CN112903884B - 一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法及其应用 - Google Patents

一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法，包括：取待测样品，对所述待测样品进行预处理；用活化后的固相萃取柱对所述预处理后的待测样品进行富集处理，然后依次用甲醇和1‑15％乙酸‑乙腈溶液对所述固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液；然后对所述洗脱液浓缩至近干后，使用甲醇溶液定容，经过膜处理后，得到处理后的待测样品；采用超高效液相色谱‑串联质谱联用检测方式，所述处理后的待测样品经液相色谱分离和多反应监测模式检测后，利用保留时间锁定和特征离子对信息锁定，检测出所述处理后的待测样品中含有的所述邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物。该方法检测速度快、选择性高。本发明还提供了该方法的应用。

Description

一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法及 其应用
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法及其应用。
背景技术
邻苯二甲酸酯(Phthalate Acid Esters，PAEs)是一类常见的增塑剂，也是一种全球性的环境污染物。该类化合物包括邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBzP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)和邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)等，主要以物理结合形式添加于各种工业产品、医疗器械、食品包装、日常用品中。随着时间的推移，PAEs可通过浸出、蒸发、磨损等方式从各种材料中逸出并渗透到环境中，并通过呼吸、饮食和皮肤接触等方式进入人体从而危害人类的健康。相关毒理学研究表明，PAEs可通过生物富集和食物链的放大作用，从而引起机体内PAEs的富集并对机体产生相应的生殖、发育、免疫等方面的危害。PAEs在进入人体内后可通过水解、氧化、羟基化等反应形成多种代谢产物，其中部分代谢产物比PAEs本体具有更高的生物活性和毒性，例如邻苯二甲酸单酯类化合物。
目前，邻苯二甲酸酯类化合物主要采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定方法，灵敏度有限，且对于液态样品处理过程复杂。同时，现有测定方法往往以邻苯二甲酸酯类化合物本体为暴露标志物或者仅以邻苯二甲酸单酯类(例如尿液检测中)为暴露标志物，不能实现对体液样品中潜在PAEs及其代谢产物较为全面分析检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法及其应用，该方法能快速、高选择性的同时检测待测样品中的邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物，能准确、全面地表征邻苯二甲酸酯类化合物的暴露水平。
第一方面，本发明提供了一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法，包括以下步骤：
(1)取待测样品，对所述待测样品进行预处理，所述待测样品包含目标化合物，所述目标化合物包括邻苯二甲酸酯类化合物和所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物；
(2)用活化后的固相萃取柱对所述预处理后的待测样品进行富集处理，然后依次用甲醇和1-15％乙酸-乙腈溶液对所述固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液；然后对所述洗脱液浓缩至近干后，使用甲醇溶液定容，经过膜处理后，得到处理后的待测样品；
(3)采用超高效液相色谱-串联质谱联用检测方式，所述处理后的待测样品经液相色谱分离和多反应监测模式(MRM)检测后，利用保留时间锁定和特征离子对信息锁定，检测出所述处理后的待测样品中含有的所述目标化合物，所述特征离子对信息包括母离子和子离子信息。
本发明实施方式中，所述步骤(3)，利用保留时间锁定和特征离子对信息锁定是指：处理后的待测样品在多反应监测模式下测得的所述目标化合物的保留时间和特征离子对信息，分别与邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的标准品保留时间和特征离子对信息比对，然后根据比对结果，可以确定所述待测测样品中的所述目标化合物具体包含的邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的种类和/或含量。
