CN114280192A - 维生素d及其代谢产物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种维生素D及其代谢产物的检测方法，涉及检测技术领域。本发明的检测方法包括以下步骤：分别配制25‑OHD及其代谢产物24,25‑(OH)2D的标准溶液；取25‑OHD和24,25‑(OH)2D的内标物以及雌三醇，配制成内标液；取标准溶液和待测血清样本，经处理后得到待测血清样品；将标准样品注入液相色谱串联质谱仪中进行检测，构建标准曲线，将待测血清样品注入液相色谱串联质谱仪进行检测，将检测图谱与标准曲线进行比较，得到检测结果。本发明的检测方法具有检测时间短、灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，特别是涉及一种维生素D及其代谢产物的检测方法。
背景技术
维生素D是类固醇衍生物，主要包括维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。维生素D的主要生理作用是调节钙的代谢，维持骨骼健康；维生素D还可通过噬菌作用而增强免疫力，在抗肿瘤活性和免疫功能调节方也面发挥着重要作用。研究表明，动脉硬化、高血压、冠心病、糖尿病、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、慢性感染性疾病、自身免疫病等慢性病的发生也与维生素D缺乏具有相关性。
人体中的维生素D在肝脏内被25-羟基氧化酶氧化成25-羟基维生素D(25-OHD)，进而经由肾脏再进一步羟基化作用，转变为1,25-双羟基维生素D(1,25-(OH)2D)或24,25-双羟基维生素D(24,25-(OH)2D)。25-OHD是维生素D在体内的稳定存在形式，也是人体内的主要循环形式，其含量能客观的反映人体内维生素D的水平，可对25-OHD的浓度进行检测来评价人体的维生素D营养水平。
25-OHD是评价维生素D营养水平的重要指标。在CYP24A1突变导致的特发性高钙血症患者中，25-OHD失活途径受阻，导致无法代谢生成24,25-(OH)2D，体内24,25-(OH)2D含量明显降低。目前临床并没有较好的方法进行查因，一般通过基因进行确诊，但是基因费用昂贵，且检测周期较长，有报道称若能精准检测25-OHD与24,25-(OH)2D的含量，其比值可作为筛查CYP24A1突变的临床检查指标，用于临床不明原因的高钙血症的查因。
目前，已有较多的免疫方法用于25-OHD的检测，但免疫方法受结构类似物的干扰，容易导致结果偏差，24,25-(OH)2D在人体内的浓度较低(血清中的浓度约为1～13nmol/L)，尚未开发出免疫或发光方法进行检测；而质谱的方法也多是检测25-OHD，检测其代谢产物24,25-(OH)2D的方法较少；色谱分析时间较长，且多采用衍生化的方法提高其检测灵敏度，但衍生化的方法一般操作复杂，且试剂对人体存在潜在危害。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种维生素D及其代谢产物的检测方法，该方法为可同步检测25-OHD和24,25-(OH)2D，检测时间短、灵敏度高，而且检测过程未进行衍生化处理，可避免衍生化试剂对环境和人体的危害。
一种维生素D及其代谢产物的检测方法，包括以下步骤：
配制标准溶液：分别取25-OHD2标准品、25-OHD3标准品、24,25-(OH)2D2标准品和24,25-(OH)2D3标准品，用牛血清白蛋白溶液配制成预定浓度的溶液，得到标准溶液；
配制内标液：取25-OHD2内标物、25-OHD3内标物、24,25-(OH)2D3内标物和雌三醇，以溶剂溶解，得到内标液；
处理待测样品：取各标准溶液，加入内标液并进行蛋白质沉淀，加入萃取剂进行萃取，取上清液，去除溶剂后复溶，得到待测标准样品；取待测血清样本，加入内标液进行蛋白质沉淀，加入萃取剂进行萃取，取上清液，去除溶剂后复溶，得到待测血清样品；
检测：将标准样品注入液相色谱串联质谱仪中进行检测，构建标准曲线；将待测血清样品注入液相色谱串联质谱仪进行检测，将检测图谱与标准曲线进行比较，得到检测结果；其中，液相色谱采用变流速梯度洗脱，流动相A为体积浓度为0.08％～0.12％的甲酸甲醇溶液，流动相B为体积浓度为0.08％～0.12％的甲酸水溶液。
上述检测方法可以同时检测25-OHD和24,25-(OH)2D，检测方法特异性高、灵敏度高，检测过程中无需对样品进行衍生化处理，降低对人体和环境的危害；而且，本发明的液相色谱检测中采用变流速梯度洗脱，配合平行液相色谱的使用，目标物检测时间缩短至2min以内，有助于提高检测通量。
在其中一个实施例中，变流速梯度洗脱时间程序如表1。
表1.变流速梯度洗脱时间程序
采用上述变流速梯度洗脱，目标物检测时间缩短至2min以内，将3.15min～3.85min时间段的流速从0.55mL/min提高到0.70mL/min，快速地将残留在色谱柱中的非极性强保留物质冲洗干净，在3.6min后平衡色谱柱至初始流速，既能保证充足的色谱柱平衡时间，提高色谱方法稳定性，也可避免强保留物质在色谱柱中的残留对后续的样本检测造成潜在干扰。
