CN114609284B - 一种基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和验证方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物标志物测定技术领域，公开了一种基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选与验证方法。该方法以职业工人作为高暴露组，以周边居民作为低暴露组，以远离暴露组所在区域上风向的乡村居民作为背景对照组，基于非靶向暴露组学方法对暴露人群的尿样进行污染暴露生物标志物的筛查，然后通过靶向定量对筛选的标志物进行验证。本发明利用分散固相萃取方法，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，并结合高效液相色谱‑四极杆飞行时间串联质谱和高效液相色谱‑串联质谱仪，分别应用于尿液中污染物暴露生物标志物的非靶向筛查和靶向定量检测，为职业复合污染暴露人群的健康风险筛查提供快速可靠的方法手段。

Description

一种基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和 验证方法
技术领域
本发明属于生物标志物测定技术领域，更具体地，涉及一种基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和验证方法。
背景技术
目前，我国正处于工业化深入发展时期，环境污染所造成的健康问题日趋严重。长期以来，国内外有关职业污染暴露对人体健康影响的研究大多局限于传统已知的污染物的致癌或非致癌风险的模型评估，例如焦化行业排放的苯系物和多环芳烃、石化行业的苯系物和石油烃以及金属冶炼行业的重金属等污染物。然而，随着各行业在原料和能源方面的不断升级和改造，继续沿用传统污染物对职业污染暴露风险进行评估会带来许多不确定性。
近年来，暴露组学提出了基于人体全局环境暴露因素的概念，为环境污染暴露与健康风险评估带来新的研究思路。有别于以往仅利用行业常规指标作为职业污染暴露标志物进行风险评估，暴露组研究能够全面地展示人群暴露的所有化合物质，通过高、中、低不同暴露人群的对比，筛选出高暴露人群的环境暴露标志物，从而大大降低结果的不确定性。这对传统行业以及新型行业的一线从业工人的污染暴露风险评估及其预防管控具有十分重要的意义。
广义的暴露组学是指人类终身的环境暴露。而对于职业暴露评估的暴露组学来说，我们只需要关注那些来自工作环境并通过各种暴露途径进入人体的污染物及其在人体内的代谢产物。暴露组学研究方法与其他组学研究方法相似，样品前处理尽可能简单甚至不进行处理直接对样品进行检测分析。但是人体中的环境污染物及其代谢产物的浓度水平比人体内源代谢物、脂质和蛋白质的浓度水平要低几个数量级。因此，暴露组学研究在生物样品前处理上既要保留尽可能多的化合物，还要通过适度的样品净化和浓缩富集降低分析过程中的基质效应，提高检测灵敏度。
非靶向暴露组学方法主要用于环境暴露毒害污染物质的广泛评估与筛查，存在重复性差和容易产生峰对齐误差的缺点；靶向暴露组学方法用于特定暴露化合物的定量分析，存在暴露化合物研究范围相对狭窄的不足。因此，结合靶向和非靶向暴露组学方法进行研究，可以快速、准确地筛选和验证职业暴露人群的暴露标志物，有针对性地对暴露人群的健康状况进行风险评估。
发明内容
针对上述情况，本发明提供了一种基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和验证方法。该方法通过不同暴露人群对比，先用非靶向暴露组学筛选出高暴露人群的环境暴露标志物，再用靶向暴露组学对筛选的暴露化合物进行定量分析，从而降低单独靶向分析中暴露化合物研究范围狭窄导致的结果不确定性。
本发明的目的通过下述方案来实现：
一种基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，包括如下具体步骤：
S1.采集三组人群尿液样本于干净的聚四氟乙烯材质的样品瓶中，并储存于-80～4℃冰箱：以一线职业工人作为高暴露组，以距离工厂5公里km以内居民区作为低暴露组，以远离暴露组所在工厂20km以上上风向的乡村居民作为背景对照组；
S2.将高暴露组、低暴露组和背景对照组各组人群随机分成若干小组，每小组5～10人，各小组每个待测样本取等量样品，制成该小组的混合样本，用于非靶向暴露组学初筛；
