CN114755321A - 血清中脂溶性维生素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血清中脂溶性维生素的检测方法，和用于血清中脂溶性维生素检测的内标工作液。本发明在内标工作液的制备上，加入了正庚烷、60％异丙醇水溶液，同时对检测前样品前处理进行了多项改进，提高了脂溶性维生素VA、VD2、VD3、VE、VK1的萃取效率，特别是增加了前处理时VK1的保护，提高其响应强度，从而极大地提高了检测的准确性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学分析方法，尤其是涉及一种血清中脂溶性维生素的检测方法。
背景技术
脂溶性维生素主要溶解于脂肪，可在人体内储存和蓄积，机体脂溶性维生素缺乏或过量均可导致疾病，甚至引起死亡。如维生素A缺乏，会导致夜盲症；维生素A过量，又会使颅压增高、骨质吸收、变形，骨膜下新骨形成、血钙、尿钙升高、肝脾肿大，肝功能改变。
因此，监测脂溶性维生素在人体内的含量，有助于对人体营养状况的评价、疾病的诊断及治疗过程的监测，具有非常重要的临床实际意义。特别是维生素A、维生素D、维生素E、维生素K几种重要的维生素。实验室生化指标检测是评估人体内脂溶性维生素营养状况的重要手段。然而，每一种脂溶性维生素都有多个生化指标，这些生化指标从不同的角度反映脂溶性维生素在人体内的营养状况。同时，同一种生化指标还可能存在着多种可供选择的检测方法，这些检测方法的准确性、可行性也存在着差异。
维生素A是指所有具有视黄醇生物活性的化合物，其中视黄醇是维生素A的最主要代表是肝脏，肝脏是维生素A的主要储存器官，所以维生素A的肝脏储备量被认为是评估个体维生素A营养状况的金标准，但是该指标在人类研究和实际应用中并不可行。目前用于评估维生素A营养状况的生化指标有：血清视黄醇浓度、血清或血斑视黄醇结合蛋白浓度和血清β-胡萝卜素浓度。其中，血清视黄醇是评估维生素A营养状况最常用的生化指标。
维生素D是类固醇衍生物，最具生物学意义的形式有维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。维生素D本身没有生物活性，其生理功能主要是通过其体内代谢产物而实现的。血液中25-(OH)D是一种非活性代谢物，是机体维生素D的主要储存形式，占总量的95％以上，半衰期相对较长(大约3周)，与其他维生素D代谢产物相比，具有相对较高的浓度，例如25-(OH)D的浓度比1,25-(OH)2D的浓度高出1000倍，并且不受血钙和甲状旁腺素水平的影响，因此，血液中25-(OH)D浓度目前被公认为是客观评价维生素D营养状况的相对可靠的指标。由于维生素D主要存在维生素D2和维生素D3两种形式，因此要准确反映人体维生素D的营养水平，需要同时检测血清25-(OH)D2和25-(OH)D3两种指标，最终以两者之和，即血清25-(OH)D总量来反映维生素D营养水平。
维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，即α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚，它们各自的生物学活性差异较大。α-生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富，活性最高的维生素E形式，通常α-生育酚作为维生素E的代表进行研究。
维生素K包括天然存在和人工合成两类，天然存在的维生素K有维生素K1和维生素K2，其中维生素K1是人类维生素K的主要形式，维生素K2根据其不饱和侧链的长度分为MK-4到MK-15共12种，其中研究较多的有MK-4和MK-7。人工合成的维生素K有维生素K3和维生素K4。反映机体维生素K营养状态的生化指标有：血清或血浆维生素K浓度、羧基化维生素K依赖性蛋白(骨钙素和基质Gla蛋白)、尿γ-羧基谷氨酸。测定血液中维生素K1和维生素K2水平被认为是评估维生素K营养状态最直接的方式。维生素K1是维生素K的主要循环形式，并有多个基于人群和临床的研究用维生素K1来评估个体维生素K的营养状况。
综上所述，监测脂溶性维生素的指标为维生素A1，25-(OH)维生素D2，25-(OH)维生素D3，α-生育酚，维生素K1(叶绿醌)。本发明中，分别以VA、VD2、VD3、VE、VK1简称。
