CN109060983A - 一种液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法 - Google Patents

一种液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液相色谱‑串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，包括以下步骤：(1)样本预处理：向待检测样本中加入混合内标溶液进行蛋白沉淀，然后离心取上清液，氮气吹干所述上清液，并用复溶剂复溶，得到复溶液；(2)将步骤(1)获得的复溶液进行纯化；(3)利用液相色谱‑串联质谱法对步骤(2)获得的纯化产物中甲氧基肾上腺素类物质进行测定。本发明方法前处理简单，灵敏度高，特异性强，重现性好，使用在线自动前处理替代部分人工操作，提高了检测效率，减少了出错率，降低了对检测人员的要求，节约了成本，适用于在自动化程度低的临床色谱质谱实验室中推广应用。

Description

一种液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法。
背景技术
嗜铬细胞瘤和副神经节瘤是以儿茶酚胺大量分泌为主要特征的肿瘤。血浆中甲氧基肾上腺素类物质包含甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3甲氧酪胺，甲氧基肾上腺素类物质一方面来源于儿茶酚胺类激素的代谢，一方面直接来源于嗜铬细胞。血浆中甲氧基肾上腺素类物质的浓度与长期儿茶酚胺水平升高有关，短期儿茶酚胺分泌变化对其影响较小。儿茶酚胺在血中的分泌具有间歇性，受采样时间点等影响，间歇入血容易导致假阳性或假阴性的结果。而血浆甲氧基肾上腺素类物质半衰期较儿茶酚胺激素更长，在体内存在时间更长，因此是重要的标志物。
血浆中甲氧基肾上腺素类物质是美国内分泌协会推荐的诊断嗜铬细胞瘤(PCC)和副神经节瘤(PGL)的首选生物标志物。基于液相色谱-串联质谱法检测该类代谢产物可以更有效、更准确、快速地检出嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者的相关代谢产物水平。目前基于液相色谱-串联质谱对血浆中甲氧基肾上腺素类物质进行检测的方法主要高效液相色谱-电化学检测、离线手工固相萃取-液相色谱-串联质谱检测、离线全自动固相萃取仪-液相色谱-串联质谱以及在线固相萃取-液相色谱-串联质谱。其中，电化学法检测生物样本存在较多干扰，同样也无法对3-甲氧酪胺进行定量分析，部分实验室采用衍生化前处理方法，衍生化过程耗时且毒性较强，而固相萃取技术是现大多数文献报道的且在各临床质谱实验室最常用的样品前处理方法，但该技术仍然存在以下一些问题：1、离线手工固相萃取技术(包含传统固相萃取与简化固相萃取技术)步骤繁多、操作复杂(活化、平衡、上样、淋洗、洗脱)，对于实验室技术人员的各方面要求较高，培训周期较长，容易出现人为导致的结果错误；2、离线全自动固相萃取仪在一定程度上实现了人力的解放，但一般适用于较大体积样本的处理，对于微升级体积样本不适用，且样本处理后，仍需浓缩复溶，较为繁琐；3、离线固相萃取柱活化、平衡、上样、淋洗洗脱体积较大，如需满足反相色谱柱以及低灵敏度质谱仪的要求，前处理过程常常需要进行氮吹浓缩和复溶等步骤，耗时更长，且容易出错；4、目前大多数采用在线固相萃取技术，样本预处理使用超滤管除掉蛋白，而超滤管成本较高，实际应用过程中，采用有机试剂蛋白沉淀仍是临床实验室日常首选方法；5、在线固相萃取技术洗脱采用高比例有机溶剂洗脱，洗脱液直接进入色谱柱分离分析，如使用反相柱则无保留，选用HILIC型色谱柱进行分析时，甲氧基肾上腺素与3-甲氧酪胺因有相同的子离子需实现色谱分离以减少共流出干扰，未分离两化合物易造成3-甲氧酪胺的结果偏高，但文献中未分离两物质。
因此，本领域技术人员迫切需要一种前处理简单、成本相对较低、对人员要求低、检测快速、方法灵敏度高、特异性强的适用于血浆甲氧基肾上腺素类物质的检测方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，该方法实现了甲氧基肾上腺素类物质的准确定性及定量分析，降低项目实际运营中对人员的要求，减少人员上岗培训的时间，提高了检测方法的分析速度及分析通量，保证了分析方法的灵敏度及重现性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，包括以下步骤：