在其中一个实施例中，所述牛血清白蛋白溶液中包括磷酸氢二钠、雌三醇、牛血清白蛋白，磷酸氢二钠的浓度为8～9g/L，雌三醇的浓度为0.8～1.2mg/L，所述牛血清白蛋白的浓度为38～42g/L。
在其中一个实施例中，所述25-OHD2内标物为d3-25-OHD2，所述25-OHD3内标物为d6-25-OHD3，所述24,25-(OH)2D2、24,25-(OH)2D3内标物为D6-24,25-(OH)2D3。
在其中一个实施例中，所述内标液中，25-OHD2内标物的浓度为115～125nmol/L，25-OHD3内标物的浓度为115～125nmol/L，24,25-(OH)2D3内标物的浓度为30～40nmol/L，雌三醇的浓度为0.8～1.2μg/L。
在其中一个实施例中，所述处理待测样品步骤中，萃取剂为正己烷，复溶所用的溶剂为体积浓度25～32％甲醇水溶液，优选为30％甲醇水溶液。
在其中一个实施例中，所述配制内标液步骤中，复溶后离心，保留上清液备用。
在其中一个实施例中，液相色谱中所用的色谱柱型号为Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)。采用此型号的色谱柱可以成功分离目标物，出峰时间快，有助于提高检测通量。
在其中一个实施例中，柱温为48～52℃，进样量为38～42μL。
在其中一个实施例中，质谱条件如表2。
表2.质谱条件
在其中一个实施例中，质谱源参数：离子喷射电压5400～5600V，雾化气33～37psi，辅助气48～52psi，离子源温度440～460℃，气帘气48～52psi，碰撞气8～10psi。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的检测方法可以同时检测25-OHD和24,25-(OH)2D，检测方法特异性高、灵敏度高，检测过程中无需对样品进行衍生化处理，降低对人体和环境的危害；而且，本发明的液相色谱检测中采用变流速梯度洗脱，目标物检测时间缩短至2min以内，提高检测通量。
附图说明
图1为实施例1中4种化合物的液相色谱图。
图2为实施例2中用Ascentis Express F5 column(2.1mm×50mm，2.7μm)检测目标物的液相色谱图之一。
图3为实施例2中用Ascentis Express F5 column(2.1mm×50mm，2.7μm)检测目标物的液相色谱图之二。
图4为实施例2中用Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)检测目标物的液相色谱图。
图5为实施例2中用Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.0μm)检测目标物的液相色谱图。
图6为实施例1变流速梯度洗脱液相色谱图。
图7为对比例1恒定流速洗脱液相色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一、试剂配制
(1)雌三醇溶液：称取100.0mg雌三醇，使用无水乙醇溶解定容至100mL，得到浓度为1.0mg/mL的雌三醇溶液。
(2)4％牛血清白蛋白溶液：称取8.95g的磷酸氢二钠，溶于去离子水中，调节pH为7.5，加入1mL 1.0mg/mL的雌三醇溶液，加入40g牛血清白蛋白(BSA)，溶解后定容至1L。
(3)内标工作液：取d3-25-OHD2、d6-25-OHD3、D6-24,25-(OH)2D3和雌三醇，用4％BSA溶液配制成内标工作液，d3-25-OHD2的浓度为120nmol/L，d6-25-OHD3的浓度为120nmol/L，D6-24,25-(OH)2D3的浓度为15nmol/L，雌三醇的浓度为1.00μg/mL。
(4)血清标准溶液：用4％BSA溶液配制以下浓度的标准溶液：
25-OHD2：3.64nmol/L、7.2nmol/L、14.5nmol/L、29.0nmol/L、58.1nmol/L、139nmol/L、279nmol/L；
25-OHD3：3.89nmol/L、7.81nmol/L、15.6nmol/L、31.2nmol/L、62.4nmol/L、150nmol/L、300nmol/L；
24,25-(OH)2D2:0.50nmol/L、1.00nmol/L、2.00nmol/L、4.00nmol/L、10.0nmol/L、20.0nmol/L、80.0nmol/L；
24,25-(OH)2D3:0.50nmol/L、1.00nmol/L、2.00nmol/L、4.00nmol/L、10.0nmol/L、20.0nmol/L、80.0nmol/L。
二、样本处理
用Agilent Bravo移液装置，分别吸取200μL标准溶液、质控、人血清样品至2mL 96孔板中，分别加入300μL的内标工作液，在线震荡5min；加入700μL正己烷，在线震荡10min；25℃下10000rpm离心10min；吸取700μL上清液到1.0mL 96孔板中，60℃加热氮气吹干，加入100μL复溶液，震荡5min，25℃下10000rpm离心5min，取上清液，上机检测。
