CN108645942A

CN108645942A - 血清中25-羟基维生素d的高效液相色谱串联质谱检测方法

Info

Publication number: CN108645942A
Application number: CN201810633177.3A
Authority: CN
Inventors: 富士山; 马金飞; 杨青青; 康洲阳; 刘华芬
Original assignee: Hangzhou Kailai Precision Medical Testing Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Kailai Precision Medical Testing Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2018-10-12

Abstract

本发明公开了一种血清中25‑羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：(1)样品预处理，其中，血清样品依次加入内标工作液和氢氧化钠溶液，混合均匀；(2)固液萃取处理，其中，步骤(1)处理后样品上样至固相支持液液萃取SLE 96孔板，用正己烷洗脱，洗脱液用氮气吹干；(3)衍生化反应，加入衍生化试剂4‑苯基‑1,2,4‑三唑啉‑3,5‑二酮(PTAD)溶液复溶，恒温反应，然后加入乙醇终止反应，氮气吹干；(4)复溶，采用基于多路复接系统(MPX)的高效液相色谱串联质谱法进行分析检测。本发明检测灵敏度高，专属性好，成本低廉，同时有效缩短样品前处理时间和分析时间，提高样品的检测效率。

Description

血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种高通量、高灵敏度、低成本的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

维生素D是一种类固醇激素，能够调节人体的钙、磷体内平衡，其体内水平对机体的正常生理功能产生重要影响。维生素D在肝脏中转化为代谢产物25-羟基维生素D，25-羟基维生素D可反映人体的维生素D的水平，是评估维生素D的重要指标。目前测定血清中的25-羟基维生素D的方法主要有酶免疫分析法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等等；这些方法有以下几点问题和缺点：酶免疫学方法不能区分25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃，测定结果是二者总和。此外，抗体可以和待测物的结构类似物结合，这就导致了不同实验室间测定结果的显著差异。25-羟基维生素D在人体内主要与血清结合蛋白DBP结合，人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此竞争蛋白结合法存在严重的基质干扰。液相色谱法的前处理相对复杂、费时费力、基质干扰严重、单个样品分析测试时间长导致单位时间内检测分析样本量较少，效率低，特异性差，检测通量和自动化程度很低。

国家知识产权局网站上公开的“血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法”，该方法包含以下步骤(1)用含有25-羟基维生素D内标物的乙腈溶液加入人血清样品进行蛋白沉淀，充分混匀；(2)加入正己烷萃取溶剂，充分混匀后离心；(2)移取上清液并进行干燥后，加入复溶剂，得到待测样品，用高通量液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测。此种方法对仪器检测灵敏度要求较高，实际检测过程中需要机构科室配备价格昂贵的高灵敏度检测仪器，方法的仪器成本较高，同时方法的基质干扰依然显著。

因此，需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题是如何克服现有方法的不足，提供一种特异性强、准确度高、灵敏度高、检测设备成本低、分析通量高的25-羟基维生素D检测方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有25-羟基维生素D检测方法中存在的部分问题，提供一种血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，该方法具有特异性强、准确度高、灵敏度高、检测设备成本低、分析通量高等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：

(1)样品预处理：取50～200μL人血清加入到10～50μL内标工作溶液，涡旋混匀，再向其中加入100mmol/L氢氧化钠溶液50～200μL，涡旋混匀；

(2)固液萃取处理：将步骤(1)中预处理样品上样到SLE96孔板上，静置5min，再将1～2mL正己烷分四次加入SLE96孔板进行洗脱，96孔接收板收集洗脱液，采用氮气吹干；

(3)衍生化反应：将40～100μL PTAD衍生化工作溶液加入到步骤(2)的残渣中，涡旋0.5min，置于40～65℃烘箱恒温反应30min，稍冷却后加入20～50μL乙醇终止反应，涡旋1min，采用氮气吹干；

(4)将步骤(3)得到的残渣，进一步用60～100μL复溶液复溶，涡旋使充分溶解，上基于多路复接系统MPX的高效液相色谱串联质谱系统进样10～20μL分析检测。

优选地，所述步骤(1)中内标工作液的配置方法如下：用乙醇配置浓度为1mg/mL的氘代25-羟基维生素D₃的内标储备液，再用乙醇进一步稀释得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液。

优选地，所述步骤(2)和(3)中采用氮气吹干的条件包括通35～60℃氮气直至干燥。

优选地，所述步骤(3)的衍生化工作溶液的配置方法如下：用乙酸乙酯配置浓度为25mg/mL的PTAD的衍生化储备液，再用乙酸乙酯进一步稀释得到浓度为1mg/mL的衍生化次级储备液，随后用乙酸乙酯进一步稀释得到浓度为0.2mg/mL的衍生化工作溶液。

优选地，所述步骤(4)中的复溶液为甲醇：水：甲酸的混合物，其体积比为50：50：0.1。

优选地，所述步骤(4)所述的高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪。

优选地，所述步骤(4)通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：以水-甲醇-甲酸为流动相体系，色谱柱为C18柱，流动相的流速为0.4～1.0mL/min，柱温为30～45℃，采用多反应监测扫描模式。