(1)样本预处理：向待检测样本中加入混合内标溶液进行蛋白沉淀，然后离心取上清液，氮气吹干所述上清液，并用复溶剂复溶，得到复溶液；
(2)将步骤(1)获得的复溶液进行纯化；
(3)利用液相色谱-串联质谱法对步骤(2)获得的纯化产物中甲氧基肾上腺素类物质进行测定。
本发明所述甲氧基肾上腺素类物质包括甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺。
优选地，所述步骤(1)中样本为血浆样本。
本发明检测方法使用的样本优选为血浆样本，但并不仅限于血浆样本。
优选地，所述步骤(1)中混合内标溶液为含有甲氧基肾上腺素内标物、甲氧基去甲肾上腺素内标物和3-甲氧酪胺内标物的溶液。
进一步地，将甲氧基肾上腺素内标物、甲氧基去甲肾上腺素内标物和3-甲氧酪胺内标物中至少一种溶解在蛋白沉淀剂中获得所述混合内标溶液。所述蛋白沉淀剂为可以使蛋白沉淀的溶液，例如可以为乙腈、甲醇、乙醇等，优选乙腈。
优选地，所述甲氧基肾上腺素内标物为碳代、氮代、氘代或氧代的稳定同位素标记的甲氧基肾上腺素；及/或，
所述甲氧基去甲肾上腺素内标物为碳代、氮代、氘代或氧代的稳定同位素标记的甲氧基去甲肾上腺素；及/或，
所述3-甲氧酪胺内标物为碳代、氮代、氘代或氧代的稳定同位素标记的3-甲氧酪胺。
优选地，所述混合内标溶液中所述甲氧基肾上腺素内标物的浓度为3nmol/L～5nmol/L、所述甲氧基去甲肾上腺素内标物的浓度为3nmol/L～5nmol/L、所述3-甲氧酪胺内标物的浓度为15nmol/L～20nmol/L。
优选地，所述甲氧基肾上腺素内标物为d3-甲氧基肾上腺素；所述甲氧基去甲肾上腺素内标物为d3-甲氧基去甲肾上腺素；所述3-甲氧酪胺内标物为d4-3-甲氧酪胺。
优选地，所述步骤(1)中待检测样本与混合内标溶液的体积比为1：(3.0-4.0)；
所述氮气吹干温度为40℃～70℃；
所述待检测样本和复溶剂的体积比为1：(1.0-2.0)；所述复溶剂为5-20mmol/L磷酸盐缓冲液溶液。
优选地，所述步骤(2)中将复溶液进行纯化的方法为在线固相萃取。
优选地，所述在线固相萃取的填料为弱阳性离子交换型。
优选地，所述在线固相萃取纯化包括以下步骤：
①依次使用第一混合溶液和甲醇活化在线固相萃取柱，然后使用10-30mmol/L乙酸铵溶液平衡在线固相萃取柱；其中，所述第一混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为(0.1～0.3):100混合形成的混合液；
②取步骤(1)获得的复溶液进入在线固相萃取系统，上样溶液为水；
③用第二混合溶液对在线固相萃取柱进行淋洗，其中，所述第二混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为(0.8～1.2):1混合形成的混合液；
④洗脱，以甲酸铵含量为50-100mmol/L的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，所述流动相A与流动相B的体积比为(5-15)：(85-95)；
优选地，所述固相萃取柱为Waters WCX弱阳离子固相萃取柱。
优选地，所述步骤①中使用第一混合溶液活化在线固相萃取柱的流速为1-3mL/min。
优选地，所述步骤①中使用甲醇活化在线固相萃取柱的流速为1-3mL/min。
优选地，所述步骤①中使用10-30mmol/L乙酸铵溶液平衡在线固相萃取柱的流速为1-3mL/min。
优选地，所述步骤②中上样的流速为0.2-0.5mL/min。
优选地，所述步骤③中淋洗的流速为0.2-0.5mL/min。
优选地，所述步骤(3)中液相色谱条件为：
色谱柱：液相色谱柱，
流动相：A相为甲酸铵含量为50-100mmol/L的水溶液，B相为乙腈，采用梯度洗脱，梯度洗脱方式为第一阶段、第二阶段、第三阶段、第四阶段、第五阶段依次进行，其中，
第一阶段，持续0.3min～0.5min，流动相中A相与B相的体积比为(5-15):(85-95)；
第二阶段，持续2min～3min，流动相中A相与B相的体积比为(35-45):(55-65)；
