CN116466004A - 测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒及使用方法 - Google Patents

测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒及方法，该试剂盒采用同位素稀释‑液相色谱串联质谱法进行测定，所述试剂盒包括萃取剂、蛋白变性剂、内标溶液、标准品溶液、流动相和稀释液。通过蛋白质沉淀后再液液萃取的方式处理样本，从而提取富集血清样本中的总T3和总T4，能够从经济性、处理简单的前体下，处理临床样本；通过液相色谱分离技术及质谱仪选择反应监测模式(MRM)，使本申请试剂盒检测血清中总T3和总T4含量，具有特异性强、灵敏度、线性、准确度、精密度性能优秀的优点。

Description

测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒及使用方法
技术领域
本申请涉及生物检测领域，具体涉及一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒及使用方法。
背景技术
三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)是一类由甲状腺分泌而来的激素。这两种激素在调节生长、发育、碳代谢、氧消耗、蛋白质合成、胎儿神经发育等生物过程中具有重要作用。一般情况下，在正常的人体中，大约80～90％的T4是由甲状腺分泌而来，但是相对于T3，仅有20％左右的T3是由甲状腺分泌而来。事实上，人体内大约80％的T3是由T4通过脱碘作用转化而来。但是在甲亢病理状态下的人体中，绝大多数的T3并不是通过T4脱碘转化而来，而是通过甲状腺分泌而来。因而，当需要诊断人体甲状腺功能机能是否正常时，可以通过测定血清中T3和T4的水平变化来判断。
目前，T3和T4的检测方法主要是放射免疫法、胶体金法、酶联免疫法及化学发光法等，这些都是基于抗原和抗体特异性识别的免疫学原理方法。该方法受到结构类似物干扰时，存在交叉反应，从而导致特异性较差、测值出现偏差。另外常规方法在测较低浓度的样本时，由于灵敏度的限制，导致测试结果容易出现跳值现象，难以满足临床检测需求。因此，亟需一种特异性强，灵敏度高的测定T3和T4的试剂盒，来满足临床上甲状腺功能诊断的需求。
发明内容
基于此，本申请有必要一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒及方法。
具体技术方案如下：
第一方面，本申请提供了一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒，所述试剂盒采用同位素稀释-液相色谱串联质谱法进行测定，所述试剂盒包括萃取剂、蛋白变性剂、内标溶液、标准品溶液、流动相和稀释液。
在其中一个实施例中，所述萃取剂包括乙酸乙酯或叔丁基甲醚。
在其中一个实施例中，所述蛋白变性剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙腈中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述内标溶液包括含有T3-13C6同位素内标的内标母液1和含有T4-13C6同位素内标的内标母液2；或，所述内标溶液包括含有T3-13C6同位素内标和T4-13C6同位素内标的混合液。
在其中一个实施例中，所述标准品溶液包括含有T3标准品的标准品母液1和含有T4标准品的标准品母液2；或，所述标准品溶液包括含有T3标准品和T4标准品的混合液。
在其中一个实施例中，所述流动相包括流动相A和流动相B；
可选地，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为甲醇或乙腈。
可选地，所述流动相A为甲酸含量为0.1％～0.2％(v/v)甲酸水溶液。
在其中一个实施例中，所述稀释液包括稀释液1、稀释液2和稀释液3，其中，稀释液1为超纯水或0.9％生理盐水，稀释液2为活性炭处理的去T3/T4血清，稀释液3为10％～50％(v/v)甲醇水溶液。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括质控品和/或复溶液；
在其中一个实施例中，所述质控品包括不同浓度的所述标准品溶液；所述复溶液为10％～50％(v/v)甲醇水溶液。
第二方面，本申请提供了一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
采用所述的试剂盒中的试剂，按照如下步骤进行检测:
加入内标溶液的样本经蛋白变性剂处理后，离心，加入萃取剂获得含有三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的萃取液；
在其中一个实施例中，所述萃取液采用液相色谱进行分离后，进入质谱检测。
