CN111879876A - 一种基于免疫质谱技术的25羟维生素d快速灵敏分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于免疫质谱技术的25羟维生素D快速灵敏分析方法,步骤包括:S1、富集纯化:取样本,加入同位素内标溶液和生物素化抗体磁珠,并震荡孵育,孵育后依次用磁珠清洗液和纯水洗涤;S2、一步法衍生洗脱:将洗涤后的磁珠加入含4‑苯基‑1,2,4‑三唑啉‑3,5‑二酮的乙腈溶液,并震荡孵育进行衍生洗脱,再向衍生洗脱液中加入含CH3NH2的水溶液以终止反应;S3、液相色谱‑质谱检测:转移所述衍生洗脱液至液相色谱‑质谱联用仪检测。本发明创新性地在样本维生素D代谢物的洗脱阶段发明了一种样本一步法衍生洗脱的策略,从而提高了免疫‑质谱法的分析灵敏度,实现精准的维生素D代谢物定量,且不增加额外的样本处理时间及步骤。
Description
技术领域
本发明涉及免疫质谱技术领域,尤其涉及一种基于免疫质谱技术的25羟维生素D快速灵敏分析方法。
背景技术
25羟维生素D,即25(OH)D包括25羟维生素D2,即25(OH)D2和25羟维生素D3,即25(OH)D3是维生素D在体内的主要存在形式。生物样本(如全血、血清、尿液或唾液)中的25(OH)D2和25(OH)D3检测方法主要包括液相色谱质谱法和免疫分析法。
液相色谱质谱法检测前,25(OH)D2和25(OH)D3需从生物样本中富集和分离出来,传统的样本处理方法主要包括沉淀法,液液萃取法和固相萃取法,获得样本中的物质根据性质不同经液相色谱分离随后根据质核比不同经质谱检测分析。液相色谱质谱法可实现25(OH)D2和25(OH)D3的同时检测。免疫分析法包括放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、化学发光免疫法(CLIA)、电化学发光免疫法(ECLIA)和全自动生化法。其基本原理是利用25(OH)D的抗体特异地捕获生物样本中的25(OH)D,然后通过检测相应的放射量、光或电化学信号,达到分析25(OH)D的目的。但一般25(OH)D2和25(OH)D3均会被抗体捕获,因而免疫分析法检测的为总25(OH)D的水平,且非特异性富集易干扰检测结果。
由于25(OH)D2和25(OH)D3的人体内源水平较低,因而对质谱仪器的检测灵敏度要求较高,对于大部分临床质谱平台,为实现低浓度样本的精准定量,维生素D代谢物从样本中提取后还需要进行衍生化,从而提升25(OH)D2和25(OH)D3的分析灵敏度。但该过程需要将提取的样本干燥和衍生后再稀释上机,会引入额外的操作步骤,十分费时并增加人工负担。
因此,亟需一种基于免疫抗体富集纯化、一步法衍生洗脱并结合液相色谱-质谱检测的25(OH)D2和25(OH)D3分析法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种一种基于免疫质谱技术的25羟维生素D快速灵敏分析方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
提供一种基于免疫质谱技术的25羟维生素D快速灵敏分析方法,步骤包括:
S1、富集纯化:取样本,加入同位素内标溶液和生物素化抗体磁珠,并震荡孵育,孵育后依次用磁珠清洗液和纯水洗涤;
S2、一步法衍生洗脱:将洗涤后的磁珠加入含4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙腈溶液,并震荡孵育进行衍生洗脱,再向衍生洗脱液中加入含CH3NH2的水溶液以终止反应;
S3、液相色谱-质谱检测:转移所述衍生洗脱液至液相色谱-质谱联用仪检测;
其中,所述样本为血清、全血、尿液或体液中的一种;
其中,所述液相色谱-质谱联用仪采用QSight 210MD液相色谱-三重四极杆质谱系统;
其中,所述液相色谱条件为:色谱柱为Brownlee SPP C18柱,2.1×50mm,2.7μm;柱温25℃,进样时温度为室温,进样量10μL;流动相均是由A相:体积浓度0.1%甲酸甲醇溶液和B相:体积浓度0.1%甲酸水含5mM甲胺溶液组成;等度洗脱,条件为0~1.5min,90%A相/10%B相,流速0.3mL/min,柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测;