优选地，所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液使用的流动相由以下流动相A和流动相B组成；其中流动相A相为含体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B相为体积分数0.1％甲酸甲醇溶液，流动相A和流动相B的体积比为40～5：60～95％。

优选地，所述色谱柱的的填料为十八烷基键合硅胶C18，填料粒径为1.7～5.0μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～100mm。

优选地，所述步骤(4)中，质谱检测采用电喷雾电离源(ESI)和MRM模式，用于检测的25-OHD₂衍生化产物和25-OHD₃衍生化产物的母离子/子离子检测对如下所示：25-OHD₂衍生化产物，m/z 570.2>m/z 298.2和m/z 570.2>m/z 280.2；25-OHD₃衍生化产物，m/z 558.2>m/z 298.2和m/z 558.2>m/z 280.2；内标d6-25-OHD₃衍生化产物的检测离子对为m/z564.2>m/z 298.2。

更进一步地，所述25-羟基维生素D₃(25-OHD₃)和25-羟基维生素D₂(25-OHD₂)的保留时间均为1.1min。

优选地，步骤(4)所述的MPX系统为提高单位时间内分析效率，采用MPX软件，应用两台高效液相色谱连接一台质谱。

基于上述的实验条件，经过多次试验验证，本发明的精密度RSD％<10％。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下所示：

本发明采用固相支持液液萃取技术(SLE96孔板)和衍生化技术将待测化合物从复杂的血清基质中提取并净化后，得到待测样品，待测样品通过配有MPX系统的液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测。此种方法优势在于：1.采用SLE板和衍生化方法净化基质，使得基质干扰降到最低，特异性更强；2.衍生化以后检测目标化合物带上特异性基团使待测化合物极性变大，出峰时间更早，大大缩短了单个样本的检测时间，单个样本的检测时间控制在1.25分钟；还可以使待测物离子化效果更好，从而提高灵敏度，即便采用灵敏度较低、价格相对便宜、仪器型号老旧的串联四级杆质谱仪，也有很好的测定结果，有效降低质谱仪的成本，促进维生素D检测技术在本领域内的应用和推广；3.采用96孔板进行前处理大大提高了自动化水平，提高分析的通量。此外，整个操作过程都可以在移液工作站上完成，大大节约人力成本，同时避免潜在的人为误差或者差错。4.采用两台高效液相色谱连接一台质谱，应用MPX软件控制，使不同自动进样器的样本交替进入质谱，大大提高了质谱的利用效率并降低了单个样本的分析时间，提高单位时间内检测样本的通量，单个样本的检测时间控制在1.3分钟。

本发明一次测定准确给出25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃测定值；本方法分析时间大大缩短，单个样本在1.3分钟内完成分析，提高检测效率，降低检测成本；采用96孔板，提高效率并实现自动化，对于医院检验科及第三方医学检验单位来说尤为重要；样本前处理采用SLE技术(固相支持的液液萃取)和衍生化手段提高了方法的检测灵敏度和选择性，有效地减少了样本中复杂基质有可能引入的干扰，通过低灵敏度的仪器设备就可以检测得到。

此外，方法的样本前处理过程简单，所用试剂常规且成本低，便于操作。

附图说明：

图1a和图1b分别是检测2ng/mL 25-OHD₂和5ng/mL 25-OHD₃的定量下限的色谱图；

图2a和图2b分别是25-OHD₂和25-OHD₃的标准曲线。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明用于25-羟基维生素D检测的具体实现过程。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例：一种血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法

一、溶液配置

标准工作溶液配置：分别准确称量25-OHD₂和25-OHD₃标准品，加入乙醇溶解得到浓度为1mg/mL的一级储备液，然后用乙醇将一级储备液稀释为25-OHD₂浓度为10μg/mL和25-OHD₃浓度为50μg/mL的二级储备液；精密吸取一定体积乙醇置于2mL的EP管中，再分别依次精密吸取一定体积的25-OHD₂二级储备液和25-OHD₃二级储备液置于该EP管中，涡旋10s混匀，得到浓度为800ng/mL的25-OHD₂和2000ng/mL的25-OHD₃混合标准工作溶液，命名为标准工作溶液SD6。将标准工作溶液SD6用乙醇稀释成系列标准工作溶液SD1、SD2、SD3、SD4、SD5，SD1-SD6中25-OHD₂和25-OHD₃的浓度分别为50、100、200、500、1000和2000ng/mL和20、40、80、200、400和800ng/mL。

衍生化工作溶液配置：准确称量5mg PTAD标准品，加入200μL乙酸乙酯溶解并稀成浓度为25mg/mL的PTAD衍生化一级储备液。吸取40μL该储备液于2mL的EP管中，加入960μL的乙酸乙酯，涡旋混匀，稀释成浓度为1mg/mL的PTAD衍生化二级储备液。吸取200μL次级储备液于2mL的EP管中，加入800μL乙酸乙酯，涡旋混匀，得到浓度为0.2mg/mL的PTAD衍生化工作溶液。

内标工作溶液配置：准确称量d6-25-OHD₃标准品，加入乙醇稀释成浓度为1mg/mL的d6-25-OHD₃的内标储备液，再用乙醇进一步稀释得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液。

