CN111239300A - 一种血清中脂肪酸的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血清中脂肪酸的提取方法，所述方法为配制甲酸和异丙醇的混合液作为提取液，在血清中加入提取液，混合后的液体放入SLE萃取板中进行萃取，然后利用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液吹干后利用乙腈溶解然后利用HPLC‑MS进行分析。提取血清中的脂肪酸的效果更好，样品用样量少，试剂消耗少，提取效果更佳，减轻操作人员负担，提取过程更安全。

Description

一种血清中脂肪酸的提取方法

技术领域

本发明属于脂肪酸的提取技术领域，具体涉及一种血清中脂肪酸的提取方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脂肪酸类化合物在生命过程中具有非常重要的作用，它们通常是生物体内重要的营养成分和代谢产物。脂肪酸类化合物既是构成生物体内脂肪和类脂的基本物质，同时也是细胞膜磷脂的重要成分，具有直接调节细胞膜的组成及蛋白质与膜内受体的功能，对正常的生理代谢有很大影响。而人体过量增高的游离脂肪酸，又与代谢综合征、高血压、冠心病及心力衰竭等疾病的发生发展密切相关，因此，人体血清中脂肪酸的组成及其水平是人体摄入脂肪酸和代谢后的重要指标，进行脂肪酸组分分析有助于健康状况评价，而检测血液中各脂肪酸的含量是评估自身以及科学指导的唯一依据。

目前脂肪酸的测定通常采用衍生的方法对脂肪酸进行甲酯化反应后通过气相色谱或气相色谱-质谱法分析，但是衍生化的过程不仅花费大量的时间，而且会对样品造成损失，并且衍生化试剂毒性很强，对操作人员和操作环境会造成极大的伤害和污染。高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)样品预处理过程较简单、样品需要量少，并且不需要结合物水解及化学衍生化，是临床常规检测的理想选择方法。但是血液样本中成分复杂，简单的蛋白沉淀处理并不能完全去除杂质，在进行定量分析时，杂质的存在严重影响检测结果的准确性。而过于复杂的提取方法如固相萃取技术则成本过高，并不适合市场化大规模推广。

常用的非衍生化的Dole提取法中要用到磷酸，基于质谱检测只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，磷酸不易挥发，因此在液质联用中尽量不要使用，并且此方法耗时时间长，用样量大，混匀麻烦，混匀过程中容易发生液体泄露，对操作人员和样品准确性均有影响，提取过程需要全手动进行操作，故重现性、灵敏度并不高，且不易用于大量样本提取。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种血清中脂肪酸的提取方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种血清中脂肪酸的提取方法，所述方法为配制甲酸和异丙醇的混合液作为提取液，在血清中加入提取液，混合后的液体放入SLE萃取板中进行萃取，然后利用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液吹干后利用乙腈溶解然后利用HPLC-MS进行分析。

在一些实施例中，甲酸和异丙醇的混合溶液中甲酸的质量分数为4-6％。发明人发现甲酸和异丙醇的混合能够提高脂肪酸的提取效果，而且单独的异丙醇提取的效果低于甲酸和异丙醇的混合提取效果。

在一些实施例中，血清和提取液的体积比为0.8-1.2：1。

在一些实施例中，SLE萃取板中萃取的方法为：利用正压将混合液压入SLE萃取板的硅藻柱中。优选的，在硅藻柱中停留的时间为4-6min。

在一些实施例中，洗脱的过程为：先用一半体积的正己烷进行洗脱，自然沉降后，再利用另一半体积的正己烷进行第二次洗脱。

在一些实施例中，收集后的洗脱液利用氮气进行吹干。氮气吹干具有保护洗脱液的作用。

在一些实施例中，正己烷和乙腈的体积比为9-11：1。

在一些实施例中，色谱条件为：流动相A：含0.05％甲酸pH值为3的HPLC级水；流动相B：含0.05％甲酸且pH值为3的甲醇；梯度洗脱条件为：0～3min，70％B，3～4min，90％B，4～6min，90％B，6～9min，100％B，9～13min，70％B，流速250μL/min，进样量20μL。

在一些实施例中，质谱条件为采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：4.5kV，去溶剂温度：450℃。

在一些实施例中，提取得到的脂肪酸包括月桂酸、花生四烯酸。

本发明的有益效果：

(1)本提取方法可以更简便快速的提取血清中的脂肪酸，相比普通提取方法操作更简单快速，样品用样量少，试剂消耗少，提取效果更佳，而且可以配合SLE萃取板实现自动化提取，减轻操作人员负担，提取过程更安全，重复性更好。