在其中一个实施例中，所述方法还包括质谱检测后，采用同位素内标定量法，采用最小二乘法以标准品与内标峰面积比为X轴，标准品与内标峰的浓度比为Y轴，建立校准曲线，并计算出样本中三碘甲状腺原氨酸及甲状腺素的浓度。
相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
本申请提供了基于同位素稀释-液相色谱串联质谱法同时测定总T3和总T4两种关键甲状腺激素的试剂盒，通过蛋白质沉淀后再液液萃取的方式处理样本，从而提取富集样本中的总T3和总T4，能够从经济性、处理过程简单的前体下，处理临床样本；通过液相色谱分离技术及质谱仪选择反应监测模式(MRM)，使用本申请试剂盒检测中总T3和总T4含量，具有特异性强、灵敏度、线性、准确度、精密度性能优秀的优点，提升了医学实验室检验中T3和T4的能力。
附图说明
图1为标准品T3和T4总离子流色谱图；
图2为血清样本T3和T4总离子流色谱图；
图3a为特异性样本1总离子流色谱图；图3b为特异性样本2总离子流色谱图；图3c特异性样本3总离子流色谱图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本申请所使用的术语“和/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。比如，“A和/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，B，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多组”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。“以上”包括本数，比如“两种以上”包括两种、三种或更多种。
本申请中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请一实施方式提供了一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒，其中，测定的样本可以是血清或血浆。使用蛋白变性剂和萃取剂处理样本，提取富集样本中的总T3和总T4，从而达到经济、方便处理样本的目的。采用同位素稀释-液相色谱串联质谱法可同时特异性检测T3和T4，解决了免疫方法测定T3/T4特异性差、灵敏度低、结果不准及线性不好的问题。具体地，该试剂盒包括萃取剂、蛋白变性剂、内标溶液、标准品溶液、流动相和稀释液。
其中，蛋白变性剂用于样本中蛋白质的变性，萃取剂用于提取样本中三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素，使样本处理过程简单，成本低。
在一个具体示例中，萃取剂包括乙酸乙酯或叔丁基甲醚，优选，乙酸乙酯。
在一个具体示例中，蛋白变性剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙腈中的一种或多种。优选，甲醇。
在一个具体示例中，内标溶液含有T3-13C6同位素内标和/或T4-13C6同位素内标。
在一个具体示例中，内标溶液包括含有T3-13C6同位素内标的内标母液1，和含有T4-13C6同位素内标的内标母液2；或，内标溶液包括含有T3-13C6同位素内标和T4-13C6同位素内标的混合液。
进一步可选地，内标母液1为含有1μg/mL T3-13C6的0.1％(v/v)盐酸甲醇溶液，内标母液2为含有20μg/mL T4-13C6的0.1％(v/v)盐酸甲醇溶液。具体配置方法：分别称取0.1mg T3-13C6和2mg T4-13C6同位素内标粉末于各自的100mL容量瓶中，用含有0.1％盐酸的甲醇溶液溶解并定容至刻度线处，得到T3-13C6浓度为1μg/mL的内标母液1和T4-13C6浓度为20μg/mL的内标母液2。内标母液1或2作为同位素内标储备液，在使用时，将内标母液1和内标母液2混合使用。
在一个具体示例中，标准品溶液含有T3标准品和/或T4标准品。在一个具体示例中，标准品溶液包括含有T3标准品的标准品母液1和含有T4标准品的标准品母液2；或，标准品溶液包括含有T3标准品和T4标准品的混合液。
进一步可选地，标准品母液1为含有0.1mg/mL T3的0.1％(v/v)盐酸的甲醇溶液和标准品母液2为含有5mg/mL T4的0.1％(v/v)盐酸的甲醇溶液。具体配置方法：分别精确称取10mg T3标准品粉末于100mL容量瓶中，25mg T4标准品粉末于5mL容量瓶中。用含有0.1％盐酸的甲醇溶液溶解并定容至刻度线处，得到T3浓度为0.1mg/mL的标准品母液2和T4浓度为5mg/mL的标准品母液2。标准品母液1或2作为标准品储备液，在使用时，将标准品母液1和标准品母液2混合使用。
在一个具体示例中，流动相包括流动相A和流动相B。可选地，流动相A为甲酸水溶液，可选地，流动相A为甲酸含量为0.1％～0.2％(v/v)甲酸水溶液，优选甲酸含量为0.1％(v/v)甲酸水溶液。可选地，流动相B为甲醇或乙腈，优选甲醇。