现有技术中，对脂溶性维生素的检测方法，已经有相应的基础内容公开。如中国专利公开号：CN2018108333260，一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法的专利文件中，公开了采用固相支撑液液萃取法并适配自动移液站，极大的简化了样本前处理方法，结合液相色谱串联质谱法实现了高通量、快速的同时精准检测5种脂溶性维生素的目标。本发明通过对样品的前处理研究，发现此类方法中前处理工序尚有缺陷，比如待检测维生素被蛋白质吸附导致提取效率下降，检测精准度还有待提高等。
发明内容
本发明是为了克服现有脂溶性维生素检测技术在前处理过程中的不足之处，提供了一种血清中脂溶性维生素的检测方法，对前处理过程做了较多改进，提升检测的灵敏度和准确性。本发明还提供了一种用于血清中脂溶性维生素检测的内标工作液，用于血清中脂溶性维生素的检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种用于血清中脂溶性维生素检测的内标工作液，内标工作液包含脂溶性维生素内标和混合液，所述混合液包括正庚烷、60％异丙醇水溶液。
作为优选，正庚烷、异丙醇水溶液的体积比为1:1～3:1。
作为优选，正庚烷、异丙醇水溶液的体积比为2:1。
选择正庚烷、60％异丙醇水溶液的混合液，优势在于，使预处理后的溶液形成分散的悬浊液，便于更高效地吸附在萃取板上，同时加入的正庚烷可对VE和VK1进行保护，避免其被吸附在蛋白质上或被蛋白包裹，导致提取效率下降。
本发明利用上述内标工作液，还提供了一种血清中脂溶性维生素的检测方法，包括对样品的前处理，然后通过液相色谱串联质谱检测待测维生素含量，所述前处理过程包括粗混、萃取、干燥、复溶，所述的内标工作液在粗混过程加入。
作为优选，粗混步骤，取100μL样品，加入100μL内标工作液。对比以前300μL样品，进100μL内标工作液，减少样本量，可以降低除杂的难度，并节省样本。
作为优选，前处理过程中：萃取步骤，萃取液选择正己烷、正庚烷或异辛烷中的一种；干燥步骤采用氮气吹干或真空浓缩至干；复溶步骤加入的复溶液选择甲醇水溶液。
作为优选，萃取步骤，将粗混液体转移至96孔萃取板，静置至液体全部浸入萃取板；加入所述萃取液，令其自然流出收集于96孔收集板，并重复3次；第四次用正压装置将其全部压入收集板。相比于常规的直接用正压装置压入，对萃取工艺进行了改进，萃取更彻底，而且避免堵孔。
作为优选，所述萃取液选用正庚烷。
作为优选，复溶液选择90％甲醇水溶液。
萃取液分别研究正己烷、正庚烷和异辛烷，最后优选正庚烷，可使萃取效率提升。
复溶液分别研究70％、80％、90％的甲醇水溶液、纯甲醇和纯乙腈，最终优选90％的甲醇水溶液，避免VK1在收集板上的过度吸附，同时避免选择纯甲醇在转移过程中的挥发损失，并减少了溶剂效应，可不需要添加其他复溶液即可达到各类进样量的需求。即，在常规进样时，根据仪器灵敏度，若进样量为10μL及以上，需向每孔中再加入5μL其他复溶液，吹打混匀，覆上铝箔封膜，检测备用；若进样量低于10μL，可不加其他复溶液。
作为优选，液相色谱串联质谱检测待测维生素含量，配制VA、VD2、VD3、VE、VK1的标准品样本，标准品加入甲醇和0.1％BHT溶液，用超纯水稀释，再加入到模拟基质样本中。
作为优选，配制模拟基质样本时，用10mmol/L的PBS溶液溶解BSA。
PBS为磷酸盐缓冲溶液，BSA为牛血清白蛋白。标准品和牛血清白蛋白混合后，配制标准品样本和质控样本，用于质谱检测中的标准曲线。
在配制模拟基质样本时，用10mmol/L的PBS溶液溶解BSA，避免造成VK1在容器表面的吸附。加入标准品时，将标准品的甲醇和0.1％BHT溶液用超纯水稀释，再加入到模拟基质样本中，避免产生局部沉淀引起测定结果偏差。
有益效果：本发明在内标工作液的制备上，加入了正庚烷、60％异丙醇水溶液，一方面保护VE和VK1，另一方面提高萃取效率。
本发明样品前处理萃取步骤，萃取液选用正庚烷，又进一步提升萃取效率。
本发明样品前处理复溶步骤，复溶液选择90％甲醇水溶液，简化了操作工艺，且提高了VK1的检测响应。
本发明通过样品前处理的改进，极大地提高了检测的准确性和稳定性。
附图说明
图1是本发明实施例1中100ng/mL下VA的定量、定性离子对色谱峰。
图2是本发明实施例1中10ng/mL下VD2的定量、定性离子对色谱峰。
图3是本发明实施例1中20ng/mL下VD3的定量、定性离子对色谱峰。
图4是本发明实施例1中1μg/mL下VE的定量、定性离子对色谱峰。
图5是本发明实施例1中0.5ng/mL下VK1的定量、定性离子对色谱峰。
