CN110988210A - 一种降低脂溶性维生素96孔板非特异性吸附的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于脂溶性维生素检测前处理技术领域，具体涉及一种降低脂溶性维生素96孔板非特异性吸附的方法。商品化的96孔板在样品前处理过程中具有重要的应用，发明人研究过程中发现，96孔收集板的材料对脂溶性维生素具有较高的非特异性吸附，包括后续的氮吹步骤均会对脂溶性维生素的检测造成影响。本发明提供了一种有效降低96孔板对脂溶性维生素非特异性吸附的方法，所述方法包括采用高压灭菌对96孔收集板进行预处理，经本发明研究验证，该处理方法能够有效降低96孔收集板对脂溶性维生素的特异性吸附，提高回收率。

Description

一种降低脂溶性维生素96孔板非特异性吸附的方法

技术领域

本发明属于脂溶性维生素检测前处理技术领域，具体涉及一种降低脂溶性维生素高效液相检测前、样品预处理时非特异性吸附的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脂溶性维生素(包括VA、VE、VK以及VD的主要代谢物25-OH VD2以及25-OH VD3)作为维持人体正常物质代谢和某些特殊生理功能不可缺少的低分子有机化合物，能够起到调节人体的各种生理机能，增强人体的免疫机能，在调节体内各方面的代谢作用具有重要作用，比如维生素A的缺乏，容易引起夜盲症，维生素D促进骨骼的发育，其缺乏容易引起佝偻病等。因此，定期检测人体内维生素水平，使其保持在正常范围内，进而确保顺利参与生理活动，具有重要意义。

高效液相色谱串联质谱法(LC-MS)因具有快速、高效和高灵敏度的优点，已成为脂溶性维生素类生物样品分析的标准检测手段。LC-MS系统作为功能强大且精细复杂的分析工具，对分析样品的纯度有较高要求。因此样品在进入液质联用系统前，需要对样品进行前处理过程。而前处理过程试剂及耗材的选择及使用会影响样品的前处理效果进而对性能指标如回收率等产生较大影响。

目前样品前处理方法主要包括蛋白质沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)等。针对如上前处理方法已有商品化的96孔板如PPT、SLE、SPE及PLD等。针对上述脂溶性维生素的检测，在采用含水试剂进行处理的过程中，可能会造成乳相形成，96孔支撑液相萃取(SLE)微孔板将含水样品固定于惰性载体，使有机相流过从而消除了上述问题。前处理后的收集样品置于96孔收集板中可直接放置于高效液相自动进样器中进行检测。

上述前处理过程涉及洗脱过程，以及后续的氮吹和复溶过程，如上过程需要有配套的96孔收集板，因此样品留存在96孔收集板中的时间较久，而在数次实验中发现脂溶性维生素回收率偏低，发明人分析原因可能是96孔收集板为塑料材质，容易与脂溶性维生素尤其是维生素D和维生素K发生非特异结合所致，上述器材的缺陷严重影响了检测的准确性。

发明内容

基于上述技术缺陷，本发明提供了一种降低树脂材质孔板对脂溶性维生素的非特异性吸附的方法，在加样之前对孔板进行高压灭菌，可以有效降低孔板对样品中脂溶性维生素成分的吸附，提高检测回收率。采用上述前处理方法，可以有效提高检测方法的准确性。

基于上述研究成果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种降低收集板非特异性吸附的方法，所述方法包括在加样之前采用高压灭菌方法对收集板进行预处理。