可选地，所述邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的标准保留时间和特征离子对信息是基于在相同检测条件下，由含有邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的标准溶液的测定数据组成。
本发明实施方式中，所述处理后的待测样品可以通过高校液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)进行检测。
可选地，所述邻苯二甲酸酯类化合物包括邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl ortho-phthalate，DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(Dicthyl ortho-phthalate，DEP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(Di(2-methoxyethyl)phthalate，DMEP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(Bis(2-Ethoxyethyl)phthalate，DEEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(Diisobutyl phthalate，DIBP)、邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(Benzylbutyl phthalate，BBP)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(Bis(2-n-butoxyethyl)phthalate，DBEP)、邻苯二甲酸二戊酯(Dipentyl phthalate，DPP)、邻苯二甲酸二环己酯(Dicyclohexyl phthalate，DCHP)、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(Bis(4-Methyl-2-pentyl)phthalate，BMPP)、邻苯二甲酸二己酯(Dihexyl phthalate，DHXP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(Bis-(2-Ethylhexyl)phthalate，DEHP)、邻苯二甲酸正二辛酯(Di-n-octylphthalate，DNOP)和邻苯二甲酸二壬酯(Dinonyl phthalate，DNP)中的一种或多种。
其中，所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物包括邻苯二甲酸单丁酯(Monobutylphthalate，MBP)、邻苯二甲酸单异丁酯(Monoisobutyl phthalate，MIBP)、邻苯二甲酸单正戊基酯(Mono-n-pentyl phthalate，MNPP)、邻苯二甲酸单己基酯(Monohexyl phthalate，MHP)、邻苯二甲酸单-庚酯(Mono-2-heptyl phthalate，M2HP)、邻苯二甲酸单异丙酯(Monoisopropyl phthalate，MIPP)、邻苯二甲酸单环己酯(Monocyclohexyl phthalate，MCHP)、邻苯二甲酸单苄酯(Monobenzyl phthalate，MBZP)、邻苯二甲酸单乙酯(Monoethylphthalate，MEP)、邻苯二甲酸单乙基己基酯(Monoethylhexyl phthalate，MEHP)、邻苯二甲酸单甲酯(Monomethyl phthalate，MMP)和邻苯二甲酸单异壬酯(Monoisononylphthalate，MNP)中的一种或多种。
本发明一实施方式中，所述邻苯二甲酸酯类化合物可以但不限于包括邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯、邻苯二甲酸二己酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸正二辛酯和邻苯二甲酸二壬酯中的多种或全部。所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物包括邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸单异丁酯、邻苯二甲酸单正戊基酯、邻苯二甲酸单己基酯、邻苯二甲酸单-庚酯、邻苯二甲酸单异丙酯、邻苯二甲酸单环己酯、邻苯二甲酸单苄酯、邻苯二甲酸单乙酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、邻苯二甲酸单甲酯和邻苯二甲酸单异壬酯中的多种或全部。