第三阶段，持续0.5min～1.5min，流动相中A相与B相的体积比为(35-45):(55-65)；
第四阶段，持续0.5min～1.5min，流动相中A相与B相的体积比为(5-15):(85-95)；
第五阶段，持续1min～3min，流动相中A相与B相的体积比为(5-15)：(85-95)；
流动相的流速：0.2-0.5mL/min；
柱温：28-32℃。
优选地，所述液相色谱柱为C18键合固定相色谱柱。
优选地，所述步骤(3)中质谱条件为正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描。
本发明所述检测方法可以实现血浆中甲氧基肾上腺素类物质的定性和定量检测，前处理简单，有效去除干扰物质，且蛋白沉淀后直接进样，在线固相萃取系统完成对待测化合物的纯化与富集，减少人工固相萃取操作，灵敏度高，特异性强，准确性好，并且整个检测过程时间短、检测通量高。还增加对3-甲氧酪胺的检测，提高诊断的灵敏度和特异性。
本发明所述检测方法采用质谱多反应监测(MRM)的扫描模式，能够得到样品的总离子流色谱图和各化合物的选择离子色谱图，每个化合物通过扫描两个离子对进行定性，用于检测过程中监测出峰时间处的化合物是否为目标化合物，以免出现其他干扰。此外，选择监测离子对中信号响应高且稳定的离子对作为定量离子对，加入同位素内标化合物进行校正，进一步提高了检测准确度和方法的特异性。
本发明所述检测方法使用的HILIC Amide色谱柱适用于儿茶酚胺类代谢产物的分离分析，最低检出限达到了3.5pmol/L，检测灵敏度高。按本发明提供的检测方法，单个样品在线固相萃取分离分析检测时间为8.9min，与现有离线固相萃取方法相比，不计算离线固相萃取的时间，仅单个样本的色谱分离分析时间就达到了8.7min，因此，在线固相萃取方法的总检测时间短，检测通量高，大大地节约了人力和时间成本。
本发明采用在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱仪，实现了血浆样本在线净化浓缩，直接进入液相色谱-串联质谱分析。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)全自动在线固相萃取技术告别繁琐的手工分步固相萃取操作，减少了人为错误，降低了对操作人员的要求；(2)全自动在线固相萃取技术对样品直接进行萃取浓缩，萃取液直接进入色谱柱分析，大大节省了分析时间；(3)样品采用有机试剂沉淀蛋白代替超滤管离心，能够满足临床检测要求的同时，降低了样品预处理成本；(4)全自动在线固相萃取技术减少了上样的用量，实际上样量小于100μL，降低了化合物在洗脱过程中的损失量，同时也降低了固相萃取过程中溶剂的使用量；(5)选用HILICAmide型色谱柱，实现了甲氧基肾上腺素与3-甲氧酪胺的完全分离。
附图说明
图1为在线固相萃取步骤流程图。
图2为甲氧基肾上腺素的标准曲线。
图3为甲氧基去甲肾上腺素的标准曲线。
图4为3-甲氧酪胺的标准曲线。
图5为血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质检测的总离子流色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本发明液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)样本预处理：取200μL血浆样品于1.5mL离心管中，加入800μL混合内标溶液，震荡离心，转移900μL上清液于1mL 96孔承接板中，40℃氮气吹干，加入300μL 5mmol/L磷酸盐缓冲液，得复溶液，待用；
所述混合内标溶液为含有甲氧基肾上腺素内标物、甲氧基去甲肾上腺素内标物和3-甲氧酪胺内标物的乙腈溶液；所述甲氧基肾上腺素内标物为d3-甲氧基肾上腺素，所述甲氧基去甲肾上腺素内标物为d3-甲氧基去甲肾上腺素，所述3-甲氧酪胺内标物为d4-3-甲氧酪胺；所述d3-甲氧基肾上腺素、d3-甲氧基去甲肾上腺素和d4-3-甲氧酪胺的浓度分别为：d3-甲氧基肾上腺素：4.68nmol/L；d3-甲氧基去甲肾上腺素：3.23nmol/L；d4-3-甲氧酪胺：18.99nmol/L。
(2)将步骤(1)获得的复溶液进行在线固相萃取(流程图如图1所示)纯化：
