或者,
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)、亚油酸(Linoleic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)和棕榈酸(Palmitic acid)的组合物。
3.权利要求1或2任意一项所述的睾丸损伤生物标志物,进一步包括反油酸(Elaidicacid)和/或缬氨酸(Valine)。
4.权利要求3所述的睾丸损伤生物标志物,更进一步包括以下代谢物中的任意一种或两种以上的组合物:硬脂酸(Stearic acid)、乳酸(Lactic acid)、亮氨酸(Leucine)、琥珀酸(Succinic acid)或亚麻酸(Linolenic Acid)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid)、花生四烯酸(Arachidonic acid)、芥酸(Erucic acid)、肌酸(Creatine)、精素(Spermin)或牛磺酸(Taurine)。
5.权利要求1所述的睾丸损伤生物标志物,是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid)、亚油酸(Linoleic acid)、L-乙酰肉碱(L-Acetylcarnitine)、棕榈酸(Palmiticacid)、反油酸(Elaidic acid)、缬氨酸(Valine)、硬脂酸(Stearic acid)、乳酸(Lacticacid)、亮氨酸(Leucine)、琥珀酸(Succinic acid)、亚麻酸(Linolenic Acid)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid)、花生四烯酸(Arachidonic acid)、芥酸(Erucic acid)、肌酸(Creatine)、精素(Spermin)和牛磺酸(Taurine)的组合物。
6.权利要求1所述的生物标志物在制备检测睾丸损伤的试剂盒中的应用,其特征在于:将所述的生物标志物作为检测目标来制备检测睾丸损伤的试剂盒。
7.检测睾丸损伤的试剂盒,其中含有用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂。
8.一种睾丸损伤生物标志物的筛选方法,具体包括样品前处理、数据采集、内源性代谢物的鉴定、多元统计数据处理;步骤如下:
1)按照常规方法处理睾丸样品,使其符合LC-MS/MS2分析进样条件;
2)将步骤1)处理后的样品做LC-MS/MS2分析,完成代谢物谱图数据采集,获得代谢物色谱保留时间和质荷比;其中,
使用特征色谱条件为:色谱条件:A:水(2mmoL/L甲酸铵),D:乙腈;梯度洗脱,梯度洗脱程序:0-1.0min,5%D;1.0-5.0min,5%-60%D;5.0-8.0min,60%-100%D;8.0-11.0min,100%D;11.0-14.0min,100%-60%D;14.0-15.0min,60%-5%D;15.0-18.0min,5%D,分析时间0~18min,进样量5μL,流速0.25mL/min,色谱柱:ACQUITY BEH C18 1.7μm,2.1×50mm;
使用特征质谱条件为:离子源:ESI(±),离子源参数:喷雾电压:2800V;蒸发温度:350℃;鞘气:35Arb;辅助气:10Arb;毛细管温度:350℃;S-lens RF:50;化合物参数:一级全扫描(Full scan):分辨率:70000;AGC target:1e6;Maximun TT:100ms;扫描范围:70-1050m/z;
3)针对步骤2)得到的代谢物谱数据进行内源性代谢物的鉴定,建立内源性代谢物的数据库;
4)对步骤3)建立的内源性代谢物的数据库进行多元统计数据处理,找出睾丸损伤与否的代谢模式差异和明显的分类趋势,最后按照常规方法进行差异代谢物筛选。
9.权利要求8所述的筛选方法,其特征在于:步骤3)所述的内源性代谢物的鉴定利用高分辨质谱mzCloud获取每一个内源性代谢物的小数点5位的精确质量数,并通过每个内源性代谢物的分子式来识别,再利用Tracefinder软件建立内源性代谢物的数据库。
10.权利要求8所述的筛选方法,其特征在于:步骤4)所述的多元统计数据处理利用Tracefinder软件建立的数据库自动采集相应内源性代谢物的峰面积,再利用MetaboAnalyst3.0网站分析,绘制PCA和PLS-DA模型图,找出睾丸损伤与否的代谢模式差异和明显的分类趋势,最后根据VIP>1的标准选出具有显著性差异的内源性代谢物。
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