其中,所述质谱条件为:采用多反应监测(MRM)正离子模式下扫描;干燥气105PSI,雾化气180PSI,加热气350PSI,HISD温度300℃,离子源温度350℃;检测分子离子质谱参数信息如下:25-羟基维生素D3即25(OH)D3,母离子607.4,子离子298.1,锥孔电压20V,碰撞电压-24V;25-羟基维生素D2即25(OH)D2,母离子619.4,子离子298.1,锥孔电压20V,碰撞电压-24V。
优选地,步骤包括:
S1、富集纯化:取25-75μL样本,加入50-150μL同位素内标溶液和25-75μL生物素化抗体磁珠,并于18-56℃震荡孵育5-15min,孵育后用200-600μL磁珠清洗液洗涤1-3次,随后用200-600μL纯水洗涤1-2次;
S2、一步法衍生洗脱:将洗涤后的磁珠加入50-150μL的含2-8mM 4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙腈溶液,并于12-38℃震荡孵育5-15min进行衍生洗脱,再向衍生洗脱液中加入10-30μL的含2-8mM CH3NH2的水溶液以终止反应;
S3、液相色谱-质谱检测:转移所述衍生洗脱液至液相色谱-质谱联用仪检测;
其中,所述样本为血清、全血、尿液或体液中的一种。
优选地,所述同位素内标溶液的配制方法为:
选择2H,13C或18O稳定同位素标记的化合物中的一种或多种制备内标溶液。
优选地,所述同位素内标溶液的配制方法为:制备2H3-25羟基维生素D2和2H3-25羟基维生素D3内标溶液,使其终浓度分别达到25-75ng/mL。
优选地,所述生物素化抗体磁珠的制备步骤包括:
A1、把链霉亲和素磁珠摇匀,然后吸取30-90mg磁珠,用不低于磁珠1-3倍体积的结合缓冲液清洗1-3次,然后用结合缓冲液把磁珠复溶至不低于5-15mg/mL;
A2、把磁珠和生物素化抗体混合,磁珠终浓度不低于5-15mg/mL,磁珠置于35-39℃恒温振荡箱,90-270rpm/min摇匀反应110-130min;
A3、把反应后的磁珠取下,用不低于1-3倍反应体积的结合缓冲液清洗2-6次,把清洗好的磁珠用结合缓冲液复溶至200-600μg/mL,2-8℃保存待用。
优选地,所述生物素化抗体的制备步骤包括:
B1、取1-2mg 25(OH)D抗体;
B2、用pH8.0磷酸盐缓冲液于2-38℃透析16-24h;
B3、将0.02-0.08mg生物素滴加到透析后的抗体中,再加入pH8.0磷酸盐缓冲液使抗体终浓度为1-2mg/mL,混匀2-8min;
B4、将混合液置于23-27℃恒温培养箱,静置反应110-130min;
B5、使用pH7.4磷酸盐缓冲液于2-38℃透析生物素化抗体16-24h。
优选地,所述透析期间换液不少于4次,总透析体积不低于200:1。
优选地,所述结合缓冲液的配置步骤包括:
C1、12-38℃条件下,向一定体积的纯化水中加入3-9g的Tris、4-14g的氯化钠和2-6mL的HCl,至少搅拌5-15min至完全溶解,然后加入0.2-0.8mL的Tween-20和2-8mL的20%NaN3,最后缓慢加入10-30g的牛血清白蛋白BSA,至少搅拌5-15min至完全溶解;
C2、待所有成分完全溶解后,用pH计测pH值在7.1-7.3为合格,纯化水定容至1L。
优选地,所述磁珠清洗液的配置方法为:12-38℃条件下,向一定体积的纯化水中加入1-2g的Tris、4-14g的氯化钠、0.2-0.6mL的HCl、0.1-0.3mL的Tween-20、2-8mL的20%NaN3、0.2-0.8mL的Brij-35,混合均匀后检测pH值为8.1-8.5为合格,纯化水定容至1L。
优选地,所述步骤S3还包括:转移50-150μL所述衍生洗脱液到进样容器后上液相色谱-质谱联用仪检测。
本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有如下技术效果:
本发明利用免疫抗体纯化的特异性和质谱检测的特异性和选择性,解决了现有技术中液相色谱-质谱分析法的样本前处理特异性不高,分析前样本成分复杂所引起的后续色谱分离难度较高、色谱柱残留高、质谱检测信号受干扰物抑制以及干扰定量,进一步导致检测结果准确度和精确度下降、仪器维护成本较高、使用率不高的问题;以及免疫分析法富集后检测无选择性引起的交叉干扰和定量不准确的问题;同时创新性地在样本维生素D代谢物的洗脱阶段发明了一种样本一步法衍生洗脱的策略,从而提高了免疫-质谱法的分析灵敏度,实现精准的维生素D代谢物定量,且不增加额外的样本处理时间及步骤。
附图说明
图1为本发明实施例的流程图;
图2为本发明实施例中25(OH)D3的质谱图谱;
图3为本发明实施例中2H6-25(OH)D3的质谱图谱;
图4为本发明实施例中25(OH)D2的质谱图谱;
图5为本发明实施例中2H3-25(OH)D2的质谱图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,但不作为本发明的限定。
实施例
提供一种基于免疫质谱技术的25羟维生素D快速灵敏分析方法,步骤包括:
1.配制同位素内标溶液:
根据需要选择同位素内标化合物制备进内标溶液,如2H,13C和18O等稳定同位素标记的化合物均可作为相应的25羟维生素D2和D3化合物的内标,制备内标溶液。如可使用2H3-25羟基维生素D2和2H3-25羟基维生素D3制备内标溶液,使终浓度分别达到50ng/mL。
2.制备生物素化抗体磁珠:
A1、制备生物素化抗体:
A1-1、取1mg 25(OH)D抗体;
A1-2、用pH8.0磷酸盐缓冲液于4℃或室温透析16-24h;
A1-3、将0.05mg生物素滴加到透析后的抗体中,再加入pH8.0磷酸盐缓冲液使抗体终浓度为1mg/mL,混匀5min;
A1-4、将混合液置于25±2℃恒温培养箱,静置反应120±10min;
A1-5、使用pH7.4磷酸盐缓冲液于4℃或室温透析生物素化抗体16-24h;
其中,所述透析期间换液不少于4次,总透析体积不低于200:1;
A2、配置结合缓冲液:
A2-1、室温条件下,向一定体积的纯化水中加入6.06g的Tris、9.0g的氯化钠和3.84mL的HCl,至少搅拌10min至完全溶解,然后加入0.5mL的Tween-20和5mL的20%NaN3,最后缓慢加入20.0g的牛血清白蛋白BSA,至少搅拌10min至完全溶解;
A2-2、待所有成分完全溶解后,用pH计测pH值在7.2±0.1为合格,纯化水定容至1L;
A3、制备生物素化抗体磁珠:
A3-1、把链霉亲和素磁珠摇匀,然后吸取60mg磁珠,用不低于磁珠2倍体积的结合缓冲液清洗2次,然后用结合缓冲液把磁珠复溶至不低于10mg/mL;
A3-2、把磁珠和生物素化抗体混合,磁珠终浓度不低于10mg/mL,磁珠置于37±2℃恒温振荡箱,180rpm/min摇匀反应120±10min;
A3-3、把反应后的磁珠取下,用不低于2倍反应体积的结合缓冲液清洗4次,把清洗好的磁珠用结合缓冲液复溶至400μg/mL,2-8℃保存待用;
3.样品富集纯化、一步法衍生洗脱和液相色谱-质谱检测:
S1、取50μL样本;加入100μL同位素内标溶液,用于分析物定量;再加入50μL生物素化抗体磁珠,用于维生素D分析物富集;于37℃震荡孵育10min,使磁珠偶联抗体充分捕获目标分析物;孵育后用400μL磁珠清洗液洗涤2次,随后用400μL纯水洗涤1次;
其中,所述磁珠清洗液的配置方法为:室温条件下,向一定体积的纯化水中加入1.212g的Tris、9.0g的氯化钠、0.4mL的HCl、0.2mL的Tween-20、5.0mL的20%NaN3、0.5mL的Brij-35,混合均匀后检测pH值为8.3±0.2为合格,纯化水定容至1L。
S2、将洗涤后的磁珠加入100μL的含5mM 4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙腈溶液,用于衍生和洗脱维生素D分析物;于室温震荡孵育10min,充分衍生和洗脱维生素D;再向衍生洗脱液中加入20μL的含5mM CH3NH2的水溶液,终止反应;