①250μL第一混合溶液与250μL甲醇依次活化在线固相萃取柱，250μL 20mmol/L乙酸铵溶液平衡在线固相萃取柱，流速均为2mL/min；其中，所述第一混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为0.1:100混合形成的混合液；
②取75μL复溶液进入在线固相萃取系统中，上样溶液为300μL水，流速0.25mL/min；
③取250μL第二混合溶液对在线固相萃取柱进行淋洗，流速0.25mL/min；其中，所述第二混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为1:1混合形成的混合液；
④洗脱，以甲酸铵含量为80mmol/L的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流动相A与流动相B的体积比为15：85，洗脱2min到液相色谱进行分离和质谱数据的采集；
通过上述过程，将血浆样品中的蛋白、磷脂等易堵塞色谱柱和产生基质效应的干扰物质除去，并通过在线固相萃取去除大部分干扰物，对样品进行了提取纯化和富集。该方法与现有离线固相萃取过程相比，在离线固相萃取过程中，每个步骤需要活化平衡淋洗液至少1mL，在线固相萃取的引入，减少了有机溶剂的用量，均在500μL以下，同时减少了离线固相萃取过程人为的操作过程，采用HILIC高比例有机相进行洗脱，免去了分析物固相萃取(SPE)富集后氮吹的过程。
(3)利用液相色谱-串联质谱法对步骤(2)获得的纯化产物中甲氧基肾上腺素类物质进行测定：
富集后洗脱液注入液相色谱-质谱仪进行检测。
液相色谱条件包括：采用Waters UPLC Amide色谱柱，流动相：A相为甲酸铵含量为80mmol/L的水溶液，B相为乙腈；分离洗脱为梯度洗脱，液相梯度如表1液相分离条件所示：
表1液相分离条件
质谱检测采用电喷雾电离(ESI)，正离子模式下的多反应监测(MRM)扫描方式。质谱条件包括：载气为氮气，碰撞气为氩气，锥孔气流速为145L/Hr，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为550℃，脱溶剂气流速为900L/Hr，碰撞气流速为0.16mL/min。多反应监测(MRM)扫描模式参数如表2所示。
表2多反应监测模式参数
分析物名称 MRM离子对 Cone(V) Collision(V) Time(msec)
MN定量离子对 180.0/148.1 30.0 17.0 18
MN定性离子对 180.0/165.1 30.0 16.0 18
D3-MN内标离子对 183.1/151.0 30.0 16.0 18
NMN定量离子对 166.1/134.1 45.0 15.0 18
NMN定性离子对 166.1/149.1 45.0 11.0 18
D3-NMN内标离子对 169.1/137.1 45.0 15.0 18
3-MT定量离子对 151.0/91.2 17.0 22.0 18
3-MT定性离子对 151.0/119.2 17.0 18.0 18
D4-3-MT内标离子对 155.1/95.0 17.0 22.0 18
血浆中甲氧基肾上腺素类物质的定性、定量检测：以样品中各甲氧基肾上腺素类物质两个离子对与标准品的化合物保留时间进行比对作为定性依据，各甲氧基肾上腺素类物质保留时间如表3所示，样品色谱图中所选择的定性定量离子的离子比与标准溶液的离子比的偏差不超过预设规定范围。用内标标准曲线法定量，各甲氧基肾上腺素类物质的峰面积与相应内标化合物面积的比值为纵坐标，各甲氧基肾上腺素类物质的浓度与内标物的浓度比值为横坐标，加权方式为权重1/x，绘制标准曲线，对实际样本进行定量计算，标准曲线图2-4所示。
表3甲氧基肾上腺素类物质的保留时间
实施例2
本发明液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)样本预处理：取200μL血浆样品于1.5mL离心管中，加入600μL混合内标溶液，震荡离心，转移500μL上清液于1mL96孔承接板中，70℃氮气吹干，加入200μL 15mmol/L磷酸盐缓冲液，得复溶液，待用；