本发明一实施方式中，所述邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的标准品的种类是大于或等于待测样品中所述目标化合物包含的邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的种类。例如，邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的标准品包括上述实施方式中罗列的全部种类，而待测样品中的目标化合物仅包括邻苯二甲酸酯类化合物的一部分和邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物的一部分，通过处理后的待测样品在多反应监测模式下测得的保留时间和特征离子对信息，分别与邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的标准品保留时间和特征离子对信息比对，然后根据比对结果，可以快速确定所述待测测样品中目标化合物具体包含的邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的种类，并进一步测定其含量。
可选地，所述步骤(2)之后，所述步骤(3)之前还包括配制多个浓度梯度的标准溶液，然后对所述标准溶液进行测定并绘制标准曲线，所述标准曲线用于外标法测定所述待测样品中所述目标化合物的含量。
可选地，所述步骤(3)中，所述液相色谱分离条件为：BEH C18色谱柱，所述BEH C18色谱柱的规格为2.1mm×100mm×1.7μm，按梯度洗脱程序洗脱，柱温为40℃；进样体积为5.0～10.0μL；洗针液为体积比1:1的乙腈和水的混合溶液。
可选地，所述邻苯二甲酸酯类化合物检测时的流动相为乙腈和水的混合溶液，所述梯度洗脱程序为：起始梯度按乙腈：水＝15：85比例洗脱，维持0.5min，然后在0.5～1.0min内，变化为乙腈：水＝90：10比例洗脱，然后在1.0～2.0min内，变化为乙腈：水＝100：0比例洗脱，维持至4.0min；然后在4.1min时恢复至所述起始梯度平衡系统至7.0min；流速为0.3mL/min。
可选地，所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物检测时的流动相为甲醇和水的混合溶液，所述梯度洗脱程序为：起始梯度按甲醇：水＝40：60比例洗脱，维持0.2min，然后在0.2～2.0min内，变化为甲醇：水＝95：5比例洗脱，维持至10.0min，然后在10.0～10.1min内，变化为甲醇：水＝100：0比例洗脱，维持至12.5min；然后在12.6min时恢复至所述起始梯度平衡系统至15.0min；流速为0.3mL/min。
可选地，所述步骤(3)中，所述串联质谱条件为：电离模式为电喷雾电离，正离子和负离子模式混合；检测方式为多反应监测模式；离子源温度为80～150℃，毛细管电压为3.0～4.0kV，锥孔电压为20～40V，脱溶剂温度为300～500℃，脱溶剂气流速为500～700L/h，锥孔气流速为30～80L/h。
可选地，所述待测样品包括哺乳动物体液样品，所述体液样品包括血液样品、尿液样品、脑脊液样品和组织提取液样品中的至少一种。
可选地，所述待测样品为血液样品时，所述预处理过程包括：将所述血液样品进行离心处理，收集上清液，然后用有机溶剂多次萃取后得到萃取液，将所述萃取液浓缩至体积小于1mL。
可选地，所述待测样品为尿液样品时，所述预处理过程包括：取尿液样品，加入乙酸铵缓冲液得到混合溶液，调节pH＝4.0-5.0，然后加入β-葡萄糖醛解酶进行酶解。
可选地，所述固相萃取柱的活化过程包括为：依次用5.0～15.0mL的甲醇和超纯水进行活化，所述活化过程中，所述固相萃取柱保持不干状态。
可选地，所述固相萃取柱为HLB固相萃取柱。
一实施方式中，所述固相萃取柱为可以为HLB固相萃取小柱，型号为3cc/60mg。
本发明一实施方式中，所述依次采用5.0～15.0mL的甲醇和5.0～15.0mL的超纯水对HLB固相萃取柱进行活化处理，且在活化HLB固相萃取柱的过程中，始终保持HLB固相萃取柱处于不干状态。
本发明第一方面所述的同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法，高选择性、快速的检测待测样品中的邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物。相比于传统仅单独对邻苯二甲酸酯类化合物，或单独针对其代谢产物的检测方法，本发明所述方法能更为全面地检测出待测样品内的苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物，更为准确地反映出待测样品的邻苯二甲酸酯类化合物的暴露水平。同时，本发明所述方法操作简单，易发展成为一种苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的标准化检测手段。