优选的，所述高压灭菌温度为114～124℃。

优选的，所述高压灭菌的时间为15～25min。

优选的，所述收集板为96孔收集板。

本发明第二方面，提供一种脂溶性维生素的样品前处理方法，所述前处理方法包括以下步骤：

(1)对收集板进行高压灭菌处理；

(2)将血清样品与内标工作液加入提取板中混匀；

(3)将步骤(2)中的液体通过过滤板及正压装置转移至灭菌后的收集板中静置；

(4)加入提取液，通过正压装置将洗脱液收集至灭菌后的收集板中，氮气吹干后复溶检测。

优选的，所述脂溶性维生素为维生素A、维生素E、维生素K、25-OH VD2、25-OH VD3。

优选的，所述静置时间为5-10min。

优选的，所述氮吹流量为1.8～2.2mL/min。

优选的，所述氮吹时间为4～6min。

本发明第三方面，提供一种脂溶性维生素的高效液相分析方法，所述分析方法包括采用第二方面所述脂溶性维生素的样品前处理方法对待测样品进行处理。

优选的，所述分析包括采用液相-质谱进行检测。

进一步优选的，所述液相条件如下：色谱柱为C18柱，流速：0.4～0.6mL/min；柱温：38～42℃。

进一步优选的，所述液相流动相为：(A)-甲醇，(B)-0.1％甲酸水。

进一步优选的，所述液相采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0-0.5min 80％流动相B，0.5-2.0min 98％流动相B，2.0-5.0min 98％流动相B，5.0-6.0min 80％流动相B，6.0-7.0min Stop。

进一步优选的，所述质谱采用电喷雾ESI源正离子方式。

进一步优选的，所述质谱离子源温度为440～460℃。

进一步优选的，所述质谱喷雾电压为5400～5600V。

进一步优选的，所述质谱采用MRM模式采集数据。

本发明第四方面，提供一种提高脂溶性维生素检测准确度的方法，所述方法包括采用第一方面所述降低收集板非特异性吸附的方法中的步骤。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.该方法能够有效的降低因96孔收集板为塑料材质而带来的非特异性吸附问题，大大降低了因96孔收集板对待测物质吸附的问题，有效提高样品的回收率。

2.该方法取代了过去用玻璃瓶，无法实现高通量的问题，有效的提高了样品前处理的效率，同时降低了单个处理而产生的人为误差，提高了检测的准确度。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中用未处理的96孔收集板参与脂溶性维生素样品前处理过程，五种脂溶性维生素的色谱图。

图2为实施例1中高压灭菌(115℃，20min)处理的96孔收集板参与脂溶性维生素样品前处理过程，五种脂溶性维生素的色谱图。

图3为实施例1中高压灭菌(121℃，20min)处理的参与脂溶性维生素样品前处理过程，五种脂溶性维生素的色谱图。

图4为实施例1中为高压灭菌(121℃，30min)处理的参与脂溶性维生素样品前处理过程，五种脂溶性维生素的色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种降低脂溶性维生素高效液相检测前，样品预处理时非特异性吸附的方法。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。以下实施例中采用的立式压力蒸汽灭菌器为上海三申医疗器械有限公司，正压装置为山东英盛生物技术有限公司生产的YS-600。采用的液质联用系统为山东英盛生物技术有限公司生产的YS EXACT 9050MD。

实施例1

本实施例中，提供了一种脂溶性维生素样品检测前处理方法，降低96孔收集板非特异性吸附的处理方法。

1)首先将96孔收集板进行高压灭菌的，摸索高压灭菌的条件；

2)将血清样品与内标工作液在96孔提取板中，吹打混匀；

3)将2)中的全部液体转移至96孔过滤板中(配已高压灭菌96孔收集板)中，用正压装置将液体压入小柱内，静置5-10min；

4)加入提取液，用正压装置将洗脱液收集于96孔收集板中。此步骤重复一次.

5)将96孔收集板置于室温下，氮气吹干(2mL/min流量，约5min)。

6)复溶，上机检测。

实施例2

本实施例中，提供一种血清样品中脂溶性维生素(维生素A、维生素E、维生素K、25-OH VD2、25-OH VD3)含量的测定方法。

1.1待测样品制备

取300μL血清至96孔提取板中，加入100μL内标工作液，吹打混匀；将上述液体全部转移至96孔过滤板中(配96孔收集板)，用正压装置将液体压入小柱内，静置5-10min。加入750μL提取液，用正压装置将洗脱液收集于96孔收集板中。此步骤重复一次。置于室温下，氮气吹干，复溶液复溶，振荡混匀2min，覆上铝箔封膜，作为待测样品。

上述提取液为正己烷。

1.2标准工作液的配制

以甲醇配制100ug/mL各维生素标准品储备液，其中维生素K溶解时间较长，要逐步溶解，方可溶好，然后用5％BSA(m/v)(牛血清白蛋白)甲醇溶液制备7个梯度的混合标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用，标准品需参与样本提取。