S3、转移100μL所述衍生洗脱液到进样容器后上液相色谱-质谱联用仪检测,根据目标分析物的浓度和离子化效率以及质谱仪的检测灵敏度,可选择离线纯化后直接注入质谱检测或液相色谱分离联合质谱检测分析;
其中,所述样本为血清、全血、尿液或体液中的一种;
其中,所述所述液相色谱-质谱联用仪采用QSight 210MD液相色谱-三重四极杆质谱系统;
其中,所述液相色谱条件为:色谱柱为Brownlee SPP C18柱,2.1×50mm,2.7μm;柱温25℃,进样时温度为室温,进样量10μL;流动相均是由A相:体积浓度0.1%甲酸甲醇溶液和B相:体积浓度0.1%甲酸水含5mM甲胺溶液组成;等度洗脱,条件为0~1.5min,90%A相/10%B相,流速0.3mL/min,柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测;
其中,所述质谱条件为:采用多反应监测(MRM)正离子模式下扫描;干燥气105PSI,雾化气180PSI,加热气350PSI,HISD温度300℃,离子源温度350℃;检测分子离子质谱参数信息如下表所示:
表1
化合物 | 缩写 | 母离子 | 子离子 | 锥孔电压 | 碰撞电压 |
25-羟基维生素D3 | 25(OH)D3 | 607.4 | 298.1 | 20V | -24V |
六氘代25-羟基维生素D3 | <sup>2</sup>H<sub>6</sub>-25(OH)D3 | 613.4 | 298.1 | 20V | -24V |
25-羟基维生素D2 | 25(OH)D2 | 619.4 | 298.1 | 20V | -24V |
三氘代25-羟基维生素D2 | <sup>2</sup>H<sub>3</sub>-25(OH)D2 | 622.4 | 301.1 | 20V | -24V |
检测结果如表2所示:
表2
还提供一种所述25羟维生素D快速灵敏分析方法的检测试剂盒,包括:
校准品:具有可溯源的、3到6个可覆盖25(OH)D3和25(OH)D2内源浓度范围的以及和相应临床样本有基质互换性的样本,用于校正实际检测中25(OH)D3和25(OH)D2的浓度,一般为冻干品封装;
质控品:2到3个25(OH)D3和25(OH)D2内源水平和医学决定水平附近浓度和相应临床样本有基质互换性的样本,一般为冻干品封装;
内标品:含25(OH)D3和25(OH)D2稳定同位素内标的冻干品;
磁珠偶联抗体:在以上描述的磁珠保存液里封装;
洗脱液:含5mM 4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙腈溶液;
该试剂盒是基于本发明提供的分析方法而设计的,可以用于生物样本25(OH)D3和25(OH)D2浓度的快速灵敏检测。该基于固相免疫富集和一步法衍生加洗脱的策略也可扩展到其他小分子如三碘甲状腺原氨酸,甲状腺素,醛固酮,17-羟孕酮,睾酮,雌三醇等以获得亲和性抗体和易衍生的分析物的检测中。
对比例
本对比例所采用的方法与实施例类似,但未进行一步衍生和洗脱处理,检测结果如表3所示:
表3
本发明描述了一种基于磁珠偶联抗体富集,一步法衍生和洗脱,并结合液相-质谱联用检测的一种维生素D代谢物的全新分析策略。和此前的维生素D代谢物分析方法相比,该方法高灵敏、低成本兼具快速高通量的特点,可以在30分钟内实现从原始样本到25(OH)D2和25(OH)D3精准定量结果输出。
免疫提取-质谱检测因质谱在检测分析端的优势,和传统免疫检测相比,检测结果更加精准。免疫质谱分析可基于管式随机流水线式样本处理方式,可实现样本“即来即测”,和传统的96孔板式样本批处理相比,样本处理不仅全自动,病人获取检测报告也更加及时。
以维生素D检测为例,从样本处理到结果输出,整个过程30分钟内即可完成。在随机样本处理平台上可实现1.5分钟/样本的分析速度。由于免疫质谱前处理获得的样本成分简单,无需复杂的液相分离纯化,因而较传统液相质谱的≥4分钟/样本的检测速度,维生素D的检测通量也大大提高。