特别是针对哺乳动物(包括人)体液样品，由于邻苯二甲酸酯类化合物在进入体内会存在部分代谢的情况，若单独检测邻苯二甲酸酯类化合物，或单独针对其代谢产物的进行检测，均不能全面、准确地反映出体液样品内的邻苯二甲酸酯类化合物的暴露水平，而本发明第一方面所述的方法就能很好地改善上述问题，且该方法更加高效，更加灵敏。
第二方面，本发明还提供了一种包含本发明第一方面所述同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法在生化分析检测或生命科学领域中的应用。
例如，本发明所述同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法可以用于检测人体的尿液样品或血液样品，用于评价上述样品中的邻苯二甲酸酯类化合物的暴露水平，获得的检测数据可以服务于生化分析检测或生命科学领域，或者其他领域。
由于邻苯二甲酸酯类化合物是一种全球性的环境污染物，其通过呼吸、饮食和皮肤接触等方式进入人体从而危害人类的健康，甚至对机体产生相应的生殖、发育、免疫等方面的危害。因此，全面、准确地反映出待测样品内的邻苯二甲酸酯类化合物的暴露水平对于研究人体健康具有重要意义，同时也可为毒理学相关研究提供重要的技术支撑。
同时，目前评估人体内邻苯二甲酸酯暴露水平的方法主要是以尿液作为基质。但是，尿液中的邻苯二甲酸酯及其代谢产物的时间稳定性与其化学结构有关，需严格控制尿液样品采集时间，而且尿液中代谢物的含量与肌酐值有关，仅能反映短期暴露情况(几天或几周)，无法直接反应邻苯二甲酸酯及其代谢产物在人体内的累积情况。且尿液中高分子量邻苯二甲酸酯类化合物如DINP、DEHP、DNOP和邻苯二甲酸二苯酯(DPHP)等二级代谢产物(OH-单酯类、oxo-单酯类和cx-单酯类等)的含量高于初级代谢产物，更适合作为暴露标志物。
本发明所述方法由于可以同时对邻苯二甲酸酯类类化合物及其代谢产物进行检查，因此，可以将他们一并作为生物标志物，对血清、尿液等体液样品中潜在的PAEs进行分析，可精准地评估邻苯二甲酸酯及其代谢产物在样品内的含量，甚至可以评估相应人体内邻苯二甲酸酯的暴露水平。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
为更清楚地阐述本发明的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
图1为本发明一实施例提供的同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法的工艺流程图；
图2为本发明一实施例提供的邻苯二甲酸酯类化合物DMP、DEP、DMEP、PEEP和DIBP的离子流色谱图；
图3为本发明一实施例提供的邻苯二甲酸酯类化合物DBP、BBP、DBEP、DPP和DCHP的离子流色谱图；
图4为本发明一实施例提供的邻苯二甲酸酯类化合物BMPP、DHXP、DEHP、PNOP和DNP的离子流色谱图；
图5为本发明一实施例提供的邻苯二甲酸酯类化合物代谢产物MMP、MEP、MIPP、MBP、MNPP和MCHP的离子流色谱图；
图6为本发明一实施例提供的邻苯二甲酸酯类化合物代谢产物MHP、MBZP、M2HP、MEHP和MINP的离子流色谱图；
图7为本发明一实施例提供的不同类型固相萃取柱对邻苯二甲酸酯类化合物回收率柱状图；
图8为本发明一实施例提供的不同洗脱条件对邻苯二甲酸酯类化合物回收率柱状图。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。其中，本发明实施例不限定于以下的具体实施例。在不变主权利的范围内，可以适当的进行变更实施。
若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。
参见图1，本发明另一实施例还提供了一种检测方法的制备方法，包括；
S10、取待测样品，对所述待测样品进行预处理，所述待测样品包含目标化合物，所述目标化合物包括邻苯二甲酸酯类化合物和所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物；
S20、用活化后的固相萃取柱对所述预处理后的待测样品进行富集处理，然后依次用甲醇和1-15％乙酸-乙腈溶液对所述固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液；然后对所述洗脱液浓缩至近干后，使用甲醇溶液定容，经过膜处理后，得到处理后的待测样品；
S30、采用超高效液相色谱-串联质谱联用检测方式，所述处理后的待测样品经液相色谱分离和多反应监测模式检测后，利用保留时间锁定和特征离子对信息锁定，检测出所述处理后的待测样品中含有的所述目标化合物，所述特征离子对信息包括母离子和子离子信息。