三、检测
将标准样品注入液相色谱串联质谱仪中进行检测，构建标准曲线；将待测血清样品注入液相色谱串联质谱仪进行检测，将检测图谱与标准曲线进行比较，得到检测结果。具体的液相色谱和质谱条件如下。采用本实施例的方法检测4种化合物25-OHD2、25-OHD3、24,25-(OH)2D2、24,25-(OH)2D3的色谱图如图1所示。
(1)液相色谱条件
色谱柱采用Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)，流动相A(有机相)为0.1％甲酸甲醇溶液(V/V)，流动相B(水相)为0.1％甲酸水溶液(V/V)，柱温为50℃，进样量为40μL。
采用平行液相色谱仪，使用两套相同的独立液相系统，两个相同的独立色谱柱，在一个样本运行时注入新样本，从而有效利用冲洗平衡时间来提高分析速度，单个样品质谱信号采集时间窗口：0.50min(开始)-2.50min(结束)。
表1.变流速梯度洗脱时间程序
(2)质谱条件
使用电喷雾离子源(ESI)，在正离子模式下，多反应监测模式(MRM)。
表2.质谱条件
表3.源参数
四、曲线验证
每天检测2条曲线，连续测量三天，结果如表4，25-OHD及24,25-(OH)2D在其各自的线性范围内，回收率在85％～115％之间，R2＞0.98，LOQ信噪比＞10，线性良好。
表4.线性验证数据
五、稀释倍数
取浓度范围在曲线中高点水平的样本，采用曲线基质BSA作为稀释液，对样本进行2倍、4倍稀释，分别测量其原样本、2倍稀释样本、4倍稀释样本，已原样本检测值为靶值，计算2倍稀释、4倍稀释样本的回收率，从实验数据可知，其回收率在85％-115％之间，当检测样本浓度超过曲线浓度范围时，可通过稀释进一步扩大其可报告范围。
表5.线性验证数据
六、项目精密度
重复性精密度：在一个批次内，分别对低高2个浓度水平的样品平行处理20个，每个进样1次。中间精密度：低、高2个浓度水平的样品每批次检测2组数据，连续测定10天。
测试结果如表6所示。从实验数据可知，本发明检测方法重复性精密度/中间精密度均在1％～8％之间，精密度良好。
表6.精密度
七、加标回收率
收集低、高2个浓度水平的病人样品，分别加入低、高2个浓度标准溶液混合得混合样品，将上述的2个不同来源的病人样品和混匀后得到的6个样品，在同一批次内进行检测，加标样品结果计算回收率，25-OHD2加标回收率在90.8％～102％，25-OHD3加标回收率在91.7％～103％，24,25～(OH)2D2加标回收率在86.6％～100％，24,25-(OH)2D3加标回收率在89.4％～103％，方法准确度较高。
实施例2
在与实施例1的检测方法相同的情况下，仅变换色谱柱类型，以25-OHD3为例，比较三种色谱柱的分离效果，分别为①Ascentis Express F5 column(2.1mm×50mm，2.7μm)，②Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)，③Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.0μm)。Ascentis Express F5 column(2.1mm×50mm，2.7μm)对应的色谱图如图2所示，Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)对应的色谱图如图4所示，AscentisExpress C18(5.0cm×2.1mm，2.0μm)两种色谱柱对应的分为如图5所示。
从色谱图可以看出，在相同的液相条件下，使用Ascentis Express F5 column色谱柱，在4min内未检测到维生素25-OHD3(图2)，将液相时间延长至6min，仍未见维生素25-OHD3出峰(图3)，故在本液相梯度下，Ascentis Express F5 column色谱柱不适合用作维生素D及其代谢产物的检测。Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)、AscentisExpress C18(5.0cm×2.1mm，2.0μm)两款色谱柱的差别在于填料粒径的不同，其均可以实现维生素D及其代谢产物的色谱分离，但是，2.0μm粒径的色谱柱，其液相压力比2.7μm粒径的色谱柱，增加了4mPa，从色谱图上看，色谱峰和响应并没有明显的提升作用(1.8*10e5→2.1*10e5)，但出峰时间延迟0.1min。经对比可知，色谱柱Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)为最优色谱柱型号，在保证目标化合物分离度的同时，提高分析方法通量。
实施例3
使用实施例1中的前处理方式处理96个样本，完成全部的加液移液环节，仅需要5分钟的时间(表7)，对比采用单通道/多通道的移液器，本发明的优势在于提高样本制备通量，减少人工操作，样本量越大，优势越明显，且可减少人工处理的不精密性，更适合临床进行大规模的检测应用。