S3.取步骤S2的混合样本分别用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节pH至5～5.5，加入β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶，置于恒温摇床上在25～45℃酶解1～24h；酶解后的尿液中加入有机溶剂沉淀蛋白涡旋混匀，随后加入除水剂，离心分离后取有机上清液，加入分散固相萃取剂涡旋混匀，离心分离后取上清液，浓缩氮吹近干，用甲醇定容；
S4.用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱分别进行正离子和负离子模式下的一级质谱全扫描检测；利用数据预处理软件对获得的质谱原始数据进行质量和保留时间矫正、峰过滤、峰提取、峰识别、峰积分、峰对齐；对提取的峰的响应进行归一化处理，采用单因素方差分析混合尿液样本中高暴露组、低暴露组和背景对照组之间的暴露化合物的差异情况，非靶向筛选出差异化合物；
S5.利用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱对筛选的差异化合物进行二级质谱采集；利用化合物数据库对差异化合物的二级质谱数据进行匹配，结合潜在污染物进行判别，筛选出与职业环境污染暴露相关的差异化合物，并利用标准品对差异化合物进行鉴定；
S6.将鉴定的差异化合物进行个体样品的靶向定量，样品前处理方法同步骤S3，采用高效液相色谱-串联质谱进行定量分析；靶向定量结果中，当高暴露组化合物浓度均值均高于低暴露组和背景对照组化合物浓度均值，且进行非参数检验时均满足p<0.05，即完成筛选和验证差异化合物为职业复合污染暴露生物标志物。
优选地，步骤S3中所述混合样本和β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶的体积比为(50～500)：1；所述混合样本取量为0.1～10mL；所述有机溶剂和酶解后尿液的体积比为(1～10)：1；所述有机溶剂为乙腈或/和异丙醇；所述除水剂为无水硫酸镁和氯化钠的混合物或者无水硫酸钠；所述分散固相萃取剂为Z-Sep和无水硫酸镁。
更为优选地，所述无水硫酸镁和氯化钠的质量比为(1～10)：1；所述Z-Sep和无水硫酸镁的质量比为(1～10)：(1～10)。
优选地，步骤S3中所述涡旋的时间均为1～10min，离心的转速均为2000～10000rpm，离心的温度均为4～25℃，离心的时间均为5～30min。
优选地，步骤S4-S6中所述高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱和高效液相色谱-串联质谱使用的色谱柱为粒径小于或等于2.7μm的C18反相色谱柱，柱温30～60℃，进样量为1～20μL；当离子源为ESI正模式时所用液相色谱流动相为添加0.01～0.1％甲酸的超纯水和乙腈；当离子源为ESI负模式时所用液相色谱流动相为添加1～10mmol/L乙酸铵的超纯水和乙腈，流动相流速为0.2～0.4mL/min；梯度洗脱程序为0～2min，5～15％乙腈；2～2.1min，15～50％乙腈；2.1～10min，50％乙腈；10～15min，50～80％乙腈；15～18min，80～95％乙腈；18～19min，95％乙腈；19～20min，95～99％乙腈；20～22min，99％乙腈。
优选地，步骤S4-S6中所述四极杆飞行时间串联质谱的条件为：离子源为ESI正模式或负模式，雾化器压力30～50psi，干燥气流速8～10L/min，干燥气温度300～350℃，毛细管正电压为4000V，细管正电压负为3500V，鞘气温度250～350℃，鞘气流速10～12L/min，喷嘴电压500～2000V；步骤S4中所述一级质谱的扫描速率为1～8spec/s，质量数为100～1700m/z。
优选地，步骤S4中所述数据预处理软件为XCMS或MassHunter Profinder(随着技术的发展，也适用其它可替代的数据库或者自建库)。
优选地，步骤S4所述差异化合物筛选标准为p<0.05以及变化倍数大于1，高暴露组、低暴露组与背景对照组相比均呈上升趋势。