其中，所述步骤S10中，所述待测样品包括哺乳动物体液样品，其中，所述哺乳动物包括人类；所述体液样品包括血液样品、尿液样品、脑脊液样品和组织提取液样品中的至少一种。
可选地，所述待测样品为血液样品时，所述预处理过程包括：将所述血液样品进行离心处理，收集上清液，然后用有机溶剂多次萃取后得到萃取液，将所述萃取液浓缩至体积小于1mL。
一实施方式中，使用己烷、乙腈和甲基叔丁基醚中的一种或多种对所述血液样品的上清液进行萃取。可选地，使用己烷、乙腈和甲基叔丁基醚的混合溶液对所述血液样品的上清液进行萃取；其中，所述己烷、乙腈和甲基叔丁基醚的体积比为1：1：1。
本发明所述实施方式中，采用己烷、乙腈和甲基叔丁基醚的混合溶液可以更加充分地将待测样品中的含有的邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物萃取出来
可选地，采用氮吹浓缩的方式将所述萃取液浓缩至体积小于1mL。例如，使用氮吹仪对所述萃取液进行浓缩。
可选地，所述待测样品为尿液样品时，所述预处理过程包括：取尿液样品，加入乙酸铵缓冲液得到混合溶液，调节pH＝4.0-5.0，然后加入β-葡萄糖醛解酶进行酶解。
可选地，所述酶解过程的温度为35-38℃，酶解时间为2-6小时。例如，所述酶解过程的温度为37℃，酶解时间为4小时。
可选地，所述步骤S20中，所述富集处理后，所述洗脱过程之前还包括：用5.0～15.0mL的甲醇溶液冲洗盛放所述预处理后的待测样品的容器及所述富集处理后的所述固相萃取柱，然后抽干所述富集处理后的固相萃取柱中残留水分。可选地，所述甲醇溶液为体积含量为5％的甲醇溶液。可选地，采用真空抽干方式抽干所述富集处理后的固相萃取柱中残留水分，抽干时间为10-20min。
可选地，所述S20中，采用氮吹浓缩的方式将所述洗脱液浓缩至近干。例如，使用40℃水浴氮吹仪进行氮吹，氮气的气流流速始终保持在使所述洗脱液液面呈下凹状态。其中，所述近干是指所述洗脱液经所述浓缩过程后的体积忽略不计。例如，所述洗脱液经浓缩处理后的体积小于0.1mL。
可选地，所述S20中，所述1-15％乙酸-乙腈溶液是指体积含量为1-15％乙酸-乙腈溶液，或乙酸-乙腈溶液中，乙酸的体积含量为1-15％。进一步地，可选地，所述乙酸-乙腈溶液中，乙酸的体积含量为1％，或为5％，或为10％，或为15％。
可选地，所述S20中，使用体积比为1:1的甲醇溶液进行定容。所述定容过程后，通过孔径为0.22μm的滤膜进行过膜处理。
可选地，所述S30中，所述液相色谱分离条件为：BEH C18色谱柱，所述BEHC18色谱柱的规格为2.1mm×100mm×1.7μm，按梯度洗脱程序洗脱，柱温为40℃；进样体积为5.0～10.0μL；洗针液为体积比1:1的乙腈和水的混合溶液。
可选地，所述邻苯二甲酸酯类化合物检测时的流动相为乙腈和水的混合溶液，所述梯度洗脱程序为：起始梯度按乙腈：水＝15：85比例洗脱，维持0.5min，然后在0.5～1.0min内，变化为乙腈：水＝90：10比例洗脱，然后在1.0～2.0min内，变化为乙腈：水＝100：0比例洗脱，维持至4.0min；然后在4.1min时恢复至所述起始梯度平衡系统至7.0min；流速为0.3mL/min。
可选地，所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物检测时的流动相为甲醇和水的混合溶液，所述梯度洗脱程序为：起始梯度按甲醇：水＝40：60比例洗脱，维持0.2min，然后在0.2～2.0min内，变化为甲醇：水＝95：5比例洗脱，维持至10.0min，然后在10.0～10.1min内，变化为甲醇：水＝100：0比例洗脱，维持至12.5min；然后在12.6min时恢复至所述起始梯度平衡系统至15.0min；流速为0.3mL/min。
可选地，所述S30中，所述串联质谱条件为：电离模式为电喷雾电离，正离子和负离子模式混合；检测方式为选择多反应监测模式；离子源温度为80～150℃，毛细管电压为3.0～4.0kV，锥孔电压为20～40V，脱溶剂温度为300～500℃，脱溶剂气流速为500～700L/h，锥孔气流速为30～80L/h。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。
实施例1
一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法，包括以下步骤：
取血液样品(血站提供)置于4℃，10000×g离心10min，取上层血清300μL，并加入相当于体积约900μL的己烷/乙腈/甲基叔丁基醚混合溶液(v/v/v为1：1：1)进行液液萃取10min。重复萃取三次后，收集上层萃取液并置于氮吹仪下40℃水浴氮吹浓缩至约0.5mL，得到预处理的血液样品；
