CN103063782A - 水样品中PAEs类环境激素及代谢产物同时检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，对对照品和处理所得的液体层分别进行GC-FI分析，分别获得对照品以及液体层中PAEs类环境激素及其代谢产物的峰面积；根据以下计算公式获得待测水样中PAEs类环境激素及其代谢产物的含量：待测水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的含量＝（液体层中PAEs类环境激素及其代谢产物含量峰面积×PAEs类环境激素及其代谢产物在对照品中的浓度）/对照品中PAEs类环境激素及其代谢产物峰面积。该水环境中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法检测水环境中PAEs类环境激素及其代谢产物具有准确性、灵敏性高的优点。

Description

水样品中PAEs类环境激素及代谢产物同时检测的方法

技术领域

本发明涉及一种环境激素检测方法，具体是一种水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯类（Phthalic Acid Esters，简称PAEs，别名酞酸酯）是一类重要的有机化合物，主要用于塑料改性添加剂、农药、涂料、印染、化妆品、油漆和香料的生产。近年来研究发现PAEs类化合物具有雌激素样活性，已经将PAEs归类于环境激素（又称环境荷尔蒙或内分泌干扰物），它能对生物的正常行为及生殖、发育相关的正常激素的合成、贮存、分泌、体内输送、结合以及清除等过程产生障碍，因此PAEs类化合物在环境中的富集、迁移势必成为动物和人类的潜在威胁。美国国家环保局（EPA）已经将6种PAEs列入129种重点控制的污染物名单中。我国优先污染物黑名单中也列出了3种PAEs，即邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二乙基己基酯（DEHP），目前部分PAEs类化合物也被列入我国水环境中重点监控的环境污染物。

PAEs类化合物大多是无色油状粘稠的液体，常温下不易挥发，属于中等极性物质。PAEs与聚烯烃类塑料分子之间是由氢键或范德华力相连接，彼此保留各自相对独立的化学性质，因此较容易从塑料中迁移到外环境中，造成对空气、水和土壤的污染。由于水环境中含有大量的浮游生物、饵料以及水生微生物，这些水生生物或饵料含有脂类成分，可以与PAEs类化合物相融合，进而被鱼类等水生动物所吞噬，从而对水生动物产生毒害作用。邻苯二甲酸酯类化合物作为一种重要的环境激素类物质，在自然水体、城市污水以及生活饮用水中均检测到PAEs类化合物的存在。由于许多PAEs类化合物可以使一些水生动物的生殖、发育和内分泌系统受到干扰，长期存在可能使得养殖水域中的水生动物繁殖发育障碍、性别比例失调，进而引起水生动物的种群资源量下降和生存力减退。有研究指出，环境激素还能引起鱼类免疫力下降，使得鱼类疾病抵抗力大大降低。因此，PAEs类化合物对人工养殖水域和天然水域中养殖鱼类或野生鱼类产生毒害作用，可能导致鱼类生殖系统（器官）或其他系统（器官）产生病理变化，引起鱼类增养殖功能下降，最终造成鱼类资源总量急剧下降。

PAEs类污染物在环境中的储存、迁移及水产动物可食性组织内的残留将会影响到人们的生命健康。目前越来越多的研究也已经证实PAEs类化合物具有重要的激素样作用。研究表明邻苯二甲酸二丁酯（DBP）低剂量暴露对神经细胞株PC12体外生长具有显著的抑制作用；乳酸脱氢酶释放增多，谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，丙二醛含量增高；DNA凝胶电泳显示出现明显的DNA梯形条带。DBP还可引起子代雄鼠隐睾睾丸、附睾的脏器系数减轻；睾丸生精上皮萎缩，生精细胞层减少甚至消失，曲精小管体积减小；附睾管腔中精子缺如。DBP和DOP联合染毒在一定剂量下对小鼠骨髓微核试验和精子畸形试验呈阳性结果。同时DBP还可影响小鼠卵巢的内分泌功能及卵泡的发育、成熟，具有体内雌激素作用。除了对动物细胞和生殖系统产生重要影响之外，DBP对体外培养的人肝细胞HL-7702具有细胞毒性和氧化损失作用。DBP还对大鼠睾丸支持细胞具有重要影响，通过诱导雄激素结合蛋白mRAN和抑制素α-mRNA表达水平下调，使得雄激素结合蛋白和抑制素α合成减少，干扰精子发生。DBP还可引起大鼠睾丸精子运动能力和抗氧化能力的下降。DBP还可使对羟基苯甲酸酯类雌激素效应增强。邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和其他邻苯二甲酸酯类化合物对怀孕大鼠具有生殖毒性，对雄性大鼠睾丸滋养细胞也产生危害作用。研究发现DBP的主要代谢产物MBuP可以导致后代生殖系统发育出现毒副作用，而且可以诱导DBP的雌激素样作用。这一研究表明PAEs的代谢产物可能跟原型化合物具有协同作用，共同导致环境毒物的毒性增强。