由于体内一些代谢物结构非常相似,抗体难以将他们区分开来,因而一个抗体可捕获多种分析物,如维生素D抗体一般可捕获25羟维生素D2和25羟维生素D3,这种有限特异性,还在激素,脂肪酸等小分子抗体中普遍存在,对于免疫检测会造成干扰严重,定量不准的结果,但对于免疫质谱却劣势变优势,因其仅需一个抗体,即可多种分析物富集,和传统免疫分析相比,质谱检测器具有极高的选择性和特异性,因而可实现多指标同时精准定量分析。
样本洗脱阶段同时进行衍生,即可提高维生素D的检测灵敏度。应用优化后的策略,维生素D可在更多的中低端质谱平台上进行精准高通量检测,扩展现有临床质谱仪器的检测项目。同时,衍生后的维生素D因结构发生明显改变,不会和特异性的维生素D抗体结合,进一步提高了衍生物从磁珠上洗脱下来的效率。如上表结果所示,由于衍生和洗脱效率的提升,和未一步衍生和洗脱处理的免疫质谱分析结果相比,一步法衍生洗脱和免疫质谱检测的信号强度提升将近1000倍。
研究结果显示,维生素D的两种代谢产物25(OH)D2和25(OH)D3的灵敏度分别为0.4ng/mL和0.2ng/mL,线性和精密性等重要分析性能指标结果均优异。一般25(OH)D2和25(OH)D3的临床参考范围在10-100ng/mL,因而,免疫质谱法维生素D检测完全满足临床应用的需求。
和已有方法相比,免疫质谱技术结合一步法衍生策略用于维生素D检测,具有高灵敏度、高特异性、重现性好,兼具高通量、可实现全自动等优势,该方法学进一步拓展到其他项目,可在临床多个领域对传统诊断方法学进行替代,进一步显著扩容临床质谱市场。
以上所述仅为本发明较佳的实施例,并非因此限制本发明的实施方式及保护范围,对于本领域技术人员而言,应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案,均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于免疫质谱技术的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,步骤包括:
S1、富集纯化:取样本,加入同位素内标溶液和生物素化抗体磁珠,并震荡孵育,孵育后依次用磁珠清洗液和纯水洗涤;
S2、一步法衍生洗脱:将洗涤后的磁珠加入含4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙腈溶液,并震荡孵育进行衍生洗脱,再向衍生洗脱液中加入含CH3NH2的水溶液以终止反应;
S3、液相色谱-质谱检测:转移所述衍生洗脱液至液相色谱-质谱联用仪检测;
其中,所述样本为血清、全血、尿液或体液中的一种;
其中,所述液相色谱-质谱联用仪采用QSight 210MD液相色谱-三重四极杆质谱系统;
其中,所述液相色谱条件为:色谱柱为Brownlee SPP C18柱,2.1×50mm,2.7μm;柱温25℃,进样时温度为室温,进样量10μL;流动相均是由A相:体积浓度0.1%甲酸甲醇溶液和B相:体积浓度0.1%甲酸水含5mM甲胺溶液组成;等度洗脱,条件为0~1.5min,90%A相/10%B相,流速0.3mL/min,柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测;
其中,所述质谱条件为:采用多反应监测(MRM)正离子模式下扫描;干燥气105PSI,雾化气180PSI,加热气350PSI,HISD温度300℃,离子源温度350℃;检测分子离子质谱参数信息如下:25-羟基维生素D3即25(OH)D3,母离子607.4,子离子298.1,锥孔电压20V,碰撞电压-24V;25-羟基维生素D2即25(OH)D2,母离子619.4,子离子298.1,锥孔电压20V,碰撞电压-24V。
2.根据权利要求1所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,步骤包括:
S1、富集纯化:取25-75μL样本,加入50-150μL同位素内标溶液和25-75μL生物素化抗体磁珠,并于18-56℃震荡孵育5-15min,孵育后用200-600μL磁珠清洗液洗涤1-3次,随后用200-600μL纯水洗涤1-2次;