优选地，步骤S5中所述化合物数据库为Metlin、Human Metabolome Database、Massbank或PubChem(随着技术的发展，也适用其它可替代的数据库或者自建库)，
优选地，步骤S5中所述二级质谱的扫描速率为1～8spec/s，质量数为30～1700m/z。
本发明定量分析用外标法或内标法，以不含或含有相同浓度同位素内标物的不同浓度目标化合物标准品制得一系列校准溶液，以校准溶液目标化合物色谱峰面积(或校准溶液目标化合物与内标峰面积比值)对其响应浓度(或其响应浓度比值)进行回归分析，得到标准工作曲线，将测得样品中化合物(和内标)的色谱峰面积带入标准曲线，得到样品中化合物的含量，然后根据进样样品液所代表实际样本的质量计算得到样品中化合物的浓度。
本发明采用非靶向筛选出差异化合物，非靶向是一个半定量的初步筛查，一般通过软件根据峰面积或者峰响应计算，最后用单因素方差分析，满足p<0.05，变化倍数大于1，筛选出差异化合物。而靶向定量是对筛选出来的差异化合物进行准确的定量分析后，通过非参数检验确证筛选出来的差异化合物在高暴露组显著高于低暴露组和背景对照组。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过不同暴露人群对比，先用非靶向暴露组学筛选出高暴露人群的环境暴露标志物，再用靶向暴露组学对筛选的暴露化合物进行定量分析，从而降低单独靶向分析中暴露化合物研究范围狭窄导致的结果不确定性。
2.本发明利用靶向定量分析验证非靶向筛选的标志物，避免了单独非靶向分析过程中样品重复性差和存在峰对齐误差导致的标志物的误判。
3.本发明方法兼容性强，除了用于职业暴露标志物筛查和验证以外，还能够通过收集足够数量样本用于区域环境污染暴露标志物的筛查和验证。
4.本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，并结合高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱和高效液相色谱-串联质谱仪，分别应用于尿液中污染物暴露生物标志物的非靶向筛查和靶向定量检测，为职业暴露人群的人体复合健康风险筛查提供一种快速可靠的方法手段。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
本发明实施例中所用的β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶(β-葡萄糖醛苷酶的浓度≥85,000units/mL，芳基硫酸酯酶的浓度≤7,500units/mL)购于美国Sigma-Aldrich公司。
实施例1
1.查阅某金属冶炼厂区环境评价报告，将120名一线从业工人作为高暴露组，以距离工厂5公里km以内的120名居民作为低暴露组，以远离暴露组所在工厂20km以上上风向的120名乡村居民作为背景对照组，三组人群在年龄、性别和饮食习惯构成上相似。纳入标准：(1)个人健康信息问卷资料填写完整者；(2)收集到尿液样本者；排除标准：(1)患有慢性病者；(2)患有急性传染病者；(3)长期服药者。分别采集3mL以上尿液样品于干净的聚四氟乙烯样品瓶中，并储存于-20℃冰箱待分析。
2.将各组人群随机分成12小组(合计36小组)，每小组10人份样本，各小组每个待测样本取等量1mL样品制成该小组混合样本，合计36个混合样本，用于暴露生物标志物初筛。
3.步骤2中的36个混合样本各取2mL分别于50mL离心管中，加入1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(1mol/L，pH＝5)，再加入10μLβ-葡糖苷酸-芳基硫酸酯酶(β-葡萄糖醛苷酶≥85,000units/mL，芳基硫酸酯酶≤7,500units/mL)，于37℃恒温摇床中酶解10h。酶解完成后待样品冷却至室温，加入9mL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀1min，倒入2g无水硫酸镁和氯化钠，(无水硫酸镁和氯化钠的质量比为4:1)，立刻涡旋2～5min，于4000rmp下离心10min，取上清液转移加入400mg分散固相萃取剂(质量比为1:3的Supel QuE Z-Sep和无水硫酸镁)，涡旋混匀2min，于4000rmp下离心10min，取上清液旋蒸浓缩，转移浓缩液至样品瓶中，在柔和氮气下吹至近干，用甲醇定容到200μL，用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(安捷伦Agilent 1290-6545)分别进行正离子和负离子模式下的全扫描检测。