有研究指出，PAEs在环境中易于被其中的微生物和各种水生生物所代谢， 产生各种代谢产物，这些代谢产物由于毒性较强，引起动物生殖内分泌系统的紊乱，由于这些代谢产物排入环境，进而增加了对生态系统“二次污染”的风险。目前，关于水环境及其生物体内PAEs类环境激素的检测方法，已有大量的文献报道，然而关于PAEs类环境激素及其代谢产物的同时检测方法，至今尚未见报道。因此，建立水环境中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时检测方法必将为环境监测以及维护人们的生命健康具有重要意义。

现有的检测PAEs类环境激素的方法有HPLC法、GC、GC-MS以及LC-MS/MS法，检测环境中PAEs类环境激素代谢产物的方法有HPLC法、LC-MS/MS方法，这些方法均难以同时检测PAEs类环境激素及其代谢产物。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，依次进行以下步骤：

1）在色谱甲醇中加入纯度为100%的邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄酯（BBP）、邻苯二甲酸二乙基己基酯（DEHP）及其相应的代谢产物邻苯二甲酸单丁酯（mDBP）、邻苯二甲酸单苄酯（mBBP）、邻苯二甲酸-单-乙基己基酯（mDEHP），均匀混合后成对照品；

2）在干燥带塞玻璃离心管中加入待测水样0.2mL，吹干离心管；

3）在上述步骤2）所得的离心管中加入4.0～6.0 mL的提取试剂；

4）将步骤3）所得的离心管振荡混匀后以4000～10000r/min进行离心，获取全部有机相，并对所获取的有机相进行干燥处理；

5）向上述干燥处理后的有机相加入0.4mL色谱甲醇、1.6mL丙酮，混匀后分别加入20μL三甲基硅重氮甲烷，水浴中超声反应10min，然后将有机相在氮气下吹干后，准确加入0.2mL正己烷溶解；

6）将步骤1）所得的对照品和步骤5）所得的液体层分别进行GC-FID分析，进样量为1.0μL，检测条件如下：升温程序为：80℃保持1min，以30℃/min升至235℃，保持15min，以4℃/min升至290℃，保留1min，进样口温度为280℃，检测器温度为300℃，分别获得对照品以及液体层中PAEs类环境激素及其代谢产物的峰面积；

7）、根据以下计算公式获得待测水样中PAEs类环境激素及其代谢产物的含量：

待测水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的含量＝（液体层中PAEs类环境激素及其代谢产物含量峰面积×PAEs类环境激素及其代谢产物在对照品中的浓度）/对照品中PAEs类环境激素及其代谢产物峰面积。

进一步的，所述步骤3）中的提取试剂为乙酸乙酯。

进一步的，所述步骤4）中离心后，去除液体层；然后于30～40℃水浴中弱氮气流吹干离心管，得干燥处理后的有机相。

进一步的，所述步骤5）中采用的是对PAEs代谢产物进行甲基衍生化，其衍生试剂为所述三甲基硅重氮甲烷。

进一步的，所述PAEs类环境激素及其代谢产物在对照品中的浓度为0.625～40.0μg/mL。

该水环境中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法检测水环境中PAEs类环境激素及其代谢产物具有准确性、灵敏性高的优点。

本发明的水环境中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，采用了气相色谱（GC-FID）方法，能够使检测限达到微克级，能够满足水环境中的污染物限量的检测要求。而且气相色谱（GC-FID）方法具有分离和分析定量的功能，能够将水环境中PAEs类环境激素及其代谢产物色谱峰和杂质干扰峰分离开，进行定量分析，能避免了环境样品中的杂质对检测结果的干扰，从而确保了检测结果的正确性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是三种PAEs类环境激素及其代谢产物的标准色谱图；

图2是环境水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的检测色谱图；

图3是不含PAEs类环境激素及其代谢产物的水样品气相检测色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