表7.不同前处理方式时长比较
实施例4
在实施例1的基础上保证其他条件不变，将离子源类型替换为APCI源，检测相同的样品，结果如表8所示，ESI源相比APCI源，更适合25-OHD和24,25-(OH)2D的检测，待测物响应更强，基线更低，有利于提高目标化合物的信噪比，检测更低浓度。
表8.不同离子源检测结果
对比例1
在实施例1的基础上保证其他条件不变，将洗脱条件替换为恒定流速洗脱(液相条件如表9)，检测相同的样品，结果如图7。
表9.恒定流速洗脱
从实施例1的色谱图(图6)，可以看出，实施例1的目标化合物在2min内出峰，出峰后，进入冲柱程序进行色谱柱活化，3.15min后重新平衡色谱柱至初始流速比例，同时进一步冲洗色谱柱，改变3.20min～3.60min时间段的流速，从0.55mL/min提高到0.70mL/min，快速地将残留在色谱柱中的非极性强保留物质冲洗干净，在3.6min后平衡色谱柱至初始流速，既能保证充足的色谱柱平衡时间，提高色谱方法稳定性，也可避免强保留物质在色谱柱中的残留，对后续的样本检测造成潜在干扰。相比之下，从对比例1的色谱图(图7)可以看出，以恒定流速洗脱，在3.7min处仍可见有杂质流出，基线未回复至起始水平。说明通过采用本发明的变流速洗脱，可达到充分冲洗色谱柱的作用，也可缩短液相方法时间，提高检测通量。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种维生素D及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制标准溶液：分别取25-OHD2标准品、25-OHD3标准品、24,25-(OH)2D2标准品和24,25-(OH)2D3标准品，用牛血清白蛋白溶液配制成预定浓度的溶液，得到标准溶液；
配制内标液：取25-OHD2内标物、25-OHD3内标物、24,25-(OH)2D3内标物和雌三醇，以溶剂溶解，得到内标液；
处理待测样品：取各标准溶液，加入内标液并进行蛋白质沉淀，加入萃取剂进行萃取，取上清液，去除溶剂后复溶，得到待测标准样品；取待测血清样本，加入内标液进行蛋白质沉淀，加入萃取剂进行萃取，取上清液，去除溶剂后复溶，得到待测血清样品；
检测：将标准样品注入液相色谱串联质谱仪中进行检测，构建标准曲线；将待测血清样品注入液相色谱串联质谱仪进行检测，将检测图谱与标准曲线进行比较，得到检测结果；其中，液相色谱采用变流速梯度洗脱，流动相A为体积浓度为0.08％～0.12％的甲酸甲醇溶液，流动相B为体积浓度为0.08％～0.12％的甲酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，变流速梯度洗脱时间程序如表1。
表1.变流速梯度洗脱时间程序
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液中包括磷酸氢二钠、雌三醇、牛血清白蛋白，磷酸氢二钠的浓度为8～9g/L，雌三醇的浓度为0.8～1.2mg/L，所述牛血清白蛋白的浓度为38～42g/L。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述25-OHD2内标物为d3-25-OHD2，所述25-OHD3内标物为d6-25-OHD3，所述24,25-(OH)2D2、24,25-(OH)2D3内标物为D6-24,25-(OH)2D3；所述内标液中，25-OHD2内标物的浓度为115～125nmol/L，25-OHD3内标物的浓度为115～125nmol/L，24,25-(OH)2D3内标物的浓度为30～40nmol/L，雌三醇的浓度为0.8～1.2μg/L。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述处理待测样品步骤中，萃取剂为正己烷，复溶所用的溶剂为体积浓度25～32％甲醇水溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述配制内标液步骤中，复溶后离心，保留上清液备用。
7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，液相色谱中所用的色谱柱型号为Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，柱温为48～52℃，进样量为38～42μL。
9.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，质谱条件如表2。
表2.质谱条件
10.根据权利要求1或9所述的检测方法，其特征在于，质谱源参数：离子喷射电压5400～5600V，雾化气33～37psi，辅助气48～52psi，离子源温度440～460℃，气帘气48～52psi，碰撞气8～10psi。
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