当离子源为ESI正模式时所用液相色谱流动相为添加0.1％甲酸的超纯水和乙腈；当离子源为ESI负模式时所用液相色谱流动相为添加5mM乙酸铵的超纯水和乙腈，流动相流速为0.4mL/min；梯度洗脱程序为0～2min，5～15％乙腈；2～2.1min，15～50％乙腈；2.1～10min，50％乙腈；10～15min，50～80％乙腈；15～18min，80～95％乙腈；18～19min，95％乙腈；19～20min，95～99％乙腈；20～22min，99％乙腈，色谱柱为Poroshell 120EC-C18色谱柱(100mm×4.6mm,2.7μm)，柱温40℃，进样量为10μL。雾化器压力为35psi，干燥气流速为8L/min，干燥气温度为350℃，毛细管电压为4000V(正)或3500V(负)，鞘气温度为350℃，鞘气流速12L/min，喷嘴电压1500V，一级质谱扫描速率为2spec/s，质量数范围为100～1000m/z。
4.采用Agilent MassHunter Profinder对36个质谱原始数据进行质量和保留时间矫正、峰过滤、峰提取、峰识别、峰积分和峰对齐，并通过设置Profinder的化合物筛查条件(提取化合物保留时间范围2～23min，m/z范围100～700以及所提取化合物至少在一组人群样本中的重现性在80％以上)和手动修正，从正模式中获得了1062个化合物特征离子，从负模式中获得了2432个化合物特征离子。将正模式和负模式所获得的化合物特征离子分别导入Mass Profiler Professional(MPP)，采用单因素方差分析高暴露组、低暴露组和背景对照组之间的暴露化合物的差异情况，设置最大P<0.05，倍数变化(FC)>1。正模式下筛选出高暴露组与低暴露组和背景对照组相比均呈上升趋势的化合物有17个。将筛查的17个化合物进行二级质谱数据采集，与Metlin、Human Metabolome Database、Massbank以及PubChem等开源或商业的化合物数据库比对，并结合金属冶炼行业使用的相关原料(矿石、回收电路板等)和工艺(燃烧，高温等)过程中排放的潜在污染物，最后仅筛选出1个化合物与该职业环境污染暴露相关，其他化合物均与饮食暴露相关。经标准品确证，该化合物为邻苯二甲酸单异丁酯(MiBP)。同样地，负模式下筛选出高暴露组与低暴露组和背景对照组相比均呈上升趋势的化合物有50个，最后筛选出4个化合物与该职业环境污染暴露相关，经标准品确证，分别为1羟基萘(1-OH-Nap)、2羟基萘(2-OH-Nap)、1羟基芘(1-OH-Pyr)和MiBP。
实施例2
本实施例中尿液样品为背景对照人群混合样品以3倍超纯水稀释后的样品，用于靶标定量方法的验证。
1.所用到标准品，包括邻苯二甲酸单异丁酯(miBP)其对应的同位素内标miBP-d4；1-羟基萘(1-OH-Nap)、2-羟基萘(1-OH-Nap)1-羟基芘(1-OH-Pyr)及其对应的同位素内标2-OH-Nap-d7和1-OH-Pyr-d9。
2.取2mL混合尿液样本于50mL离心管中，加入同位素内标(miBP-d45 ng，2-OH-Nap-d715 ng和1-OH-Pyr-d910 ng)，加入1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(1M，pH＝5)，再加入10μLβ-葡糖苷酸-芳基硫酸酯酶，于37℃恒温摇床中酶解10h。酶解完成后待样品冷却至室温，加入9mL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀1min，倒入2g质量比为4:1的无水硫酸镁和氯化钠，立刻涡旋2～5min，于4000rmp下离心10min，取上清液转移加入400mg质量比为1:3的Z-sep和无水硫酸镁，涡旋混匀2min，于4000rmp下离心10min，取上清液旋蒸浓缩，转移浓缩液至样品瓶中，在柔和氮气下吹至近干，用甲醇定容到200μL，用高效液相色谱-串联质谱(安捷伦Agilent1260-6470)负模式下的多反应监测模式进行靶标定量分析，仪器参数设定同上，其它质谱参数如离子对、碰撞能和保留时间，同表1所示。