所述混合内标溶液为含有甲氧基肾上腺素内标物、甲氧基去甲肾上腺素内标物和3-甲氧酪胺内标物的乙腈溶液；所述甲氧基肾上腺素内标物为d3-甲氧基肾上腺素，所述甲氧基去甲肾上腺素内标物为d3-甲氧基去甲肾上腺素，所述3-甲氧酪胺内标物为d4-3-甲氧酪胺；所述d3-甲氧基肾上腺素、d3-甲氧基去甲肾上腺素和d4-3-甲氧酪胺的浓度分别为：d3-甲氧基肾上腺素：5nmol/L；d3-甲氧基去甲肾上腺素：5nmol/L；d4-3-甲氧酪胺：20nmol/L。
(2)将步骤(1)获得的复溶液进行在线固相萃取纯化：
①250μL第一混合溶液与250μL甲醇依次活化在线固相萃取柱，250μL 10mmol/L乙酸铵溶液平衡在线固相萃取柱，流速均为1mL/min；其中，所述第一混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为0.2:100混合形成的混合液；
②取75μL复溶液进入在线固相萃取系统中，上样溶液为300μL水，流速0.2mL/min；
③取250μL第二混合溶液对在线固相萃取柱进行淋洗，流速0.2mL/min；其中，所述第二混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为0.8:1混合形成的混合液；
④洗脱，以甲酸铵含量为100mmol/L的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流动相A与流动相B的体积比为10：90，洗脱2min到液相色谱进行分离和质谱数据的采集；
通过上述过程，将血浆样品中的蛋白、磷脂等易堵塞色谱柱和产生基质效应的干扰物质除去，并通过在线固相萃取去除大部分干扰物，对样品进行了提取纯化和富集。该方法与现有离线固相萃取过程相比，在离线固相萃取过程中，每个步骤需要活化平衡淋洗液至少1mL，在线固相萃取的引入，减少了有机溶剂的用量，均在500μL以下，同时减少了离线固相萃取过程人为的操作过程，采用HILIC高比例有机相进行洗脱，免去了分析物固相萃取(SPE)富集后氮吹的过程。
(3)利用液相色谱-串联质谱法对步骤(2)获得的纯化产物中甲氧基肾上腺素类物质进行测定：
富集后洗脱液注入液相色谱-质谱仪进行检测。
液相色谱条件包括：采用Waters UPLC Amide色谱柱，流动相：A相为甲酸铵含量为100mmol/L的水溶液，B相为乙腈；分离洗脱为梯度洗脱，液相梯度如表4液相分离条件所示：
表4液相分离条件
质谱检测采用电喷雾电离(ESI)，正离子模式下的多反应监测(MRM)扫描方式。质谱条件包括：载气为氮气，碰撞气为氩气，锥孔气流速为145L/Hr，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为550℃，脱溶剂气流速为900L/Hr，碰撞气流速为0.16mL/min。多反应监测(MRM)扫描模式参数如表2所示。
实施例3
本发明液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)样本预处理：取200μL血浆样品于1.5mL离心管中，加入700μL混合内标溶液，震荡离心，转移600μL上清液于1mL96孔承接板中，60℃氮气吹干，加入400μL 20mmol/L磷酸盐缓冲液，得复溶液，待用；
所述混合内标溶液为含有甲氧基肾上腺素内标物、甲氧基去甲肾上腺素内标物和3-甲氧酪胺内标物的乙腈溶液；所述甲氧基肾上腺素内标物为d3-甲氧基肾上腺素，所述甲氧基去甲肾上腺素内标物为d3-甲氧基去甲肾上腺素，所述3-甲氧酪胺内标物为d4-3-甲氧酪胺；所述d3-甲氧基肾上腺素、d3-甲氧基去甲肾上腺素和d4-3-甲氧酪胺的浓度分别为：d3-甲氧基肾上腺素：3nmol/L；d3-甲氧基去甲肾上腺素：3nmol/L；d4-3-甲氧酪胺：15nmol/L。
(2)将步骤(1)获得的上清液进行在线固相萃取纯化：
①250μL第一混合溶液与250μL甲醇依次活化在线固相萃取柱，250μL 30mmol/L乙酸铵溶液平衡在线固相萃取柱，流速均为3mL/min；其中，所述第一混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为0.3:100混合形成的混合液；
②取75μL复溶液进入在线固相萃取系统中，上样溶液为300μL水，流速0.5mL/min；
③取250μL第二混合溶液对在线固相萃取柱进行淋洗，流速0.5mL/min；其中，所述第二混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为1.2:1混合形成的混合液；