(2)本提取方法发现加入甲酸后可以提高脂肪酸的整体提取效果，尤其是对于血清中月桂酸(C12：0)的提取，加入甲酸后对血清月桂酸的提取效果可以实现从无法检测浓度到有正常可检测峰形；而对于加标牛血清白蛋白的提取，加入甲酸后的提取效果相对不加甲酸，可以提高近3倍。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为对比例1的提取血清月桂酸信号图；

图2为对比例2的提取血清花生四烯酸信号图；

图3为本发明实施例1的提取血清月桂酸信号图；

图4为本发明实施例1的提取血清花生四烯酸信号图；

图5为对比例1提取牛血清白蛋白月桂酸的信号图；

图6为对比例1提取牛血清白蛋白花生四烯酸的信号图；

图7为本发明的实施例1提取牛血清白蛋白月桂酸的信号图；

图8为本发明的实施例1提取牛血清白蛋白花生四烯酸的信号图；

图9为对比例2的提取血清月桂酸信号图；

图10为加入甲酸后的提取血清月桂酸信号图；

图11为对比例3提取加标的牛血清白蛋白月桂酸信号图；

图12为对比例3利用实施例1的方法提取加标的牛血清白蛋白月桂酸信号图；

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明

实施例1

①血清样品中脂肪酸提取：

(1)首先配置含5％甲酸的异丙醇提取液，混匀备用；

(2)取100uL血清于提取板中，然后加入100uL配置好的提取液，吹打混匀；

(3)将混匀后的液体全部转入SLE萃取板中，正压压入萃取板的硅藻柱后静置5min；

(4)然后用1mL正己烷进行洗脱，待洗脱液自然沉降结束后再用1mL正己烷进行第二次洗脱；

(5)收集两次的洗脱液，氮吹吹干后，用100uL乙腈复溶后进样。

牛血清白蛋白的提取方法同血清。

②色谱柱：C18柱(Waters ACQUITY HPLC CSH C₁₈ 150mm×2.1mm，1.7μm)；

柱温：40℃；

③所用HPLC-MS的条件：

色谱条件为：流动相A：含0.05％甲酸pH值为3的HPLC级水；流动相B：含0.05％甲酸且pH值为3的甲醇；梯度洗脱条件为：0～3min，70％B，3～4min，90％B，4～6min，90％B，6～9min，100％B，9～13min，70％B，流速250μL/min，进样量20μL；

质谱条件为采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：4.5kV，去溶剂温度：450℃。

④分别选取了饱和脂肪酸月桂酸(C12:0)和不饱和脂肪酸花生四烯酸(C20:4w6)进行检测，MRM质谱参数为：

为避免血清中有些脂肪酸含量过低，提取量无法检测，用生理盐水配置5％浓度的牛血清白蛋白溶液，并加入可检测浓度的脂肪酸标品，混匀后进行提取，对比提取效果，保证了此提取方法的准确性、有效性，避免了实验结果的偶然性。

牛血清白蛋白的提取方法同实施例1中血清的脂肪酸提取方法。

对比例1

常用的非衍生化的Dole提取法为：取1mL血清于15mL离心管中，加入5mL混合液(异丙醇：正己烷：2mol/L磷酸，体积比为40：10：1)，室温反应10min，随后加入2mL正己烷和3mL水，涡旋混匀，以4500r/min离心5min，提取全部上清液，氮气吹干。加入1mL甲醇复溶后进行HPLC-MS分析。对比例1中HPLC-MS分析方法与实施例1相同。

对牛血清白蛋白的提取

牛血清白蛋白的提取方法同对比例1中血清的脂肪酸提取方法，牛血清白蛋白溶液的浓度与实施例1相同。

通过质谱MRM可以证明得到了月桂酸和花生四烯酸，然后对应得到月桂酸和花生四烯酸的HPLC图。

结果：

首先对比实施例1提取方法相比于对比例1的普通Dole提取法的提取效果，本提取方法除了操作简单，用样量小，易于实现自动化提取以外，对脂肪酸的提取效果如下图所示，图1、图2分别为普通Dole提取方法提取2％牛血清白蛋白两种脂肪酸的信号图，图3、图4分别为实施例1的提取2％牛血清白蛋白脂肪酸信号图。如图所示，普通Dole提取方法提取的月桂酸峰面积为1846，花生四烯酸峰面积为340681；而实施例1方法提取的月桂酸峰面积为3037，花生四烯酸峰面积为428582；因此，本提取方法对2％牛血清白蛋白中脂肪酸的提取效果明显优于普通Dole提取法，而且色谱图可检测的峰形更好。