3.用稀释尿液中1-OH-Nap、2-OH-Nap、1-OH-Pyr和MiBP分别在10～1000ng/mL、10-1000ng/mL、1-100ng/mL和2-200ng/mL的浓度梯度范围制作标准曲线，线性系数>0.995；1-OH-Nap回收率为104.5％±1.6％，2-OH-Nap为102.6％±2.5％，1-OH-Pyr为110.3±5.8％，以及MiBP为91.4％±0.8％。
实施例3
该建立的方法可以应用于由高暴露组、低暴露组和背景对照组组成的人群尿液中复合污染暴露生物标志物的验证。
利用高效液相色谱-串联质谱多反应监测模式测定高暴露组、低暴露组和背景对照组120个个体尿液样品中1-OH-Nap、2-OH-Nap、1-OH-Pyr和miBP的浓度。结果显示：1-OH-Nap在高暴露组、低暴露组和背景对照组人群尿液中的浓度分别为37.3±62.3ng/mL、23.4±41.6ng/mL和8.66±16.3ng/mL(P＝0.00671)；2-OH-Nap在高暴露组、低暴露组和背景对照组人群尿液中的浓度分别为94.6±154.6ng/mL、63.6±99.7ng/mL和24.7±37.2ng/mL(P＝0.00664)；1-OH-Pyr在高暴露组、低暴露组和背景对照组人群尿液中的浓度分别为3.10±4.06ng/mL、1.07±1.39ng/mL和0.82±1.41ng/mL(P＝0.00003)；miBP在高暴露组、低暴露组和背景对照组人群尿液中的浓度分别为67.9±89.5ng/mL、12.0±9.63ng/mL和8.37±9.97ng/mL(P＝0.00023)。由此可见，筛选的标志物在高暴露组个体人群尿液中的浓度均显著高于低暴露组和背景对照组(P<0.05)，即确认1-OH-Nap、2-OH-Nap、1-OH-Pyr和miBP是该金属冶炼厂工人尿液中的职业污染暴露标志物。
最后，本实验例确认1-OH-Nap、2-OH-Nap、1-OH-Pyr和miBP可作为金属冶炼行业人群尿液的职业污染暴露生物标志物。
表1靶标分析的液相色谱-串联质谱参数
Figure BDA0003549340370000081
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S1.采集三组人群尿液样本于干净的聚四氟乙烯材质的样品瓶中，并储存于-80～4℃冰箱：以一线职业工人作为高暴露组，以距离工厂5km以内居民区作为低暴露组，以远离暴露组所在工厂20km以上上风向的乡村居民作为背景对照组；
S2.将高暴露组、低暴露组和背景对照组各组人群随机分成若干小组，每小组5～10人，各小组每个待测样本取等量样品，制成该小组的混合样本，用于非靶向暴露组学初筛；
S3.取步骤S2的混合样本分别用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节pH至5～5.5，加入β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶，置于恒温摇床上在25～45℃酶解1～24h；酶解后的尿液中加入有机溶剂沉淀蛋白涡旋混匀，随后加入除水剂，离心分离后取有机上清液，加入分散固相萃取剂涡旋混匀，离心分离后取上清液，浓缩氮吹近干，用甲醇定容；
S4.用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱分别进行正离子和负离子模式下的一级质谱全扫描检测；利用数据预处理软件对获得的质谱原始数据进行质量和保留时间矫正、峰过滤、峰提取、峰识别、峰积分、峰对齐；对提取的峰的响应进行归一化处理，采用单因素方差分析混合尿液样本中高暴露组、低暴露组和背景对照组之间的暴露化合物的差异情况，非靶向筛选出差异化合物；
S5.利用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱对筛选的差异化合物进行二级质谱采集；利用化合物数据库对差异化合物的二级质谱数据进行匹配，结合潜在污染物进行判别，筛选出与职业环境污染暴露相关的差异化合物，并利用标准品对差异化合物进行鉴定；
S6.将鉴定的差异化合物进行个体样品的靶向定量，样品前处理方法同步骤S3，采用高效液相色谱-串联质谱进行定量分析；靶向定量结果中，当高暴露组化合物浓度均值均高于低暴露组和背景对照组化合物浓度均值，且进行非参数检验时均满足p<0.05，即完成筛选和验证差异化合物为职业复合污染暴露生物标志物。