图6是本发明实施例1中VA的标准曲线。
图7是本发明实施例1中VD2的标准曲线。
图8是本发明实施例1中VD3的标准曲线。
图9是本发明实施例1中VE的标准曲线。
图10是本发明实施例1中VK1的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1
一、配制内标工作液
准备脂溶性维生素内标：VA-d4，VD2-d3，VD3-d6，VE-d6，VK1-d7。按下表1配制方式配制正庚烷、异丙醇水溶液为2:1的混合液，制备好内标工作液。
表1内标工作液制备
二、配制标准品和质控品样品
用10mmol/L的PBS溶液溶解BSA，配制模拟基质样本，将VA、VD2、VD3、VE、VK1的标准品加入甲醇和0.1％BHT溶液，用超纯水稀释，再加入到模拟基质样本中，制成标准品样本和质控样本。设计10个标准品梯度浓度(S1～S10)，和底、中、高三个质控品浓度，如表2所示。
表2标准品样本和质控样本
三、样品前处理
待测样品包括待测血清样品、标准品样品、质控品样品，均按如下方法进行前处理。
步骤1：粗混。
取100μL待测样品至2mL离心管，加入100μL内标工作液，震荡混匀。
步骤2：萃取。
将上述液体全部转移至96孔萃取板中(配96孔收集板)，静置5～10min至液体全部浸入萃取板。加入400μL正庚烷，令其自然流出收集于96孔收集板中。此步骤共进行3次，最后一次用正压装置将其全部压入收集板中。
步骤3：干燥。
将96孔收集板置于室温下，真空浓缩至干。此处，也可以氮气吹干。
步骤4：复溶。
每孔加入70μL复溶液(90％甲醇水溶液)，恒温振荡孵育器内振荡混匀10min。将全部液体转移至96孔低吸附进样板(聚苯乙烯材质)中，覆上铝箔封膜，检测备用。
四、样品检测
4.1液相色谱检测
液相色谱型号：Waters Acquity UPLC；
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 3.0*50mm 2.6μm；
流速：0.6ml/min。
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液
进样量：15μL
洗脱程序如表3所示。
表3洗脱梯度
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) | Curve(流速曲线) |
| 0 | 20 | 80 | Initial |
| 1.2 | 20 | 80 | 6 |
| 1.5 | 10 | 90 | 2 |
| 1.8 | 0 | 100 | 6 |
| 5.0 | 0 | 100 | 6 |
| 5.01 | 20 | 80 | 6 |
| 6.00 | 20 | 80 | 6 |
待测样品通过液相色谱分离后，不同的维生素在不同洗脱时间出峰，为示意，选取了如图1至图5所示的五种维生素色谱峰。然后进入质谱检测。
4.2质谱检测
质谱仪检测条件：
离子源类型：大气压化学电离源(APCI)；
气帘气：30psi；
碰撞气：9psi；
离子源温度：400℃；
Gas1:40psi。
待测样品和内标的MRM参数如表4所示。表中显示母离子/子离子对质荷比，保留时间，正离子模式优化去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)。
表4待测样品和内标的MRM参数表
通过检测到的离子对，保留时间，来确定脂溶性维生素的检测响应；并通过内标来进行定量。
4.3检测数据处理
标准曲线的绘制方法：以标准品样本的标示浓度为横坐标(x)，以标准品样本的实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。标准曲线如图6～图10所示。
将检测到的待测血清样品中，脂溶性维生素与内标的比值，代入标准曲线，得到脂溶性维生素的浓度含量。
实施例2
内标工作液的优化。选取6种不同的内标工作液，分别进行实施例1的检测实验，对比其检测结果中5种脂溶性维生素的响应强度。
实施例2-1：正庚烷:异丙醇＝1:1；
实施例2-2：正庚烷:异丙醇＝2:1；
实施例2-3：正庚烷:异丙醇＝3:1；
实施例2-4：异辛烷:异丙醇＝2:1；
实施例2-5：水:异丙醇＝2:3；
实施例2-6：甲醇:乙腈:异丙醇＝7:2:1；
检测结果如表5所示。
表5不同内标工作液检测结果对比表