应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中五种脂溶性维生素的含量。

1.3液相色谱的条件

色谱柱为C18柱(Kinetex C18 50×2.1mm,2.6um,phenomenex)；进样体积：20uL，流速：0.5mL/min；柱温：40℃；流动相A：甲醇；流动相B：0.1％甲酸水；梯度洗脱条件：0-0.5min 80％流动相B，0.5-2.0min 98％流动相B，2.0-5.0min98％流动相B，5.0-6.0min80％流动相B，6.0-7.0min Stop。

1.4质谱检测条件

采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度为450℃，喷雾电压5500V，采用MRM模式采集数据，条件如下表1所示。

表1

经检测获得的不同高压灭菌条件处理96孔收集板对脂溶性维生素样品回收率的影响如表2所示。

表2不同高压灭菌条件处理96孔收集板对脂溶性维生素样品回收率的影响

从表1可以看出，实验组为对96孔收集板预先进行高压灭菌处理组，相比未处理组，五种脂溶性维生素的回收率均有所提高，尤其是VK，预先对96孔收集板进行高压灭菌，其回收率提高显著，经121℃，20min处理的96孔收集板，回收率比未处理组提高14％。大大降低了样本浓度的损失，提高了检测结果的准确性。

将如上4种处理条件的96孔收集板用到脂溶性维生素样品前处理的过程中，然后上机分析，所得的质谱图如图1-4所示。

上述实施例证明，本发明通过高压灭菌预处理96孔收集板，操作简单，可有效降低非特异性吸附，大大提高检测样品的回收率，对提高检测结果的准确度具有重要意义。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种降低收集板非特异性吸附的方法，其特征在于，所述方法包括在加样之前采用高压灭菌方法对收集板进行预处理；

优选的，所述高压灭菌温度为114～124℃；

优选的，所述高压灭菌的时间为15～25min；

优选的，所述收集板为96孔收集板。

2.一种脂溶性维生素的样品前处理方法，其特征在于，所述前处理方法包括以下步骤：

(1)对收集板进行高压灭菌处理；

(2)将血清样品与内标工作液加入提取板中混均；

(3)将步骤(2)中的液体通过过滤板及正压装置转移至灭菌后的收集板中静置；

(4)加入提取液，通过正压装置将洗脱液收集至灭菌后的收集板中，氮气吹干后复溶检测。

3.如权利要求2所述脂溶性维生素的样品前处理方法，其特征在于，所述脂溶性维生素为维生素A、维生素E、维生素K、25-OH VD2、25-OH VD3。

4.如权利要求2所述脂溶性维生素的样品前处理方法，其特征在于，所述静置时间为5-10min。

5.如权利要求2所述脂溶性维生素的样品前处理方法，其特征在于，所述氮吹流量为1.8～2.2mL/min；或所述氮吹时间为4～6min。

6.一种脂溶性维生素的高效液相分析方法，其特征在于，所述分析方法包括采用权利要求2-5任一项所述脂溶性维生素的样品前处理方法对待测样品进行处理。

7.如权利要求6所述脂溶性维生素的高效液相分析方法，其特征在于，所述分析包括采用液相-质谱进行检测；

优选的，所述液相条件如下：色谱柱为C18柱，流速：0.4～0.6mL/min；柱温：38～42℃；

优选的，所述液相流动相为：(A)-甲醇，(B)-0.1％甲酸水。

8.如权利要求7所述脂溶性维生素的高效液相分析方法，其特征在于，所述液相采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0-0.5min 80％流动相B，0.5-2.0min 98％流动相B，2.0-5.0min 98％流动相B，5.0-6.0min 80％流动相B，6.0-7.0min Stop。

9.如权利要求7所述脂溶性维生素的高效液相分析方法，其特征在于，所述质谱采用电喷雾ESI源正离子方式；

或所述质谱离子源温度为440～460℃；

或所述质谱喷雾电压为5400～5600V；

或所述质谱采用MRM模式采集数据。

10.一种提高脂溶性维生素检测准确度的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1所述降低收集板非特异性吸附的方法中的步骤。

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