S2、一步法衍生洗脱:将洗涤后的磁珠加入50-150μL的含2-8mM 4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙腈溶液,并于12-38℃震荡孵育5-15min进行衍生洗脱,再向衍生洗脱液中加入10-30μL的含2-8mM CH3NH2的水溶液以终止反应;
S3、液相色谱-质谱检测:转移所述衍生洗脱液至液相色谱-质谱联用仪检测;其中,所述样本为血清、全血、尿液或体液中的一种。
3.根据权利要求1所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,所述同位素内标溶液的配制方法为:
选择2H,13C或18O稳定同位素标记的化合物中的一种或多种制备内标溶液。
4.根据权利要求3所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,所述同位素内标溶液的配制方法为:
制备2H3-25羟基维生素D2和2H3-25羟基维生素D3内标溶液,使其终浓度分别达到25-75ng/mL。
5.根据权利要求1所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,所述生物素化抗体磁珠的制备步骤包括:
A1、把链霉亲和素磁珠摇匀,然后吸取30-90mg磁珠,用不低于磁珠1-3倍体积的结合缓冲液清洗1-3次,然后用结合缓冲液把磁珠复溶至不低于5-15mg/mL;
A2、把磁珠和生物素化抗体混合,磁珠终浓度不低于5-15mg/mL,磁珠置于35-39℃恒温振荡箱,90-270rpm/min摇匀反应110-130min;
A3、把反应后的磁珠取下,用不低于1-3倍反应体积的结合缓冲液清洗2-6次,把清洗好的磁珠用结合缓冲液复溶至200-600μg/mL,2-8℃保存待用。
6.根据权利要求5所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,所述生物素化抗体的制备步骤包括:
B1、取1-2mg 25(OH)D抗体;
B2、用pH8.0磷酸盐缓冲液于2-38℃透析16-24h;
B3、将0.02-0.08mg生物素滴加到透析后的抗体中,再加入pH8.0磷酸盐缓冲液使抗体终浓度为1-2mg/mL,混匀2-8min;
B4、将混合液置于23-27℃恒温培养箱,静置反应110-130min;
B5、使用pH7.4磷酸盐缓冲液于2-38℃透析生物素化抗体16-24h。
7.根据权利要求6所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,所述透析期间换液不少于4次,总透析体积不低于200:1。
8.根据权利要求5所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,所述结合缓冲液的配置步骤包括:
C1、12-38℃条件下,向一定体积的纯化水中加入3-9g的Tris、4-14g的氯化钠和2-6mL的HCl,至少搅拌5-15min至完全溶解,然后加入0.2-0.8mL的Tween-20和2-8mL的20%NaN3,最后缓慢加入10-30g的牛血清白蛋白BSA,至少搅拌5-15min至完全溶解;
C2、待所有成分完全溶解后,用pH计测pH值在7.1-7.3为合格,纯化水定容至1L。
9.根据权利要求1所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,所述磁珠清洗液的配置方法为:12-38℃条件下,向一定体积的纯化水中加入1-2g的Tris、4-14g的氯化钠、0.2-0.6mL的HCl、0.1-0.3mL的Tween-20、2-8mL的20%NaN3、0.2-0.8mL的Brij-35,混合均匀后检测pH值为8.1-8.5为合格,纯化水定容至1L。
10.根据权利要求1所述的25羟维生素D快速灵敏分析方法,其特征在于,所述步骤S3还包括:转移50-150μL所述衍生洗脱液到进样容器后上液相色谱-质谱联用仪检测。
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