图5、图6为普通Dole提取方法提取牛血清白蛋白脂肪酸的信号图；图7、图8为实施例1方法提取牛血清白蛋白脂肪酸的信号图。普通Dole提取方法提取牛血清白蛋白中的月桂酸峰面积为5184，花生四烯酸峰面积为1411524；实施例1方法提取牛血清白蛋白月桂酸峰面积为6879，花生四烯酸峰面积为1949612，因此，实施例1提取方法对牛血清白蛋白的提取效果明显优于普通Dole提取法。

综上所述：无论是2％牛血清白蛋白还是牛血清白蛋白，对于饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的提取，本发明实施例1的提取效果均优于普通Dole提取方法的提取效果。

对比例2

相比于实施例1，提取液中不加甲酸，其余检测方法与实施例1相同。

结果显示提取液不加甲酸提取效果大大降低，其中对血清中月桂酸的提取效果对比最为明显，具体信号图如下，不加甲酸提取血清月桂酸效果如图9，没有明显峰图和信号值，而加入甲酸后提取效果如图10，有明显的峰图，峰面积为966；因此，不加甲酸提取血清的月桂酸达不到可检测水平，而加入甲酸后，有很明显的可积分峰形。

对比例3

相比于实施例1对比实验中，提取对象为加标的牛血清白蛋白溶液，其中加标后月桂酸浓度喂5μg/mL，花生四烯酸加标后浓度为3μg/mL，同时利用实施例1和对比例2的提取液对加标的牛血清白蛋白溶液进行提取，不加甲酸提取加标牛血清白蛋白效果如图11，峰面积为955，加入甲酸后提取效果如图12，峰面积为2825；加入甲酸后对牛血清白蛋白的提取效果可提高2.96倍，因此加入甲酸后提高了对牛血清白蛋白中脂肪酸的提取。

通过以上可知，本发明的提取液对血清中或牛血清白蛋白中的月桂酸、花生四烯酸的提取效果均优于Dole提取方法，说明本发明的提取液能够对月桂酸、花生四烯酸具有特异性，能够去除相对于月桂酸、花生四烯酸之外的杂质。

本发明的提取液可以适用于低浓度的血清中脂肪酸的提取。

提取液中加入甲酸后相比于不加甲酸的提取液，提取液中加入甲酸无论是低浓度的脂肪酸还是高浓度的脂肪酸提取效果都优于不加甲酸的提取液。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：所述方法为配制甲酸和异丙醇的混合液作为提取液，在血清中加入提取液，混合后的液体放入SLE萃取板中进行萃取，然后利用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液吹干后利用乙腈溶解然后利用HPLC-MS进行分析。

2.根据权利要求1所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：甲酸和异丙醇的混合溶液中甲酸的质量分数为4-6％。

3.根据权利要求1所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：血清和提取液的体积比为0.8-1.2：1。

4.根据权利要求3所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：SLE萃取板中萃取的方法为：利用正压将混合液压入SLE萃取板的硅藻柱中。优选的，在硅藻柱中停留的时间为4-6min。

5.根据权利要求1所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：洗脱的过程为：先用一半体积的正己烷进行洗脱，自然沉降后，再利用另一半体积的正己烷进行第二次洗脱。

6.根据权利要求1所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：收集后的洗脱液利用氮气进行吹干。

7.根据权利要求1所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：正己烷和乙腈的体积比为9-11：1。

8.根据权利要求1所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：色谱条件为：流动相A：含0.05％甲酸pH值为3的HPLC级水；流动相B：含0.05％甲酸且pH值为3的甲醇；梯度洗脱条件为：0～3min，70％B，3～4min，90％B，4～6min，90％B，6～9min，100％B，9～13min，70％B，流速250μL/min，进样量20μL。

9.根据权利要求1所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：质谱条件为采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：4.5kV，去溶剂温度：450℃。

10.根据权利要求1所述的血清中脂肪酸的提取方法，其特征在于：提取得到的脂肪酸包括月桂酸、花生四烯酸。

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