如图1所示是三种PAEs类环境激素及其代谢产物的标准色谱图；如图2所示是本实施例的水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的检测色谱图；其中：峰1为mDBP色谱峰，峰2为DBP色谱峰，峰3为mBBP色谱峰；峰4为mDEHP色谱峰；峰5为BBP色谱峰；峰6为DEHP色谱峰。

本发明的水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，该待测为液体水样，依次进行以下步骤：

1）、在色谱甲醇中加入纯度为100%的邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄酯（BBP）、邻苯二甲酸二乙基己基酯（DEHP）及其相应的代谢产物邻苯二甲酸单丁酯（mDBP）、邻苯二甲酸单苄酯（mBBP）、邻苯二甲酸-单-乙基己基酯（mDEHP），均匀混合后成对照品，PAEs类环境激素及其代谢产物在对照品中的浓度为1.25μg/mL，（此处，PAEs类环境激素及其代谢产物在对照品中的浓度可以为0.625～40.0μg/mL）；

2）、在干燥带塞玻璃离心管中加入上述标准品浓度为1.25μg/mL甲醇溶液，吹干离心管，然后将超纯水0.2mL加入吹干后的离心管中(此处模拟含有PAEs类环境激素及其代谢产物的待测水样)；

3）、在上述步骤2）所得的离心管中加入4.0～6.0 mL的提取试剂；

4）、将步骤3）所得的离心管振荡混匀后以4000～10000r/min进行离心，获取全部有机相；并对所获取的有机相进行干燥处理；

5）、向上述干燥处理后的有机相加入0.4mL色谱甲醇、1.6mL丙酮，混匀后分别加入20μL三甲基硅重氮甲烷，水浴中超声反应10min，然后将有机相在氮气下吹干后，准确加入0.2mL正己烷溶解；

6）、将步骤1）所得的对照品和步骤5）所得的液体层分别进行GC-FID分析，进样量为1.0μL，检测条件如下：升温程序为：80℃保持1min，以30℃/min升至235℃，保持15min，以4℃/min升至290℃，保留1min，进样口温度为280℃，检测器温度为300℃，分别获得对照品以及液体层中PAEs类环境激素及其代谢产物的峰面积；

7）、根据以下计算公式获得待测水样中PAEs类环境激素及其代谢产物的含量：

待测水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的含量＝液体层中PAEs类环境激素及其代谢产物含量峰面积×PAEs类环境激素及其代谢产物在对照品中的浓度/对照品中PAEs类环境激素及其代谢产物峰面积。

以安捷伦6890气相色谱系统为例，毛细管柱为HP-5色谱柱(0.25μm, 30m×0.25 mm)，载气为高纯氦气载气流量为1.0mL/min；不分流进样，进样体积为1μL。升温程序为：80℃保持1min，以30℃/min升至235℃，保持15min，以4℃/min升至290℃，保留1min。进样口温度280℃，检测器温度为300℃。