在一个具体示例中，稀释液包括稀释液1～稀释液3，其中，稀释液1为超纯水或0.9％生理盐水，优选超纯水；稀释液2为活性炭处理的去T3/T4血清；稀释液3为10％～50％(v/v)甲醇水溶液，优选10％(v/v)甲醇水溶液。
在一个具体示例中，该试剂盒还包括质控品和/或复溶液。具体地，质控品为不同浓度的标准品溶液，具体地，标准品溶液为含有T3标准品和T4标准品的混合液，使用活性炭处理的去T3/T4血清对标准品溶液进行稀释。所述复溶液为10％～50％(v/v)甲醇水溶液。
本申请一实施方式还提供了一种检测样本中总三碘甲状腺原氨酸和总甲状腺素的方法，该方法包括如下(1)～(2)步骤：
步骤(1)加入内标溶液的样本经蛋白变性剂处理后，离心，加入萃取剂获得含有三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的萃取液。
具体地，样本包括血清。
具体地，蛋白变性剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙腈中的一种或多种，优选，甲醇。
具体地，内标溶液为混合内标工作液，混合内标工作液包含10ng/mL T3-13C6和200ng/mL T4-13C6。
具体地，萃取剂包括乙酸乙酯或叔丁基甲醚，优选，乙酸乙酯。
步骤(2)所述萃取液采用液相色谱进行分离后，进入质谱检测。
具体地，液相色谱的色谱中可以为Hypersil GOLD反向色谱柱；梯度洗脱条件：流动相A(水相)为0.1％的甲酸水，流动相B(有机相)为100％甲醇，柱温为40℃，进样量5μL，流速和洗脱条件见表4。
进一步具体地，质谱检测使用美国Thermo TSQ Quantis液相色谱质谱仪，在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，源参数见表5，质谱碰撞条件见表6。
在一个具体示例中，该方法还包括质谱检测后，采用同位素内标定量法，采用最小二乘法以标准品与内标峰面积比为X轴，标准品与内标峰的浓度比为Y轴，建立校准曲线，根据测得的样本中三碘甲状腺原氨酸或甲状腺素与相对应内标峰面积比对照校准曲线，计算出样本中三碘甲状腺原氨酸及甲状腺素的浓度。
本申请一实施方式还提供了一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：采用上述的试剂盒中的试剂，按照上述检测样本中三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的方法进行检测。可选，样本为血清。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
一种试剂盒组分的示例，如表1所示。
表1试剂盒的成分
具体说明如下：
(1)流动相：
流动相A：体积比为0.1～0.2％甲酸水溶液(优选0.1％)，流动相B：质谱纯甲醇或乙腈(优选甲醇)；
(2)标准品母液：分别精确称取10mg T3标准品粉末于100mL容量瓶中，25mg T4标准品粉末于5mL容量瓶中。用含有0.1％盐酸的甲醇溶液溶解并定容至刻度线处，得到T3浓度为0.1mg/mL的标准品母液和T4浓度为5mg/mL的标准品母液；
(3)内标母液：分别大约称取0.1mg T3-13C6和2mg T4-13C6同位素内标粉末于各自的100mL容量瓶中。用含有0.1％盐酸的甲醇溶液溶解并定容至刻度线处，得到T3-13C6浓度为1μg/mL的内标母液和T4-13C6浓度为20μg/mL的内标母液；
(4)稀释液：
稀释液1：超纯水或0.9％生理盐水(优选超纯水)，稀释液2：活性炭处理的去T3/T4血清，稀释液3：10％～50％甲醇水溶液(优选10％)；
(5)蛋白质变性剂：甲醇、乙醇、丙酮、乙腈(优选甲醇)；
(6)萃取剂：乙酸乙酯或叔丁基甲醚(优选乙酸乙酯)；
(7)质控品：以活性炭处理的去T3/T4血清为稀释液将标准品母液配置成如下表所示的低、中、高浓度的T3/T4 QC样本，如表2所示。
表2质控品
水平 T3(ng/mL) T4(ng/mL)
QC(低) 0.50 10.0
QC(中) 2.00 100
QC(高) 5.00 200
(8)复溶液：10％～50％甲醇水(优选10％)。
实施例2
试剂盒的使用方法的示例：
1.标曲及内标工作液的配置
(1)混合标准品一级工作液的配置：分别取10μL的T3和T4的标准品母液至980μL的稀释液3(10％甲醇水溶液)中，配置成T3浓度为1μg/mL和T4浓度为50μg/mL的混合标准品一级工作液；
(2)混合标准品二级工作液的配制：取100μL的混合标准品一级工作液至900μL的稀释液3中，配置成T3浓度为100ng/mL和T4浓度为5000ng/mL的混合标准品二级工作液；
(3)混合内标工作液的配置：分别取10μL的T3-13C6和T4-13C6的内标母液至980μL的稀释液3中，配置成T3-13C6浓度为10ng/mL和T4-13C6浓度为200ng/mL的混合内标工作液；
