CN106370741B - 一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于：血清经过有机溶剂‑甲醇沉淀蛋白以后，取上清液，引入亲水作用色谱飞行时间质谱仪进行测定，经过峰对齐、校正和标准化、多变量统计分析和谱库检索可以找到喉癌志愿者和健康志愿者血清中的差异代谢物。本发明为全新的血清中差异代谢物的鉴定方法，通过差异代谢物可以反应喉癌患者血清代谢物的变化情况，将有助于喉癌的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。
Description
技术领域：
本发明属于血清的理化检验技术领域，具体说是一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法。
背景技术：
常见的喉癌类型为鳞片状细胞癌，具有高发病率和高复发率的特点，且容易发生颈部淋巴结转移。在喉癌的治疗中主要采用手术为主的喉切术，并辅以放化疗，但其对于化疗不敏感，且容易引起患者发音、吞咽功能差，生存质量降低等问题，早期喉癌治疗效果较好而晚期喉癌疗效差，但对于喉癌的早期诊断仍然缺乏十分有效的生物标志物。因此，新的生物标志物的发现对于临床上实现喉癌的早期诊断和治疗具有重要意义。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。代谢组学技术可以发现新的生物标志物，这将有助于头颈癌的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。
血液流过受试者的全身，能够很好的反应受试者的身体状况，是一种常用的生物检材。然而，血清中除了脂质等非极性物质以外，还含有一些极性的成分。如Lin等采用反相色谱飞行时间质谱和亲水作用色谱飞行时间质谱对肾癌的血清代谢组学研究，在亲水作用色谱柱子条件下发现了乙酰苯丙氨酸、甘油磷酸胆碱等差异代谢物，这表明亲水作用色谱是反相色谱的一个很好的补充，可以进一步地提高代谢覆盖率，尽可能多的发现潜在差异代谢物。
发明内容：
本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的筛选喉癌志愿者和健康志愿者血清中差异代谢物的液相色谱飞行时间质谱方法，该方法能快速、准确鉴定血清中的差异代谢物。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于亲水作用飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，是以喉癌志愿者和健康志愿者血清为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：
a、血液在室温下解冻，移取200 µL的血清，加入600 µL的甲醇，涡旋混合15 s，然后以12000 g离心力在离心机中离心10 min；
b、移取上清液于2 mL的色谱瓶中，待测；
c、亲水作用色谱飞行时间质谱对所有血清样本进行逐一分析，得原始数据；
d、将原始数据转换为mzXML的格式后，对数据进行峰对齐、校正、滤噪后，采用SIMCA-P进行多变量统计分析，筛选VIP大于1的代谢物。
e、用SPSS进行T检验，对于P<0.05且VIP大于1的为潜在差异代谢物。
f、对于潜在差异代谢物，采用谱库检索或者标准品比对等方法进行验证，即为差异代谢物。
在c步骤中，所有的样品均采用Water公司生产的XBridgeTM BEH色谱柱 （2.1 ×150 mm, 2.5 µm）进行分离，色谱柱温度为30 ºC，流动相A为含有0.1%的甲酸的10 mmol乙酸胺水溶液，流动相B为0.1%的甲酸乙腈，流动相流速为200 μL/min，梯度洗脱条件：0-7min，95%B-95%B；7-10 min，95%B-80%B；10-20 min，80%B-70%B；20-22 min，70%B-5%B；22-25min，5%B-5%B；25-25.1 min，5%B-95%B，并维持7 min，总分析时间为32 min，进样量为5 μL。
在c步骤中，飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压为3500 V，干燥气为4 L/min (180℃)，雾化气为0.04 MPa，碰撞能量为7eV，传输时间为100 µs。
本发明方法的稳定性和重复性：
从每个喉癌志愿者血清样本和健康志愿者血清样品取等量的血清，混合均匀，即为质控（QC）样品，采用质控（QC）样品来评价仪器的稳定性和重复性以确保实验结果的可靠性，选取m/z分别为226.9463，362.9193，496.3312，529.4017和758.5715来评价仪器的稳定性和重复性，这五个内生性化合物保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）见表1，保留时间的RSD小于1.2%，峰面积的RSD均小于10%，说明系统的稳定性和重复性均符合要求