2.根据权利要求1所述的基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，其特征在于，步骤S3中所述混合样本和β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶的体积比为(50～500)：1；所述混合样本取量为0.1～10mL；所述有机溶剂和酶解后尿液的体积比为(1～10)：1；所述有机溶剂为乙腈或/和异丙醇；所述除水剂为无水硫酸镁和氯化钠的混合物或者无水硫酸钠；所述分散固相萃取剂为Z-Sep和无水硫酸镁。
3.根据权利要求2所述的基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，其特征在于，所述无水硫酸镁和氯化钠的质量比为(1～10):1；所述Z-Sep和无水硫酸镁的质量比为(1～10):(1～10)。
4.根据权利要求1所述的基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选与验证方法，其特征在于，步骤S3中所述涡旋的时间均为1～10min，离心的转速均为2000～10000rpm，离心的温度均为4～25℃，离心的时间均为5～30min。
5.根据权利要求1所述的基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选与验证方法，其特征在于，步骤S4-S6中所述高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱和高效液相色谱-串联质谱使用的色谱柱为粒径小于或等于2.7μm的C18反相色谱柱，柱温30～60℃，进样量为1～20μL；当离子源为ESI正模式时所用液相色谱流动相为添加0.01～0.1％甲酸的超纯水和乙腈；当离子源为ESI负模式时所用液相色谱流动相为添加1～10mmol/L乙酸铵的超纯水和乙腈，流动相流速为0.2～0.4mL/min；梯度洗脱程序为0～2min，5～15％乙腈；2～2.1min，15～50％乙腈；2.1～10min，50％乙腈；10～15min，50～80％乙腈；15～18min，80～95％乙腈；18～19min，95％乙腈；19～20min，95～99％乙腈；20～22min，99％乙腈。
6.根据权利要求1所述的基于人体尿液的职业复合污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，其特征在于，步骤S4-S6中所述四极杆飞行时间串联质谱的条件为：离子源为ESI正模式或负模式，雾化器压力30～50psi，干燥气流速8～10L/min，干燥气温度300～350℃，毛细管正电压为4000V，细管正电压负为3500V，鞘气温度250～350℃，鞘气流速10～12L/min，喷嘴电压500～2000V；所述步骤S4中一级质谱的扫描速率为1～8spec/s，质量数为100～1700m/z。
7.根据权利要求1所述的基于人体尿液的职业污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，其特征在于，步骤S4中所述数据预处理软件为XCMS或MassHunter Profinder。
8.根据权利要求1所述的基于人体尿液的职业污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，其特征在于，步骤S4中所述非靶向筛选出差异化合物的筛选标准为p<0.05以及变化倍数大于1。
9.根据权利要求1所述的基于人体尿液的职业污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，其特征在于，步骤S5中所述化合物数据库为Metlin、Human Metabolome Database、Massbank或PubChem。
10.根据权利要求1所述的基于人体尿液的职业污染暴露生物标志物的筛选和验证方法，其特征在于，步骤S5中所述二级质谱的扫描速率为1～8spec/s，质量数为30～1700m/z。
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