对HLB固相萃取小柱(购自沃特世Waters Oasis)(3cc/60mg)依次使用10.0mL的甲醇活化和10.0mL的超纯水平衡HLB固相萃取小柱，在活化和平衡HLB固相萃取小柱的过程中始终保持HLB固相萃取小柱湿润不干涸；当固相萃取柱中超纯水的液面距离上层筛板约1mm左右时，关闭固相萃取装置，并向HLB固相萃取小柱中灌满超纯水，待用。然后将中所得到的血清样品加入已活化的HLB固相萃取小柱中进行富集，富集结束后，用10.0mL的5％甲醇-水溶液冲洗样品瓶及固相萃取柱，真空抽干15min，使固相萃取柱中残留的水分挥干。将富集好的HLB固相萃取小柱进行洗脱，洗脱条件为依次加入10.0mL的甲醇和10.0mL的10％乙酸-乙腈溶液进行洗脱，并收集洗脱液。然后将所收集的洗脱液置于氮吹仪中40℃水浴氮吹浓缩至近干，用甲醇/水(v/v，1：1)定容样品至0.5mL，样品混匀后经GHP注射器过滤器(GHPSyringe Filter)过滤后，得到处理后的待测样品，待仪器分析；
处理后的待测样品通过超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS，沃特世(Waters)Xevo Q-TOF)进行分析，获取多反应监测(MRM)数据，并利用保留时间锁定和特征离子对锁定的方式定性筛查样品中可能存在的PAEs及其代谢产物。同时，通过对梯度浓度的标准样品进行检测并绘制标准曲线，利用外标法计算出实际样本中的邻苯二甲酸酯及其代谢产物在样本中的含量。所用的分析柱为超高效液相色谱柱(沃特世(Waters)ACQUITYUPLC)BEH C18(规格为2.1×100mm，1.7μm)。其中，PAEs类化合物分析时流动相：A相为乙腈，B相为水。梯度洗脱程序：起始比例A相为15％，B相为85％，持续0.5min；0.5～1.0min，A相升至90％，B相降至10％；1.0～2.0min，A相升至100％，B相降至0％，持续至4.0min；4.1min时恢复至起始梯度平衡系统至7.0min。整个洗脱过程流速始终为0.3mL/min；柱温为40℃；进样体积为5～10μL；洗针液为乙腈/水混合液(v/v，1:1)。串联质谱条件：电离模式为电喷雾电离，正离子和负离子模式混合；检测方式为选择反应监测模式；离子源温度为120℃，毛细管电压为3.0kV，锥孔电压为30V，脱溶剂温度为350℃，脱溶剂气流速为650L/h，锥孔气流速为50L/h。
其中，PAEs代谢产物分析时流动相A相为甲醇，B相为水。梯度洗脱程序：起始比例A相为40％，B相为60％，持续至0.2min；0.2～2.0min，A相升至80％，B相降至20％，持续至6.0min；6.0～6.1min，A相升至95％，B相降至5％，持续至10.0min；10.0～10.1min，A相升至100％，B相降至0％，持续至12.5min；12.6min时恢复至起始梯度平衡系统至15.0min。整个洗脱过程流速始终为0.3mL/min；柱温为40℃；进样体积为5～10μL；洗针液为乙腈/水(v/v，1:1)。串联质谱条件：电离模式为电喷雾电离，正离子和负离子模式混合；检测方式为多反应监测模式(MRM)；离子源温度为120℃，毛细管电压为3.5kV，锥孔电压为30V，脱溶剂温度为350℃，脱溶剂气流速为650L/h，锥孔气流速为50L/h。然后，记录PAEs类化合物及其代谢产物的监测离子对、碰撞能等参数数据。
实施例2
一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法，包括以下步骤：
取尿液样品1.0mL，加入200μL的乙酸铵缓冲液(pH＝4.5)，再加入20μLβ-葡萄糖醛解酶，并置于37℃恒温水浴锅中加热酶解4h，得到预处理的尿液样品；
对HLB固相萃取小柱(购自沃特世Waters Oasis)(3cc/60mg)依次使用10.0mL的甲醇活化和10.0mL的超纯水平衡HLB固相萃取小柱，在活化和平衡HLB固相萃取小柱的过程中始终保持HLB固相萃取小柱湿润不干涸；当固相萃取柱中超纯水的液面距离上层筛板约1mm左右时，关闭固相萃取装置，并向HLB固相萃取小柱中灌满超纯水，待用。然后将中所得到的血清样品加入已活化的HLB固相萃取小柱中进行富集，富集结束后，用10.0mL的5％甲醇-水溶液冲洗样品瓶及固相萃取柱，真空抽干15min，使固相萃取柱中残留的水分挥干。将富集好的HLB固相萃取小柱进行洗脱，洗脱条件为依次加入10.0mL的甲醇和10.0mL的10％乙酸-乙腈溶液进行洗脱，并收集洗脱液。然后将所收集的洗脱液置于氮吹仪中40℃水浴氮吹浓缩至近干，用甲醇/水(v/v，1：1)定容样品至0.5mL，样品混匀后经GHP注射器过滤器(GHPSyringe Filter)过滤后，得到处理后的待测样品，待仪器分析；