表1 方法的稳定性和重复性
本发明的方法是一种新的喉癌血清差异代谢物的发现方法，对液相色谱飞行时间质谱的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。本发明方法具有如下优良效果：
①与HPLC和LC-MS比较，亲水作用液相色谱飞行时间质谱灵敏度更高。
②本方法前处理简便，不需要经过复杂的固相萃取过程，可以提高分析通量，具有快速及重复性好的优点。
附图说明
图 1. 典型的基峰色谱图（上图为健康志愿者，下图为喉癌志愿者）。
图 2. 喉癌志愿者血清样本和健康志愿者血清样本的得分图，图中1为健康者，2为喉癌患者。
具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的研究方法，其测试过程是血清经过有机溶剂-甲醇沉淀蛋白以后，取上清液，引入超高效液相色谱-电喷雾电离源-飞行时间质谱仪进行测定。
实例1：
1．仪器与试剂：实验所使用的液相色谱仪为Dionex的UltiMate 3000，包括液相泵（HPG-3400 SD）、自动进样器（WPS-3000 SL）和柱温箱（TCC-3000 SD），所有的样品均采用Water公司生产的XBridgeTM BEH色谱柱 （2.1 × 150 mm, 2.5 µm）进行分离，色谱柱温度为30 ºC。
色谱级甲酸，纯度为98%，购买自TEDIA公司，乙腈，纯度为99.9%，购买自韩国德山药品工业株（DUKSAN PURE CHEMIVALS），实验用水均为去离子水。
2．样品处理：血清在室温下解冻，移取200 µL的血清，加入600 µL的甲醇，涡旋混合15 s，然后以12000 g离心力在离心机中离心10 min，移取上清液于1.8 mL的色谱瓶中，待测。
3．测定方法：吸取前处理后的血清样品5 µL，注入亲水作用色谱飞行时间质谱系统进行分离分析。
4. 原始数据转换为mzXML的格式以后，对数据进行峰识别、提取和保留时间校正，具体的参数设置为：质荷比（m/z）允许的误差为10 ppm，色谱峰的宽度为10-60 s，保留时候的步长设置为1 m/z。
5. 然后使用SIMCA-P 13.0 Demo软件对XCMS online提取的数据进行归一化，并进行主成份分析、偏最小二乘判别分析或正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），根据OPLS-DA的结果找到变化比较大的代谢物，然后利用SPSS 20.0进行T检验。
6. 根据VIP>1和P<0.05共发现了一百多个潜在的差异代谢物，然后利用飞行时间质谱仪在MRM或者AutoMSn模式下进行二级碎片扫描，在允许误差范围为10 ppm的条件下利用二级碎片进行谱库检索。
实例2：按实施例1所述的方法，选取22例喉癌志愿者和26例健康志愿者血清样本，鉴定出其中的一个差异代谢物可能为十三甲基十四烷酸。
Claims (1)
1.一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于：是以喉癌志愿者和健康志愿者血清为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：
a、血液在室温下解冻，移取200 µL的血清，加入600 µL的甲醇，涡旋混合15 s，然后以12000 g离心力在离心机中离心10 min；
b、移取上清液于2 mL的色谱瓶中，待测；
c、亲水作用色谱飞行时间质谱对所有血清样本进行逐一分析，得原始数据；
亲水作用色谱条件：采用Water公司生产的XBridgeTM BEH色谱柱 、规格2.1 × 150mm, 2.5 µm进行分离，色谱柱温度为30 ºC，流动相A为含有0.1%的甲酸的10 mmol乙酸胺水溶液，流动相B为0.1%的甲酸乙腈，流动相流速为200 μL/min，梯度洗脱条件如下：0-7 min，95%B-95%B；7-10 min，95%B-80%B；10-20 min，80%B-70%B；20-22 min，70%B-5%B；22-25min，5%B-5%B；25-25.1 min，5%B-95%B，并维持7 min；总分析时间为32 min，进样量为5 μL；
飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压为3500 V，干燥气为180℃条件下4 L/min ，雾化气为0.04 MPa，碰撞能量为7 eV，传输时间为100 µs；
d、将原始数据转换为mzXML的格式后，对数据进行峰对齐、校正、滤噪后，采用SIMCA-P多元数据分析软件进行多变量统计分析，筛选VIP大于1的代谢物；
e、用SPSS进行T检验，对于P<0.05且VIP大于1的为潜在差异代谢物；
f、对于潜在差异代谢物，采用谱库检索或者标准品比对方法进行验证，即为差异代谢物。
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