二、具体操作步骤：

(1)100μL人血清与10μL内标工作溶液混合，涡旋1min充分混匀，再向其中加入100mmol/L氢氧化钠溶液100μL，涡旋1min充分混匀。

(2)步骤(1)中预处理样品全部转移到96孔SLE板上，静置5min，再将1.2mL正己烷分四次加入SLE96孔板进行洗脱，96孔接收板收集洗脱液，通40℃氮气直至干燥。

(3)将60μL衍生化工作溶液加入到步骤(2)吹干后的残渣中，涡旋0.5min，置于50℃烘箱反应30min，稍冷却后加入40μL乙醇终止反应，涡旋1min，氮气吹干；

(4)步骤(3)得到的残渣，进一步用100μL复溶液复溶，涡旋使充分溶解，上配有MPX系统的高效液相色谱串联质谱联用系统进样20μL分析。

步骤(4)中的复溶液为甲醇：水：甲酸的体积比为50：50：0.1。

步骤(4)所述的质谱为三重四级杆质谱仪。

步骤(4)通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：色谱柱为Durashell C18(2.7μm,3.0×50mm，150A)，流速为1.0mL/min，柱温为40℃；

梯度洗脱程序见表1；

流动相A相为含体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B相为体积分数0.1％甲酸甲醇溶液；A相∶B相体积比为40～5％：60～95％，按表1梯度程序洗脱。流动相的流速为1.0mL/min。

25-OHD₃和25-OHD₂的保留时间均为1.1min。

步骤(4)中的MPX系统采用两台高效液相色谱连接一台质谱，应用MPX软件控制，使不同自动进样器的样本交替进入质谱。

质谱条件如表2所示；

表2质谱条件

按以上液相条件分离后，采用电喷雾电离源(ESI)和MRM进行质谱检测，用于检测的25-OHD₂衍生化产物和25-OHD₃衍生化产物。的母离子/子离子检测对如下所示：25-OHD₂，m/z 570.2>m/z 298.2和m/z 570.2>m/z 280.2；25-OHD₃衍生化产物，m/z 558.2>m/z298.2和m/z 558.2>m/z 280.2；内标d6-25-OHD₃衍生化产物的检测离子对为：m/z 564.2>m/z 298.2。以上检测离子对的MRM质谱参数如表3所示；

表3检测离子对质谱MRM参数

图1a和图1b分别示出了定量下限2ng/mL 25-OHD₂和5ng/mL 25-OHD₃色谱图。

采用内标法建立标准曲线。如图2a、图2b、和表4可知，25-OHD₂在2～80ng/mL的线性范围内，25-OHD₃在5～200ng/mL线性相关性良好，相关系数r分别为0.9975和0.9983，准确度范围分别为97.6％～105.2％和99.4％～103.8％。

表4：标准曲线结果

本发明已用于临床批量样本的检验测定，结果表明该方法线性范围能够满足临床检验的需要。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中内标工作液的配置方法如下：用乙醇配置浓度为1mg/mL的氘代25-羟基维生素D₃的内标储备液，再用乙醇进一步稀释得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液。

3.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中采用氮气吹干的条件包括通35～60℃氮气直至干燥。

4.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的衍生化工作溶液的配置方法如下：用乙酸乙酯配置浓度为25mg/mL的PTAD的衍生化储备液，再用乙酸乙酯进一步稀释得到浓度为1mg/mL的衍生化次级储备液，随后用乙酸乙酯进一步稀释得到浓度为0.2mg/mL的衍生化工作溶液。

5.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的复溶液为甲醇：水：甲酸的混合物，其体积比为50：50：0.1。

6.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)所述的高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪。

7.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：以水-甲醇-甲酸为流动相体系，色谱柱为C18柱，流动相的流速为0.4～1.0mL/min，柱温为30～45℃，采用多反应监测扫描模式。

8.根据权利要求7所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液使用的流动相由以下流动相A和流动相B组成；其中流动相A相为含体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B相为体积分数0.1％甲酸甲醇溶液，流动相A和流动相B的体积比为40～5：60～95％。

9.根据权利要求7所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述色谱柱的的填料为十八烷基键合硅胶C18，填料粒径为1.7～5.0μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～100mm。

10.根据权利要求1或7所述的的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤(4)中，质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM模式，用于检测的25-OHD₂衍生化产物和25-OHD₃衍生化产物的母离子/子离子检测对如下所示：25-OHD₂衍生化产物，m/z 570.2>m/z 298.2和m/z 570.2>m/z 280.2；25-OHD₃衍生化产物，m/z 558.2>m/z 298.2和m/z 558.2>m/z 280.2；内标d6-25-OHD₃衍生化产物的检测离子对为m/z 564.2>m/z 298.2。

11.根据权利要求10所述的血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述25-羟基维生素D₃(25-OHD₃)和25-羟基维生素D₂(25-OHD₂)的保留时间均为1.1min。

12.根据权利要求1所述血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)所述的MPX系统为提高单位时间内分析效率，采用MPX软件，应用两台高效液相色谱连接一台质谱。