步骤1）所得对照品中，DBP、BBP、DEHP、mDBP、mBBP和mDEHP峰面积分别为1.7、2.3、2.8、3.2、1.2和3.1。

步骤6）所得的模拟待测水样品中，DBP、BBP、DEHP、mDBP、mBBP和mDEHP峰面积分别为4.9、22.6、29.4、3.8、12.3和10.6。

7）、根据以下计算公式获得待测水样品中DBP、BBP、DEHP、mDBP、mBBP和mDEHP的含量：

待测水样品中PAEs化合物的含量＝水样品中PAEs化合物的吸收峰面积比×PAEs化合物在对照品中的浓度/对照品中PAEs化合物的吸收峰面积比。

因此，待测水样品中DBP、BBP、DEHP、mDBP、mBBP和mDEHP的含量分别为：

DBP含量＝4.9×1.25（μg/mL）÷1.7＝3.61（μg/mL）

BBP含量＝22.6×1.25（μg/mL）÷2.3＝12.28（μg/mL）

DEHP含量＝29.4×1.25（μg/mL）÷2.8＝13.12（μg/mL）

mDBP含量＝3.8×1.25（μg/mL）÷3.2＝1.48（μg/mL）

mBBP含量＝12.3×1.25（μg/mL）÷1.2＝12.81（μg/mL）

mDEHP含量＝10.6×1.25（μg/mL）÷3.1＝4.27（μg/mL）

步骤3）中的提取试剂可以为乙酸乙酯；

步骤2）中于30～40℃水浴中弱氮气流吹干离心管；

步骤4）中离心后，去除液体层；然后于30～40℃水浴中弱氮气流吹干离心管，得干燥处理后的有机相；

步骤5）中采用的是PAEs代谢产物进行甲基衍生化，其衍生试剂为三甲基硅重氮甲烷。

步骤6）中采用的是PAEs及其代谢产物在毛细管柱中程序升温GC-FID中检测。

当待检样品为液态或固态时，采用本发明的方法能得知每mL或mg待检样品中含有多少μg的PAEs类环境激素及其代谢产物。当待检化妆品为固体时，可以先得出每cm³（等同于每mL）待检样品中含有多少μg的PAEs类环境激素及其代谢产物，然后根据其比重，换算后得知每g或mg待检样品中含有多少μg的PAEs类环境激素及其代谢产物。

对比实验：

选用一种已经确定不含PAEs类环境激素及其代谢产物的水样品（例如超纯水），其色谱图如图3所示（色谱分析检测条件同本发明）。在该种基质中加入不同重量的3种PAEs类环境激素及其代谢产物，从而形成含有不同浓度PAEs类环境激素及其代谢产物的待测样品。对上述待测样品分别用本发明的方法和气相色谱进行检测；结果如表1、表2所述：

表1. PAEs类环境激素及其代谢产物在水样中GC-FID检测

表2. PAEs类环境激素及其代谢产物在水样中HPLC检测

ND表示检测不出

由表1、2对比可知：本发明的方法相对于HPLC方法，具有测试结果准确、分离度高、能同时检测多种PAEs类环境激素及其代谢产物的优点。而且上述几种由于PAEs类化合物及其代谢产物极性相差较大，使得HPLC必须梯度洗脱下检测，基线漂移较严重，而且严重干扰分离和定量。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，依次进行以下步骤：

1）在色谱甲醇中加入纯度为100%的邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄酯（BBP）、邻苯二甲酸二乙基己基酯（DEHP）及其相应的代谢产物邻苯二甲酸单丁酯（mDBP）、邻苯二甲酸单苄酯（mBBP）、邻苯二甲酸-单-乙基己基酯（mDEHP），均匀混合后成对照品；

2）在干燥带塞玻璃离心管中加入待测水样0.2mL，吹干离心管；

3）在上述步骤2）所得的离心管中加入4.0～6.0 mL的提取试剂；

4）将步骤3）所得的离心管振荡混匀后以4000～10000r/min进行离心，获取全部有机相，并对所获取的有机相进行干燥处理；

5）向上述干燥处理后的有机相加入0.4mL色谱甲醇、1.6mL丙酮，混匀后分别加入20μL三甲基硅重氮甲烷，水浴中超声反应10min，然后将有机相在氮气下吹干后，准确加入0.2mL正己烷溶解；

6）将步骤1）所得的对照品和步骤5）所得的液体层分别进行GC-FI分析，进样量为1.0μL，检测条件如下：升温程序为：80℃保持1min，以30℃/min升至235℃，保持15min，以4℃/min升至290℃，保留1min，进样口温度为280℃，检测器温度为300℃，分别获得对照品以及液体层中PAEs类环境激素及其代谢产物的峰面积；

7）根据以下计算公式获得待测水样中PAEs类环境激素及其代谢产物的含量：

待测水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的含量＝（液体层中PAEs类环境激素及其代谢产物含量峰面积×PAEs类环境激素及其代谢产物在对照品中的浓度）/对照品中PAEs类环境激素及其代谢产物峰面积。

2.根据权利要求1所述的水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，其特征在于：所述步骤3）中的提取试剂为乙酸乙酯。

3.根据权利要求1所述的水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，其特征在于：所述步骤4）中离心后，去除液体层；然后于30～40℃水浴中弱氮气流吹干离心管，得干燥处理后的有机相。

4.根据权利要求1所述的水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，其特征在于：所述步骤5）中采用的是对PAEs代谢产物进行甲基衍生化，其衍生试剂为所述三甲基硅重氮甲烷。

5.根据权利要求1所述的水样品中PAEs类环境激素及其代谢产物的同时定量检测方法，其特征在于：所述PAEs类环境激素及其代谢产物在对照品中的浓度为0.625～40.0μg/mL。

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