处理后的待测样品通过超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS，沃特世(Waters)Xevo Q-TOF)进行分析，获取多反应监测(MRM)数据，并利用保留时间锁定和特征离子对锁定的方式定性筛查样品中可能存在的PAEs及其代谢产物。所用的分析柱为超高效液相色谱柱(沃特世(Waters)ACQUITY UPLC)BEH C18(规格为2.1×100mm，1.7μm)。其中，PAEs类化合物分析时流动相：A相为乙腈，B相为水。梯度洗脱程序：起始比例A相为15％，B相为85％，持续0.5min；0.5～1.0min，A相升至90％，B相降至10％；1.0～2.0min，A相升至100％，B相降至0％，持续至4.0min；4.1min时恢复至起始梯度平衡系统至7.0min。整个洗脱过程流速始终为0.3mL/min；柱温为40℃；进样体积为5～10μL；洗针液为乙腈/水混合液(v/v，1:1)。串联质谱条件：电离模式为电喷雾电离，正离子和负离子模式混合；检测方式为反应监测模式；离子源温度为120℃，毛细管电压为3.0kV，锥孔电压为30V，脱溶剂温度为350℃，脱溶剂气流速为650L/h，锥孔气流速为50L/h。
其中，PAEs代谢产物分析时流动相A相为甲醇，B相为水。梯度洗脱程序：起始比例A相为40％，B相为60％，持续至0.2min；0.2～2.0min，A相升至80％，B相降至20％，持续至6.0min；6.0～6.1min，A相升至95％，B相降至5％，持续至10.0min；10.0～10.1min，A相升至100％，B相降至0％，持续至12.5min；12.6min时恢复至起始梯度平衡系统至15.0min。整个洗脱过程流速始终为0.3mL/min；柱温为40℃；进样体积为5～10μL；洗针液为乙腈/水(v/v，1:1)。串联质谱条件：电离模式为电喷雾电离，正离子和负离子模式混合；检测方式为多反应监测模式(MRM)；离子源温度为120℃，毛细管电压为3.5kV，锥孔电压为30V，脱溶剂温度为350℃，脱溶剂气流速为650L/h，锥孔气流速为50L/h。然后，记录PAEs类化合物及其代谢产物的监测离子对、碰撞能等参数数据。
效果实施例
(1)PAEs类化合物及其代谢产物的监测离子对、碰撞能参数
按实施例1所述方法，获得PAEs类化合物及其代谢产物的监测离子对、碰撞能参数数据见下表1和表2。PAEs类化合物及其代谢产物对应的提取离子流色谱图，进一步参见图2-图6所示。
表1.PAEs本体监测特征离子对及碰撞能参数
Figure BDA0002279180040000141
表2.PAEs代谢产物监测特征离子对及碰撞能参数
Figure BDA0002279180040000142
结果显示，本发明实施例所述方法，可以有效固相萃取PAEs及其代谢产物，获得干净的洗脱液并去除杂质的干扰；然后同时提取并检测出血清样品中含有的多种PAEs类化合物本体及其代谢产物。同时，本发明实施例所述采用保留时间锁定与特征离子对锁定的方法，可以高效、快速对样品中可能存在的PAEs类化合物及其代谢产物进行定性筛查和定量分析。
相比于传统的检测方法，本发明实施例所述方法在对待测样品中PAEs本体及其代谢产物的初步筛查和定量分析方面具有潜在的应用价值；特别是针对哺乳动物(包括人)体液样品，由于邻苯二甲酸酯类化合物在进入体内会存在部分代谢的情况，单独检测邻苯二甲酸酯类化合物，或单独针对其代谢产物的进行检测，均不能全面、准确地反映出体液样品内的邻苯二甲酸酯类化合物的暴露水平，而本发明实施例所述方法就能很好地改善上述问题，且该方法更加高效，更加灵敏。进一步地，本发明实施例所述方法可为PAEs及其代谢产物对人体健康的影响及相关毒理学研究提供重要的参考信息。
例如，相对于气质联用方法，本发明实施例所述液质联用方法具有更高的灵敏度，并且可以很好的分离邻苯二甲酸酯类的同分异构体，从而获得更加准确的定量分析。另外，针对液体样品，在一定条件下(例如灵敏度足够高)，本发明所述方法甚至可以直接进样，无需做任何前处理，而气质联用的方法则必须进行相应溶剂转换方可进样。
(2)不同类型固相萃取柱对PAEs类化合物回收率的影响
在样品中添加PAEs类化合物标准品，按实施例1所述方法，采用HLB固相萃取小柱进行萃取，并最后计算PAEs类化合物的回收率，将其设为实验组；同时，按同样操作，设置对照组，对照组和实验组的区别在于：对照组采用C18固相萃取小柱。
结果如图7所示，采用HLB固相萃取小柱进行萃取的实验组中，PAEs类化合物的回收率普遍偏高，该方法可以更有效的测定待测样品中的PAEs类化合物。
(3)不同洗脱条件对PAEs的回收率的影响
在样品中添加PAEs类化合物标准品，按实施例1所述方法，且分别使用甲醇、1％乙酸-乙腈溶液、5％乙酸-乙腈溶液和10％乙酸-乙腈溶液单独对富集后的固相萃取小柱洗脱，并最后计算PAEs类化合物的回收率。