(4)工作曲线的配置：取100μL的混合标准品二级工作液至900μL的稀释液2中，配置成T3浓度为10ng/mL和T4浓度为500ng/mL的第1个高值点工作校准品S9，然后将S9依次逐级稀释(见表3)，得到各曲线点。
表3标曲曲线点的配置
2.样本处理
(1)取250μL的样本(临床血清样本、各浓度点的标曲及QC样本(低、中、高)至1.5mL的离心管中，并加入25μL混合内标工作液，充分震荡混匀后，于室温条件下孵育1h。
(2)孵育完后，加入0.5mL 2-8℃预冷过的变性剂甲醇，充分震荡混匀5min后，并于10000g，4℃条件下离心5min；
(3)转移上清至新的5.0mL离心管中，并加入1mL的稀释液1，充分震荡混匀；
(4)接着加入3mL的萃取剂乙酸乙酯，充分震荡混匀，于室温条件下孵育10min(期间不断摇匀)后，于2000g，4℃条件下离心10min；
(5)转移上层有机层至新的5mL离心管中，于30℃条件下，氮吹干，并加入300μL复溶液，震荡混匀复溶；
(6)复溶后的复溶液于10000g、室温条件下，离心5min。取100μL上清至进样小瓶中，进行上机检测。
3.液相条件
色谱柱采用Thermo厂家的Hypersil GOLD反向色谱柱(100×2.1mm，1.9μM)，流动相A(水相)为0.1％的甲酸水，流动相B(有机相)为100％甲醇，柱温为40℃，进样量5μL，流速和洗脱条件见表4：
表4流速和洗脱条件
步骤 时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
1 0 0.3 90 10
2 1 0.3 90 10
3 4 0.3 30 70
4 7 0.3 30 70
5 7.1 0.3 90 10
6 10.5 0.3 90 10
4.质谱条件
使用美国Thermo TSQ Quantis液相色谱质谱仪，在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式。源参数见表5，质谱碰撞条件见表6。
表5质谱源参数
表6质谱碰撞条件
方法学验证
1、校准曲线
采用同位素内标定量法，采用最小二乘法以标准物与内标物峰面积比为X轴，标准物与内标物峰的浓度比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中T3及T4待测物的浓度。2种甲状腺激素在各自浓度范围内的线性拟合方程的线性良好、相关系数R在0.997以上，详见表7。
表7保留时间及线性范围结果
2、精密度
将低、中、高的浓度质控品作为精密度样本。其中天内精密度是每个浓度样本重复做4个平行，每个平行测5次。天间精密度是每个浓度样本重复做4个平行，每个平行测1次，连续测定5天。2种甲状腺激素的精密度结果均在8％范围内，详见表8。
表8天内精密度及天间结果
3、准确度
该项目的准确度是以加标回收率的方式及JCTLM推荐的参考实验室Rfb溯源机构所赋值血清盘进行验证。其中加标回收率是将一混合临床血清样本分成12份，每份250μL，其中3份不加标，其它9份分别加入低、中、高浓度的标准品，12份血清样本经处理后上机测定3次。2种甲状腺激素的加标回收率均在85％～115％范围内，详见表9。而本申请试剂盒所测值与Rfb所测值偏差也均在8％范围内，详见表10。
表9加标回收率结果
表10本申请试剂盒测值VS Rfb实验室测值结果
4、最低定量限(LOQ)
以稀释液2作为空白基质，稀释S7制备接近最低定量限的样本，稀释后的样本做5个平行，每个平行测5次，计算其精密度(RSD)和回收率，需满足RSD≤20％，85％≤回收率≤115％。得到的2种甲状腺激素的LOQ分别为0.02ng/mL及0.8ng/mL，详见表11。
表11LOQ结果
5、特异性
以稀释液2作为空白基质往里面添加T4、T3、rT3标准品，分别配制成T4理论浓度为800ng/mL、T3理论浓度为800ng/mL及rT3为100ng/mL的特异性样本1、特异性样本2、特异性样本3。然后测试特异性样本1和特异性样本3中的T3浓度，测试特异性样本2和特异性样本3中的T4浓度，每种特异性样本做3个平行，需满足特异性样本1所测T3浓度≤2.0ng/mL，特异性样本2所测T4浓度≤15.0ng/mL，特异性样本3所测T3浓度≤2.0ng/mL及所测T4浓度≤15.0ng/mL。如附图3a～3c所示，本申请试剂盒特异性样本所测T3、T4信号几乎为0，无法检出，表明了本申请试剂盒的特异性较好。
实施例3
本申请试剂盒与化学发光法试剂盒性能对比：
1、线性范围对比
本申请试剂盒的T3及T4线性范围分别为0.03-10ng/mL、1.5-500ng/mL。而T3及T4化学发光法试剂盒的线性范围分别为0.4-8ng/mL、5-240ng/mL(说明书宣称)。与化学发光法试剂盒相比，本申请的试剂盒线性范围更宽。T3及T4化学发光法试剂盒购自深圳亚辉龙三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素化学发光法试剂盒。