④洗脱，以甲酸铵含量为50mmol/L的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流动相A与流动相B的体积比为5：95，洗脱2min到液相色谱进行分离和质谱数据的采集；
通过上述过程，将血浆样品中的蛋白、磷脂等易堵塞色谱柱和产生基质效应的干扰物质除去，并通过在线固相萃取去除大部分干扰物，对样品进行了提取纯化和富集。该方法与现有离线固相萃取过程相比，在离线固相萃取过程中，每个步骤需要活化平衡淋洗液至少1mL，在线固相萃取的引入，减少了有机溶剂的用量，均在500μL以下，同时减少了离线固相萃取过程人为的操作过程，采用HILIC高比例有机相进行洗脱，免去了分析物富集后氮吹的过程。
(3)利用液相色谱-串联质谱法对步骤(2)获得的纯化产物中甲氧基肾上腺素类物质进行测定：
富集后洗脱液注入液相色谱-质谱仪进行检测。
液相色谱条件包括：采用Waters UPLC Amide色谱柱，流动相：A相为甲酸铵含量为50mmol/L的水溶液，B相为乙腈；分离洗脱为梯度洗脱，液相梯度如表5液相分离条件所示：
表5液相分离条件
质谱检测采用电喷雾电离(ESI)，正离子模式下的多反应监测(MRM)扫描方式。质谱条件包括：载气为氮气，碰撞气为氩气，锥孔气流速为145L/Hr，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为550℃，脱溶剂气流速为900L/Hr，碰撞气流速为0.16mL/min。多反应监测(MRM)扫描模式参数如表2所示。
实施例4
本实施例采用实施例1所述方法对1例血浆样本中的甲氧基肾上腺素类物质进行检测。
如液相条件未能将甲氧基肾上腺素与3-甲氧酪胺分离，则高浓度的甲氧基肾上腺素将导致低浓度3-甲氧酪胺在加标后回收率到达150％，3-甲氧酪胺检测结果偏高，通过对液相部分的优化，最终上述液相条件下甲氧基肾上腺素与3-甲氧酪胺分离度达到1.3以上，干扰验证通过加标回收率实验证明，高浓度的甲氧基肾上腺素对于低浓度的3-甲氧酪胺在加标前后无影响，回收率介于85％-115％之间，方法准确。
采用实施例1所述方法，对1例血浆样本中的甲氧基肾上腺素类物质进行了检测，得出了3种甲氧基肾上腺素类物质各自的含量，总离子流色谱图如图5所示。从图5可以看出，各甲氧基肾上腺素类物质峰形良好，响应合适，分离效果好。
本发明最低检出限达到了3.5pmol/L，3种甲氧基肾上腺素类物质的测定的浓度范围覆盖医学决定水平，线性良好，相关系数在0.999以上。
实施例5
本实施例从日内精密度、日间精密度和准确度三方面对本发明所述方法进行方法学验证。
1、日内精密度实验：取2个不同来源的血浆(低、高)样本各12份，同一天进行相同的前处理和检测，3种甲氧基肾上腺素类物质的变异系数CV均在2.1％～4.0％之间，说明本发明检测方法的日内精密度好。
2、日间精密度实验：取2个不同来源的血浆(低、高)样本各20份，每个浓度每天两组测定，连续10天进行相同的前处理和检测，3种甲氧基肾上腺素类物质的变异系数CV均在4.0％～8.0％之间，说明本发明检测方法的日间精密度好。
3、准确度实验：通过加标回收率实验验证了方法的准确度，回收率均在85％-115％之间，说明本发明检测方法准确度满足要求。
实施例6
本实施例对本发明在线全自动固相萃取与现有离线手工固相萃取的方法学性能比较。
分别采用本发明实施例1在线全自动固相萃取和现有的离线手工固相萃取两套方法对相同来源的血浆样本进行纯化处理，然后分别利用液相色谱-串联质谱法对两种方法纯化得到的产物中甲氧基肾上腺素类物质进行测定，测定步骤同实施例1。对两套方法学性能参数进行对比，详细结果如表6所示：
表6方法线性范围与定量限
从表中可知，本发明在线全自动固相萃取方法定量下限更低，分析测量范围更广，其他参数之间无明显差异，均能满足临床检测要求，效果明显优于现有的离线手工固相萃取方法。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样本预处理：向待检测样本中加入混合内标溶液进行蛋白沉淀，然后离心取上清液，氮气吹干所述上清液，并用复溶剂复溶，得到复溶液；
(2)将步骤(1)获得的复溶液进行纯化；
(3)利用液相色谱-串联质谱法对步骤(2)获得的纯化产物中甲氧基肾上腺素类物质进行测定。