结果如图8所示，采用不同洗脱条件下中，PAEs类化合物的回收率之间存在巨大差别，而本发明实施例所述方法采用依次甲醇和1-15％乙酸-乙腈溶液对所述固相萃取柱进行洗脱，可以更有效、更全面地提取到待测样品中的PAEs类化合物，因此，最终可以更加准确的测定待测样品中的PAEs类化合物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取待测样品，对所述待测样品进行预处理，所述待测样品包含目标化合物，所述目标化合物包括邻苯二甲酸酯类化合物和所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物；
其中，所述邻苯二甲酸酯类化合物包括邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯、邻苯二甲酸二己酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸正二辛酯和邻苯二甲酸二壬酯中的一种或多种；所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物包括邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸单异丁酯、邻苯二甲酸单正戊基酯、邻苯二甲酸单己基酯、邻苯二甲酸单-庚酯、邻苯二甲酸单异丙酯、邻苯二甲酸单环己酯、邻苯二甲酸单苄酯、邻苯二甲酸单乙酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、邻苯二甲酸单甲酯和邻苯二甲酸单异壬酯中的一种或多种；
(2)用活化后的HLB固相萃取柱对所述预处理后的待测样品进行富集处理，然后依次用甲醇和1-15％乙酸-乙腈溶液对所述固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液；然后对所述洗脱液浓缩至近干后，使用甲醇溶液定容，经过膜处理后，得到处理后的待测样品；
(3)采用超高效液相色谱-串联质谱联用检测方式，所述处理后的待测样品经液相色谱分离和多反应监测模式检测后，利用保留时间锁定和特征离子对信息锁定，检测出所述处理后的待测样品中含有的所述目标化合物，所述特征离子对信息包括母离子和子离子信息；
其中，所述液相色谱分离条件为：采用规格为2.1mm×100mm×1.7μm的BEH C18色谱柱，按梯度洗脱程序洗脱，柱温为40℃；进样体积为5.0～10.0μL；洗针液为体积比1:1的乙腈和水的混合溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类化合物检测时的流动相为乙腈和水的混合溶液，所述梯度洗脱程序为：起始梯度按乙腈：水＝15：85比例洗脱，维持0.5min，然后在0.5～1.0min内，变化为乙腈：水＝90：10比例洗脱，然后在1.0～2.0min内，变化为乙腈：水＝100：0比例洗脱，维持至4.0min；然后在4.1min时恢复至所述起始梯度平衡系统至7.0min；流速为0.3mL/min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类化合物的代谢产物检测时的流动相为甲醇和水的混合溶液，所述梯度洗脱程序为：起始梯度按甲醇：水＝40：60比例洗脱，维持0.2min，然后在0.2～2.0min内，变化为甲醇：水＝95：5比例洗脱，维持至10.0min，然后在10.0～10.1min内，变化为甲醇：水＝100：0比例洗脱，维持至12.5min；然后在12.6min时恢复至所述起始梯度平衡系统至15.0min；流速为0.3mL/min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述串联质谱条件为：电离模式为电喷雾电离，正离子和负离子模式混合；检测方式为多反应监测模式；离子源温度为80～150℃，毛细管电压为3.0～4.0kV，锥孔电压为20～40V，脱溶剂温度为300～500℃，脱溶剂气流速为500～700L/h，锥孔气流速为30～80L/h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括哺乳动物体液样品，所述体液样品包括血液样品、尿液样品、脑脊液样品和组织提取液样品中的至少一种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相萃取柱的活化过程包括为：依次用5.0～15.0mL的甲醇和超纯水进行活化，所述活化过程中，所述固相萃取柱保持不干状态。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)之后，所述步骤(3)之前还包括配制多个浓度梯度的标准溶液，然后对所述标准溶液进行定量测定并制作标准曲线，所述标准曲线用于外标法测定所述待测样品中所述目标化合物的含量。
8.一种如权利要求1-7任意一项所述同时检测邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢产物的方法在生化分析检测或生命科学领域中的应用。
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