2、精密度对比
T3及T4化学发光法试剂盒也同时测定了相同的低、中、高浓度质控品，并按照相同的方法评定其精密度，其实测天内及天间精密度见表12所示。与化学发光试剂盒(自动化的化学发光测定仪进行加样)相比，本申请试剂盒(手动法)的天内及天间精密度也均在8％范围以内，精密度性能良好。
表12化学发光法试剂盒天内精密度及天间结果
3、准确度对比
T3及T4化学发光法试剂盒也同时测定相同的JCTLM推荐的参考实验室Rfb溯源机构所赋值血清盘，其和Rfb测值偏差多数水平超过±10％的偏差范围，如表13所示。这表明与化学发光试剂盒相比，本申请试剂盒的准确度更优。
表13化学发光法试剂盒测值VS Rfb实验室测值结果
4、最低定量限(LOQ)对比
本申请试剂盒的T3及T4最低定量限分别为0.02ng/mL、0.8ng/mL。而T3及T4化学发光法试剂盒采用同样的验证方式得到的最低定量限分别为0.1ng/mL、2.0ng/mL(如表14所示)。与化学发光法试剂盒相比，本申请试剂盒最低定量限更低，表明了本申请试剂盒灵敏度性能更具优势。
表14化学发光法试剂盒LOQ结果
5、特异性对比
本申请试剂盒的T3及T4检测的技术手段是基于液相色谱分离技术耦合质谱分析器检测技术，来达到特异性检测T3及T4的目的。而化学发光法试剂盒特异性的性能依赖于抗体与分析物的特异性识别作用。尽管采用相同的方式验证了化学发光法试剂盒的特异性性能也能满足相应的条件，见表15所示。但是，本申请试剂盒特异性样本所测T3、T4信号几乎为0，无法检出(附图3a～3c所示)。从检测的基本原理和实验结果上看，本申请的试剂盒特异性更优。
表15化学发光法试剂盒特异性结果
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用同位素稀释-液相色谱串联质谱法进行测定，所述试剂盒包括萃取剂、蛋白变性剂、内标溶液、标准品溶液、流动相和稀释液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述萃取剂包括乙酸乙酯或叔丁基甲醚。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白变性剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙腈中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标溶液包括含有T3-13C6同位素内标的内标母液1和含有T4-13C6同位素内标的内标母液2；或
所述内标溶液包括含有T3-13C6同位素内标和T4-13C6同位素内标的混合液；
可选地，所述标准品溶液包括含有T3标准品的标准品母液1和含有T4标准品的标准品母液2；或
所述标准品溶液包括含有T3标准品和T4标准品的混合液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述流动相包括流动相A和流动相B；
可选地，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为甲醇或乙腈；
可选地，所述流动相A为甲酸含量为0.1％～0.2％(v/v)的甲酸水溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括稀释液1、稀释剂2和稀释液3，其中，所述稀释液1为超纯水或0.9％生理盐水，稀释液2为活性炭处理的去T3/T4血清，稀释液3为10％～50％(v/v)甲醇水溶液。
7.根据权利要求1～6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品和/或复溶液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品为不同浓度的所述标准品溶液；所述复溶液为10％～50％(v/v)甲醇水溶液。
9.一种测定三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用权利要求1～8任一项所述的试剂盒中的试剂，按照如下步骤进行检测:
加入所述内标溶液的样本经蛋白变性剂处理后，离心，加入所述萃取剂获得含有三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的萃取液；
所述萃取液采用液相色谱进行分离后，进入质谱检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括质谱检测后，采用同位素内标定量法，采用最小二乘法以标准品与内标峰面积比为X轴，标准品与内标峰的浓度比为Y轴，建立校准曲线，并计算出样本中三碘甲状腺原氨酸及甲状腺素的浓度。
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