2.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合内标溶液为含有甲氧基肾上腺素内标物、甲氧基去甲肾上腺素内标物和3-甲氧酪胺内标物的溶液。
3.根据权利要求2所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述甲氧基肾上腺素内标物为碳代、氮代、氘代或氧代的稳定同位素标记的甲氧基肾上腺素；及/或，
所述甲氧基去甲肾上腺素内标物为碳代、氮代、氘代或氧代的稳定同位素标记的甲氧基去甲肾上腺素；及/或，
所述3-甲氧酪胺内标物为碳代、氮代、氘代或氧代的稳定同位素标记的3-甲氧酪胺。
4.根据权利要求2所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述混合内标溶液中所述甲氧基肾上腺素内标物的浓度为3nmol/L～5nmol/L；所述甲氧基去甲肾上腺素内标物的浓度为3nmol/L～5nmol/L；所述3-甲氧酪胺内标物的浓度为15nmol/L～20nmol/L。
5.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中待检测样本与混合内标溶液的体积比为1：(3.0-4.0)；
所述氮气吹干温度为40℃～70℃；
所述待检测样本和所述复溶剂的体积比为1：(1.0-2.0)；所述复溶剂为5mmol/L～20mmol/L磷酸盐缓冲液溶液。
6.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将复溶液进行纯化的方法为在线固相萃取。
7.根据权利要求6所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述在线固相萃取的填料为弱阳性离子交换型。
8.根据权利要求7所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述在线固相萃取纯化包括以下步骤：
①依次使用第一混合溶液和甲醇活化在线固相萃取柱，然后使用10-30mmol/L乙酸铵溶液平衡在线固相萃取柱；其中，所述第一混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为(0.1～0.3):100混合形成的混合液；
②取步骤(1)获得的复溶液进入在线固相萃取系统，上样溶液为水；
③用第二混合溶液对在线固相萃取柱进行淋洗，其中，所述第二混合溶液为甲酸与乙腈的按体积比为(0.8～1.2):1混合形成的混合液；
④洗脱，以甲酸铵含量为50-100mmol/L的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，所述流动相A与所述流动相B的体积比为(5-15):(85-95)。
9.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述步骤(3)中液相色谱条件为：
色谱柱：液相色谱柱；
流动相：A相为甲酸铵含量为50-100mmol/L的水溶液，B相为乙腈，采用梯度洗脱，梯度洗脱方式为第一阶段、第二阶段、第三阶段、第四阶段、第五阶段依次进行，其中，
第一阶段，持续0.3min～0.5min，流动相中A相与B相的体积比为(5-15):(85-95)；
第二阶段，持续2min～3min，流动相中A相与B相的体积比为(35-45):(55-65)；
第三阶段，持续0.5min～1.5min，流动相中A相与B相的体积比为(35-45): (55-65)；
第四阶段，持续0.5min～1.5min，流动相中A相与B相的体积比为(5-15):(85-95)；
第五阶段，持续1min～3min，流动相中A相与B相的体积比为(5-15)：(85-95)；
流动相的流速：0.2-0.5mL/min；
柱温：28-32℃。
10.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法，其特征在于，所述步骤(3)中质谱条件为正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描。
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