分析：在实验过程中，几种内标工作液均可使处理后的样本处于悬浊状态，其中实施例2-1至2-4出现分层现象，实施例2-5为混匀的悬浊液。但从上表数据可以看出，2:1的正庚烷/异丙醇综合响应最高，尤其可显著提高VK1的响应，因此选用该配比的内标工作液作为预处理溶液。
实施例3
萃取液的优化。选取4种不同的萃取液(正庚烷、正己烷、异辛烷、乙酸乙酯)，分别进行实施例1的检测实验，对比其检测结果中5种脂溶性维生素的响应强度。其结果如表6所示。
表6不同萃取液检测结果对比表
从上表数据可以看出，各指标的综合响应，正庚烷萃取后的样本＞异辛烷萃取后的样本＞正己烷萃取后的样本，因此选择正庚烷作为优选的萃取试剂。
实施例4
复溶液的优化。取6种不同的复溶液，分别进行实施例1的检测实验，对比其检测结果中VK1的响应，如表7所示。
表7不同复溶液检测结果对比表
| 序号 | 复溶液 | 比例 | S1的VK1响应 |
| 实施例4-1 | 甲醇水溶液 | 70％ | —— |
| 实施例4-2 | 甲醇水溶液 | 80％ | 802.23 |
| 实施例4-3 | 甲醇水溶液 | 90％ | 1694.21 |
| 实施例4-4 | 纯甲醇 | 100％ | 1852.91 |
| 实施例4-5 | 纯乙腈 | 100％ | 955.40 |
| 实施例4-6 | 纯异丙醇 | 100％ | 1153.56 |
由于VK1在收集板上的吸附现象，我们通过调整复溶液的比例来尽可能提高复溶效率，从上表可以看出，在用纯甲醇的条件下，VK1的响应最高，但由于实施例4-2至4-6中，纯甲醇的饱和蒸气压最大(12.3kpa)，因此其挥发性是这些溶剂中最强的，由于90％的甲醇其复溶效率只比纯甲醇低10％左右，可达到检测要求，因此优选90％甲醇水溶液作为复溶液使用。
Claims (11)
1.一种用于血清中脂溶性维生素检测的内标工作液，其特征在于，内标工作液包含脂溶性维生素内标和混合液，所述混合液包括正庚烷、60％异丙醇水溶液。
2.根据权利要求1所述的一种用于血清中脂溶性维生素检测的内标工作液，其特征在于，正庚烷、异丙醇水溶液的体积比为1:1～3:1。
3.根据权利要求2所述的一种用于血清中脂溶性维生素检测的内标工作液，其特征在于，正庚烷、异丙醇水溶液的体积比为2:1。
4.一种血清中脂溶性维生素的检测方法，包括对样品的前处理，然后通过液相色谱串联质谱检测待测维生素含量，其特征在于，所述前处理过程包括粗混、萃取、干燥、复溶，如权利要求1至3中任一权利要求所述的内标工作液在粗混过程加入。
5.根据权利要求4所述的一种血清中脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，粗混步骤，取100μL样品，加入100μL内标工作液。
6.根据权利要求4所述的一种血清中脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，前处理过程中：萃取步骤，萃取液选择正己烷、正庚烷或异辛烷中的一种；
干燥步骤采用氮气吹干或真空浓缩至干；
复溶步骤加入的复溶液选择甲醇水溶液。
7.根据权利要求6所述的一种血清中脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，萃取步骤，将粗混液体转移至96孔萃取板，静置至液体全部浸入萃取板；加入所述萃取液，令其自然流出收集于96孔收集板，并重复3次；第四次用正压装置将其全部压入收集板。
8.根据权利要求6或7所述的一种血清中脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，所述萃取液选用正庚烷。
9.根据权利要求4所述的一种血清中脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，复溶液选择90％甲醇水溶液。
10.根据权利要求4所述的一种血清中脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，液相色谱串联质谱检测待测维生素含量，配制VA、VD2、VD3、VE、VK1的标准品样本，标准品加入甲醇和0.1％BHT溶液，用超纯水稀释，再加入到模拟基质样本中。
11.根据权利要求10所述的一种血清中脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，配制模拟基质样本时，用10mmol/L的PBS溶液溶解BSA。
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